蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途
阅读：115发布：2021-04-12
专利汇可以提供蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种蛋白酶抗性的人睫状神经营养因子突变体。该突变体是由天然人睫状神经营养因子突变而成，所说的突变包括其第13位和第14位 氨 基酸残基单独或同时突变为除精氨酸残基以外的任意氨基酸残基。该突变体可在 酵母 表达系统实现高效表达。与 现有技术 相比，本发明的突变体具有更高的 生物 活性和临床应用前景，在生物医药领域中具有广泛的用途。，下面是蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途专利的具体信息内容。
1.一种蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体，其特征在于该突变体是 由天然人睫状神经营养因子突变而成，所说的突变包括其第13位和第14位 氨基酸残基单独或同时突变为除精氨酸残基以外的任意氨基酸残基。
2.权利要求1所述的蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体，其特征在 于所说的第13和第14位氨基酸残基为赖氨酸、亮氨酸或丙氨酸残基。
3.权利要求1所述的蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体，其特征在 于该突变体具有序列表中序列鉴定号1所示的氨基酸序列。
4.一种表达载体，其特征在于它含有编码权利要求3所述氨基酸序列的 DNA序列。
5.一种宿主细胞，其特征在于它含有权利要求4所述的表达载体。
6.权利要求5所述的宿主细胞，其特征在于该宿主细胞是甲醇酵母细胞。
7.权利要求6所述的宿主细胞，其特征在于所说的甲醇酵母细胞是巴斯 德毕赤酵母。
8.权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于该宿主细胞基因组中整合有 编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列，而且在所说的编码人睫状神经 营养因子突变体的DNA序列的5′端上游与巴斯德毕赤酵母菌来源的5′调控 区可操作地相连，所说的5′调控区包含内含启动子元件和Kozak序列增强子 元件，所说的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列的3′端下游与甲 醇酵母来源的3′终止序列可操作地相连。
9.权利要求8所述的宿主细胞，其特征在于所说的5′调控区选自以下基 因的5′调控区：毕赤酵母来源的醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因、3-磷酸甘 油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、二羟基丙酮合成酶(DAS1) 基因或组氨醇脱氧酶(HIS4)基因；所说的3′终止序列选自以下基因的3′终止 序列：巴斯德毕赤酵母来源的AOX1基因、AOX2基因、p40基因和His4基 因。
10.权利要求9所述的宿主细胞，其特征在于在所说的编码人睫状神经 营养因子突变体的DNA序列与5′调控区之间，还含有酿酒酵母来源的α-交 配因子基因引导肽序列的编码序列。
11.权利要求8、9、10所述的宿主细胞，其特征在于所说的Kozak序列 增强子元件为AAACGATG。
12.权利要求11所述的宿主细胞，其特征在于所说的宿主细胞包括Mut- 和Mut+表型。
13.一种生产权利要求1、2或3所述的人睫状神经营养因子突变体的方 法，其特征在于它包括以下步骤：
(a)在适合表达人睫状神经营养因子突变体的条件下，用生物反应器培养 权利要求5所说的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出人睫状神经营养因子突变体。
14.权利要求13所述的方法，其特征在于在步骤(a)中，培养密度为 500-800个OD600，每升菌体干重为100-300克，人睫状神经营养因子突变体 的表达量大于100mg/L。
15.权利要求13所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，用甲醇诱导表 达4～8天。
16.权利要求1、2或3所述的蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体在 生物医药中的用途。
技术领域
本发明涉及一种神经营养因子，具体涉及蛋白酶抗性人睫状神经营养因 子突变体，还涉及该突变体在甲醇酵母细胞中的生产方法和在医药领域中的 用途。
背景技术
睫状神经营养因子(ciliary neurotrophic factor，CNTF)是一种具有多种生 物学功能的细胞因子：CNTF能促进感觉神经元、运动神经元、大脑神经元 和海马神经元的存活；CNTF能够促进交感神经元的胆碱能分化及使神经胶 质祖细胞分化为星形胶质细胞；CNTF能够促进少突胶质细胞的成熟和存活； 另外有一些外周组织如骨骼肌也对CNTF有反应(Sleeman，M.W.，et al. Pharma.Acta.Helv.，2000，74：265-272。本文献及在本申请中所引用的其它文献 都作为本发明的参考解释资料，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那 样。)。重组人CNTF(rhCNTF)曾被用来治疗肌萎缩侧索硬化症(ALS)，但 因副反应太大及疗效不确切而终止了临床实验。最近研究表明CNTF可通过 激活位于下丘脑的受体而对机体的体重设定点(set-point)进行调节，从而起 到减少摄食，减轻体重的作用。为研制出生物活性更高、不良反应更少，可 用于临床的CNTF，研究人员开始研究开发CNTF突变体。AX15是由 Regeneron公司发明的一个CNTF三重突变体：17位的Cys被Ala替换，63 位的Gln被Arg替换，缺失了C末端的15个氨基酸。与天然CNTF相比， AX15具有更高的生物学活性，更好的稳定性和可溶性。目前，AX15作为生 物制品在美国已完成适应症为肥胖症的III期临床实验，并且临床实验结果经 统计学分析显示具有显著性差异。
酵母表达系统的载体-宿主系统分附加体型与整合型两种表达方式。附加 体型的重组质粒存在于酵母的细胞质内，重组质粒内有自主复制序列 (autonomously replicating sequence，ARS)。可在酵母细胞内自主复制，并在启 动子元件调控下表达外源基因，但这种重组质粒在酵母宿主细胞芽殖分裂、 世系传代中容易丢失，因而往往难以用工业化大型发酵罐来放大生产。整合 型表达质粒是以线形化质粒或环形质粒形式通过同源重组方法整合到酵母的 基因组内(单拷贝或多拷贝整合)，然后随着酵母宿主菌染色体的复制而复制， 外源目的基因在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失，另外目的基因在酵母启 动子元件的调控下进行表达的过程同酵母菌自身基因表达的过程一样，是在 细胞核内转录出hnRNA，经过修饰和加工成为mRNA，并穿越核膜到达细胞 质与核糖体结合，再表达目的基因的。整合型表达方式适合用工业化大型发 酵罐来进行发酵生产。另一方面，酵母作为工业微生物的重要宿主菌，在工 业发酵方面已积累了大量的经验。酵母宿主菌为巴期德毕赤酵母，它是一种 工业酵母菌种，70年代以来被用于生产单细胞蛋白(single cell protein，SCP)。 由于它可利用甲醇作为唯一的碳源和能源，因而在工业微生物中称其为嗜甲 醇酵母(Methylotrophic yeast)或直接称为甲醇酵母。甲醇酵母目前被用来作为 基因工程表达系统的还有多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假丝 酵母(Candida boidinii)等。甲醇酵母一般都有发酵密度高、蛋白质分泌能力强、 外源基因表达水平高和糖基化修饰更接近高等真核生物等优点，是目前国际 生物技术领域中最为理想的真核微生物表达系统。尤其是巴斯德毕赤酵母、 多形汉逊酵母几种酵母菌在大型发酵罐高细胞密度发酵培养方面已有相当成 熟的生产工艺。因此，用低等真核生物酵母表达系统表达外源基因具有许多 产业上的优点：能将基因工程产物直接分泌到培养基内，而培养基内是氧化 环境有利于二硫键形成，有利于表达出天然构象的蛋白质分子。例如，1982 年用酿酒酵母表达大分子量蛋白乙型肝炎表面抗原(作为基因工程疫苗)获得 成功(Valenzuela P，et al.Nature1982，298：347-350)，并批准上市。
