技术领域
[0001] 本
发明涉及一种发酵豆粕，尤其涉及的是一种富硒发酵豆粕、制备方法及应用。
背景技术
[0002] 硒是维持
生物体正常生命活动必须的多功能营养要素，动物缺硒主要表现为白肌病和生长缓慢等。天然食物中硒含量普遍较低，无法满足动物正常生长的需要，富硒
饲料能够显著改善动物的生长性能，增强动物繁殖性能，改善动物免疫机能，提高幼仔的存活率及抗病能
力。目前动物饲料中主要补硒形式为添加亚硒酸钠，而亚硒酸钠生物有效性低、毒性大、易污染环境，因而其使用量受到严格限制，例如瑞典已限制其在乳猪料中使用，日本则禁止在动物饲料中添加亚硒酸钠。与亚硒酸钠相比，利用
微生物产生的有机硒具有更高的生物安全性和相容性，生物利用效率高，成为当前禽畜补硒产业的主流发展趋势。
[0003] 豆粕是大豆经提取豆油后得到的副产品，其中
粗蛋白含量高，
氨基酸组成平衡，是畜禽最重要的
植物性蛋白原料，其用量占畜禽
蛋白质饲料用量的60％以上。豆粕经发酵处理后，蛋白质品质得到显著提高，用发酵豆粕替代日粮中的豆粕，可以提高断奶仔猪的生长性能及营养物质消化率，减轻肠道损伤，缓解腹泻。目前发酵豆粕相关研究大多停留在改良豆粕的蛋白质品质上，关于富硒发酵豆粕的研究少见报道，这也限制了豆粕营养价值的进一步提升。因此，迫切需要研制富硒发酵豆粕，从而进一步提升豆粕营养价值，减少亚硒酸钠等硒类添加剂在养殖中的应用，提升饲料工业
水平，促进
畜牧业健康发展。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服
现有技术的不足，提供了一种富硒发酵豆粕、制备方法及应用，将豆粕转
化成富含小肽和有机硒的
营养元素的多功能豆粕。
[0005] 本发明是通过以下技术方案实现的：本发明的一种富硒发酵豆粕的制备方法，包括以下步骤：
[0006] (1)富硒菌株选育
[0007] 将产阮假丝
酵母Candida utilis进行氮
离子注入诱变，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，命名为C.utilis cas6；
[0009] 将产阮假丝酵母突变菌株C.utilis cas6接种在斜面培养基得到斜面菌株，然后将所述斜面菌株接种于种子培养基中，得到种子培养液；
[0010] (3)发酵培养
[0011] 将种子培养液按体积百分含量8～12％的接种量接种至发酵培养基中，在发酵产物中补加终浓度为150～200mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20～24h，获得发酵菌液；
[0013] 将地衣芽孢杆菌Bacillus Lincheniforms cas58、戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus cas138、乳酸链球菌Streptococcus lactis cas168这三株菌株分别单独进行发酵，获得各自的益生菌发酵菌液；
[0014] (5)益生菌复合菌液制备
[0015] 将富硒酵母菌C.utilis cas6、地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58、戊糖片球菌P.pentosaceus cas138、乳酸链球菌S.lactis cas168四株菌株的发酵菌液按照3～5：2～3：2～3：1～2的体积比混合，制得益生菌复合菌液，其中有效活菌数为8.0×109～1.3×1010cfu/ml；
[0016] (6)新鲜培养基添加
[0017] 按
质量浓度2～3％向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘
蔗糖蜜；
[0018] (7)高活性富硒豆粕的制备
[0019] 将豆粕、
羽毛粉、麸皮、水按重量比10：2～3：1.5～2：4～5，混合后按照重量比2～3‰比例加入步骤(6)中的制得的益生菌复合菌液混合搅拌均匀，在36～42℃恒温下发酵36～48小时，烘干即可制成富硒豆粕。
[0020] 所述步骤(1)包括以下步骤：
[0021] (11)产朊假丝酵母Candida utilis采用YEPD培养平板上培养48～72h，挑取单菌落至含YEPD液体培养基的培养瓶中，180～200rpm，震荡培养48～72h，菌液离心洗涤，制成8 9
单细胞悬液，使细胞浓度在10～10个/mL；
[0022] (12)将菌悬液均匀涂布到无菌培养皿中，
风干制成菌膜；
[0023] (13)在N+注入机中进行离子注入，
能量14～18KeV；
[0024] (14)每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板，N+注入剂量分别为4.0×1014、6.0×1014、8.0×1014、1.0×1015、1.2×1015、1.4×1015ion/cm2，并做
