AAV载体柱纯化方法
阅读：297发布：2020-05-08
专利汇可以提供AAV载体柱纯化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本文描述和提供的是用于重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的纯化、生产和制造方法。本文阐述的纯化、生产和制造方法例如包括至少两个柱色谱法步骤。柱色谱法步骤包括，例如，单独地或组合地并且以任何顺序进行的阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法和/或AAV亲和色谱法。，下面是AAV载体柱纯化方法专利的具体信息内容。
1.一种纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)收获含有rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；
(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；
(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；
(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；
(e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；
(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、步骤(e)中的所述澄清的裂解物或步骤(e)中产生的稀释的澄清的裂解物进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选稀释所述柱洗脱液以产生稀释的柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述稀释的柱洗脱液进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；
(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第三柱洗脱液以产生浓缩的第三柱洗脱液；以及
(i)过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
2.一种纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)收获含有rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；
(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；
(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；
(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；
(e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；
(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、步骤(e)中的所述澄清的裂解物或步骤(e)中产生的稀释的澄清的裂解物进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选浓缩所述柱洗脱液以产生浓缩的柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；
(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述稀释的第二柱洗脱液进行阴离子交换色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第三柱洗脱液以产生稀释的第三柱洗脱液；以及
(i)过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
3.一种纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)收获含有rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；
(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；
(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；
(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；
(e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；
(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、步骤(e)中的所述澄清的裂解物或步骤(e)中产生的稀释的澄清的裂解物进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选稀释所述柱洗脱液以产生稀释的柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述稀释的柱洗脱液进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；
(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液过滤，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
4.一种纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)收获含有rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；
(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；
(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；
(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；
(e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；
(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、或步骤(e)中产生的所述澄清的裂解物或稀释的澄清的裂解物进行AAV亲和柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选稀释所述柱洗脱液以产生稀释的柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述稀释的柱洗脱液进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；
(h)任选地将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第三柱洗脱液以产生浓缩的第三柱洗脱液；以及