基于以上因素，酵母表达系统已经成为目前国际上开发基因工程人睫状 神经营养因子很有价值的表达系统。然而，在用巴斯德毕赤酵母表达AX15 时发现，AX15易被降解，因此迫切需要构建一种蛋白酶抗性人睫状神经营养 因子突变体。
酵母表达系统的载体-宿主系统分附加体型与整合型两种表达方式。附加 体型的重组质粒存在于酵母的细胞质内，重组质粒内有自主复制序列 (autonomously replicating sequence，ARS)。可在酵母细胞内自主复制，并在启 动子元件调控下表达外源基因，但这种重组质粒在酵母宿主细胞芽殖分裂、 世系传代中容易丢失，因而往往难以用工业化大型发酵罐来放大生产。整合 型表达质粒是以线形化质粒或环形质粒形式通过同源重组方法整合到酵母的 基因组内(单拷贝或多拷贝整合)，然后随着酵母宿主菌染色体的复制而复制， 外源目的基因在酵母世系传代趋于稳定，不易丢失，另外目的基因在酵母启 动子元件的调控下进行表达的过程同酵母菌自身基因表达的过程一样，是在 细胞核内转录出hnRNA，经过修饰和加工成为mRNA，并穿越核膜到达细胞 质与核糖体结合，再表达目的基因的。整合型表达方式适合用工业化大型发 酵罐来进行发酵生产。另一方面，酵母作为工业微生物的重要宿主菌，在工 业发酵方面已积累了大量的经验。酵母宿主菌为巴期德毕赤酵母，它是一种 工业酵母菌种，70年代以来被用于生产单细胞蛋白(single cell protein，SCP)。 由于它可利用甲醇作为唯一的碳源和能源，因而在工业微生物中称其为嗜甲 醇酵母(Methylotrophic yeast)或直接称为甲醇酵母。甲醇酵母目前被用来作为 基因工程表达系统的还有多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)和博伊丁假丝 酵母(Candida boidinii)等。甲醇酵母一般都有发酵密度高、蛋白质分泌能力强、 外源基因表达水平高和糖基化修饰更接近高等真核生物等优点，是目前国际 生物技术领域中最为理想的真核微生物表达系统。尤其是巴斯德毕赤酵母、 多形汉逊酵母几种酵母菌在大型发酵罐高细胞密度发酵培养方面已有相当成 熟的生产工艺。因此，用低等真核生物酵母表达系统表达外源基因具有许多 产业上的优点：能将基因工程产物直接分泌到培养基内，而培养基内是氧化 环境有利于二硫键形成，有利于表达出天然构象的蛋白质分子。例如，1982 年用酿酒酵母表达大分子量蛋白乙型肝炎表面抗原(作为基因工程疫苗)获得 成功(Valenzuela P，et al.Nature1982，298：347-350)，并批准上市。
基于以上因素，酵母表达系统已经成为目前国际上开发基因工程人睫状 神经营养因子很有价值的表达系统。然而，在用巴斯德毕赤酵母表达AX15 时发现，AX15易被降解，因此迫切需要构建一种蛋白酶抗性人睫状神经营养 因子突变体。
发明内容
为提供一种蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体，本发明的发明人经 过深入而广泛的研究，根据AX15在巴斯德毕赤酵母宿主细胞中表达时降解 发生的位点，令人意外地获得了蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体。该 突变体通过使天然人睫状神经营养因子的第13位和第14位氨基酸残基单独 或同时发生突变而成。所说的第13位和第14位氨基酸残基可突变为除精氨 酸残基以外的任意氨基酸残基，优选突变为赖氨酸、亮氨酸或丙氨酸残基。 序列表中序列鉴定号1所示的氨基酸序列代表本发明的突变体之一。
本发明的发明人通过创造性的研究，实现了人睫状神经营养因子突变体 在酵母细胞中的高效表达。
本发明的重组人睫状神经营养因子突变体优选用甲醇酵母工程菌系统进 行大规模生产：一种至少被整合有一个拷贝的含有人睫状神经营养因子突变 体基因的重组质粒的工程菌，在摇瓶或发酵罐高密度发酵条件下，人睫状神 经营养因子突变体基因在一种甲醇诱导启动子的驱动下，将重组人睫状神经 营养因子突变体表达产物分泌到培养基内。
本发明的人睫状神经营养因子突变体的方法包括以下步骤：
(a)在适合表达人睫状神经营养因子突变体的条件下，用生物反应器培养 合适的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出人睫状神经营养因子突变体。
在步骤(a)中，培养密度为500-800个OD600，每升菌体干重为100-300 克，人睫状神经营养因子突变体的表达量大于100mg/L。
在步骤(a)中，用甲醇诱导表达4～8天。
本发明人还进一步对表达盒中的元件进行优化，尤其是在5′端增加了酵 母的内源性酶切位点，从而进一步提供了表达和分离效率。在此基础上，完 成了本发明。
为便于基因的分子克隆以及使表达的目的产物经酵母内源性蛋白酶加工 后，可以直接获得5′端无Met的人睫状神经营养因子突变体，从而大大简化 了后续的分离和纯化工艺，本发明的发明人在人睫状神经营养因子突变体的 5′端引入了限制性内切酶XhoI和酵母内源性蛋白酶KEX-2加工位点。优选 的酵母内源性酶切位点是LEKR。
方法中的将人睫状神经营养因子突变体基因插入质粒、转化酵母细胞、 酵母工程菌的筛选、工程菌的发酵、以及产物的分离等技术基本上按本领域 已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验指南(第三版) (New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。所用的原始菌株和质粒等生物材料均可通过市购获 得。
本发明的甲醇酵母表达载体内至少有一个上述的含有人睫状神经营养因 子突变体基因基因的表达盒和一种可供筛选的标记基因。这种重组表达载体 转化甲醇酵母宿主菌可用环状质粒形式或线性化位点特异性整合载体二种形 式。本发明优先选择线性化位点特异性整合载体，并优先用原生质体转化法 将重组表达载体定点整合到甲醇酵母(如巴斯德毕赤酵母等)基因组上特异性 位点的基因座内(如整合到AOX1基因或HIS4基因位点)，本发明所涉及的生 产人睫状神经营养因子突变体基因的工程菌内至少稳定地整合有一个拷贝的 含上述表达盒的重组载体。
本发明人还发现，目的基因的ATG之前插入酵母来源的基因5′非编码区 的脱氧核苷酸(5-11聚脱氧寡核苷酸序列)能提高目的基因的表达量。插入的 脱氧寡聚核苷酸优先选择A和T碱基。在本发明中与人睫状神经营养因子突 变体基因ATG相连接的寡聚核苷酸序列优先来自巴斯德毕赤酵母的AOX1 和AOX2、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAP)、甲醛脱氢酶基因(formaldehyde dehydrogenase gene，FLD1)或二羟基丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase，DAS1)基因5′端 调控区序列。
