高效玉米秸秆生物饲料的集成化加工方法
阅读：555发布：2021-04-13
专利汇可以提供高效玉米秸秆生物饲料的集成化加工方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了高效玉米秸秆 生物 饲料 的集成化加工方法，属于生物饲料领域。涉及玉米秸秆经三步 发酵 ，规模化生产一种高效低成本的 反刍动物 优质 微生物 粗饲料。首先基于玉米秸秆高效纯种固态培养白腐菌菌酶制剂，再以大接种量转接到玉米秸秆一期发酵培养基中，同时再接种系列木质 纤维 素降解菌和产朊假丝 酵母 ，协同快速降解和转化，再添加芽孢杆菌和 酿酒酵母 进行二期发酵，乳酸菌三期厌 氧 发酵获得成品。本发明原料不需灭菌，成品不需干燥，菌酶丰富，成本低，木质素显著降低，真蛋白提高到12%以上，可以作为 牛 羊优质粗饲料和蛋白精料，添加量可达60%以上，也可10%左右添加量用于 单胃动物 ，技术规模化集成度高，经济和社会效益显著。，下面是高效玉米秸秆生物饲料的集成化加工方法专利的具体信息内容。
1.一种高效玉米秸秆微生物饲料的集成化加工方法，其特征是以玉米秸秆和无机氮为主要原料生产高蛋白低木质素微生物粗饲料，包括以下步骤集成：
（1）以玉米秸秆和限量无机氮源为主要原料，添加无机盐和激活剂，固态纯种发酵预先培养白腐菌菌酶制剂，发酵至木质素酶积累高峰期备用；
（2）以玉米秸秆粉和无机氮源为主要原料，加入商品漆酶、无机盐、部分激活剂，再以1-
15%(重量计，以下百分比同)接种量接入上述白腐菌菌酶制剂，及大接种量接入脉胞霉等木质纤维素降解霉菌及假丝酵母，进行一期固态发酵；
（3）一期玉米秸秆固态发酵产物上加入5-15%玉米秸秆粉，接入芽孢杆菌和酿酒酵母混匀，进行二期好氧发酵；
（4）二期好氧发酵产物添加5-15%麸皮、米糠、白酒糟或醋糟等，再接入乳酸菌进行三期厌氧发酵，即库存放置二星期后获得成品。
2.根据权利要求1所述的一种高效玉米秸秆微生物饲料的集成化加工方法，其特征是：
白腐菌固态纯种发酵培养基为：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆（20mm以下）占培养基的70-90%（以干料计），麸皮、米糠、白酒糟或醋糟占10-30%，酒石酸胺、硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.03-1%， CaCO3占0.1-2%，KH2PO4占0.1-3%，MgSO4、Mg(NO3)2、或MgCl2占
0.01-1%，FeSO4·7H2O占 0. 0.01-0.05%，ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、CoCl2、NaMoO4各占0.000001-0.01%，吐温80占0.01-1%，藜芦醇(3,4-二甲氧基苯甲醇, Veratryl alcohol) 占0.001-0.1%，草酸占0.001-0.1%， 培养基最终含水量为45-65%，用柠檬酸调整到 pH 5-
6；
白腐菌液态菌种转接到上述白腐菌固态发酵种子培养基中（气相脉动双动态固态发酵罐），充分搅拌后，30-40℃，发酵48-192h，获得固态纯种发酵白腐菌菌酶制剂。
3.根据权利要求1所述的一种高效玉米秸秆微生物饲料的集成化加工方法，其特征是：
脉孢霉等木质纤维降解霉菌固态发酵种子培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆（20mm以下）占培养基的70-95%（以干料计），麸皮、米糠、白酒糟或醋糟占5-30%，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.1-2%，尿素0.1-2%，碳酸钙占0.1-1%，磷酸二氢钾占0.1-3%，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1%，培养基最终含水量为53-65%，用柠檬酸调整到 pH 5-6；
脉孢霉等木质纤维降解霉菌玉米秸秆一期发酵培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆（20mm以下）占培养基的90%以上（以干料计），麸皮、米糠、白酒糟或醋糟干料占
0-5%，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.5-5%，尿素0.5-5%，碳酸钙0.1-5%，磷酸二氢钾占0.1-
3%，硫酸镁、硝酸镁或氯化镁占0.01-1%，FeSO4.7H2O、ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O、CoCl2和NaMoO4各占0.000001-0.01%，吐温80占0.05-0.5%，培养基最终含水量为45-65%，用柠檬酸调整到 pH 5-6；
脉孢霉等木质纤维降解霉菌经液态培养后，再以1-10%接种量（重量）转接到上述脉孢霉等固态发酵种子培养基，充分搅拌后，25-38℃，通无菌空气发酵24-96h，作为固态发酵生产种子，再以1-15%接种量（重量）接种到上述一期玉米秸秆发酵培养基，另加0.1-1%自发酵的产朊假丝酵母液或热带假丝酵母液，再以1-15%接种量接入上述自制的白腐菌菌酶制剂，及0.01-0.5%的商品漆酶，充分搅拌后，移入发酵室通气规模发酵（室内分层通气、散热），
25-38℃，发酵24-72h，完成一期发酵。
4.根据权利要求1所述的一种高效玉米秸秆微生物饲料的集成化加工方法，其特征是：