真空对照平板；
[0025] (15)诱变完成后，加入无菌水洗涤菌体制成菌悬液；
[0026] (16)将菌悬液稀释104～108倍涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠的酵母突变菌株，而且其发酵生物量在同等条件下比出发菌株提高了2倍以上，命名为C.utilis cas6。
[0027] 所述步骤(2)中，将产阮假丝酵母突变菌株C.utilis cas6接种在斜面培养基25～30℃培养24～32h得到斜面菌株，然后将所述斜面菌株接种于种子培养基中，25～30℃，180～200r/min，振荡培养24～36h，得到种子培养液。
[0028] 所述斜面培养基包括以下成分：
葡萄糖15～20g/L，蛋白胨15～20g/L,酵母膏5～10g/L,亚硒酸钠20～30mg/L，琼脂12～18g/L。
[0029] 所述种子培养基包括以下成分：麦芽抽提物10～20g/L，蛋白胨10～15g/L，酵母膏5～10g/L，亚硒酸钠30～60mg/L。
[0030] 所述步骤(3)中，发酵培养基包括以下组分：可发酵还原糖30～40g/L，
硫酸铜0.035～0.05g/L，硫酸锰0.03～0.04g/L，硫酸亚
铁0.35～0.45g/L，
硫酸镁5.5～7.0g/L，硫酸锌2.5～3.5g/L，氯化
钙3.5～5.5g/L，硫酸铵5～7g/L，
氯化钠8.5～11g/L，谷氨酸7～
11g/L，L-半胱氨酸为11～13g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
[0031] 所述步骤(3)中，发酵过程为：25～30℃，溶
氧为50～70％，pH在5.5～6.0，发酵12～14h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为150～200mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20～24h，获得发酵菌液。
[0032] 所述步骤(4)中，地衣芽孢杆菌Bacillus Lincheniforms cas58采用LB培养基培养24～36h，接种量为2～3％，摇床转速为180～200rpm；所述戊糖片球菌Pediococcus pentosaceus cas138采用MRS培养基培养24～36h，接种量为2～3％，摇床转速为180～200rpm；所述乳酸链球菌Streptococcus lactis cas168采用培养基培养24～36h，接种量为2～3％，摇床转速为180～200rpm。
[0033] 一种所述的富硒发酵豆粕的制备方法制备所得的富硒发酵豆粕。
[0034] 一种富硒发酵豆粕在动物饲料中的应用。
[0035] 本发明采用高富硒酵母产阮假丝酵母Candida utilis cas6为生产菌株，用包含
水解糖和营养盐的液体培养基为发酵培养基，将亚硒酸钠转化成安全无毒、生物有效性高的有机硒。随后，将富硒酵母与地衣芽孢杆菌、戊糖片球菌、乳酸链球菌等益生菌菌株进行复配，利用复配后的混合菌液发酵豆粕，通过益生菌之间的协同作用，将豆粕转化成富含小肽和有机硒的营养元素的多功能豆粕。
[0036] 本发明相比现有技术具有以下优点：本发明采用富硒酵母和益生菌共同发酵豆粕，得到有机硒含量高、氨基酸含量丰富的发酵豆粕。一方面克服了直接在饲料中添加亚硒酸盐类物质对环境和动物体可能造成的污染和伤害，另一方面可以大大提升豆粕中硒的含量，不仅富含生物有机硒，同时含有大量的有益微生物以及发酵代谢产物，营养更加丰富，豆粕的品质得到明显改善，能促进动物对营养物质的消化吸收，增强
机体的免疫功能，打造高富硒的多功能豆粕，提升豆粕营养价值和功效。同时，该制作方法工艺简单、取材便利、设备简单、成本低，具有较高的推广价值。
具体实施方式
[0037] 下面对本发明的
实施例作详细说明，本实施例在以本发明技术方案为前提下进行实施，给出了详细的实施方式和具体的操作过程，但本发明的保护范围不限于下述的实施例。
[0038] 实施例1
[0039] 本实施例的发酵豆粕复合益生菌菌液的菌株构成如下：
[0040]
[0041] 本实施例的富硒发酵豆粕制备方法如下：
[0042] (1)富硒菌株选育
[0043] 产阮假丝酵母C.utilis采用YEPD培养平板上培养48-72h，挑取单菌落至含100ml YEPD液体培养基的250ml三
角瓶中，180～200rpm，震荡培养48～72h，菌液离心洗涤3～4次，制成单细胞悬液，使细胞浓度在108～109个/mL。取0.1mL菌悬液均匀涂布到无菌培养皿中，置于超净