几种调控序列被鉴定和证实，能用来在巴斯德毕赤酵母中表达人睫状神 经营养因子突变体。从巴斯德毕赤酵母基因组中克隆的醇氧化酶(AOX1和 AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、二羟 基丙酮合成酶(DAS1)基因和p40基因的5′调控区(启动子元件)能用来驱动 下游的人睫状神经营养因子突变体基因表达。本发明优先选择的5′调控区， 例如选择AOX1，AOX2、GAP、FLD1和DAS1等(Stroman DW，et al.US 4,855,231)。本发明最优先选择的5′调控区是选择AOX1启动子序列。
3′终止序列的功能是对编码的结构基因起终止、多聚腺苷化和稳定 mRNA的作用。任何本领域常用的3′终止序列都可用于本发明，例如来源于 汉逊多形酵母和巴斯德毕赤酵母的3′终止序列。优先采用那些从巴斯德毕赤 酵母菌来源的3′终止序列，例如AOX1基因、AOX2基因、DAS1基因、p40 基因和His4基因的3′终止序列，特别优先选择AOX13′终止序列。
在本发明中，构建好的人睫状神经营养因子突变体基因克隆到一种合适 的巴斯德毕赤酵母分泌性表达和胞内表达载体上，如pPIC9、pPIC9K、pPIC3、 pPIC3K、pAO804、pAO815、pHIL-S1、pHIL-D2、pHWO10、pPICZ、pPICZα、 pGAPZ、pGAPZα、pYAM7SP6等。本发明优先选择用pPIC9与pPIC9K分泌 性表达质粒作为表达载体。
将上述构建完成的重组质粒直接或经线性化后转化到巴斯德毕赤酵母宿 主菌细胞，其中较成熟的转化技术有，如用氯化锂的化学转化方法(Ito，et al.J Bacteriol.1983，153：163-168)；电穿孔转化方法(Bio-Rad laboratories 1991，Gene pulser transfection apparatus operating instruction and applications guide.)；原生 质体转化方法(Cregg JM，et al.Mol.Cell Biol.1985，5：3376-3385)。在本发明科 研中优先选择Cregg等人提供的原生质体转化方法，重组质粒线性化和鉴定重 组载体整合用Southern杂交技术。
本发明用于作为基因工程宿主菌是甲醇酵母。甲醇酵母包括假丝酵母 (Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)四 个属，其中所有甲醇酵母菌株均可用来作为本发明人睫状神经营养因子突变 体基因的表达的宿主菌。在本发明中优先选择巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵 母，尤其是优先选择营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS115(NRRLY-15851)， GS190(NRRLY-18014)，PPFI(NRRLY-18017)，KM71和蛋白酶缺陷型巴斯德毕 赤酵母菌株SMD1168(pep4Δhis4(Mut+his-))，这些菌株的微生物学特性已 被详细地描述(U.S.patent 4,818,700和U.S.patent 4,812,405)。本发明人还发 现，营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株还有便于筛选、重组和转化的作用。
野生型巴斯德毕赤酵母菌株如NRRLY-11430和NRRLY-11431也能直接 作为本发明人睫状神经营养因子突变体基因的宿主菌，只要在表达载体上克 隆一个可供筛选的标记基因(如SUC2基因和neo基因等)，这样重组载体转 化野生型毕赤酵母菌株后，其中转化子便能在含蔗糖的培养基或含有G418 抗生素的培养基上生长，而非转化子则不能在此类培养基上生长，这样就能方 便地筛选出重组转化子。
在本发明一个优选例中，用醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因偏爱密码子替 换酿酒酵母α交配基因的信号肽序列(也可用其他酵母宿主菌来源的信号肽序 列和人工合成的嵌合信号肽序列)，在人睫状神经营养因子突变体基因ATG 前面插入5聚脱氧寡聚核苷酸(AAACGATG)，其中内含有真核基因保守的 kozak序列AXXATGG(Kozak M.Nucleic Acids Res.1987，15：8 125-8148；Kozak M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87：8301-8305)；在基因5′端插入酿酒酵母 KEX-2蛋白酶加工位点(Leu-Glu-Lys-Arg)的基因序列，目的基因与酿酒酵母 来源的α-交配因子(alpha-mating factor，α-MF)Prepro序列(编码85个氨基酸的 基因序列)构成嵌合基因。这两种基因片段再与上游巴斯德毕赤酵母的AOX1 基因5′调控区(pichia pastoris AOX1 5′regulation region)相连接，在AOX1调控 区内含有启动子元件和增强子元件。
在另一优选例中，本发明将适合于毕赤酵母宿主菌表达的人睫状神经营 养因子突变体基因克隆至pPIC9表达载体等的AOX1 5′调控区和AOX1 3′终 止序列的中间，校正阅读框架，在表达载体上构成一个表达盒(expression cassette)，再将这种基因重组的表达载体(可以是环状的或线性化的)通过原生 质体转化法，转化毕赤酵母菌原生质体，进而将表达盒稳定地整合到宿主菌 的基因组内(即染色体上)。该表达盒AOX1 5′调控区或启动子用于增强人睫状 神经营养因子突变体及突变体mRNA转录的速率；AOX1 3′终止序列具有终 止人睫状神经营养因子突变体基因翻译和稳定mRNA转录产物的功能和作用 (如促使hnRNA加polyA尾等)。
在本发明中，为了大规模工业化生产基因重组人睫状神经营养因子突变 体产品，根据甲醇酵母，尤其是巴斯德毕赤酵母-整合型表达系统的微生物 特性，在发酵罐上制定了三阶段、高密度和分批补料的发酵工程的操作程序 (fermentation protocol)：1.第一阶段，也称为生长期，将上述筛选分离得到的 最高水平表达人睫状神经营养因子突变体的工程菌作为种子菌接菌在一种酵 母基础培养基(10 X Basal Salts+250 X PTM1+5％甘油)内，这种培养基内的 碳源为一种非诱导型碳源(如甘油)。当生长于含这种碳源的培养基时，这种甲 醇酵母工程菌表达外源基因被完全抑制，即只允许细胞分裂、增殖，细胞密 度增加，而外源基因不被表达，在生长相培养基的pH维持在3-6。2.第二阶 段，这是短暂的时期，非诱导型碳源逐渐消耗贻尽诱导型碳源(甲醇)缓慢地开 始补入发酵罐，发酵罐内的细胞密度在进一步增加，甲醇反应启动子(methanol responsive promoter)的抑制状态在逐步解除。在这个阶段培养基的pH被逐步 调整到生产阶段的pH值，即一般在pH3-6范围内。3.第三阶段，也称生产 阶段，在这个阶段诱导型碳源甲醇开始加快补入发酵罐内，发酵罐内的细胞 密度有的就不再增加(如mut-菌株)，有的还稍有增加(如mut+菌株)，人睫状 神经营养因子突变体基因在甲醇反应启动子(如AOX1启动子)的调控下将基 因表达产物开始源源不断地分泌发酵培养基内，这种发酵方式称为限制甲醇 分批补料方式(limited methanol fed-batch mode)，在整个生产阶段发酵罐内 的甲醇浓度通过甲醇电极在线检测将其控制在0.5-0.9％的浓度范围内。本发 明发酵生产人睫状神经营养因子突变体，在第三阶段，即生产阶段，也可采 用混合补料方式(mixed feed fed-batch mode)，即非诱导型碳源甘油加诱导型碳 源甲醇按一定比例(2∶1)混合后逐渐补入发酵罐内，这种发酵方式的特点是， 发酵罐内的细胞密度在生产阶段还在进一步增加，含人睫状神经营养因子突 变体基因的表达盒在诱导型碳源甲醇诱导下将人睫状神经营养因子突变体分 泌到发酵培养基内。混合补料方式尤其适合用巴斯德毕赤酵母宿主菌作连续 发酵，持续生产目的基因产物人睫状神经营养因子突变体。