所述的纤维降解霉菌为：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila)，间型脉孢霉(Neurospora intermedia)，降解木质素的米曲霉(Aspergillus oryzae)和木霉属(Trichoderma sp.)的任意一种或多种；白腐菌为黄胞原毛平革菌(Panerochaete chrysosporium) ；酵母菌为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母（Candida utilis），酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的任意一种或多种；
乳酸菌为：植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum），保加利亚乳杆菌（Lactobacillus bulgaricus），嗜酸乳杆菌（Lactobacillus acidophilus），乳酸乳杆菌（Lactobacillus lactis），干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等的任意一种或多种；芽孢杆菌为：地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis）、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）的任意一种或两种。
高效玉米秸秆生物饲料的集成化加工方法
技术领域
背景技术
[0002] 玉米秸秆是中国最多的秸秆之一，如果当作发电、沼气、气化、固化成型等能源化物质利用，经济效益低下；秸秆乙醇，其生产成本7千多元每吨，没有国家补贴，不易赢利；肥料化实际上也是巨大的资源浪费；用于板才等加工总量有限；相对于稻草、小麦秆等，玉米秸秆具有较好的营养指标，不少地方收购价比小麦秆低一倍，玉米秸秆用于饲料是较好的出路，但目前收获玉米后的秸秆大多数没有加工处理直接饲喂存在适口性差、采食量低、消化率不高、营养价值极低等缺点，而且农村里大多数玉米秸秆甚至都没有粉碎，牛羊只吃叶片部分，50％左右浪费掉。总体上讲，目前黄熟玉米秸秆利用层次较低，附加值低，不易市场化，跟本原因是科技创新不足。
[0003] 另一方面，目前饲料绝大多数是以粮食为原料进行配合，成本难以下降。中国的饲料用粮已超过粮食消费总量的40％，粮食安全问题严重，所以以非粮原料(秸秆、菌糠、杂粕等)，通过系列微生物处理生产价廉物美的生物饲料，是今后的主要方向，同时化废为宝，有利于废弃物及养殖环境的生物治理。农区牛羊养殖主要瓶颈是质优价廉的粗饲料，种植苜蓿等牧草或青贮等造成了人畜争地矛盾，成本也高，而且青贮品质也不稳定，木质素没有降低，真蛋白没有提高。
[0004] 黄熟的玉米秸秆总能含量相当于干草，但其营养价值不到干草的一半，主要原因是可利用营养不足。众所周知，秸秆含有较多纤维素、半纤维和木质素。但木质素是由香豆醇、松柏醇、芥子醇和愈伤木基醇等交联聚合形成的苯基丙烷类聚合物，是植物细胞壁中主要支撑结构，并保持细胞壁的不通透性，抵抗微生物攻击及抗氧化等。木质素和半纤维素形成牢固结合层，紧紧地包围着纤维素，阻碍酶和其他物质与纤维素的接触，大大降低了纤维素的消化率。另一方面，虽然反刍动物瘤胃内含有大量微生物，可分泌纤维素酶，分解利用纤维素和半纤维素，但缺乏降解木质素的酶，木质素不能被瘤胃微生物降解，也直接影响了被木质素保护着的纤维素和半纤维素的有效降解和释放，这就限制了反刍动物对可消化的纤维素和半纤维素等营养成分的消化利用，这是导致秸秆的利用率降低的主要因素。因此，合理利用秸秆资源的前提就是极大程度地去除其中的木质素。加上玉米秸秆的氮素、维生素A、D、钙、镁、磷、锌等都很贫乏，玉米秸秆必须经系列有效加工，提高真蛋白等含量，降低木质素，才能真正具有饲用价值。
[0005] 秸秆处理方法大体上可分为物理、化学和生物三大类，其中物理方法包括切割、揉丝、粉碎、碾压、热喷、汽爆等，主要是部分提高消化率、适口性，但不改变秸秆的化学组成，不能提高秸秆的营养成分，效果好些的蒸汽爆破设备投资大，特别是大规模生产时爆破设备产能跟不上，能耗要求较高，投入大，进而使得生产成本过高，不易推广。化学方法传统上包括碱化处理、酸化处理或其他药剂处理，虽然可以部分改变秸秆的化学组成，提高玉米秸秆的消化率，但是污染高成本大使这一技术不能很好地推广。氨化饲料经常有导致动物中毒的情况发生，对设备的要求较高，环境污染严重，氨的损失率大，并污染空气，真蛋白增加有限，纤维降解少，木质素只有部分溶解但并不降解。这一系列问题都成了化学法处理秸秆饲料技术的瓶颈，总体上讲，这些方法都没有提高真蛋白和有机功能物质含量。
[0006] 与之相比，微生物处理具有环保、高效率等特点，秸秆生物饲料适口性好、消化率高、营养价值高。青贮、微贮、黄贮是目前秸秆生物处理的主要方法，也是主要的秸秆发酵饲料，即使有时添加了各种辅料或酶的发酵也是微贮范畴。青贮主要是利用不用于粮食生产的青秸秆的厌氧保存，在农区造成人畜争粮争地的矛盾。收获粮食后的秸秆用于微贮、黄贮又往往营养不够，木质纤维太多，处理很容易失败，如果加了其它较多高成本的辅料共发酵，饲用成本也增加。总体上讲，青贮、微贮、黄贮这些处理方法，主要是延长贮存保质期，并能够改善秸秆饲料的适口性，适当提高牲畜的采食量和采食速度，可以提高牲畜的机体免疫能力，预防并治疗肠道疾病，但是青贮、微贮、黄贮都不会真正明显提高真蛋白含量，没有降低木质素含量，纤维素和半维素转化也很有限，对动物的秸秆消化率没有明显提高，加上大规模青、黄贮在制作和饲用时都容易染菌而失败。
[0007] 因此，人们一直在研究提高秸秆生物处理的效果，提高蛋白质含量，降低木质纤维素，提高饲用效果。纤维降解菌和部分益生菌好氧共发酵秸秆研究较多，如发明专利(CN102696865B)、(CN103392918B)、(CN100337555C)、(CN101690554B)、(CN102132762B)、(CN102113622B)、(CN101946853B)、(CN102578441B)和(CN102488084B)等，一般选用木霉、白地霉、黑曲霉、米曲霉、酵母、芽孢杆菌、乳酸菌等几种进行好氧发酵，没有白腐菌对木质素的降解，自然也会影响纤维素的降解，也导致好氧发酵增加真蛋白不明显，有些靠辅料本身蛋白源增加蛋白质量，有些好氧发酵时间太长(如10天)易染菌，耗时长，成本也更高。以粗蛋白计算蛋白的增加量本来就不准确，发酵成品用干燥的处理方法也不太好，菌酶失活严重，能耗高，适口性也往往不太好，后续处理没有优化集成。有些专利如(CN1319464C)，秸秆封膜包装厌氧共发酵，但会使好氧的木霉、白地霉发挥作用有限，尿素变真蛋白有限，木质纤维降解更有限。