工作台风干制成菌膜。在N+注入机中进行离子注入，能量14～18KeV。每个菌株做6个梯度剂量，每个剂量两个平板。N+注入剂量分别为4.0×1014、6.0×1014、8.0×1014、1.0×15 15 15 2
10 、1.2×10 、1.4×10 ion/cm ，并做真空对照平板。诱变完成后，加入1ml无菌水洗涤菌体制成菌悬液。将菌悬液稀释105倍涂布于含亚硒酸钠的筛选培养基，采用3,3'-二氨基联苯胺
盐酸盐法测定酵母菌株硒的含量。经过多次诱变筛选，获得耐受高浓度亚硒酸钠(200mg/L)的酵母突变菌株，而且其发酵生物量在同等条件下较出发菌株提高了近2.5倍，命名为C.utilis cas6。
[0044] (2)种子培养液制备
[0045] 将产阮假丝酵母C.utilis cas6接种在斜面培养基28℃培养24h，得到斜面菌株，斜面培养基成分组成为：葡萄糖15g/L，蛋白胨15g/L,酵母膏5g/L,亚硒酸钠20mg/L，琼脂12g/L。
[0046] 将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，28℃、180r/min、振荡培养24h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物10g/L，蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，亚硒酸钠30mg/L。
[0047] (3)发酵培养
[0048] 将种子培养液按8％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L
发酵罐中(装液量为40％)，28℃，溶氧控制50％，pH维持5.5，发酵12h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为150mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养20h，获得发酵菌液。
[0049] 发酵培养基成分组成为：可发酵还原糖30g/L，硫酸铜0.035g/L，硫酸锰0.03g/L，硫酸亚铁0.35g/L，硫酸镁5.5g/L，硫酸锌2.5g/L，
氯化钙3.5g/L，硫酸铵5g/L，氯化钠8.5g/L，谷氨酸7g/L，L-半胱氨酸为11g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
[0050] (4)单株菌发酵
[0051] 地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，纯水1000ml)培养24h，接种量为2％，摇床转速为180rpm。
[0052] 戊糖片球菌P.pentosaceus cas138采用MRS培养基(蛋白胨10.0g，
牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，
磷酸氢二
钾2.0g，乙酸钠5.0g，
柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纯水1000mL)培养24h，接种量为2％，摇床转速为180rpm。
[0053] 乳酸链球菌S.lactis cas168采用培养基(蔗糖10g，蛋白胨20g，酵母膏10g，磷酸二氢钾30g，氯化钠2g，硫酸镁0.2g，纯水1000ml)培养24h，接种量为2％，摇床转速为180rpm。
[0054] (5)益生菌复合菌液制备
[0055] 上述各单菌株发酵结束后，将酵母菌C.utilis cas6、地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58、戊糖片球菌P.pentosaceus cas138、乳酸链球菌S.lactis cas168四株菌株新鲜发酵液按照3:2:2:1的体积比混合，制得益生菌复合菌液，其中有效活菌数为8.0×109cfu/ml。
[0056] (6)新鲜培养基添加
[0057] 按质量浓度2％向复合菌液中加入新鲜培养基质-
甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，锤度(Bx)85％以上)。
[0058] (7)高活性富硒豆粕的制备
[0059] 称取100公斤(干重)的豆粕，然后加入20公斤羽毛粉，麸皮15公斤，过夜放置
自来水40公斤，和料。搅拌均匀后，按照2‰比例加入步骤(6)中制得的益生菌复合菌液0.35公斤，混合搅拌均匀，在36℃恒温下发酵36小时，然后采用滚筒式工艺烘干(气流
温度不超过80℃)，即可制成富含高活性富硒豆粕。
[0060] 本实施例制备的高活性富硒豆粕含量检测：参照GB/T 6432-1994检测制备的豆粕中粗蛋白含量；采用常规检测方法，测定制备的豆粕中有机硒含量。检测结果表明，富硒豆粕中粗蛋白含量45.3％，小肽含量6.1％，水分7.2％，有机硒8.5mg/kg。