在本发明中，人睫状神经营养因子突变体产品在巴斯德毕赤酵母中获得 分泌性表达，表达产物直接分泌到培养基内，发酵液内分泌表达的水平高达 100mg/L，通过发酵生产工艺的优化，酵母工程菌还有进一步提高表达量的潜 力。
为实现高效表达，本发明还提供了一种表达载体，该表达载体含有编码 本发明上述的人睫状神经营养因子突变体的DNA序列。
本发明还提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的表达载体或上述的 编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列。该宿主细胞是甲醇酵母细胞， 优选巴斯德毕赤酵母。在其基因组中整合有编码人睫状神经营养因子突变体 的DNA序列，而且在所述的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列的 5′端上游与巴斯德毕赤酵母菌来源的5′调控区可操作地相连，所述的5′调控区 包含内含启动子元件和Kozak序列增强子元件；
所述的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列的3′端下游与甲醇 酵母来源的3′终止序列可操作地相连。
所述的5′调控区选自以下基因的5′调控区：毕赤酵母来源的醇氧化酶 (AOX1和AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因 (FLD1)、二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因或组氨醇脱氧酶(HIS4)基因；
所述的3′终止序列选自以下基因的3′终止序列：巴斯德毕赤酵母来源的 AOX1基因、AOX2基因、p40基因和His4基因。
在所述的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列与5′调控区之间， 还含有酿酒酵母来源的α-交配因子基因引导肽序列的编码序列。
所述的Kozak序列增强子元件为AAACGATG。
所述的宿主细胞包括Mut-和Mut+表型。
所述的宿主细胞包括在其染色体中整合有本发明编码人睫状神经营养因 子突变体的DNA序列的GS115和SMD1168等菌株。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
与现有技术相比，本发明的蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体具有 更高的生物活性和更好地临床应用前景。
附图说明
图1是一种酵母表达质粒pPIC9的结构图谱。
图2是AX15在巴斯德毕赤酵母中表达产物的电泳图。
图3是AX15降解位点的确定。
图4是AX15(R14K)基因的构建。
图5是AX15(R14K)在巴斯德毕赤酵母中表达产物的电泳图。
图6是AX15(R14K)的纯化过程。
图7是AX15(R14K)的活性测定。
本发明的发明人通过创造性的研究，实现了人睫状神经营养因子突变体 在酵母细胞中的高效表达。
本发明的重组人睫状神经营养因子突变体优选用甲醇酵母工程菌系统进 行大规模生产：一种至少被整合有一个拷贝的含有人睫状神经营养因子突变 体基因的重组质粒的工程菌，在摇瓶或发酵罐高密度发酵条件下，人睫状神 经营养因子突变体基因在一种甲醇诱导启动子的驱动下，将重组人睫状神经 营养因子突变体表达产物分泌到培养基内。
本发明的人睫状神经营养因子突变体的方法包括以下步骤：
(a)在适合表达人睫状神经营养因子突变体的条件下，用生物反应器培养 合适的宿主细胞；
(b)从培养物中分离出人睫状神经营养因子突变体。
在步骤(a)中，培养密度为500-800个OD600，每升菌体干重为100-300 克，人睫状神经营养因子突变体的表达量大于100mg/L。
在步骤(a)中，用甲醇诱导表达4～8天。
本发明人还进一步对表达盒中的元件进行优化，尤其是在5′端增加了酵 母的内源性酶切位点，从而进一步提供了表达和分离效率。在此基础上，完 成了本发明。
为便于基因的分子克隆以及使表达的目的产物经酵母内源性蛋白酶加工 后，可以直接获得5′端无Met的人睫状神经营养因子突变体，从而大大简化 了后续的分离和纯化工艺，本发明的发明人在人睫状神经营养因子突变体的 5′端引入了限制性内切酶XhoI和酵母内源性蛋白酶KEX-2加工位点。优选 的酵母内源性酶切位点是LEKR。
方法中的将人睫状神经营养因子突变体基因插入质粒、转化酵母细胞、 酵母工程菌的筛选、工程菌的发酵、以及产物的分离等技术基本上按本领域 已知的常规方法进行(例如Sambrook等人，分子克隆：实验指南(第三版) (New York：Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001)中所述的条件，或按照 制造厂商所建议的条件。所用的原始菌株和质粒等生物材料均可通过市购获 得。
本发明的甲醇酵母表达载体内至少有一个上述的含有人睫状神经营养因 子突变体基因基因的表达盒和一种可供筛选的标记基因。这种重组表达载体 转化甲醇酵母宿主菌可用环状质粒形式或线性化位点特异性整合载体二种形 式。本发明优先选择线性化位点特异性整合载体，并优先用原生质体转化法 将重组表达载体定点整合到甲醇酵母(如巴斯德毕赤酵母等)基因组上特异性 位点的基因座内(如整合到AOX1基因或HIS4基因位点)，本发明所涉及的生 产人睫状神经营养因子突变体基因的工程菌内至少稳定地整合有一个拷贝的 含上述表达盒的重组载体。
本发明人还发现，目的基因的ATG之前插入酵母来源的基因5′非编码区 的脱氧核苷酸(5-11聚脱氧寡核苷酸序列)能提高目的基因的表达量。插入的 脱氧寡聚核苷酸优先选择A和T碱基。在本发明中与人睫状神经营养因子突 变体基因ATG相连接的寡聚核苷酸序列优先来自巴斯德毕赤酵母的AOX1 和AOX2、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(glyceraldehydes-3-phosphate dehydrogenase gene，GAP)、甲醛脱氢酶基因(formaldehyde dehydrogenase gene，FLD1)或二羟基丙酮合成酶(dihydroxyacetone synthase，DAS1)基因5′端 调控区序列。
几种调控序列被鉴定和证实，能用来在巴斯德毕赤酵母中表达人睫状神 经营养因子突变体。从巴斯德毕赤酵母基因组中克隆的醇氧化酶(AOX1和 AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因(FLD1)、二羟 基丙酮合成酶(DAS1)基因和p40基因的5′调控区(启动子元件)能用来驱动 下游的人睫状神经营养因子突变体基因表达。本发明优先选择的5′调控区， 例如选择AOX1，AOX2、GAP、FLD1和DAS1等(Stroman DW，et al.US 4,855,231)。本发明最优先选择的5′调控区是选择AOX1启动子序列。