[0008] 为了提高木质素的降解，有些相对科学的发明专利进行纤维降解菌和白腐菌共发酵，如(103146606B)和(103549129B)，前者用黄孢原毛平革菌、木霉、酵母菌、枯草杆菌和乳酸菌的等共发酵，秸秆好氧发酵并和厌氧菌一起发酵，但是白腐菌生长慢和木霉生长快不协调，导致好氧发酵时间太长，成本高，易染菌。后者也用生长慢的黄胞原毛平革菌，同生长快的木霉、青霉、曲霉共发酵会出现不协调，发酵时间长，木质素产酶高峰一般在7天后，发酵时间也要10天，压实和密封下木质素降解不显著，降解率一般不到20％。
[0009] 本发明采用生长速度比木霉、青霉、曲霉等更快的脉孢霉，纤维素酶系和半纤维素酶系比较全，其中不同种脉孢霉各含有漆酶(Lacs)、锰过氧化物酶(Mnps)，配合好可加快木质素降解。在脉孢霉为优势菌群的同时，也配以能附带降解木质素酶的特殊米曲霉、青霉或木霉，进行共发酵。考虑到黄胞原毛平革菌是降解木质素最好的菌种之一，但生长慢，本发明特意另外固体纯种发酵，发酵至木质素酶积累高峰期，再以大接种量接到脉孢霉培养基中，和脉孢霉及其它几种霉菌共发酵，高效快速降解木质素。之后，再加酵母菌和芽孢杆菌搅拌混合二次发酵，经一天的菌群演变后，再添加乳酸菌等厌氧益生菌进行三次厌氧发酵，成品不需要干燥，菌酶活性全保留，能耗低，适口性好，饲用效果显著。
发明内容
[0010] 本发明目的是提供一种基于玉米黄熟秸秆的微生物饲料的规模化加工方法，使其真蛋白大幅度增加，木质素大幅度降解，纤维素和半维素有效转化，益生菌、功能酶、功能营养物质丰富，必需氨基酸匀恒，饲养效果显著，价廉物美，保存期长，主要用于反刍动物，也可10％左右添加到单位动物中，市场容量大，环境友好，社会和经济效益明显。
[0011] 本发明所述的基于玉米秸秆的微生物粗饲料是以粉碎的玉米秸秆为主要碳源，添加尿素等无机氮为主要氮源，再大量添加预先发酵的白腐菌，然后经生长迅速且具有降解木质素能力的系列食品级纤维降解霉菌一期发酵预处理，再以好氧益生菌芽孢杆菌和酵母菌为发酵菌种进行二期发酵，最后再添加部分麸皮、米糠、白酒糟或醋糟等低价干料调低水分，接种乳酸菌等充分混匀后，分装在单向膜厌氧袋中密封保存或发酵桶(池)厌氧发酵，即三期发酵获得成品。
[0012] 本发明所有菌种中，纤维降解霉菌为：粗糙脉孢霉(Neurospora crassa)，好食脉孢霉(Neurospora sitophila)，间型脉孢霉(Neurospora intermedia)，米曲霉(Aspergillus oryzae)，木霉属(Trichoderma sp.)的任意一种或多种；白腐菌为黄胞原毛平革菌(Panerochaete chrysosporium)；酵母菌为：热带假丝酵母(Candida tropicalis)，产朊假丝酵母(Candida utilis)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)等的任意一种或多种；乳酸菌为：植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等的任意一种或多种；芽孢杆菌为：地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的任意一种或多种。
[0013] 本发明的目的是这样实现的，一种高效玉米秸秆微生物饲料的集成化加工方法，按照下述步骤进行：
[0014] (一)白腐菌菌酶制剂预生产：
[0015] (1)白腐菌培养基：
[0017] 种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3g，麦芽汁3g，酒石酸氨1g，定容于1L中，其中FeSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O和CoCl2各0.000001-0.01％(质量比)，pH 5.5。500ml三角瓶中加100ml培养基，110℃灭菌30min。
[0018] 白腐菌固态纯种发酵培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆(20mm以下)占培养基的70-90％(以干料计)，麸皮或米糠占10-30％，酒石酸胺、硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.01-1％，CaCO3占0.1-2％，KH2PO4占0.1-3％，MgSO4、Mg(NO3)2、或MgCl2占0.01-1％，FeSO4·7H2O占0.0.01-0.05％。ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4·4H2O、CoCl2、NaMoO4各占0.000001-0.01％，吐温80占0.01-1％，藜芦醇(3,4-二甲氧基苯甲醇,Veratryl alcohol)占0.001-0.1％，草酸占0.001-0.1％，培养基最终含水量为45-65％，用柠檬酸调整到pH 5-
6。
6。
[0019] (2)培养方法
