一株生防巨腔茎点霉菌P2及其应用
阅读：25发布：2022-10-02
专利汇可以提供一株生防巨腔茎点霉菌P2及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于农业 微 生物 学技术领域，具体公开了一株巨腔茎点霉及其应用， 申请 人 分离了一株巨腔茎点霉（Phoma macrostoma）菌株，保藏编号为CCTCC NO：M 2018726。巨腔茎点霉或其 发酵 物滤液可有效抑制油菜上重要病原菌（核盘菌、 灰葡萄孢 、立枯丝核菌、油菜黑胫病菌）菌丝生长，分生孢子及菌核萌发；还具有较为广谱的抗 真菌 作用，能够抑制大多数其它 植物 病原真菌菌丝生长。此外，菌株P2发酵物滤液对油菜 种子 无毒害作用，发酵物滤液浸泡处理油菜种子，种子能正常萌发，因此可以作油菜种子处理，以防治土传病害。同时，该菌具有很强的耐高温、耐酸 碱 、抗紫外线 辐射 的能 力 。因此，P2菌株存在着开发利用的潜力。，下面是一株生防巨腔茎点霉菌P2及其应用专利的具体信息内容。
1.一株巨腔茎点霉（Phoma macrostoma），所述的巨腔茎点霉的保藏编号为CCTCC NO：M
2018726 ，分类命名：巨腔茎点霉（Phoma macrostoma）P2。
2.权利要求1所述的巨腔茎点霉（Phoma macrostoma）P2发酵物滤液。
3.权利要求1所述的巨腔茎点霉或权利要求2所述的P2发酵物滤液在制备植物病原菌抑制剂中的应用。
4.权利要求1所述的巨腔茎点霉P2或权利要求2所述的P2发酵物滤液在制备植物种子包衣剂中的应用。
5.根据权利要求3所述的应用，所述的植物病原菌包括：瓜果腐霉（Pythium apanidermatum）、根霉（Rhizopus stolonifer）、毛霉（Mucor hiemails）、黄曲霉（Aspergillus flavus）、黑曲霉（Aspergillus niger）、灰葡萄孢（Botrytis cinerea）、水稻弯孢菌（Curvularia lunata）、油菜黑胫病菌（Leptosphaeria biglobosa）、莴苣菌核病菌（Sclerotinia minor）、油菜菌核病菌（Sclerotinia sclerotiorum）、立枯丝核菌（Rhizoctonia solani）。
一株生防巨腔茎点霉菌P2及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 茎点霉属(Phoma)真菌能引起植物的重要病害，它可以为害豆科、茄科、十字花科以及木兰科等上百种植物，造成植物的叶斑、茎腐和枝枯等病害。例如Phoma destructiva是导致番茄叶枯及茎枯的病原菌(Boerema et al,2004)，而Phoma lingam是引起十字花科作物茎基溃疡病的一个重要病原菌(有性态是Leptosphaeria maculans/Leptosphaeria biglobosa 两种类型)，能造成油菜籽减产20％～60％。茎点霉属中的P.andigena和P.tracheiphila在欧洲等地区，P.foveata在美国南部以及P.macdonaldii在澳大利亚等地区分别被列入当地检疫性病原菌，具有重要的检疫性。在我国，P.exigua、P.pinodella和P.tracheiphila被列入 2007年公布的《中华人民共和国进境植物检疫性有害生物名录》。
[0003] 茎点霉属真菌广泛存在于环境中，在降解有机物的过程中起着重要作用；此外，一些茎点霉属真菌还可以作为生防因子来防治生物植物病害。例如Arie在1999年曾报道Phoma glomerata，能够产生epoxydon(环氧素)进而抑制十字花科作物根肿病的发生；此外，White 在2000年报道该菌还能重寄生白粉菌，它能在白粉菌闭囊壳上产生大量的分生孢子器，从而抑制白粉菌的生长。Graupner曾在2003年报道过巨腔茎点霉(Phoma macrostoma)能够产生新型环四酸(novel cyclic tetramic acid)作为除草剂来防治草坪上杂草，例如蓟，蒲公英、铁线莲等阔叶类杂草，但在国内外利用巨腔茎点霉进行植物病原菌生物防治尚未见报道。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供了一株巨腔茎点霉(Phoma macrostoma)，所述的巨腔茎点霉的保藏编号为CCTCC NO：M 2018726，分类命名：Phoma macrostoma P2。