(i)过滤步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液，或过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
5.一种纯化重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的方法，所述方法包括以下步骤：
(a)收获含有rAAV载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；
(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；
(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；
(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物；
(e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；
(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、或步骤(e)中产生的所述澄清的裂解物或稀释的澄清的裂解物进行AAV亲和柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选浓缩所述柱洗脱液以产生浓缩的柱洗脱液；
(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第二柱洗脱液，以产生稀释的第二柱洗脱液；
(h)任选地将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述稀释的第二柱洗脱液进行阴离子交换色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第三柱洗脱液以产生稀释的第三柱洗脱液；以及
(i)过滤步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液，或过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤(b)和/或步骤(f)和/或步骤(g)和/或步骤(h)的所述浓缩是经由超滤/渗滤进行的，任选地通过切向流过滤(TFF)进行。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤(b)的所述浓缩将所述收获的细胞和细胞培养上清液的体积减少约50％-95％。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中步骤(f)和/或步骤(g)和/或步骤(h)的所述浓缩将所述柱洗脱液的体积减少约80％-95％。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的方法，其中步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物的所述裂解是通过物理或化学手段进行的。
10.根据权利要求9所述的方法，其中，所述物理手段包括微流化或均质化。
11.根据权利要求9所述的方法，其中所述化学手段包括去污剂，任选地非离子型去污剂，例如Triton X-100，其任选地浓度在约0.1％与1.0％之间，包括端值。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法，其中步骤(d)包括用核酸酶处理，从而减少污染核酸。
13.根据权利要求12所述的方法，其中核酸酶包括全能核酸酶。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的所述过滤所述澄清的裂解物或所述稀释的澄清的裂解物是通过孔径为介于约0.1微米和10.0微米之间且包括端值的过滤器进行的。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法，其中步骤(e)中的所述稀释所述澄清的裂解物是用缓冲磷酸盐、乙酸盐或Tris水溶液进行的。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中步骤(f)的所述柱洗脱液或步骤(g)中的所述第二柱洗脱液的所述稀释是用缓冲磷酸盐、乙酸盐或Tris水溶液进行的。
17.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述缓冲磷酸盐或乙酸盐水溶液的pH为介于约4.0和7.4之间，包括端值。
18.根据权利要求15或16所述的方法，其中所述缓冲Tris水溶液的pH为大于7.5，优选介于约8.0和9.0之间，包括端值。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的方法，其中将从步骤(i)得到的所述rAAV载体颗粒与表面活性剂一起配制以产生AAV载体制剂。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法，其中步骤(f)、(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱色谱法包括聚乙二醇(PEG)调制的柱色谱法。
21.根据权利要求20所述的方法，其中步骤(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱色谱法包括在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用PEG溶液洗涤所述柱。
22.根据权利要求20或21所述的方法，其中所述PEG具有约1,000至80,000g/mol的范围内且包括端值在内的平均分子量。
23.根据权利要求20至22中任一项所述的方法，其中所述PEG的浓度为约4％至约10％，包括端值。
24.根据权利要求1至23中任一项所述的方法，其中步骤(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱包括在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用表面活性剂水溶液洗涤所述柱。
25.根据权利要求1至24中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的所述阳离子交换柱包括在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用表面活性剂溶液洗涤所述柱。
26.根据权利要求21至25中任一项所述的方法，其中所述PEG溶液和/或所述表面活性剂溶液包含含水Tris-Cl/NaCl缓冲液、含水磷酸盐/NaCl缓冲液或含水乙酸盐/NaCl缓冲液。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述NaCl缓冲液包含范围介于约20mM和300mM之间且包括端值的NaCl，或介于约50mM和250mM之间且包括端值的NaCl。
28.根据权利要求24至26中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括阳离子或阴离子表面活性剂。
29.根据权利要求24至28中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括十二碳链表面活性剂。