[0020] 将白腐菌在斜面培养基上划单菌落复壮，再挑选强壮的单菌落，各接种在新的白腐菌斜面培养基30-40℃生长，斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中，装液量100-250ml/L三角瓶，150-220r/min，25-38℃，培养48-192h，再各以0.1-1％(V/V)接种量，混合转接到200L-1000L的种子罐中，于30-40℃，150-220r/min通无菌空气培养24-48h，活菌总数为1×107cfu/ml以上，再以1-10％接种量(重量)转接到上述白腐菌固态发酵种子培养基(气相脉动双动态固态发酵罐)，充分搅拌后，30-40℃，发酵48-192h，获得高活性白腐菌菌酶制剂，大生产可以多级放大生产种子。
[0021] (二)第一期玉米秸秆发酵
[0022] (1)脉孢霉纤维降解菌种子培养基和生产培养基
[0023] 脉孢霉等斜面培养基和平板培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，定容1L中，pH 5.0，110℃灭菌30min。接种32℃培养2-5天。
[0024] 脉孢霉等种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3g，麦芽汁或红糖3g，硫酸氨或尿素5g，FeSO4·7H2O 0.005g，ZnSO4 0.0014g，MnSO4·4H2O 0.0016g，CoCl20.002g，定容于1L中，pH 5.5。500ml三角瓶中加100ml培养基，110℃灭菌
30min。
30min。
[0026] 产朊假丝酵母液态培养基：成分同斜面培养基，不加琼脂。
[0027] 脉孢霉等固态发酵种子培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆(20mm以下)占培养基的70-95％(以干料计)，麸皮或米糠占5-30％，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.1-2％，尿素0.1-2％，碳酸钙0.1-5％，磷酸二氢钾0.1-3％，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-
1％，培养基最终含水量为53-65％，用柠檬酸调整到pH 5-6。
1％，培养基最终含水量为53-65％，用柠檬酸调整到pH 5-6。
[0028] 玉米秸秆一期发酵培养基：按重量计，切割、粉碎后的玉米秸秆(20mm以下)占培养基的90％以上(以干料计)，麸皮、米糠、白酒糟或醋糟占0-5％，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.5-5％，尿素0.5-5玉米％，碳酸钙0.1-5％，磷酸二氢钾0.1-3％，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.01-1％。FeSO4·7H2O，ZnSO4，CuSO4·5H2O，MnSO4.4H2O，CoCl2，NaMoO4各占0.000001-
0.01％，吐温80占0.01-1％，培养基最终含水量为45-65％，用柠檬酸调整到pH 5-6。
0.01％，吐温80占0.01-1％，培养基最终含水量为45-65％，用柠檬酸调整到pH 5-6。
[0029] (2)培养方法
[0030] 将脉孢霉、米曲霉、木霉等分别在斜面培养基上划单菌落复壮，再分别挑选强壮的单菌落，各接种在新的脉孢菌等斜面培养基25-38℃生长，斜面培养基菌种中的孢子分别用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中，装液量100-250ml/L三角瓶，150-220r/min，25-38℃，培养24-48h，再各以0.1-1％(V/V)接种量(脉孢霉、米曲霉、木霉比例为8:1:1)，混合转接到7
200L-1000L的种子罐中，于25-38℃，150-220r/min培养24-48h，活菌总数为1×10 cfu/ml以上。再以0.1-10％接种量(重量，下同)转接到上述脉孢霉等固态发酵种子培养基，充分搅拌后，25-38℃，通无菌空气发酵24-96h，作为固态发酵生产种子。
200L-1000L的种子罐中，于25-38℃，150-220r/min培养24-48h，活菌总数为1×10 cfu/ml以上。再以0.1-10％接种量(重量，下同)转接到上述脉孢霉等固态发酵种子培养基，充分搅拌后，25-38℃，通无菌空气发酵24-96h，作为固态发酵生产种子。
[0031] 产朊假丝酵母或热带假丝酵母在上述酵母液态培养基上培养放大，根据生产规模确定放大级别。
[0032] 脉孢霉等固态发酵生产种子以1-15％接种量(重量)接种到上述玉米秸秆发酵培养基，另加0.1-1％上述酵母液，再以1-15％接种量接入上述自制的白腐菌菌酶制剂，和0.01-0.5％的商品漆酶，充分搅拌后，移入发酵室通气规模发酵(室内分层通气、散热)，25-
38℃，发酵24-72h，完成一期发酵。进入连续生产阶段，一期固态发酵接种生产种子为上次一期秸秆发酵后的固态菌剂，按1-15％接种量(重量比)接种，另加1-15％(重量比)新鲜的白腐菌菌酶制剂，及0.01到0.1％(重量比)的商品漆酶，再充分搅拌后好氧发酵。
38℃，发酵24-72h，完成一期发酵。进入连续生产阶段，一期固态发酵接种生产种子为上次一期秸秆发酵后的固态菌剂，按1-15％接种量(重量比)接种，另加1-15％(重量比)新鲜的白腐菌菌酶制剂，及0.01到0.1％(重量比)的商品漆酶，再充分搅拌后好氧发酵。
[0033] (三)第二期玉米秸秆发酵
[0034] (1)芽孢杆菌培养基
[0035] 芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0±0.2。110-121℃灭菌20-30min。
[0036] 芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐液态培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖5.0g/L，FeCl2·6H2O 0.07g/L，MnC12·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，pH 6.5-7.0，110-121℃灭菌20-30min。