[0006] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术措施：
[0007] 本发明的巨腔茎点霉分离自湖北省郧西县采集的油菜黑胫病样品，因其形态特征与油菜黑胫病菌无性态Phoma lingam很相似，该菌株已于2018年10月30日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏，申请人将其命名为菌株P2。所述的巨腔茎点霉的保藏编号为CCTCC NO：M 2018726，分类命名：Phoma macrostoma P2。
[0008] 菌落特性：
[0009] 在OA培养基上培养7d后，菌落边缘整齐，呈灰绿色，背面浅绿色，分生孢子器密集产生在菌落中央，菌落直径49.0mm；在MA培养基上培养7d后，菌落边缘整齐，菌落呈白色绒毛状，背面橘黄色，未见孢子器产生，菌落直径61.3mm；在PDA培养基上培7d 后，菌落边缘整齐，呈灰绿色，背面绿色，分生孢子器密集散生，菌落直径64.3mm；P2 在PDA培养基上14d能在培养基表面看到有大量的分生孢子器产生，且分生孢子器有橘粉色孢子粘液出现。分生孢子器圆球形，棕褐色，器外壁不光滑呈革质状，大小为320～333μm；分生孢子梗翁瓶状，大小为6.6～11.2μm×6.6～8.6μm；分生孢子梗末端着生有一个椭圆状，光滑，透明，无隔，分生孢子内含2-5个油滴，分生孢子大小为7.3-9.3μm×3.3-4.0μm。
[0010] 巨腔茎点霉(Phoma macrostoma)P2菌株的应用，包括利用该菌株制备成植物病原菌的防治剂，或作为植物种子的包衣剂；所述的植物病原菌包括但不限于：瓜果腐霉(Pythium apanidermatum)、根霉(Rhizopus stolonifer)、毛霉(Mucor hiemails)、黄曲霉(Aspergillus flavus)、黑曲霉(Aspergillus niger)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、水稻弯孢菌(Curvularia lunata)、油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)、莴苣菌核病菌(Sclerotinia minor)、油菜菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)。
[0011] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0012] 利用本发明提供的巨腔茎点霉P2发酵物滤液可有效抑制油菜上重要病原菌核盘菌、灰葡萄孢等菌丝生长，分生孢子及菌核的萌发；P2发酵物滤液还具有较为广谱的抑菌作用，除了能够抑制大多数植物病原真菌的生长，还能有效抑制黄曲霉等对人体有害的病原菌生长。此外，P2发酵物滤液对油菜种子无毒力作用，发酵物滤液浸泡处理油菜种子，种子能正常萌发，因此可以考虑在防治土壤病害时灌根P2发酵物滤液，避免化学防治对环境和作物安全的潜在不良影响。最后，该菌具有很强的耐高温、耐酸碱、抗紫外的特点，可将其作代谢产物的剂型加工开发。附图说明
[0013] 图1为巨腔茎点霉P2在培养基上培养的菌落形态图；
[0014] 其中A为OA培养基菌落形态；B为MEA培养基菌落形态；C为PDA培养基菌落形态；D为PDA 14d培养形态；E为PDA培养基上形成的分生孢子器；F为分生孢子器；G 为分生孢子梗；H为分生孢子。
[0015] 图2为本发明的巨腔茎点霉P2及其它Phoma菌株(P1、P3和P4)对油菜的致病力示意图。
[0016] 图3为本发明的巨腔茎点霉P2及其它Phoma菌株(P1、P3和P4)与病原菌Leptosphaeria biglobosa对峙试验结果示意图。