3′终止序列的功能是对编码的结构基因起终止、多聚腺苷化和稳定 mRNA的作用。任何本领域常用的3′终止序列都可用于本发明，例如来源于 汉逊多形酵母和巴斯德毕赤酵母的3′终止序列。优先采用那些从巴斯德毕赤 酵母菌来源的3′终止序列，例如AOX1基因、AOX2基因、DAS1基因、p40 基因和His4基因的3′终止序列，特别优先选择AOX13′终止序列。
在本发明中，构建好的人睫状神经营养因子突变体基因克隆到一种合适 的巴斯德毕赤酵母分泌性表达和胞内表达载体上，如pPIC9、pPIC9K、pPIC3、 pPIC3K、pAO804、pAO815、pHIL-S1、pHIL-D2、pHWO10、pPICZ、pPICZα、 pGAPZ、pGAPZα、pYAM7SP6等。本发明优先选择用pPIC9与pPIC9K分泌 性表达质粒作为表达载体。
将上述构建完成的重组质粒直接或经线性化后转化到巴斯德毕赤酵母宿 主菌细胞，其中较成熟的转化技术有，如用氯化锂的化学转化方法(Ito，et al.J Bacteriol.1983，153：163-168)；电穿孔转化方法(Bio-Rad laboratories 1991，Gene pulser transfection apparatus operating instruction and applications guide.)；原生 质体转化方法(Cregg JM，et al.Mol.Cell Biol.1985，5：3376-3385)。在本发明科 研中优先选择Cregg等人提供的原生质体转化方法，重组质粒线性化和鉴定重 组载体整合用Southern杂交技术。
本发明用于作为基因工程宿主菌是甲醇酵母。甲醇酵母包括假丝酵母 (Candida)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia)和球拟酵母(Torulopsis)四 个属，其中所有甲醇酵母菌株均可用来作为本发明人睫状神经营养因子突变 体基因的表达的宿主菌。在本发明中优先选择巴斯德毕赤酵母和多形汉逊酵 母，尤其是优先选择营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株GS115(NRRLY-15851)， GS190(NRRLY-18014)，PPFI(NRRLY-18017)，KM71和蛋白酶缺陷型巴斯德毕 赤酵母菌株SMD1168(pep4Δhis4(Mut+his-))，这些菌株的微生物学特性已 被详细地描述(U.S.patent 4,818,700和U.S.patent 4,812,405)。本发明人还发 现，营养缺陷型巴斯德毕赤酵母菌株还有便于筛选、重组和转化的作用。
野生型巴斯德毕赤酵母菌株如NRRLY-11430和NRRLY-11431也能直接 作为本发明人睫状神经营养因子突变体基因的宿主菌，只要在表达载体上克 隆一个可供筛选的标记基因(如SUC2基因和neo基因等)，这样重组载体转 化野生型毕赤酵母菌株后，其中转化子便能在含蔗糖的培养基或含有G418 抗生素的培养基上生长，而非转化子则不能在此类培养基上生长，这样就能方 便地筛选出重组转化子。
在本发明一个优选例中，用醇氧化酶(AOX1和AOX2)基因偏爱密码子替 换酿酒酵母α交配基因的信号肽序列(也可用其他酵母宿主菌来源的信号肽序 列和人工合成的嵌合信号肽序列)，在人睫状神经营养因子突变体基因ATG 前面插入5聚脱氧寡聚核苷酸(AAACGATG)，其中内含有真核基因保守的 kozak序列AXXATGG(Kozak M.Nucleic Acids Res.1987，15：8 125-8148；Kozak M.Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990，87：8301-8305)；在基因5′端插入酿酒酵母 KEX-2蛋白酶加工位点(Leu-Glu-Lys-Arg)的基因序列，目的基因与酿酒酵母 来源的α-交配因子(alpha-mating factor，α-MF)Prepro序列(编码85个氨基酸的 基因序列)构成嵌合基因。这两种基因片段再与上游巴斯德毕赤酵母的AOX1 基因5′调控区(pichia pastoris AOX1 5′regulation region)相连接，在AOX1调控 区内含有启动子元件和增强子元件。
在另一优选例中，本发明将适合于毕赤酵母宿主菌表达的人睫状神经营 养因子突变体基因克隆至pPIC9表达载体等的AOX1 5′调控区和AOX1 3′终 止序列的中间，校正阅读框架，在表达载体上构成一个表达盒(expression cassette)，再将这种基因重组的表达载体(可以是环状的或线性化的)通过原生 质体转化法，转化毕赤酵母菌原生质体，进而将表达盒稳定地整合到宿主菌 的基因组内(即染色体上)。该表达盒AOX1 5′调控区或启动子用于增强人睫状 神经营养因子突变体及突变体mRNA转录的速率；AOX1 3′终止序列具有终 止人睫状神经营养因子突变体基因翻译和稳定mRNA转录产物的功能和作用 (如促使hnRNA加polyA尾等)。
在本发明中，为了大规模工业化生产基因重组人睫状神经营养因子突变 体产品，根据甲醇酵母，尤其是巴斯德毕赤酵母-整合型表达系统的微生物 特性，在发酵罐上制定了三阶段、高密度和分批补料的发酵工程的操作程序 (fermentation protocol)：1.第一阶段，也称为生长期，将上述筛选分离得到的 最高水平表达人睫状神经营养因子突变体的工程菌作为种子菌接菌在一种酵 母基础培养基(10 X Basal Salts+250 X PTM1+5％甘油)内，这种培养基内的 碳源为一种非诱导型碳源(如甘油)。当生长于含这种碳源的培养基时，这种甲 醇酵母工程菌表达外源基因被完全抑制，即只允许细胞分裂、增殖，细胞密 度增加，而外源基因不被表达，在生长相培养基的pH维持在3-6。2.第二阶 段，这是短暂的时期，非诱导型碳源逐渐消耗贻尽诱导型碳源(甲醇)缓慢地开 始补入发酵罐，发酵罐内的细胞密度在进一步增加，甲醇反应启动子(methanol responsive promoter)的抑制状态在逐步解除。在这个阶段培养基的pH被逐步 调整到生产阶段的pH值，即一般在pH3-6范围内。3.第三阶段，也称生产 阶段，在这个阶段诱导型碳源甲醇开始加快补入发酵罐内，发酵罐内的细胞 密度有的就不再增加(如mut-菌株)，有的还稍有增加(如mut+菌株)，人睫状 神经营养因子突变体基因在甲醇反应启动子(如AOX1启动子)的调控下将基 因表达产物开始源源不断地分泌发酵培养基内，这种发酵方式称为限制甲醇 分批补料方式(limited methanol fed-batch mode)，在整个生产阶段发酵罐内 的甲醇浓度通过甲醇电极在线检测将其控制在0.5-0.9％的浓度范围内。本发 明发酵生产人睫状神经营养因子突变体，在第三阶段，即生产阶段，也可采 用混合补料方式(mixed feed fed-batch mode)，即非诱导型碳源甘油加诱导型碳 源甲醇按一定比例(2∶1)混合后逐渐补入发酵罐内，这种发酵方式的特点是， 发酵罐内的细胞密度在生产阶段还在进一步增加，含人睫状神经营养因子突 变体基因的表达盒在诱导型碳源甲醇诱导下将人睫状神经营养因子突变体分 泌到发酵培养基内。混合补料方式尤其适合用巴斯德毕赤酵母宿主菌作连续 发酵，持续生产目的基因产物人睫状神经营养因子突变体。
在本发明中，人睫状神经营养因子突变体产品在巴斯德毕赤酵母中获得 分泌性表达，表达产物直接分泌到培养基内，发酵液内分泌表达的水平高达 100mg/L，通过发酵生产工艺的优化，酵母工程菌还有进一步提高表达量的潜 力。
为实现高效表达，本发明还提供了一种表达载体，该表达载体含有编码 本发明上述的人睫状神经营养因子突变体的DNA序列。