30.根据权利要求24至29中任一项所述的方法，其中所述表面活性剂包括十二烷基三甲基氯化铵(DTAC)或肌氨酰。
31.根据权利要求1至30中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒利用含水Tris-Cl/NaCl缓冲液从步骤(f)、(g)和/或(h)的所述阴离子交换柱洗脱。
32.根据权利要求31所述的方法，其中所述Tris-Cl/NaCl缓冲液包括100-400mM NaCl，包括端值，任选地pH在约7.5至约9.0的范围内，包括端值。
33.根据权利要求1至32中任一项所述的方法，其中步骤(f)、(g)和/或(h)的所述阴离子交换柱用含水Tris-Cl/NaCl缓冲液洗涤。
34.根据权利要求33所述的方法，其中在所述含水Tris-Cl/NaCl缓冲液中的所述NaCl在约75-125mM NaCl的范围内，包括端值。
35.根据权利要求31至33中任一项所述的方法，其中所述的含水Tris-Cl/NaCl缓冲剂的pH为约7.5至约9.0，包括端值。
36.根据权利要求1至39中任一项所述的方法，其中将步骤(f)、(g)和/或(h)的所述阴离子交换柱洗涤一次或多次以减少第二或第三柱洗脱液中的AAV空衣壳的量。
37.根据权利要求33或36所述的方法，其中，所述阴离子交换柱洗涤在去除rAAV和/或替代rAAV之前从所述柱上去除AAV空衣壳，从而减少所述第二或第三柱洗脱液中的AAV空衣壳的量。
38.根据权利要求33或36所述的方法，其中，所述阴离子交换柱洗涤液在去除rAAV和/或替代rAAV之前从所述柱上去除总AAV空衣壳中的至少约50％，从而减少所述第二或第三柱洗脱液中的所述AAV空衣壳的量约50％。
39.根据权利要求33或36至38中任一项所述的方法，其中在所述含水Tris-Cl/NaCl缓冲液中的所述NaCl在约110-120mM NaCl的范围内，包括端值。
40.根据权利要求33至40中任一项所述的方法，其中洗脱的所述rAAV载体颗粒和AAV空衣壳的比例和/或量由所述洗涤缓冲液控制。
41.根据权利要求1至41中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒在含水磷酸盐/NaCl缓冲液或含水乙酸盐/NaCl缓冲液中从步骤(f)中的所述阳离子交换柱洗脱。
42.根据权利要求41所述的方法，其中所述磷酸盐/NaCl缓冲液或含水乙酸盐/NaCl缓冲液包含范围在约125mM-500mM之间且包括端值的NaCl。
43.根据权利要求41所述的方法，其中所述磷酸盐/NaCl缓冲液或含水乙酸盐/NaCl缓冲液具有范围在约5.5至约7.5之间且包括端值的pH。
44.根据权利要求1至43中任一项所述的方法，其中步骤(f)、(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱包含季铵官能团，例如季铵化聚亚乙基亚胺。
45.根据权利要求1至44中任一项所述的方法，其中步骤(g)和/或(h)中的所述尺寸排阻柱(SEC)具有(分子量)介于约10,000至约600,000之间且包括端值的分离/分馏范围。
46.根据权利要求1至45中任一项所述的方法，其中步骤(f)中的所述阳离子交换柱包含磺酸或官能团，例如磺基丙基。
47.根据权利要求3至46中任一项所述的方法，其中所述AAV亲和柱包含与AAV衣壳蛋白结合的蛋白或配体。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述蛋白包括与AAV衣壳蛋白结合的抗体。
49.根据权利要求48所述的方法，其中与AAV衣壳蛋白结合的所述抗体包括单链美洲驼抗体(骆驼科)。
50.根据权利要求1至49中任一项所述的方法，其中所述方法不包括氯化铯梯度超速离心步骤。
51.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含转基因，所述转基因编码选自由siRNA、反义分子、miRNA、核酶和shRNA组成的群组中的核酸。
52.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码基因产物的转基因，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子(BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白，头蛋白，音猬因子和酪氨酸羟化酶。
53.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码基因产物的转基因，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk-2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类MHC分子。
54.根据权利要求1至50中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码用于校正天然存在的代谢错误的蛋白的转基因，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6-磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
55.根据权利要求1至54中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含编码因子VIII或因子IX的转基因。
56.根据权利要求1至55中任一项所述的方法，其中所述方法从步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物中回收全部rAAV载体颗粒的约50-90％。
57.根据权利要求1至56中任一项所述的方法，其中所述方法产生比通过单个AAV亲和柱纯化产生或纯化的rAAV载体颗粒具有更高纯度的rAAV载体颗粒。
58.根据权利要求1至57中任一项所述的方法，其中，步骤(c)和(d)基本同时进行。
59.根据权利要求1至58中任一项所述的方法，其中在步骤(c)之后但在步骤(f)之前，将NaCl调节到约100-400mM NaCl的范围内，包括端值，或者在约140-300mM NaCl的范围内，包括端值。
60.根据权利要求1至59中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒衍生自选自由AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10和Rh74组成的群组中的AAV。
61.根据权利要求1至60中任一项所述的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、Rh74、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2衣壳序列具有70％或70％以上的同一性的衣壳序列。
62.根据权利要求1-61中任一项的方法，其中所述rAAV载体颗粒包含与AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、Rh10、或Rh74 ITR序列具有70％或70％以上的同一性的ITR序列。
63.根据权利要求1至62中任一项所述的方法，其中所述细胞包括悬浮细胞或贴壁细胞。
64.根据权利要求1至63中任一项所述的方法，其中所述细胞包括哺乳动物细胞。
65.根据权利要求1至64中任一项所述的方法，其中所述细胞包括HEK-293细胞。