[0017] 图4为本发明的巨腔茎点霉P2及其它Phoma菌株(P1、P3和P4)发酵物滤液在油菜上对 Leptosphaeria biglobosa侵染抑制作用的试验结果示意图。
[0018] 图5为本发明的巨腔茎点霉P2发酵物滤液产生抗真菌物质的时间动态示意图。
[0019] 图6为本发明的巨腔茎点霉P2发酵物滤液抗真菌物质生物活性测定菌的筛选示意图。
[0020] 图7为本发明的巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对Leptosphaeria biglobosa产生抑菌圈示意图；
[0021] 其中：A，抑菌圈整体图；B，体式镜下透明圈边界图；C光学显微镜下透明圈边界菌丝尖端图；D，透明圈内部畸形分生孢子图。
[0022] 图8为不同温度处理对巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)活性的影响示意图。
[0023] 图9为酸碱处理对巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)活性的影响示意图。
[0024] 图10为紫外线处理对巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)活性的影响示意图。
[0025] 图11为环境pH对巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)活性发挥影响示意图。
[0026] 图12为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)不同浓度对4种植物病原真菌菌丝影响示意图。
[0027] 图13为本发明巨腔茎点霉0.6％P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对4种病原菌菌丝的致畸示意图；
[0028] 0.6％P2发酵物滤液(含抗真菌物质)是指90mL的PDA培养基+600μL P2发酵物滤液。
[0029] 图14为本发明巨腔茎点霉10％P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对核盘菌及灰葡萄孢菌核萌发影响的示意图；
[0030] 10％P2发酵物滤液(含抗真菌物质)是指90mL的PDA培养基+10mL P2发酵物滤液。
[0031] 图15为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)浸泡核盘菌及灰葡萄孢菌核后，其对菌核萌发影响示意图。
[0032] 图16为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对灰葡萄孢分生孢子萌发影响示意图。
[0033] 图17为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对油菜黑胫病菌分生孢子萌发影响示意图。
[0034] 图18为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)在活体油菜叶片上对核盘菌防病效果示意图。
[0035] 图19为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)在活体油菜叶片上对灰葡萄孢防病效果示意图。
[0036] 图20为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)的抑菌谱测定示意图。
[0037] 图21为本发明巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对油菜种子的毒力测定示意图。
具体实施方式
[0038] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明实施例所涉及的技术方案，如未特别说明，均为本领域常规方案；所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0039] 实施例1：
[0040] 巨腔茎点霉P2菌株的分离鉴定及生物学特性分析
[0041] 一、菌株的分离及其生物学特性分析