本发明还提供了一种宿主细胞，它含有本发明上述的表达载体或上述的 编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列。该宿主细胞是甲醇酵母细胞， 优选巴斯德毕赤酵母。在其基因组中整合有编码人睫状神经营养因子突变体 的DNA序列，而且在所述的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列的 5′端上游与巴斯德毕赤酵母菌来源的5′调控区可操作地相连，所述的5′调控区 包含内含启动子元件和Kozak序列增强子元件；
所述的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列的3′端下游与甲醇 酵母来源的3′终止序列可操作地相连。
所述的5′调控区选自以下基因的5′调控区：毕赤酵母来源的醇氧化酶 (AOX1和AOX2)基因、3-磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAP)、甲醛脱氢酶基因 (FLD1)、二羟基丙酮合成酶(DAS1)基因或组氨醇脱氧酶(HIS4)基因；
所述的3′终止序列选自以下基因的3′终止序列：巴斯德毕赤酵母来源的 AOX1基因、AOX2基因、p40基因和His4基因。
在所述的编码人睫状神经营养因子突变体的DNA序列与5′调控区之间， 还含有酿酒酵母来源的α-交配因子基因引导肽序列的编码序列。
所述的Kozak序列增强子元件为AAACGATG。
所述的宿主细胞包括Mut-和Mut+表型。
所述的宿主细胞包括在其染色体中整合有本发明编码人睫状神经营养因 子突变体的DNA序列的GS115和SMD1168等菌株。
此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可 以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求 书所限定的范围。
与现有技术相比，本发明的蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体具有 更高的生物活性和更好地临床应用前景。
附图说明
图1是一种酵母表达质粒pPIC9的结构图谱。
图2是AX15在巴斯德毕赤酵母中表达产物的电泳图。
图3是AX15降解位点的确定。
图4是AX15(R14K)基因的构建。
图5是AX15(R14K)在巴斯德毕赤酵母中表达产物的电泳图。
图6是AX15(R14K)的纯化过程。
图7是AX15(R14K)的活性测定。
具体实施方式
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例应理解为仅用于 说明本发明而不用于限制本发明。下列实施例中未注明具体条件的实验方法 为常规或现有技术方法。
一、材料和方法
(一)菌种：
1.巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115 his4(Mut+his-)NRRLY-15851； KM71aox1Δ∷SARG4his4arg4(MutsHis-)；SMD1 168 pep4Δhis4(Mut+his-)。
2.大肠杆菌宿主菌：
E.coli Top10 F′{proAB，lacIq，lacZΔM15，Tn10(TetR)}mcrA，Δ(mrr- hsdRMS-mcrBC)，φ80lacZΔM15，ΔLacX74，deoR，recA1，araD139， Δ(ara-leu)7697，galU，galK，epsL(strR)，endA 1，nupGλ-；
E.coli JM109 F′[(recA1，supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi Δ(lac-proAB)F′[traD36 proAB+lacIq lacZ ΔM15])；
E.coli HB101(supE44 hsd S20(rB-mB-)recA13ara-14 proA2 lac Y1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1)。
以上菌株均通过市购获得。
(二)主要试剂
1.DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBCO-BRL、 Pharmacia、Bio-Labs及华美生物工程有限公司
2.酪蛋白水解物 (德国MERK公司产品)
3.Bacto-酵母抽提物 (美国Difco公司产品)
4.PCR扩增试剂盒 (瑞典Pharmacia公司产品)
5.DNA序列分析试剂盒 (美国USB公司产品)
6.同位素α-P32-dATP与γ-P32-dATP (英国Amersham公司产品)
7.酵母菌原生质体转化法的一些溶液配制
(1)SED：1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0
(2)SCE：9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168gEDTA，pH5.8
(3)CaS：1M山梨醇，10mM CaCl2
(4)SOS：1M山梨醇，0.3 X YPD，10mM CaCl2
(5)CaT：20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl2
(6)PEG：20％PEG-3350，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)
(7)1M PBS buffer：132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，pH6.0。
二、AX15基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
将表达载体pPIC9-AX15用原生质体转化法转化GS115，从RDB培养板 上随机挑取24个克隆，接种于4ml BMMY培养液中，在30℃摇床振摇36-48 小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，样品被分别进 行15％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出高表 达克隆。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面 培养，用于作为进一步表达的工程菌或做Southern杂交和甲醇利用表型等鉴 定之用。
挑取上述工程化的高表达克隆的菌落接种于4ml BMGY液体培养基中， 30℃摇床振荡过夜。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续振 摇18-24小时，再按4％接菌量接40ml种子菌入1000ml BMGY培养基内， 在30℃摇床继续振荡24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清， 然后这二种工程菌分别用200ml BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，放置在 30℃摇床继续振荡3-4天，每隔24小时补加(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。 这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度一般已达到18-20个OD600，基因表 达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃ 10000rpm离心 20min，弃菌体，含大量AX15表达产物的上清液，样品可用于SDS-PAGE 电泳鉴定，见图2。