66.根据权利要求1至65中任一项所述的方法，其中该方法根据实施例1-3中任一项所述的任何一个或多个柱、条件、浓度、摩尔浓度、体积、容量、流速、压力、材料、温度、pH值或步骤进行。
67.根据权利要求1至66中任一项所述的方法，其中，在柱纯化之前的所述细胞裂解和/或制备根据实施例4中所述的任何一个或多个条件、浓度、摩尔浓度、体积、容量、流速、压力、材料、温度、pH值或步骤进行。
AAV载体柱纯化方法
相关申请
[0001] 本专利申请要求于2017年6月30日提交的美国专利申请No. 62/527,633；2017年7月12日提交的美国专利申请No.62/531,744；以及于 2017年10月4日提交的美国专利申请No.62/567,905的权益，上述申请的全部内容通过引用并入本文，前述申请的包括所有文本、表格、附图和序列在内的全部内容通过引用并入本文。
背景技术
[0003] AAV是依赖于辅助的DNA细小病毒，其属于依赖性病毒 (Dependovirus)属。AAV需要辅助病毒功能，例如腺病毒、疱疹病毒或牛痘，以便发生增殖性感染。在没有辅助病毒功能的情况下，AAV通过将其基因组插入宿主细胞染色体来建立潜伏状态。随后由辅助病毒感染拯救了整合的病毒基因组，其然后可以复制以产生感染性AAV后代。
[0004] AAV具有广泛的宿主范围，并且能够在合适的辅助病毒存在下在来自任何物种的细胞中复制。例如，人AAV将在共同感染犬腺病毒的犬细胞中复制。AAV未与任何人或动物疾病相关，并且在整合时似乎不会对宿主细胞的生物学特性产生不利影响。
[0005] 可以通过全部或部分地删除AAV基因组的内部部分并在ITR之间插入感兴趣的核酸序列来改造AAV载体以携带感兴趣的异源核酸序列(例如，编码治疗性蛋白的选定基因，抑制性核酸，例如反义分子，核酶， miRNA等)。ITR在这样的载体中保持功能，允许复制和包装含有感兴趣的异源核酸序列的rAAV。异源核酸序列通常还与能够驱动患者靶细胞中核酸表达的启动子序列连接。终止信号，例如多腺苷酸化位点，也可以包括在载体中。
[0006] 感染性重组AAV(rAAV)载体的构建已在许多出版物中描述。参见，例如，美国专利No.5,173,414和5,139,941；国际公开号WO 92/01070和 WO 93/03769；Lebkowski et al.(1988)Molec.Cell.Biol.8:3988-3996；Vincent et al.(1990)Vaccines 90(Cold Spring Harbor Laboratory Press)；Carter,B.J. (1992)Current Opinion in Biotechnology 3:533-539；Muzyczka,N.(1992) Current Topics in Microbiol.and Immunol.158:97-
129；以及Kotin,R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801。
129；以及Kotin,R.M.(1994) Human Gene Therapy 5:793-801。
[0007] 重组腺相关病毒(AAV)载体在多个组的几个早期临床试验中显示出极好的治疗前景。开发这种新型生物制品以获得批准将涉及改进载体表征和质量控制方法，包括更好地理解载体设计和制造工艺参数如何影响临床等级载体中的杂质谱。
[0008] 设计rAAV生产和纯化系统的一个重要目标是实施最小化/控制生产相关性杂质的生成的策略，生产相关性杂质例如蛋白、核酸和载体相关杂质，包括野生型/假野生型AAV类(wtAAV)和AAV包裹的残留DNA杂质。由于产生rAAV载体的方式，去除AAV载体中的杂质是复杂的。在一个生产过程中，通过使用三种质粒的瞬时转染过程产生rAAV载体。将大量质粒DNA导入细胞中以产生rAAV载体。此外，当rAAV载体从生产细胞中释放时，细胞蛋白和核酸被共同释放。考虑到rAAV载体仅占生物质量的约 1％，将rAAV载体纯化至可用作临床人基因治疗产品的纯度水平是非常具有挑战性的。(Smith PH Wright JF.Qu G.et al 2003,Mo.Therapy,7:8348；Chadeuf G.et al,Mo.Therapy 2005,12:744.Report from the CHMP gene therapy expert group meeting.European Medicines Agency EMEA/CHMP 2005,183989/2004)。
[0009] 开发纯化重组AAV作为治疗人类疾病的产品的制备工艺应该达到以下目标：1)一致的载体纯度、效力和安全性；2)制造工艺的可扩展性；和3)可接受的制造成本。目前的“工业标准”可扩展AAV载体纯化工艺不能充分地去除杂质，这对于满足上面列出的第一个目标(一致的载体纯度、效力和安全性)是重要的。此外，使用当前行业标准的可扩展纯化方法未能充分去除杂质的原因是：1)开发用于除疫苗(其中通常寻求而不是避免免疫应答)之外的应用的病毒产品(例如重组AAV)的纯化工艺是相对较新的；2)参与开发 AAV载体的可扩展纯化方法的许多小组一直没有意识到高水平的载体相关杂质和/或已经假定这些杂质不会有助于临床上显著的载体免疫原性；以及3)开发适用于rAAV载体的工业规模制造的可扩展纯化工艺在技术上具有挑战性。发明内容
[0010] 本发明提供了重组腺相关病毒(rAAV)载体颗粒的纯化和生产方法。本发明的方法包括至少2个柱色谱步骤。
[0011] 在一实施方案中，一种方法包括以下步骤：(a)收获含有rAAV 载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物； (e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、步骤(e)中的所述澄清的裂解物或步骤(e)中产生的稀释的澄清的裂解物进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选稀释所述柱洗脱液以产生稀释的柱洗脱液；(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述稀释的柱洗脱液进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第三柱洗脱液以产生浓缩的第三柱洗脱液；以及(i)过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
[0012] 在另一实施方案中，一种方法包括以下步骤：(a)收获含有rAAV 载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物； (e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、步骤(e)中的所述澄清的裂解物或步骤(e)中产生的稀释的澄清的裂解物进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选浓缩所述柱洗脱液以产生浓缩的柱洗脱液；(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述稀释的第二柱洗脱液进行阴离子交换色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第三柱洗脱液以产生稀释的第三柱洗脱液；以及(i)过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