[0042] 申请人从湖北省郧西县采集的油菜黑胫病样品中，选取具有典型症状的病残体，在其病健交界处剪切组织块，大小约为0.5cm×0.5cm；用75％乙醇、5％次氯酸钠分别处理30s 和5min，然后用无菌水连续清洗3次，再将其转至含有25％乳酸的PDA培养基平板中央，
22℃恒温培养4d，最后将从病组织边缘长出来的真菌进行纯化。此外，本实验室还分别从油菜黑胫病样品中分离得到4种与油菜黑胫病致病菌相似的真菌(Phoma sp.)，命名为P1、 P2、P3、P4，通过致病力分析确定这4种Phoma菌株均不能使油菜致病(图2)，故采用平板对峙培养法对P1、P2、P3及P4菌株进行初步生防测定；最后，利用这4种Phoma菌株的PDB摇培液测定其在油菜上对油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa Lb20)侵染的影响，以此判断这
4种Phoma菌株中是否存在生防菌株。
22℃恒温培养4d，最后将从病组织边缘长出来的真菌进行纯化。此外，本实验室还分别从油菜黑胫病样品中分离得到4种与油菜黑胫病致病菌相似的真菌(Phoma sp.)，命名为P1、 P2、P3、P4，通过致病力分析确定这4种Phoma菌株均不能使油菜致病(图2)，故采用平板对峙培养法对P1、P2、P3及P4菌株进行初步生防测定；最后，利用这4种Phoma菌株的PDB摇培液测定其在油菜上对油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa Lb20)侵染的影响，以此判断这
4种Phoma菌株中是否存在生防菌株。
[0043] 试验结果发现4种Phoma菌株在与油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa Lb20)对峙培养过程中，发现Lb20的菌丝生长受到一定抑制，产生的分生孢子器与CK(只接种Lb20) 相比明显减少(图3)。4种Phoma菌株发酵物滤液在油菜上对Lb20侵染的试验结果表明，在含有P2发酵物滤液上的病原菌Lb20不能够在油菜侵染，其余3种Phoma菌株的发酵物滤液处理后Lb20均能在油菜上侵染(图4)，CK(只接种Lb20，接种点滴加清水)能正常发病，且接种7d后病斑直径达8.4mm，因此初步判断P2可以产生某种抗真菌物质，从而能很好的抑制Lb20菌丝的生长，该菌株已于2018年10月30日送交湖北省武汉市武汉大学内的中国典型培养物保藏中心保藏,其保藏编号为CCTCC NO：M 2018726，分类命名： Phoma macrostoma P2。
[0044] 二、菌株的形态学特征
[0045] (1)菌落特征
[0046] 在OA培养基上培养7d后，菌落边缘整齐，呈灰绿色，背面浅绿色，分生孢子器密集产生在菌落中央，菌落直径49.0mm；在MA培养基上培养7d后，菌落边缘整齐，菌落呈白色绒毛状，背面橘黄色，未见孢子器产生，菌落直径61.3mm；在PDA培养基上培7d 后，菌落边缘整齐，呈灰绿色，背面绿色，分生孢子器密集散生，菌落直径64.3mm；P2 菌株在PDA培养基上培养14d后，能在培养基表面看到有大量分生孢子器产生，且分生孢子器上分泌橘粉色孢子粘液(图1)。
[0047] (2)显微观察结果
[0048] 分生孢子器圆球形，棕褐色，器外壁不光滑呈革质状，大小为320～333μm；分生孢子梗翁瓶状，大小为6.6～11.2μm×6.6～8.6μm；分生孢子梗末端着生有一个椭圆状，光滑，透明，无隔，分生孢子内含有2～5个油滴，分生孢子大小为7.3～9.3μm×3.3～4.0μm(图1)。
[0049] 三、菌株P2的分类属性鉴定
[0050] 将培养4d的P2菌丝从铺有玻璃纸的PDA培养基上刮下，放至研钵，加入适量液氮后充分研磨，通过CTAB法提取P2菌株的总DNA，上述真菌的鉴定是基于内转录间隔区 l(ITS1)、5.85rDNA、内转录间隔区2(ITS2)进行鉴定的。通过引物ITS1和ITS4对菌株的总DNA进行PCR扩增，所得到的序列在NCBI网站中进行Blast比对，鉴定结果为Phoma macrostoma即巨腔茎点霉。
[0051] 实施例2：
[0052] 巨腔茎点霉P2的纯化及发酵培养