三、AX15降解位点的确定
对AX15及其降解产物分别进行N-端序列测定，结果见图3。N-端序列 分析结果表明分子量较大的条带是完整的AX15分子，而分子量较小的条带 是缺失了N-端13个氨基酸的降解产物。
四、AX15(R14K)基因的构建
用引物1：5’CC CTC GAG AAA AGA GCT TTC ACA GAG CAT TCA CCG CTG ACC CCT CAC CGT AAG GAC 3’及引物2：5’GG GAA TTC CTA TTA CCC AGT CTG ATG AGA AGA AAT 3’以pPIC9-AX15为模板扩增出AX15 (R14K)基因，见图4。
五、AX15(R14K)基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
将表达载体pPIC9-AX15(R14K)用原生质体转化法转化GS115，从RDB 培养板上随机挑取24个克隆，接种于4ml GMMY培养液中，在30℃摇床振 摇36-48小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，样品 被分别进行15％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴 定出高表达克隆。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保 菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程菌或做Southern杂交和甲醇利用 表型等鉴定之用。
挑取上述工程化的高表达克隆的菌落接种于4ml BMGY液体培养基中， 30℃摇床振荡过夜。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续振 摇18-24小时，再按4％接菌量接40ml种子菌入1000ml BMGY培养基内， 在30℃摇床继续振荡24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清， 然后这二种工程菌分别用200ml BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，放置在 30℃摇床继续振荡3-4天，每隔24小时补加(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。 这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度一般已达到18-20个OD600，基因表 达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃ 10000rpm离心 20min，弃菌体，含大量AX15(R14K)表达产物的上清液，样品可用于 SDS-PAGE电泳鉴定，见图5。
六、AX15(R14K)的纯化及活性测定
进而，对培养上清进行了中试纯化工艺方面的研究：培养液先进行离心 5000g×20min，弃菌体，上清液经超滤浓缩，凝胶过滤纯化后，AX15(R14K) 的纯度大于90％。经各分离纯化步骤后样品的SDS-PAGE结果见图6。TF-1 细胞存活实验显示AX15(R14K)的EC50为200ng/mL(图7)，是rhCNTF 的4-5倍，与AX15相当。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>185
<212>PRT
<213>
<400>1
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Lys Asp Leu
1 5 10 15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Ala Leu Thr Glu Ser Try Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
35 40 45
Asn Leu Glu Ser Ala Glu Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
50 55 60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Asp Asn Leu Gln Ala Try
65 70 75 80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
85 90 95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
100 105 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Try Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
115 120 125
Leu Leu Glu Try Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
130 135 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145 150 155 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
165 170 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly
180 185
一、材料和方法
(一)菌种：
1.巴斯德毕赤酵母宿主菌GS115 his4(Mut+his-)NRRLY-15851； KM71aox1Δ∷SARG4his4arg4(MutsHis-)；SMD1 168 pep4Δhis4(Mut+his-)。
2.大肠杆菌宿主菌：
E.coli Top10 F′{proAB，lacIq，lacZΔM15，Tn10(TetR)}mcrA，Δ(mrr- hsdRMS-mcrBC)，φ80lacZΔM15，ΔLacX74，deoR，recA1，araD139， Δ(ara-leu)7697，galU，galK，epsL(strR)，endA 1，nupGλ-；
E.coli JM109 F′[(recA1，supE44 endA1 hsdR17 gyrA96 relA1 thi Δ(lac-proAB)F′[traD36 proAB+lacIq lacZ ΔM15])；
E.coli HB101(supE44 hsd S20(rB-mB-)recA13ara-14 proA2 lac Y1 galK2 rpsL20 xyl-5 mtl-1)。
以上菌株均通过市购获得。
(二)主要试剂
1.DNA限制性内切酶、T4DNA连接酶、聚合酶等分别购自GIBCO-BRL、 Pharmacia、Bio-Labs及华美生物工程有限公司
2.酪蛋白水解物 (德国MERK公司产品)
3.Bacto-酵母抽提物 (美国Difco公司产品)
4.PCR扩增试剂盒 (瑞典Pharmacia公司产品)
5.DNA序列分析试剂盒 (美国USB公司产品)
6.同位素α-P32-dATP与γ-P32-dATP (英国Amersham公司产品)
7.酵母菌原生质体转化法的一些溶液配制
(1)SED：1M山梨醇，25mM EDTA，50mM DTT，pH8.0
(2)SCE：9.1g山梨醇，1.47g柠檬酸钠，0.168gEDTA，pH5.8
(3)CaS：1M山梨醇，10mM CaCl2