[0037] (2)酿酒酵母培养基
[0038] 酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100ml)：葡萄糖2g、酵母浸出物1g、蛋白胨2g、琼脂2g，pH值约6.0。
[0039] 摇瓶种子培养基和种子罐液态培养基：成分同斜面培养基，不加琼脂。
[0040] (3)二期玉米秸秆固态发酵培养基由一期发酵产物，加5-15％玉米秸秆粉组成(重量比)，含水量为40-50％(重量比)。首次启动二期发酵要制作酿酒酵母菌和芽孢杆菌液体种子液，以0.1-5％接种量(重量比，下同)接到一期秸秆发酵产物中。
[0041] (4)培养方法
[0042] 芽孢杆菌液体菌种培养：
[0043] 无菌条件下分别将4℃保存的芽孢杆菌菌种，即地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)各接一环至斜面培养基中，32-37℃培养12-36h复苏菌种。再在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基，装液量100-300ml/L三角瓶，150-240r/min，28-38℃，培养12-24h，再各以0.1-1％的接种量接种到同一100L-1000L种子罐培养基混合扩大培养，150-240r/min，通气量为
20-50L/min，培养12-24h后制得复合芽孢杆菌液体种子，活菌总数为2×108cfu/ml以上。
20-50L/min，培养12-24h后制得复合芽孢杆菌液体种子，活菌总数为2×108cfu/ml以上。
[0044] 酵母菌液体菌种培养：
[0045] 无菌条件下分别将4℃保存的酿酒酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae)，接一环至斜面培养基中，28-38℃培养24-48h复苏菌种。再挑单菌落各在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基，装液量100-300ml/L三角瓶，150-240r/min，28-38℃，培养12-36h，再各以0.1-1％的接种量接种100L-1000L种子罐培养基扩大培养，150-240r/min，通气量为20-50L/min，培养24-48h后制得酿酒酵母液体种子，活菌总数8
为2×10cfu/ml以上。
为2×10cfu/ml以上。
[0046] 二期玉米秸秆固态发酵：
[0047] 上述一期玉米秸秆发酵活性产物通过输送带送到开放式大型搅拌罐上，添加5-15％(重量比)玉米秸秆粉组成二期发酵培养基，上述芽孢杆菌液体种子以0.1-5％(重量比)接种量，酿酒酵母菌液以0.1-5％接种量(重量比)，都接种到二期玉米秸秆发酵培养基中，充分搅拌，28-38℃好氧发酵12-72h，基本完成菌群演变，得到第一批二期玉米秸秆固态发酵产物。进入连续生产阶段，种子为上次第二期玉米秸秆发酵的剩余产物(活性固态菌剂)，按1-20％接种量(重量比)，接种到下次二期玉米秸秆发酵培养基中，这样循环接种利用。
[0048] (四)第三期玉米秸秆固态发酵
[0049] (1)乳酸菌培养基
[0050] MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
[0051] 摇瓶和种子罐乳酸菌种子液态培养基：大豆低聚糖2.25％、葡萄糖2.00％、蛋白胨1.25％、酵母粉1.25％、番茄汁6.50％、吐温80.10％、磷酸氢二钾0.20％。pH 6.5，1L的三角瓶装液量200ml。
[0052] 以上培养基配好后均在115-120℃条件下高压灭菌20-30min。
[0053] (2)三期发酵培养基
[0054] 在二期玉米秸秆固态好氧发酵后的产物上，加5-15％麸皮、米糠、白酒糟或醋糟，充分混匀，组成三期发酵培养基，含水量为33-40％。首次启动三期发酵要制作乳酸菌液体种子液，以0.1-3％接种量接到三期发酵培养基进行三期发酵。
[0055] (3)培养方法
[0056] 乳酸菌液态种子培养：
[0057] 将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)，乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)等在MRS斜面培养基上划线活化，在33-38℃培养24-72h进行复壮，并形成单菌落，再各挑取单菌落，接种到摇瓶乳酸菌种子培养基，通入氮气，35-38℃静置培养24-72h，定时取样，测定生物量。再各按0.1-1％接种量(重量比)接种到种子罐乳酸菌种子培养基，通入氮气，静置混合培养24-60h，定时取样，测定生物量，活菌总数为5×108cfu/ml以上。
[0058] 第三期玉米秸秆固态发酵：
[0059] 在三期玉米秸秆固态发酵培养基上，以0.1-3％接种量(重量比)接种乳酸菌种子液到三期发酵培养基上，经开放式大型搅拌罐中充分搅拌后，尽快装入单向膜厌氧袋、厌氧桶或厌氧池中常温下保存，即进行三期厌氧发酵，含水量33-40％，(重量比)产品保质期可达1到2年，保存二到三个星期活菌数达到高峰，可达1亿cfu/g固体。
[0060] 进入连续发酵阶段，三期发酵二个星期后，以此成品为种子，按1-10％接种量(重量比)，接到上述三期玉米秸秆固态发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋、厌氧桶或厌氧池，常温下保存，即进行三期厌氧发酵。
[0061] 本发明有明显的以下优点：