[0061] 实施例2
[0062] 本实施例的发酵豆粕复合益生菌菌液的菌株构成如下：
[0063]
[0064]
[0065] 本实施例的富硒发酵豆粕制备方法如下：
[0066] (1)富硒菌株选育
[0067] 具体实施方式和实施例1相同。
[0068] (2)种子培养液制备
[0069] 将产阮假丝酵母C.utilis cas6接种在斜面培养基28℃培养30h，得到斜面菌株，斜面培养基成分组成为：葡萄糖18g/L，蛋白胨18g/L,酵母膏8g/L,亚硒酸钠25mg/L，琼脂15g/L。
[0070] 将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，28℃、190r/min、振荡培养30h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物15g/L，蛋白胨12g/L，酵母膏8g/L，亚硒酸钠45mg/L。
[0071] (3)发酵培养
[0072] 将种子培养液按10％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为45％)，28℃，溶氧控制55％，pH维持5.5，发酵13h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为180mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养22h，获得发酵菌液。
[0073] 发酵培养基成分组成为：可发酵还原糖35g/L，硫酸铜0.04g/L，硫酸锰0.035g/L，硫酸亚铁0.40g/L，硫酸镁6.5g/L，硫酸锌2.8g/L，氯化钙4.5g/L，硫酸铵6.0g/L，氯化钠9.5g/L，谷氨酸8.5g/L，L-半胱氨酸为11.5g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
[0074] (4)单株菌发酵
[0075] 地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，纯水1000ml)培养30h，接种量为2.5％，摇床转速为190rpm。
[0076] 戊糖片球菌P.pentosaceus cas138采用MRS培养基(蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，
磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纯水1000mL)培养30h，接种量为2.5％，摇床转速为190rpm。
[0077] 乳酸链球菌S.lactis cas168采用培养基(蔗糖10g，蛋白胨20g，酵母膏10g，磷酸二氢钾30g，氯化钠2g，硫酸镁0.2g，纯水1000ml)培养30h，接种量为2.5％，摇床转速为190rpm。
[0078] (5)益生菌复合菌液制备
[0079] 上述各单菌株发酵结束后，将酵母菌C.utilis cas6、地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58、戊糖片球菌P.pentosaceus cas138、乳酸链球菌S.lactis cas168四株菌株新鲜发酵液按照4:2.5:2.5:1.5的体积比混合，制得益生菌复合菌液，其中有效活菌数为1.05×1010cfu/ml。
[0080] (6)新鲜培养基添加
[0081] 按质量浓度2.5％向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，锤度(Bx)85％以上)。
[0082] (7)高活性富硒豆粕的制备
[0083] 称取100公斤(干重)的豆粕，然后加入25公斤羽毛粉，麸皮18公斤，过夜放置自来水45公斤，和料。搅拌均匀后，按照2.5‰比例加入步骤(6)中制得的益生菌复合菌液0.47公斤，混合搅拌均匀，在40℃恒温下发酵36小时，然后采用滚筒式工艺烘干(气流温度不超过80℃)，即可制成富含高活性富硒豆粕。
[0084] 本实施例制备的高活性富硒豆粕含量检测：参照GB/T 6432-1994检测制备的豆粕中粗蛋白含量；采用常规检测方法，测定制备的豆粕中有机硒含量。检测结果表明，富硒豆粕中粗蛋白含量48％，小肽含量8％，水分7.2％，有机硒10mg/kg。
[0085] 实施例3
[0086] 本实施例的发酵豆粕复合益生菌菌液的菌株构成如下：酵母菌C.utilis cas65.09
×10cfu/ml
[0087] 地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58 3.0×109cfu/ml