[0054] (2)菌株培养：将步骤(1)中培养3d的P2菌株转接至新鲜的PDA培养基上，22℃恒温箱中培养7d。
[0055] (3)发酵：用无菌打孔器将步骤(2)中的P2菌株菌落边缘打若干个菌饼，每100mL PDB培养液中接种5个菌丝块，150rpm、22℃分别振荡培养3d、6d、9d和15d，6000rpm 离心后分别收集不同天数发酵物滤液，用于以下实施例。
[0058] 实施例3：
[0059] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液的制备及其抗真菌物质活性的测定
[0060] 一、巨腔茎点霉P2发酵物滤液产生抗真菌物质的时间动态
[0061] 分别在P2菌株摇培的第3d、6d、9d、12d和15d收集发酵物滤液，测定pH值，所得菌丝烘干后称量菌丝干重(表1)。发酵滤液用孔径为0.22μm的细菌过滤器过滤后，以 10％(v/v)的比例(在本发明中，这个百分比，指的是P2发酵物滤液：培养基是1:9，体积比)添加到PDA培养基中混合均匀，倒平板即得到带毒平板，以添加10％(v/v)的PDB 溶液作为阴性对照。将直径为5mm的核盘菌(Sclerotinia sclerotiorum)、灰葡萄孢(Botrytis cinerea)、立枯丝核菌(Rhizoctonia solani)及油菜黑胫病菌(Leptosphaeria biglobosa)(如未特别说明，本发明所涉及到的核盘菌、灰葡萄孢、立枯丝核菌和油菜黑胫病菌均为以下菌株，其中灰葡萄孢(B05.10)为灰霉病菌的模式菌株，核盘菌(Ss)、立枯丝核菌(Rs)和油菜黑胫病菌(Lb20)为本实验室分离获得，其经鉴定与公开菌株性质一致)新鲜菌丝块接种到带毒平板和阴性对照平板上，22℃恒温培养，待阴性对照长满皿后，测量各处理的菌落直径，每个处理设置3次重复。根据公式计算抑菌率：
[0062]
[0063] 结果如图5所示，随着摇培时间的延长，巨腔茎点霉P2培养至第15d时生物量最大，其抑菌活性最强，且pH值也随之增加，摇培至第15d时pH值上升至8.3。根据这一试验结果，在后续试验中均采用P2菌株摇培至15d时的发酵物滤液来测定其生物活性。
[0064] 表1菌株P2发酵物滤液产生抗真菌物质的时间动态
[0065]
[0066] 注：在PDB培养液中测定不同摇培P2发酵滤液对核盘菌(Ss)、灰葡萄孢(B05.10)、立枯丝核菌(Rs) 以及油菜黑胫病菌(Lb20)菌丝生长的影响。在22℃和150rpm条件下，分别在摇培3d、6d、9d、12d 及15d后，称量发酵物中菌丝干重，并分别测不同摇培天数P2发酵物滤液pH值，利用最小差异显著法(LSD) 分析处理间的差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
[0067] 二、巨腔茎点霉P2发酵物滤液(抗真菌物质)生物活性测定菌的筛选
[0068] 分别将容易产孢且产孢量大的植物病原真菌黑曲霉Y-1(Aspergillus niger Y-1)、灰葡萄孢RoseBc-3(本试验选用分生孢子产量较大的菌株来检测其对P2抗真菌物质的敏感性，产孢量越大的菌株在培养基上显现出来的颜色越深，抑菌圈越明显，由于之前的灰葡萄孢模式菌株B05.10产孢量小，不适用于本试验中)、油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa(Lb20) 培养至产孢，然后用无菌水将分生孢子洗至无菌的50mL离心管中，四层擦镜纸过滤后得到分生孢子悬浮液，将其浓度调至1×108个孢子/mL。然后向每200mL PDA中加入20mL 分生孢子悬浮液充分混合倒平板，采用管碟法进行敏感性测定，然后将200μL P2发酵物滤液(15d)加到规格一致的孔径为6mm的牛津杯(以下同)中，同样的加入200μL PDB溶液到牛津杯中作为阴性对照，22℃恒温培养3d。结果表明，Lb20对P2产生的抗真菌物质敏感性最强，抑菌圈平均直径为2.9cm，且抑菌圈非常透明，敏感性次之的是黑曲霉，抑菌圈平均直径为2.1cm，且抑菌圈半透明，而RoseBc-3最不敏感，无抑菌圈产生，用PDB作对照的带菌平板上也无抑菌圈产生(图6)。最后将最透明的抑菌圈用光学显微镜观察，透明圈交界处可见正常菌丝(图7中C)以及畸形菌丝(图7中C)，透明圈内部可见菌丝畸形呈链状或者已经溃解(图7中D)。因此，以下试验的生物活性测定，均选用Leptosphaeria biglobosa(Lb20)作为供试菌株。