[0062] (1)技术集成度高，产品附加值高。玉米秸秆经粉碎及添加自制的白腐菌高活性菌酶制剂，经系列木质纤维素降解菌和益生菌三步发酵成成品，木质素大幅度降低，真蛋白从3.5％提高到12％以上，只需添加一定的能量饲料，就可以用于反刍动物，基本不需很贵的蛋白精料，产品品质明显好于青贮，保质期一年以上。由于成品不需要干燥处理，活菌数极高，酶量丰富，杂菌极少，木质纤维素已大幅度降解，也可以10％添加量用于单位动物，饲养效果明显：大幅度提高饲料利用率，提高产量，改善肠道环境，提高免疫力和抵抗力，代替抗生素，改善肉质。
[0063] (2)设备投资少，但适合大规模产业化。秸秆饲料靠一般小农作坊实行不太现实，多少年来一直得不到真正推广，本发明秸秆不需要蒸煮或汽爆预先处理，只是种子罐才需要纯种培养，生产物料不需要高温灭菌处理，可以好氧粗放式大规模发酵，厌氧发酵灵活化，产品不需干燥处理，因此设备投资少，适合大规模化生产。
[0064] (3)产品成本低，市场规模和潜力巨大。本发明固体原料价格低廉，不需高温灭菌，基本不需要购买木质素酶、纤维素酶制剂来降解木质纤维质原料，成品不需要干燥处理。本玉米秸秆饲料产品的原料为170元每吨，包括前处理是粉碎等，三个期发酵水、电40元每吨，人工费用80元每吨，添加麸皮、米糠、白酒糟或醋糟等为100元每吨，尿素等氮素及微量元素共计40元，菌种培养费用为40元每吨产品计，设备折旧和厂房租费为30元每吨产品计，本发明玉米秸秆饲料生产成本为500元每吨(自用)，如果是加上包装袋200元每吨，共计700元每吨(对外销售用)。含有12％真蛋白的生物饲料目前出售价格为2700元以上每吨，因此本产品利润空间及让利空间巨大。目前牛羊生物饲料市场几乎为空白，本产品是高蛋白活性粗饲料，几乎不需要添加蛋白饲料，只需添加能量饲料和预混料，可达60％以上的添加量，也可以10％添加量用于单位动物，所以市场空间巨大，真正解决农区养殖业的优质牧草缺乏的粗料瓶颈，促进中国反刍动物的大规模兴起，及工厂化生产。
[0065] (4)生产周期短，经济效益高。一般白腐菌生长慢，同木霉等共发酵时间也长，很容易染菌，所以白腐菌处理的秸秆无法产业化。本发明秸秆饲料，采用生长极快的脉孢霉作为主要菌种，并接种量大，再加产木质素酶的米曲霉和木霉为辅助菌种，另外大接种量添加单独预先培养的白腐菌，加上粗糙脉孢霉产漆酶和好食脉孢霉产锰酶的协同，及激活剂的促进作用，木质素降解快速明显，除了制种时间多几天外，生产周期很短，一般一期发酵为2天，二期发酵为1天，三期发酵就是库存期(二到三星期)，实际上共为3天的生产期，销售得当时，周转周期为二到四星期，资金周转快，加上产品成本低，售价高，经济效益极高。
[0066] (5)明显的生态和社会效益。本发明化废为宝，同时消除栏舍恶臭，有利于消除农副业和养殖业的污染，增加养殖业和饲料业的收入，改善肉质，提高肉产量，降低粮食饲用，解决三农问题和民生问题，及食品安全和粮食安全问题，因此本发明是具有明显的生态和社会意义，符合国家绿色发展方向的朝阳产业。
具体实施方式
[0067] 本发明所有菌种为普通常规的商品化菌株，可在中国各大微生物菌种保藏管理中心或市场上购买到。
[0068] 下述实施案例中所用的菌种仅为举例说明，不是对本发明的限制，本发明保护范围中的菌种都实现发明目的。
[0069] 实施例1
[0070] 白腐菌菌酶制剂预生产
[0071] (1)白腐菌培养基。
[0072] 斜面培养基和平板培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，定容1L中，pH 5.0，110℃灭菌30min。接种37℃培养4天。
[0073] 种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3g，麦芽汁或葡萄糖3g，酒石酸氨1g，定容于1L中，其中FeSO4·7H2O、ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O和CoCl2各0.001％(重量比)，pH 5.5。500ml三角瓶中加100ml培养基，110℃灭菌30min。
[0074] 白腐菌固态发酵种子培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆(20mm以下)占培养基的80％(以干料计)，麸皮15％，酒石酸胺、硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占0.3％，CaCO3占1％，KH2PO4占1％，MgSO4、Mg(NO3)2、或MgCl2占0.05％，FeSO4.7H2O 0.0.01％。ZnSO4、CuSO4·5H2O、MnSO4.4H2O、CoCl2、NaMoO4各占0.001％，吐温80占0.1％，藜芦醇(3,4-二甲氧基苯甲醇,Veratryl alcohol)0.025％，草酸0.05％，培养基最终含水量为55％，用柠檬酸调整到pH 5.5。
[0075] (2)培养方法
[0076] 将一种典型白腐菌，即黄孢原毛平革菌(Phanerochaete chrysosporium,CICC40719)在斜面培养基上划单菌落复壮，再挑选强壮的单菌落，各接种在新的白腐菌斜面培养基35℃生长，斜面培养基菌种中的孢子用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中，装液量200ml/L三角瓶，220r/min，37℃，培养48h，再各以0.1％(V/V)接种量，混合转接到200L的种子罐中，于37℃，200r/min通无菌空气培养48h，活菌总数为3×107cfu/ml以上，再以4％接种量(重量)转接到上述白腐菌固态发酵种子培养基(气相双动态固态发酵罐)，充分搅拌后，37℃，通气发酵120h，获得固态发酵白腐菌菌酶制剂。
[0077] 实施例2
[0078] 第一期玉米秸秆发酵
[0079] (1)脉孢霉等纤维降解菌种子培养基和生产培养基