(4)SOS：1M山梨醇，0.3 X YPD，10mM CaCl2
(5)CaT：20mM Tris-HCl，pH7.5，20mM CaCl2
(6)PEG：20％PEG-3350，10mM CaCl2，10mM Tris-HCl(pH7.4)
(7)1M PBS buffer：132ml 1M K2HPO4，868ml 1M KH2PO4，pH6.0。
二、AX15基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
将表达载体pPIC9-AX15用原生质体转化法转化GS115，从RDB培养板 上随机挑取24个克隆，接种于4ml BMMY培养液中，在30℃摇床振摇36-48 小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，样品被分别进 行15％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴定出高表 达克隆。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保菌、斜面 培养，用于作为进一步表达的工程菌或做Southern杂交和甲醇利用表型等鉴 定之用。
挑取上述工程化的高表达克隆的菌落接种于4ml BMGY液体培养基中， 30℃摇床振荡过夜。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续振 摇18-24小时，再按4％接菌量接40ml种子菌入1000ml BMGY培养基内， 在30℃摇床继续振荡24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清， 然后这二种工程菌分别用200ml BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，放置在 30℃摇床继续振荡3-4天，每隔24小时补加(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。 这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度一般已达到18-20个OD600，基因表 达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃ 10000rpm离心 20min，弃菌体，含大量AX15表达产物的上清液，样品可用于SDS-PAGE 电泳鉴定，见图2。
三、AX15降解位点的确定
对AX15及其降解产物分别进行N-端序列测定，结果见图3。N-端序列 分析结果表明分子量较大的条带是完整的AX15分子，而分子量较小的条带 是缺失了N-端13个氨基酸的降解产物。
四、AX15(R14K)基因的构建
用引物1：5’CC CTC GAG AAA AGA GCT TTC ACA GAG CAT TCA CCG CTG ACC CCT CAC CGT AAG GAC 3’及引物2：5’GG GAA TTC CTA TTA CCC AGT CTG ATG AGA AGA AAT 3’以pPIC9-AX15为模板扩增出AX15 (R14K)基因，见图4。
五、AX15(R14K)基因在巴斯德毕赤酵母中的表达
将表达载体pPIC9-AX15(R14K)用原生质体转化法转化GS115，从RDB 培养板上随机挑取24个克隆，接种于4ml GMMY培养液中，在30℃摇床振 摇36-48小时，5000rpm离心10min，各取100μL上清液，真空抽干，样品 被分别进行15％SDS-PAGE电泳鉴定，用pPIC9空载载体表达物作对照，鉴 定出高表达克隆。然后将这些筛选出来的高表达克隆分别用15％甘油低温保 菌、斜面培养，用于作为进一步表达的工程菌或做Southern杂交和甲醇利用 表型等鉴定之用。
挑取上述工程化的高表达克隆的菌落接种于4ml BMGY液体培养基中， 30℃摇床振荡过夜。取1ml酵母菌液转接于50ml BMGY培养液内，继续振 摇18-24小时，再按4％接菌量接40ml种子菌入1000ml BMGY培养基内， 在30℃摇床继续振荡24-30小时，将培养液用5000rpm离心5min，弃上清， 然后这二种工程菌分别用200ml BMMY诱导表达培养基悬浮菌体，放置在 30℃摇床继续振荡3-4天，每隔24小时补加(用100％甲醇加至终浓度为0.5％)。 这时巴斯德毕赤酵母工程菌的细胞密度一般已达到18-20个OD600，基因表 达的外源蛋白大多数分泌到液体培养基内。发酵培养基在4℃ 10000rpm离心 20min，弃菌体，含大量AX15(R14K)表达产物的上清液，样品可用于 SDS-PAGE电泳鉴定，见图5。
六、AX15(R14K)的纯化及活性测定
进而，对培养上清进行了中试纯化工艺方面的研究：培养液先进行离心 5000g×20min，弃菌体，上清液经超滤浓缩，凝胶过滤纯化后，AX15(R14K) 的纯度大于90％。经各分离纯化步骤后样品的SDS-PAGE结果见图6。TF-1 细胞存活实验显示AX15(R14K)的EC50为200ng/mL(图7)，是rhCNTF 的4-5倍，与AX15相当。
序列表
<110>中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所
<120>蛋白酶抗性人睫状神经营养因子突变体及其生产方法和用途
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
<211>185
<212>PRT
<213>
<400>1
Met Ala Phe Thr Glu His Ser Pro Leu Thr Pro His Arg Lys Asp Leu
1 5 10 15
Ala Ser Arg Ser Ile Trp Leu Ala Arg Lys Ile Arg Ser Asp Leu Thr
20 25 30
Ala Leu Thr Glu Ser Try Val Lys His Gln Gly Leu Asn Lys Asn Ile
35 40 45
Asn Leu Glu Ser Ala Glu Gly Met Pro Val Ala Ser Thr Asp Arg Trp
50 55 60
Ser Glu Leu Thr Glu Ala Glu Arg Leu Gln Asp Asn Leu Gln Ala Try
65 70 75 80
Arg Thr Phe His Val Leu Leu Ala Arg Leu Leu Glu Asp Gln Gln Val
85 90 95
His Phe Thr Pro Thr Glu Gly Asp Phe His Gln Ala Ile His Thr Leu
100 105 110
Leu Leu Gln Val Ala Ala Phe Ala Try Gln Ile Glu Glu Leu Met Ile
115 120 125
Leu Leu Glu Try Lys Ile Pro Arg Asn Glu Ala Asp Gly Met Pro Ile
130 135 140
Asn Val Gly Asp Gly Gly Leu Phe Glu Lys Lys Leu Trp Gly Leu Lys
145 150 155 160
Val Leu Gln Glu Leu Ser Gln Trp Thr Val Arg Ser Ile His Asp Leu
165 170 175
Arg Phe Ile Ser Ser His Gln Thr Gly
180 185
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