[0069] 三、巨腔茎点霉P2发酵物滤液(抗真菌物质)的稳定性测定
[0070] (1)热稳定性：将摇培15d的P2发酵物滤液分别在40℃、60℃、80℃和100℃水浴中处理10min、30min和60min，对照为不用热处理。将处理后的溶液迅速放置冰上冷却至室温，采用管碟法进行生物活性测定，测定菌为油菜黑胫病菌Leptosphaeria biglobosa (Lb20)，各处理生物活性结果见图8。结果表明，P2产生的抗真菌物质在100℃水浴中处理60min后，其活性与对照(不用热处理)相比几乎保持不变，说明该物质耐高温，并且在高温条件下不会丧失其生物活性。
[0071] (2)酸碱稳定性：将摇培15d的P2发酵物滤液用4mol/L的HCl和4mol/L的NaOH 溶液调节发酵物滤液pH分别至2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12和13后置于4℃冰箱，于24h后将各处理的发酵物滤液pH值分别调节至正常水平(pH 6)，最后采用管碟法进行生物活性测定，生物活性测定菌为Leptosphaeria biglobosa(Lb20)，各处理生物活性结果见图9。结果表明，P2发酵物滤液经过酸碱处理后，其生物活性仍保持不变，说明 P2产生的抗真菌物质耐酸碱。
[0072] (3)抗紫外线稳定性：将摇培15d的P2发酵物滤液至于紫外灯(UV-C,30W)下 20cm处，分别照射0min、1min、5min、15min、20min、30min、40min、60min、80min 和100min取样后采用管碟法进行生物活性测定，生物活性测定菌为Leptosphaeria biglobosa (Lb20)，各处理生物活性结果见图10。结果表明，P2发酵物滤液经紫外线延长照射至100 min后，其生物活性与未经紫外照射的对照组(未经紫外照射)基本一致，说明，P2产生的抗真菌物质耐紫外。
[0073] 实施例4：
[0074] 环境pH值对巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)活性发挥的影响
[0075] 首先将PDA培养基用4mol/L HCl和4mol/L NaOH分别调节pH值至3.5、4.0、5.0、 6.0、7.0、8.0、9.0，其中PDA培养基初始pH值为6；随后将20mL浓度为1×108个孢子 /mL油菜黑胫病菌(Lb20)的分生孢子液与200mL的PDA培养基混合，制成带菌平板，采用管碟法进行生物活性测定，将200μL P2发酵物滤液(15d)加到牛津杯中，22℃恒温培养，3d后观察结果。
结果表明(图11)P2发酵物滤液产生的抗真菌物质在酸性条件下其活性发挥得最好，产生的抑菌圈最大，但随着培养基pH值的升高，其生物活性会有所降低，但仍有活性，说明P2产生的抗真菌物质在碱性条件下其活性不如在酸性条件下发挥得好。
结果表明(图11)P2发酵物滤液产生的抗真菌物质在酸性条件下其活性发挥得最好，产生的抑菌圈最大，但随着培养基pH值的升高，其生物活性会有所降低，但仍有活性，说明P2产生的抗真菌物质在碱性条件下其活性不如在酸性条件下发挥得好。
[0076] 表2环境pH对P2发酵物滤液(含抗真菌物质)活性发挥的影响
[0077]
[0078]
[0079] 注：利用最小差异显著法(LSD)分析处理间差异显著性，同一列中字母相同表示差异不显著(P>0.05)。
[0080] 实施例5：
[0081] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对4种植物病原真菌菌丝的致畸作用[0082] 采用固体平板法，将P2发酵物滤液(15d)分别以0.1％、0.2％、0.3％、0.6％、1.3％、 2.5％、5.0％和10.0％的比例(v/v)与熔化好的PDA培养基混合，制成带毒平板，以不添加发酵物滤液的PDA作为阴性对照。每平板中央接种一个直径为5mm的病原菌(灰葡萄孢、核盘菌、立枯丝核菌和油菜黑胫病菌)菌丝块，每处理3次重复，22℃恒温培养，待阴性对照快长满皿后，测量各处理间的菌落直径，以此计算抑制病原菌菌丝生长的百分率。