[0080] 脉孢霉等斜面培养基和平板培养基：马铃薯200g，蔗糖20g，琼脂20g，定容1L中，pH 5.0，110℃灭菌30min。接种32℃培养2天。
[0081] 脉孢霉等种子液体培养基：KH2PO4 2g，MgSO4 0.3g，CaCl2 0.3g，蛋白胨5g，酵母浸膏3g，麦芽汁或红糖3g，硫酸氨或尿素5g，FeSO4·7H2O 0.005g，ZnSO4 0.0014g，MnSO4·4H2O 0.0016g，CoCl20.002g，定容于1L中，pH 5.0。500ml三角瓶中加100ml培养基，110℃灭菌
30min。
30min。
[0082] 产朊假丝酵母菌等斜面培养基和平板菌种培养基(100ml)：葡萄糖2g，酵母浸出物1g，蛋白胨1g，尿素1g，琼脂2g，pH值约6.0。
[0083] 产朊假丝酵母液态培养基：成分同斜面培养基，不加琼脂。
[0084] 脉孢霉等固态发酵种子培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米(20mm以下)占培养基的86％(以干料计)，麸皮占10％，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占1％，尿素0.5％，碳酸钙占1％，磷酸二氢钾占0.5％，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.05％，培养基最终含水量为55％。
[0085] 玉米秸秆发酵培养基：按重量计，切割、揉丝、粉碎后的玉米秸秆(20mm以下)占培养基的90％(以干料计)，麸皮2％，硝酸氨、硫酸氨或氯化氨占2％，尿素2.5％，碳酸钙占2％，磷酸二氢钾占1％，硫酸镁、硝酸镁、或氯化镁占0.2％。FeSO4.7H2O，ZnSO4 0.0014g，CuSO4·5H2O 0.0015g，MnSO4.4H2O 0.0016g，CoCl2，NaMoO4各占0.001％，0.1％吐温80，培养基最终含水量为55％，用柠檬酸调整到pH 5.5。
[0086] (2)培养方法
[0087] 将粗糙脉孢霉(Neurospora crassa,CGMCC3.1600)、好食脉孢霉(Neurospora sitophila,CGMCC3.1618)、间型脉孢霉(Neurospora intermedia,CGMCC 3.591)、米曲霉(Aspergillus oryzae var.effusus CGMCC 3.2825)、木霉(Trichoderma sp.CICC 40261)分别在斜面培养基上划单菌落复壮，再分别挑选强壮的单菌落，各接种在新的脉孢菌等斜面培养基35℃生长，斜面培养基菌种中的孢子分别用无菌水洗下接种于摇瓶培养基中，装液量200ml/L三角瓶，220r/min，35℃，培养36h，再各以0.3％(V/V)接种量(粗糙脉孢霉、好食脉孢霉、间型脉孢霉、米曲霉、木霉比例为3:3:2:1:1)，混合转接到200L的种子罐中，于35℃，200r/min培养24h，活菌总数为1×107cfu/ml以上。再以3％接种量(重量)转接到上述脉孢霉等固态发酵种子培养基，充分搅拌后，35℃，发酵48h，作为固态发酵生产种子。
[0088] 热带假丝酵母(Candida tropicalis,CGMCC 2.637)，产朊假丝酵母(Candida utilis,CGMCC 2.1180)在上述酵母液态培养基上培养放大。
[0089] 脉孢霉等固态发酵生产混合种子以3％接种量(重量)接种到上述玉米秸秆发酵培养基，另加0.3％上述酵母液，及5％上述自制白腐菌菌酶制剂，和0.03％的商品漆酶(苏柯汉，酶活力:380LCU/g，下同)，充分搅拌后，移入发酵室通气规模发酵(室内分层通气、散热)，35℃发酵48h，完成一期发酵。进入连续生产阶段，一期固态发酵接种生产种子为上次一期秸秆预处理发酵后的固态菌剂，按7％接种量接种，另加7％新鲜的白腐菌菌酶制剂，0.03％的商品漆酶，再充分搅拌后好氧发酵。
[0090] 实施例3
[0091] 第二期玉米秸秆发酵
[0092] (1)芽孢杆菌培养基
[0093] 芽孢杆菌斜面和平板菌种培养基：蛋白胨10g，牛肉膏粉5g，氯化钠5g，琼脂15g，葡萄糖20g，蒸馏水1000ml，最终pH7.0±0.2。121℃灭菌20min.
[0094] 芽孢杆菌摇瓶种子培养基和种子罐培养基：牛肉膏5.0g/L，蛋白胨20.0g/L，葡萄糖5.0g/L，FeCl2·6H2O 0.07g/L，MnC12·7H2O 0.01g/L，MgSO4·7H2O 0.15g/L，pH 6.5-7.0，110-121℃灭菌20min。
[0095] (2)酿酒酵母培养基
[0096] 酵母菌斜面培养基和平板菌种培养基(100ml)：葡萄糖2g，酵母浸出物1g，蛋白胨2g，琼脂2g，pH值约6.0。
[0097] 摇瓶种子培养基和液态种子罐培养基：成分同斜面培养基，不加琼脂。
[0098] (3)二期玉米秸秆固态发酵培养基由一期发酵产物，加5％玉米秸秆粉组成，含水量为50％。首次启动二期发酵要制作酿酒酵母菌和芽孢杆菌液体种子液，以0.5％接种量接到一期秸秆发酵产物中。
[0099] (4)培养方法
[0100] 芽孢杆菌液体菌种培养：
[0101] 无菌条件下分别将4℃保存的芽孢杆菌菌种，即地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis,CGMCC 1.813)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis,CGMCC 1.884)各接一环至斜面培养基中，37℃培养24h复苏菌种。再在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述芽孢杆菌摇瓶种子培养基，装液量200ml/L三角瓶，220r/min，37℃，培养16h，再各以0.1％的接种量接种到同一200L种子罐培养基混合扩大培养，220r/min，通气量为50L/min，培养16h后制得复合芽孢杆菌液体种子，活菌总数为2×108cfu/ml以上。