[0013] 在另一实施方案中，一种方法包括以下步骤：(a)收获含有rAAV 载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物； (e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、步骤(e)中的所述澄清的裂解物或步骤(e)中产生的稀释的澄清的裂解物进行阳离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选稀释所述柱洗脱液以产生稀释的柱洗脱液；(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述稀释的柱洗脱液进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；(h)将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液过滤，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
[0014] 在另一实施方案中，一种方法包括以下步骤：(a)收获含有rAAV 载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物； (e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、或步骤(e)中产生的所述澄清的裂解物或稀释的澄清的裂解物进行AAV亲和柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选稀释所述柱洗脱液以产生稀释的柱洗脱液；(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述稀释的柱洗脱液进行阴离子交换柱色谱法，以产生包含 rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第二柱洗脱液，以产生浓缩的第二柱洗脱液；(h)任选地将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地浓缩所述第三柱洗脱液以产生浓缩的第三柱洗脱液；以及(i)过滤步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液，或过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
[0015] 在另一实施方案中，一种方法包括以下步骤：(a)收获含有rAAV 载体颗粒的细胞和/或细胞培养上清液以产生收获物；(b)任选地浓缩步骤(a)中产生的所述收获物以产生浓缩的收获物；(c)裂解步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物以产生裂解物；(d)处理步骤(c)中产生的所述裂解物以减少所述裂解物中的污染核酸，从而产生核酸减少的裂解物； (e)任选地过滤步骤(d)中产生的所述核酸减少的裂解物以产生澄清的裂解物，并任选地稀释所述澄清的裂解物以产生稀释的澄清的裂解物；(f)将步骤(d)中的所述核酸减少的裂解物、或步骤(e)中产生的所述澄清的裂解物或稀释的澄清的裂解物进行AAV亲和柱色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的柱洗脱液，从而从蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离出rAAV载体颗粒，并任选浓缩所述柱洗脱液以产生浓缩的柱洗脱液；(g)将步骤(f)中产生的所述柱洗脱液或所述浓缩的柱洗脱液进行尺寸排阻柱色谱法(SEC)，以产生包含 rAAV载体颗粒的第二柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第二柱洗脱液，以产生稀释的第二柱洗脱液；(h)任选地将步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述稀释的第二柱洗脱液进行阴离子交换色谱法，以产生包含rAAV载体颗粒的第三柱洗脱液，从而将rAAV载体颗粒与蛋白杂质或其他与生产/工艺相关的杂质分离，并任选地稀释所述第三柱洗脱液以产生稀释的第三柱洗脱液；以及(i) 过滤步骤(g)中产生的所述第二柱洗脱液或所述浓缩的第二柱洗脱液，或过滤步骤(h)中产生的所述第三柱洗脱液或所述浓缩的第三柱洗脱液，从而产生纯化的rAAV载体颗粒。
[0017] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(b)的所述浓缩将所述收获的细胞和细胞培养上清液的体积减少约50％-95％。
[0018] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)和/或步骤(g)和/或步骤(h) 的所述浓缩将所述柱洗脱液的体积减少约80％-95％。
[0019] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物的所述裂解是通过物理或化学手段进行的。所述物理手段的非限制性示例包括微流化和均质化。所述化学手段的非限制性示例包括去污剂。去污剂包括非离子型去污剂和离子型去污剂。非离子型去污剂的非限制性示例包括Triton X-100。去污剂的浓度的非限制性示例在约0.1％与1.0％之间，包括端值。
[0020] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(d)包括用核酸酶处理，从而减少污染核酸。核酸酶的非限制性示例包括全能核酸酶(benzonase)。
[0021] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(e)中的过滤所述澄清的裂解物或所述稀释的澄清的裂解物是经由过滤器进行的。过滤器的非限制性示例是孔径为介于约0.1微米和10.0微米之间且包括端值在内的过滤器。
[0022] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(e)中的所述稀释所述澄清的裂解物是用缓冲磷酸盐、乙酸盐或Tris水溶液进行的。溶液pH的非限制性示例为介于约4.0和7.4之间，包括端值。Tris溶液pH的非限制性示例为大于7.5，例如介于约8.0和9.0之间，包括端值。
[0023] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)的所述柱洗脱液或步骤(g) 中的所述第二柱洗脱液的所述稀释是用缓冲磷酸盐、乙酸盐或Tris水溶液进行的。溶液pH的非限制性示例为介于约4.0和7.4之间，包括端值。Tris溶液pH的非限制性示例为大于7.5，例如介于约8.0和9.0之间，包括端值。
[0024] 在所述发明方法的特定方面中，将从步骤(i)得到的所述rAAV载体颗粒与表面活性剂一起配制以产生AAV载体制剂。
[0025] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)、(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱色谱法包括聚乙二醇(PEG)调制的柱色谱法。