[0083] 结果如图所示(图12)，P2发酵物滤液对灰葡萄孢、核盘菌、立枯丝核菌和油菜黑胫病菌菌丝均有致畸作用，随着P2发酵物滤液浓度的增加，4种病原菌菌丝生长受到明显抑制，菌落中间菌丝堆积，气生菌丝发达，当发酵物滤液浓度仅为0.6％时，核盘菌和油菜黑胫病菌菌丝已受到明显抑制。
[0084] 表3菌株P2发酵物滤液(含抗真菌物质)浓度对4种病原菌菌丝生长的影响[0085]
[0086] 挑取P2发酵液终浓度为0.6％的菌丝尖端及阴性对照(不含P2发酵物滤液)的菌丝尖端，棉蓝染色后用显微观察发现，P2发酵液处理后的病原菌菌丝分枝明显增多，菌丝纠结成束，菌丝溢断现象；然而阴性对照(不含P2发酵物滤液)菌丝尖端比较稀疏，菌丝分枝正常，菌丝较为饱满(图13)。
[0087] 实施例6
[0088] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对核盘菌和灰葡萄孢菌核萌发的影响[0089] 本试验采用两种方法来测定P2发酵物滤液产生的抗真菌物质对核盘菌、灰葡萄孢菌核萌发的影响。
[0090] 方法一：选取大小基本一致的菌核，用75％乙醇溶液(v/v)和5％次氯酸钠液(v/v) 将供试菌核分别处理1min和5min，接着用无菌水浸洗3次，将这些菌核置于灭过菌的滤纸上，以吸干表面的水分，无菌环境下自然风干。最后将菌核浸泡在P2发酵物滤液(15d) 中，以PDB培养液浸泡菌核为对照，室温下静置24h。24h后将各处理菌核放置在PDA平板上，每平板4粒菌核，每个处理4次重复，将平板置于22℃下培养，5d后观察菌核萌发情况。
[0091] 方法二：按照方法一选取菌核及进行表面消毒。将P2发酵物滤液(15d)以10％的比例(v/v)与熔化的PDA混合，制成带毒平板；以不添加P2发酵物滤液的PDA平板为阴性对照，最后每个平板4粒菌核，每个处理4次重复，将这些平板置于22℃下培养，5d后观察菌核萌发情况。
[0092] 方法一试验结果如图所示(图14)，核盘菌及灰葡萄孢的菌核在P2发酵物滤液中浸泡 24h后，接种至PDA平板上培养5d后从观察结果来看，两种病原菌菌核均能萌发，但萌发出来的菌丝生长比较缓慢或受到抑制，而对照组用PDB浸泡的两种菌核在PDA平板上均能正常萌发，且菌丝能正常生长。
[0093] 方法二试验结果如图所示(图15)，核盘菌及灰葡萄孢菌核在含有10％(v/v)P2发酵物滤液的带毒平板上培养5d后，两种病原菌菌核虽然能萌发产生菌丝，但萌发出来的菌丝不能正常的生长，明显受到了抑制。而在没有添加P2发酵物滤液的PDA平板，这两种菌的菌核均能正常萌发，且萌发出来的菌丝能正常生长。
[0094] 实施例7：
[0095] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对灰葡萄孢和油菜黑胫病菌分生孢子萌发的影响
[0096] 分别将灰葡萄孢和油菜黑胫病菌的分生孢子用灭菌水洗下，制成分生孢子悬浮液，血球计数板测定其分生孢子浓度，用无菌水将悬浮液中的分生孢子浓度调节至1×106个孢子/mL，取200μL分生孢子液滴在平板中央，用无菌涂布器将分生孢子液涂抹均匀，最后观察分生孢子的萌发情况，孢子萌发与否的标准：芽管长度长于分生孢子长度的1/2时视为该孢子已经萌发。
[0097] 采用固体平板法，将P2发酵物滤液(15d)分别以0.1％、0.2％、0.3％、0.6％、1.3％、 2.5％、5.0％和10.0％的比例(v/v)与熔化的WA(含2％葡萄糖)培养基混合，制成带毒平板。以不添加P2发酵物滤液的平板为阴性对照；随后分别将200μL的灰葡萄孢(B05.10)、油菜黑胫病菌(Lb20)分生孢子液滴在WA平板中央，用无菌涂布器将分生孢子液均匀涂布在平板上。每种处理涂3个平板，作为3次重复。将所有平板置于22℃下培养，灰葡萄孢分生孢子在培养9h后在光学显微镜下观察各平板上分生孢子的萌发情况，每平板随机统计100个分生孢子，以此统计分生孢子萌发率。油菜黑胫病菌(Lb20)分生孢子在培养20h 后观察分生孢子萌发情况，并统计分生孢子的萌发率。结果表明，灰葡萄孢的分生孢子随着 P2发酵物滤液浓度的升高，其芽管的萌发受到明显的抑制，当P2发酵物滤液的浓度为2.5％时，灰葡萄孢的芽管长度明显比阴性对照的芽管长度短，当发酵物滤液浓度为10％时，孢子萌发出来的芽管明显受到抑制(图16)。而油菜黑胫病菌的分生孢子对P2发酵物滤液比较敏感，当发酵物滤液浓度为0.5％时，其芽管的萌发就已经受到了明显的抑制(图17)。