[0088] 戊糖片球菌P.pentosaceus cas138 3.0×109cfu/ml
[0089] 乳酸链球菌S.lactis cas168 2.0×109cfu/ml
[0090] 本实施例的富硒发酵豆粕制备方法如下：
[0091] (1)富硒菌株选育
[0092] 具体实施方式和实施例1相同。
[0093] (2)种子培养液制备
[0094] 将产阮假丝酵母C.utilis cas6接种在斜面培养基28℃培养32h，得到斜面菌株，斜面培养基成分组成为：葡萄糖20g/L，蛋白胨20g/L,酵母膏10g/L,亚硒酸钠30mg/L，琼脂18g/L。
[0095] 将上述斜面菌株接种于80mL的种子培养基中，28℃、200r/min、振荡培养36h，得到种子培养液。种子培养基成分组成为：麦芽抽提物20g/L，蛋白胨15g/L，酵母膏10g/L，亚硒酸钠60mg/L。
[0096] (3)发酵培养
[0097] 将种子培养液按12％(体积百分含量)的接种量接种至含有发酵培养基的50L发酵罐中(装液量为50％)，28℃，溶氧控制70％，pH维持6.0，发酵14h至对数生长期，在发酵产物中补加终浓度为200mg/L的亚硒酸钠，继续发酵培养24h，获得发酵菌液。
[0098] 发酵培养基成分组成为：可发酵还原糖40g/L，硫酸铜0.05g/L，硫酸锰0.04g/L，硫酸亚铁0.45g/L，硫酸镁7.0g/L，硫酸锌3.5g/L，氯化钙5.5g/L，硫酸铵7g/L，氯化钠11g/L，谷氨酸11g/L，L-半胱氨酸为13g/L，其余部分用蒸馏水补足至1L。
[0099] (4)单株菌发酵
[0100] 地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58采用LB培养基(胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，氯化钠10g，纯水1000ml)培养36h，接种量为3％，摇床转速为200rpm。
[0101] 戊糖片球菌P.pentosaceus cas138采用MRS培养基(蛋白胨10.0g，牛肉粉5.0g，酵母粉4.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，磷酸氢二钾2.0g，乙酸钠5.0g，柠檬酸三铵2.0g，硫酸镁0.2g，硫酸锰0.05g，纯水1000mL)培养36h，接种量为3％，摇床转速为200rpm。
[0102] 乳酸链球菌S.lactis cas168采用培养基(蔗糖10g，蛋白胨20g，酵母膏10g，磷酸二氢钾30g，氯化钠2g，硫酸镁0.2g，纯水1000ml)培养36h，接种量为3％，摇床转速为200rpm。
[0103] (5)益生菌复合菌液制备
[0104] 上述各单菌株发酵结束后，将酵母菌C.utilis cas6、地衣芽孢杆菌B.Lincheniforms cas58、戊糖片球菌P.pentosaceus cas138、乳酸链球菌S.lactis cas168四株菌株新鲜发酵液按照5:3:3:2的体积比混合，制得益生菌复合菌液，其中有效活菌数为1.3×1010cfu/ml。
[0105] (6)新鲜培养基添加
[0106] 按质量浓度3％向复合菌液中加入新鲜培养基质-甘蔗糖蜜(含糖分50％以上，锤度(Bx)85％以上)。
[0107] (7)高活性富硒豆粕的制备
[0108] 称取100公斤(干重)的豆粕，然后加入30公斤羽毛粉，麸皮20公斤，过夜放置自来水50公斤，和料。搅拌均匀后，按照3‰比例加入4)中制得的益生菌复合菌液0.6公斤，混合搅拌均匀，在42℃恒温下发酵48小时，然后采用滚筒式工艺烘干(气流温度不超过80℃)，即可制成富含高活性富硒豆粕。
[0109] 本实施例制备的高活性富硒豆粕含量检测：参照GB/T 6432-1994，采用凯氏定氮仪，检测制备的豆粕中粗蛋白含量；采用常规检测方法，测定制备的豆粕中硒含量。检测结果表明，富硒豆粕中粗蛋白含量46.5％，小肽含量6.8％，水分7.3％，有机硒8.3mg/kg。
[0110] 将实施例1～3制备得到的高活性富硒豆粕应用在某生猪厂，一组对照组，一组试验组，每组猪仔50只，试验结果表明，能够提高断奶仔猪的生长性能及营养物质消化率，减轻肠道损伤，缓解腹泻。
[0111] 食用了高活性富硒豆粕的仔猪，黄白俐发生率降低50％，且养殖过程中没有使用任何抗生素，大大降低了抗生素使用成本，降低抗生素滥用对环境的污染。同时，施用本实施例的制备的高活性富硒豆粕饲喂的猪只生长速度明显高于对照组，可提前5～10天出栏，大大减少养殖者的饲料成本。
[0112] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