[0026] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱色谱法是在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用PEG溶液进行洗涤的。
[0027] 在所述发明方法的特定方面中，所述PEG具有约1,000至80,000 g/mol的范围内且包括端值在内的平均分子量。
[0028] 在所述发明方法的特定方面中，所述PEG的浓度为约4％至约 10％，包括端值。
[0029] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱是在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用表面活性剂水溶液进行洗涤的。
[0030] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)中的所述阳离子交换柱是在从所述柱中洗脱所述rAAV载体颗粒之前用表面活性剂溶液进行洗涤的。
[0031] 在所述发明方法的特定方面中，所述PEG溶液和/或所述表面活性剂溶液包含含水Tris-Cl/NaCl缓冲液、含水磷酸盐/NaCl缓冲液或含水乙酸盐/NaCl缓冲液。
[0032] 在所述发明方法的特定方面中，缓冲液或者溶液中的NaCl的范围介于约20mM和300mM之间且包括端值的NaCl，或介于约50mM和 250mM之间且包括端值的NaCl。
[0033] 在所述发明方法的特定方面中，所述表面活性剂包括阳离子或阴离子表面活性剂。
[0036] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒利用含水Tris- Cl/NaCl缓冲液从步骤(f)、(g)和/或(h)的所述阴离子交换柱洗脱。
[0037] 在所述发明方法的特定方面中，Tris-Cl/NaCl缓冲液包括100- 400mM NaCl，包括端值，任选地pH在约7.5至约9.0的范围内，包括端值。
[0038] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)、(g)和/或(h)的所述阴离子交换柱用含水Tris-Cl/NaCl缓冲液洗涤。
[0039] 在所述发明方法的特定方面中，含水Tris-Cl/NaCl缓冲液中的所述NaCl在约75-125mM的范围内，包括端值。
[0040] 在所述发明方法的特定方面中，含水Tris-Cl/NaCl缓冲剂的pH 为约7.5至约9.0，包括端值。
[0041] 在所述发明方法的特定方面中，将步骤(f)、(g)和/或(h)的所述阴离子交换柱洗涤一次或多次以减少第二或第三柱洗脱液中的AAV空衣壳的量。
[0042] 在所述发明方法的特定方面中，阴离子交换柱洗涤在去除rAAV 和/或替代rAAV之前从所述柱上去除AAV空衣壳，从而减少所述第二或第三柱洗脱液中的AAV空衣壳的量。
[0043] 在所述发明方法的特定方面中，阴离子交换柱洗涤液在去除 rAAV和/或替代rAAV之前从所述柱上去除总AAV空衣壳中的至少约 50％，从而减少所述第二或第三柱洗脱液中的所述AAV空衣壳的量约 50％。
[0044] 在所述发明方法的特定方面中，在所述含水Tris-Cl/NaCl缓冲液中的所述NaCl在约110-120mM的范围内，包括端值。
[0045] 在所述发明方法的特定方面中，洗脱的所述rAAV载体颗粒和 AAV空衣壳的比例和/或量由洗涤缓冲液控制。
[0046] 在所述发明方法的特定方面中，所述载体颗粒在含水磷酸盐 /NaCl缓冲液或含水乙酸盐/NaCl缓冲液中从步骤(f)中的所述阳离子交换柱洗脱。缓冲液中的非限制性的NaCl浓度范围在约125mM-500mM之间且包括端值的NaCl。缓冲液pH的非限制性示例在约5.5至约7.5之间且包括端值。
[0047] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)、(g)和/或(h)中的所述阴离子交换柱包含季铵官能团，例如季铵化聚亚乙基亚胺。
[0048] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(g)和/或(h)中的所述尺寸排阻柱(SEC)具有(分子量)介于约10,000至约600,000之间且包括端值的分离/分馏范围。
[0049] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(f)中的所述阳离子交换柱包含磺酸或官能团，例如磺基丙基。
[0050] 在所述发明方法的特定方面中，所述AAV亲和柱包含与AAV 衣壳蛋白结合的蛋白或配体。蛋白的非限制性示例包括与AAV衣壳蛋白结合的抗体。更具体的非限制性示例包括与AAV衣壳蛋白结合的单链美洲驼抗体 (骆驼科)。
[0051] 在所述发明方法的特定方面中，方法不包括氯化铯梯度超速离心步骤。
[0052] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒包含转基因，所述转基因编码选自由siRNA、反义分子、miRNA、核酶和shRNA组成的群组中的核酸。
[0053] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒包含编码基因产物的转基因，所述基因产物选自：胰岛素，胰高血糖素，生长激素(GH)，甲状旁腺激素(PTH)，生长激素释放因子(GRF)，卵泡刺激素(FSH)，黄体生成素(LH)，人绒毛膜促性腺激素(hCG)，血管内皮生长因子(VEGF)，血管生成素，血管抑制素，粒细胞集落刺激因子(GCSF)，促红细胞生成素(EPO)，结缔组织生长因子(CTGF)，碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)，酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)，表皮生长因子(EGF)，转化生长因子α(TGFα)，血小板衍生生长因子(PDGF)，胰岛素生长因子I和II(IGF-I和IGF-II)，TGFβ，激活素，抑制素，骨形态发生蛋白(BMP)，神经生长因子(NGF)，脑源性神经营养因子 (BDNF)，神经营养因子NT-3和NT4/5，睫状神经营养因子(CNTF)，胶质细胞系衍生的神经营养因子(GDNF)，神经营养因子，集聚蛋白，导蛋白-1和导蛋白-2，肝细胞生长因子(HGF)，肝配蛋白，头蛋白，音猬因子和酪氨酸羟化酶。
[0054] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒包含编码基因产物的转基因，所述基因产物选自：血小板生成素(TPO)，白细胞介素(IL1至 IL-17)，单核细胞趋化蛋白，白血病抑制因子，粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子，Fas配体，肿瘤坏死因子α和β，干扰素α，β和γ，干细胞因子，flk- 2/flt3配体，IgG，IgM，IgA，IgD和IgE，嵌合免疫球蛋白，人源化抗体，单链抗体，T细胞受体，嵌合T细胞受体，单链T细胞受体，I类和II类 MHC分子。
[0055] 在所述发明方法的特定方面中，所述rAAV载体颗粒包含编码用于校正天然存在的代谢错误的蛋白的转基因，所述蛋白选自：氨基甲酰基合成酶I，鸟氨酸转氨甲酰酶，精氨琥珀酸合成酶，精氨酸琥珀酸酯裂解酶，精氨酸酶，富马酰乙酰水解酶，苯丙氨酸羟化酶，α-1抗胰蛋白酶，葡萄糖-6- 磷酸酶，胆色素原脱氨酶，因子V，因子VIII，因子IX，胱硫醚β-合酶，支链酮酸脱羧酶，白蛋白，异戊酰辅酶A脱氢酶，丙酰辅酶A羧化酶，甲基丙二酰辅酶A变位酶，戊二酰辅酶A脱氢酶，胰岛素，β-葡萄糖苷酶，丙酮酸羧酸盐，肝磷酸化酶，磷酸化酶激酶，甘氨酸脱羧酶，RPE65，H蛋白，T蛋白，囊性纤维化跨膜调节因子(CFTR)序列和肌营养不良蛋白cDNA序列。