[0098] 表4菌株P2发酵滤液(含抗真菌物质)对灰葡萄孢分生抱子萌发的影响
[0099]
[0100] 表5菌株P2发酵滤液(含抗真菌物质)对油菜黑胫病菌分生孢子萌发的影响[0101]
[0102] 实施例8:
[0103] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)在活体油菜叶片上对2种病原菌的防病效果
[0104] 在室内种植中双9号油菜品种，每个钵子(10cm×10cm)里面播种5颗已催芽的油菜种子，待油菜苗长至30d后，分别用于接种核盘菌和灰葡萄孢两种病原菌。每片真叶上用 P2菌株15d的发酵物滤液均匀涂抹在表面(每片真叶上滴加约500μL P2发酵物滤液)。以PDB溶液处理的叶片作为对照，每个处理4次重复(这里的4次重复是指4盆油菜，每盆油菜接种4片真叶)。然后分别从生长3d的新鲜核盘菌和灰葡萄孢菌落边缘打取直径5 mm的菌丝块。菌丝块接种至每片真叶的两端，随后将接种好的油菜苗放置在塑料盒中，顶部用保鲜膜封好，保湿培养，置于22℃培养室中光/暗(12h/12h)培养3d后观察病原菌侵染情况。
[0105] 结果表明，接种3d后，在PDB溶液处理条件下接种核盘菌，该菌能够在油菜叶片上正常侵染，且病斑直径达14.7mm，而用P2发酵物滤液处理过的油菜叶片再接种核盘菌，该菌在油菜叶片上的侵染明显受到限制，病斑直径仅为0.9mm(图18)。在PDB溶液处理条件下接种灰葡萄孢，该菌能够在油菜叶片上正常侵染，且病斑直径达8.1mm，而用P2发酵物滤液处理过的油菜叶片再接种灰葡萄孢，该菌明显在油菜上几乎不能造成侵染，病斑直径为0mm(图19)。
[0106] 实施例9:
[0107] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)的抑菌谱测定
[0108] 采用菌丝生长速率法检测P2发酵物滤液(15d)产生的抗真菌物质对植物病原真菌的抑菌作用。首先将P2发酵物滤液按10％(v/v)比例添加到PDA培养基中，制成带毒平板。分别取新鲜的供试病原菌菌丝块(d＝直径5mm)，接种于该平板中央，以不添加P2发酵物滤液的PDA平板作为对照。每处理设3次重复，将各病原菌置于合适的生长温度(22或 28℃)培养。待对照菌落生长至接近培养皿边缘时，测量菌落直径，并计算抑菌率，表6 为P2发酵物滤液产生的抗真菌物质对供试植物病原菌的拮抗作用以及各菌株的培养条件及时间，图20为供试菌株被抑制效果菌落图。
[0109] 表6菌株P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对供试植物病原菌的拮抗作用
[0110]
[0111] 实施例10：
[0112] 巨腔茎点霉P2发酵物滤液(含抗真菌物质)对油菜种子的毒力测定
[0113] 为了明确菌株P2产生的抗真菌物质对油菜种子的萌发及生长是否有影响，因此本试验将品种为中双9号的油菜种子先用75％乙醇溶液(v/v)和5％次氯酸钠液(v/v)分别处理1 min和5min，接着用无菌水清洗3次，最后将种子分别浸泡在P2发酵物滤液(15d)和无菌水中24h，24h后将种子放在培养皿上(此时培养皿上铺上有灭过菌的滤纸片)，保湿培养，分别在第3d和第4d观察并统计各处理间种子萌发及生长的情况。结果如图所示(图 21)，P2发酵物滤液处理过的油菜种子与无菌水处理过的油菜种子在萌发、幼苗茎长及芽长上无显著性差异(P>0.05)，两种处理下种子均能正常萌发且生长。这些结果说明P2 发酵物滤液对油菜种子萌发没有毒害作用。本发明的巨腔茎点霉P2及其发酵物滤液可作为种子包衣剂用于预防植物病原菌侵染油菜种子和幼苗。
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