[0102] 酵母菌液体菌种培养：
[0103] 无菌条件下分别将4℃保存的酿酒酵母菌种(Saccharomyces cerevisiae,CGMCC 2.1527)，接一环至斜面培养基中，32℃培养24h复苏菌种。再挑单菌落各在平板上划单菌落，挑取健壮种子，分别接种到上述酵母菌摇瓶种子培养基，装液量200ml/L三角瓶,220r/min，32℃，培养16h，再以各以0.2％的接种量接种200L种子罐培养基扩大培养，220r/min，通气量为30L/min，培养24后制得酿酒酵母液体种子，活菌总数为2×108cfu/ml以上。
[0104] 二期玉米秸秆固态发酵：
[0105] 上述一期玉米秸秆发酵活性产物通过输送带送到开放式大型搅拌罐上，添加5％玉米秸秆碎粉组成二期发酵培养基，上述芽孢杆菌液体种子以0.5％接种量，酿酒酵母菌液以0.5％接种量，都接种到二期玉米秸秆发酵培养基中，充分搅拌，35℃好氧发酵18h，基本完成菌群演变，得到第一批二期玉米秸秆固态发酵产物。进入连续生产阶段，种子为上次第二期玉米秸秆发酵的剩余产物(活性固态菌剂)，按5％接种量，接种到下次二期玉米秸秆发酵培养基中，这样循环接种利用。
[0106] 实施例4
[0107] 第三期玉米秸秆固态发酵
[0108] (1)乳酸菌培养基
[0109] MRS斜面培养基(g/L)：蛋白胨10，酵母粉5，牛肉膏5，葡萄糖20，柠檬酸二铵2，吐温80 1.0ml，乙酸钠25，K2HPO4 2，MgSO4·7H2O 0.58，MnSO4·4H2O 0.25，琼脂20，pH 7.0。
[0110] 摇瓶和种子罐乳酸菌种子液态培养基：大豆低聚糖2.25％、葡萄糖2.00％、蛋白胨1.25％、酵母粉1.25％、番茄汁6.50％、吐温80.10％、磷酸氢二钾0.20％。pH 6.5，1L的三角瓶装液量200ml。
[0111] 以上培养基配好后均在120℃条件下高压灭菌20min。
[0112] (2)三期发酵培养基
[0113] 在二期玉米秸秆固态好氧发酵后的产物上，加15％麸皮，充分混匀，组成三期发酵培养基，含水量为34％。首次启动三期发酵要制作乳酸菌液体种子液，以0.5％接种量接到三期发酵培养基进行三期发酵。
[0114] (3)培养方法
[0115] 乳酸菌液态种子培养：
[0116] 将植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum,CGMCC 1.557)，保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus,CGMCC 1.1482)，嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus,CGMCC 1.2467)，乳酸乳杆菌(Lactobacillus lactis,CGMCC 1.2467)，干酪乳杆菌(Lactobacillus casei,CGMCC 1.62)在MRS斜面培养基上划线活化，在37℃培养36h进行复壮，并形成单菌落，再各挑取单菌落，分别接种到摇瓶乳酸菌种子培养基，通入氮气，37℃静置培养36h，定时取样，测定生物量。再各按0.1％接种量接种到种子罐乳酸菌种子培养基，通入氮气，混合静置培养48h，定时取样，测定生物量，活菌总数为5×108cfu/ml以上。
[0117] 第三期玉米秸秆固态发酵：
[0118] 在三期玉米秸秆固态发酵培养基上，以0.5％接种量接种乳酸菌种子液到三期发酵培养基上，开放式大型搅拌罐中充分搅拌后，尽快装入单向膜厌氧袋，即进行三期厌氧发酵，含水量34％，产品保质期可达1到2年，保存二到三个星期益生菌活菌数达到高峰，可达1亿cfu/g固体。其中25℃放置二星期后产品经测定，结果如表一。
[0119] 进入连续发酵阶段，三期发酵二个星期后，以此成品为种子，按3％接种量，接到上述三期玉米秸秆固态发酵培养基中，搅拌充分后，装入单向膜厌氧袋，常温下保存，即进行三期厌氧发酵，得到产品。
[0120] 表一 三步发酵前后玉米秸秆生物粗饲料主要成份测定
[0121]
[0122] 实施例5
[0123] 本发明生物饲料的饲用效果
[0124] 江苏省丹阳市访仙镇访东村羊场进行湖羊饲用试验，挑选体重和状况相近的4月龄湖羊，随机分为试验组和对照组，每组各10头，公母各半并去势。试验期为60d，预饲期10d内进行体内外驱虫、健胃，预饲期与试验期管理相同，试验期开始清晨空腹开始称重，试验期结束时清晨空腹称重。每只试验羊均为单栏饲喂，自由饮水，采食控制，全期精粗干料比约为1:3，精料全期以日均0.4kg左右为标准，前期少后期多，适量变化，对照组精料A由玉米、豆粕、麸皮和预混料等组成，精料A价格2500元每吨，试验组精料B为精料A的15％豆粕被15％玉米代替，即精料B的能量更多些，蛋白少些，精料B价格为2350元每吨，对照组粗料为玉米青贮秸秆(70％水份)价格为450元每吨，试验组粗料为本发明微生物粗饲料(35％水份)价格为500元每吨，记录每只羊每天采食量，每天早晨清扫食槽，观察是否有剩料，记录剩料量，做到不剩料，更不浪费料！试验结果如表二。
[0125] 表二 本发明玉米秸秆生物饲料的湖羊饲喂效果
[0126]
[0127] 从上表看出玉米黄秸秆生物饲料和玉米青贮秸秆按干料算平均日耗干粗料几乎是一样的，平均日耗精料也很接近，但平均日增重还是玉米黄秸秆生物饲料高些(0.018kg/日·头)kg，可能因为木质素已大部分降解有关。总体上讲，玉米黄秸秆生物饲料组增重1kg的饲料成本只是玉米青贮秸秆组的62.38％，按饲料成本占养殖成本的65％算，玉米黄秸秆
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