[0056] 在所述发明方法的特定方面中，所述rAAV载体颗粒包含编码因子VIII或因子IX的转基因。
[0057] 在所述发明方法的特定方面中，方法从步骤(a)中产生的所述收获物或步骤(b)中产生的所述浓缩的收获物中回收全部rAAV载体颗粒的约 50-90％。
[0058] 在所述发明方法的特定方面中，方法产生比通过单个AAV亲和柱纯化产生或纯化的rAAV载体颗粒具有更高纯度的rAAV载体颗粒。
[0059] 在所述发明方法的特定方面中，步骤(c)和(d)基本同时进行。
[0060] 在所述发明方法的特定方面中，在步骤(c)之后但在步骤(f)之前，将NaCl调节到约100-400mM NaCl的范围内，包括端值，或者在约140- 300mM NaCl的范围内，包括端值。
[0061] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒衍生自选自由 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、Rh10和Rh74组成的群组中的AAV。
[0062] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒包含与AAV1、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、 Rh10、Rh74、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO：2衣壳序列具有70％或70％以上的同一性的衣壳序列。
[0063] 在所述发明方法的特定方面中，rAAV载体颗粒包含与AAV1、 AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、 Rh10、或Rh74 ITR序列具有70％或70％以上的同一性的ITR序列。
[0064] 在所述发明方法的特定方面中，细胞包括悬浮细胞或贴壁细胞。
[0067] 在所述发明方法的特定方面中，本文所述的在柱纯化之前的所述细胞裂解和/或制备根据实施例4中所述的任何一个或多个条件、浓度、摩尔浓度、体积、容量、流速、压力、材料、温度、pH值或步骤进行。
附图说明
[0068] 图1显示了500-600ml起始rAAV收获物体积的CEX(Poros 50HS)→AEX(Poros 50HQ)>UF>SEC(Superdex 200制备级)柱色谱法，该体积可以按比例放大到更大的体积，从而显著提高rAAV的产量(例如1.2L或更大)。
[0069] 图2显示了500-600ml起始rAAV收获物体积的CEX(Poros 50HS)→AEX(Poros 50HQ)柱色谱法，该体积可放大至更大的体积，以显著提高rAAV的产量(例如1.2L或更大)。
[0070] 图3显示了500-600ml起始rAAV收获物体积的CEX(Poros 50HS)→UF>SEC(Superdex 200制备级)>AEX(Poros 50HQ)柱色谱法，该体积可以放大到更大的体积，以显著提高rAAV的产量(例如1.2L或更大)。
[0071] 图4显示了500-600ml起始rAAV收获物体积的亲和性(AVB Sepharose HP)→AEX(Poros 50HQ)柱色谱法，该体积可放大至更大的体积，以显著提高rAAV的产量(例如1.2L或更大)。从亲和柱中进行低pH洗脱后 (约7.5mL洗脱液)，加入4.5mL高pH中和溶液，然后加入约120mL 5mM Tris-Cl pH 8.5)/40mM NaCl溶液，以保持用于AEX(Poros 50HQ)柱的约132 mL的总负载体积。
具体实施方式
[0072] 本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)载体(rAAV)的载体纯化和生产方法，其可扩展到大规模。例如悬浮培养物5、10、10-20、20-50、50- 100、100-200升或更多的体积。本发明提供了重组腺相关病毒(AAV)的载体 (rAAV)载体的纯化和生产方法，其也适用于多种AAV血清型/衣壳变体。用于纯化或产生rAAV载体的本发明的方法包括去除工艺中的杂质和与生产相关的杂质。本发明的方法涉及色谱步骤和工艺步骤的独特组合，其提供可扩展性以纯化rAAV载体的许多不同血清型/假型。
[0073] 杂质包括AAV载体生产相关杂质，其包括蛋白，核酸(例如 DNA)，细胞组分如细胞内和膜组分，它们是不同于AAV载体的杂质。术语“生产或工艺相关杂质”是指在AAV纯化和生产工艺中释放的并非真正的 rAAV颗粒的任何组分。
[0074] 真正的rAAV载体是指包含能够感染靶细胞的异源核酸(例如转基因)的rAAV载体颗粒。该短语不包括空的AAV衣壳，在包装的基因组中缺乏完整插入物的AAV载体或含有污染的宿主细胞核酸的AAV载体。在某些实施方案中，真正的rAAV载体是指在包装的载体基因组中也缺乏污染的质粒序列的rAAV载体颗粒。
[0075] “空衣壳”和“空颗粒”是指包含AAV衣壳，但缺少全部或部分包含在AAV ITR的一侧或两侧侧翼的异源核酸序列的基因组的AAV颗粒或病毒粒子。这种空衣壳不发挥将异源核酸序列转移到宿主细胞或生物体内的细胞中的作用。
[0076] 术语“载体”是指核酸分子、质粒、病毒的小承载体(例如 rAAV载体)、或可以通过插入或掺入核酸来操作的其他载体。载体可用于遗传操作(即“克隆载体”)，以将多核苷酸引入/转移到细胞中，以及在细胞中转录或翻译插入的多核苷酸。“表达载体”是含有具有在宿主细胞中表达所需的必需调节区的基因或核酸序列的载体。载体核酸序列通常包含至少一个用于在细胞中增殖的复制起点和任选的其他元件，例如异源核酸序列、表达控制元件(例如，启动子、增强子)、内含子、反向末端重复序列(ITR)、可选的选择标记、多腺苷酸化信号。
[0077] rAAV载体衍生自腺相关病毒。AAV载体可用作基因治疗载体，因为它们可以引入核酸/遗传物质至细胞中，使得核酸/遗传物质可以保持在细胞中。由于AAV与人类的致病性疾病无关，因此rAAV载体能够传递异源核酸序列(例如，治疗性蛋白和药剂)给人类患者而不引起实质性AAV发病机理或疾病。
[0078] 作为载体的修饰物，例如rAAV载体，以及序列的修饰物，例如重组多核苷酸和多肽，术语“重组”意指组合物已经被以通常不在自然界中发生的方式操纵(即，工程化)。重组AAV载体的具体示例会是通常在野生型 AAV基因组中不存在的核酸插入病毒基因组中的情形。示例是将编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的核酸(例如基因)克隆到载体中的情况，其具有或不具有通常在AAV基因组内缔合该基因的5'、3'和/或内含子区。尽管在本文提及 AAV载体以及序列诸如多核苷酸时，不总是使用术语“重组”，但包括AAV 载体、多核苷酸在内的重组形式明确地被包括，虽然存在任何此类省略。
[0079] 通过使用分子方法从AAV基因组中移除野生型基因组，并用非天然(异源)核酸(例如编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的核酸)替代而由病毒的野生型基因组(例如AAV)衍生出“rAAV载体”。通常，对于AAV而言， AAV基因组中的一个或两个反向末端重复(ITR)序列保留在rAAV载体中。 rAAV区别于AAV基因组，因为AAV基因组的全部或一部分已用关于AAV 的基因组核酸的非天然序列(例如用编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸)替代。因此，并入非天然序列将AAV定义为“重组”AAV载体，其可被称为“rAAV载体”。
[0080] 重组AAV载体序列可以被包装-在本文中称为“颗粒”，其用于随后在离体、体外或体内感染(转导)细胞。当重组载体序列被衣壳化或包装到AAV颗粒中时，该颗粒也可以称为“rAAV”或“rAAV颗粒”或“rAAV 病毒粒子”。这样的rAAV、rAAV颗粒和rAAV病毒粒子包括衣壳化或包加载体基因组的蛋白。在AAV的情况下，具体示例包括衣壳蛋白。
[0081] 载体“基因组”指重组质粒序列的部分，其最终被包装或衣壳化以形成rAAV颗粒。在使用重组质粒构建或制造重组AAV载体的情况下， AAV载体基因组不包含“质粒”的不对应于重组质粒的载体基因组序列的部分。这种重组质粒的非载体基因组部分被称为“质粒骨架”，其对于质粒的克隆和扩增(其是繁殖和重组病毒生产所需的过程)而言是重要的，但其本身不被包装或衣壳化成rAAV颗粒。因此，载体“基因组”是指由rAAV包装或衣壳化的核酸。
[0082] “AAV辅助功能”涉及AAV衍生的编码序列(蛋白)，其可以被表达以提供AAV基因产物和AAV载体，其反过来起反式作用以进行增殖性的AAV复制和包装。因此，AAV辅助功能包括AAV开放阅读框(ORF)，其包括rep和cap，以及其他，例如针对某些AAV血清型的AAP。Rep表达产物已被证明具有许多功能，尤其包括：DNA复制的AAV起源的识别、结合和切口；DNA解旋酶活性；和来自AAV(或其他异源)启动子的转录调节。 Cap表达产品(衣壳)提供必要的包装功能。AAV辅助功能用于补充AAV载体基因组中缺失的补充AAV功能。
[0083] “AAV辅助构建体”通常是指包括从AAV载体缺失的提供 AAV功能的核苷酸序列的核酸序列，该核酸序列用于例如通过对受试者进行基因治疗的方式产生用于递送感兴趣的核酸序列的转导AVV载体。AAV辅助构建体通常用于提供AAV rep和/或cap基因的瞬时表达，以补充缺失的对于AAV载体复制所必需的AAV功能。辅助构建体通常缺乏AAV ITR，既不能自我复制也不能自我包装。AAV辅助构建体可以是质粒、噬菌体、转座子、粘粒、病毒或病毒粒子的形式。已经描述了许多AAV辅助构建体，例如编码Rep和Cap表达产物的质粒pAAV/Ad和pIM29+45(参见，例如， Samulski et al.(1989)J.Virol.63:3822-3828；和McCarty et al.(1991)J.Virol. 65:2936-2945)。已经描述了许多编码Rep和/或Cap表达产物的其他载体(参见，例如，美国专利No.5,139,941和No.6,376,237)。
[0084] 术语“补充功能”是指非AAV衍生的病毒和/或细胞功能， AAV依赖于该功能进行复制。该术语包括AAV复制中所需的蛋白和RNA，包括参与激活AAV基因转录、阶段特异性AAV mRNA剪接、AAV DNA复制、Cap表达产物的合成和AAV衣壳包装的部分。基于病毒的补充功能可以衍生自任何已知的辅助病毒，例如腺病毒、疱疹病毒(除了单纯疱疹病毒1型) 和痘苗病毒。
[0085] “补充功能载体”通常是指包含提供补充功能的多核苷酸序列的核酸分子。此类序列可以在补充功能载体上，并转染到合适的宿主细胞中。补充功能载体能够支持宿主细胞中的rAAV病毒粒子的产生。补充功能载体可以是质粒、噬菌体、转座子或粘粒的形式。此外，补充功能不需要齐全的腺病毒基因。例如，据报道，不能进行DNA复制和晚期基因合成的腺病毒突变体允许AAV复制(Ito et al.,(1970)J.Gen.Virol.9:243；Ishibashi et al,(1971) Virology 45:317)。类似地，已显示E2B和E3区内的突变体支持AAV复制，表明E2B和E3区可能不涉及提供辅助功能(Carter et al.,(1983)Virology 126:505)。E1区缺陷或具有缺失E4区的腺病毒不能支持AAV复制。因此， E1A和E4区似乎是AAV复制直接或间接必需的(Laughlin et al.,(1982)J. Virol.41:868；Janik et al.,(1981)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carter et al., (1983)Virology 126:505)。其他表征的腺病毒突变体包括：E1B(Laughlin et al.,(1982)，同上；Janik et al.,(1981)，同上；Ostrove et al.,(1980)Virology 104:502)；E2A(Handa et al.,(1975)
J.Gen.Virol.29:239；Strauss et al.,(1976)J. Virol.17:140；Myers et al.,(1980)J.Virol.35:665；Jay et al.,(1981)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 78:2927；Myers et al.,(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter, Adeno-Associated Virus Helper
Functions,in I CRC Handbook of Parvoviruses(P. Tijssen ed.,1990))；E3(Carter et al.(1983),同上)；和E4(Carter et al.(1983),同上； Carter(1995))。由在E1B编码区中具有突变的腺病毒提供的补充功能的研究产生了相互矛盾的结果，但是E1B55k可能是AAV病毒粒子产生所必需的，而E1B19k则不是(Samulski et al.,(1988)J.Virol.62:206-
210)。另外，国际公开WO 97/17458和Matshushita et al.,(1998)Gene Therapy 5:938-
945描述了编码各种腺病毒基因的补充功能载体。示例性的补充功能载体包括腺病毒VA RNA编码区，腺病毒E4 ORF6编码区，腺病毒E2A 72kD编码区，腺病毒E1A编码区和缺乏完整E1B55k编码区的腺病毒E1B区。例如，在国际公开号WO 01/83797中描述了这种补充功能载体。
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 78:1925；Carter et al., (1983)Virology 126:505)。其他表征的腺病毒突变体包括：E1B(Laughlin et al.,(1982)，同上；Janik et al.,(1981)，同上；Ostrove et al.,(1980)Virology 104:502)；E2A(Handa et al.,(1975)
J.Gen.Virol.29:239；Strauss et al.,(1976)J. Virol.17:140；Myers et al.,(1980)J.Virol.35:665；Jay et al.,(1981)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 78:2927；Myers et al.,(1981)J.Biol.Chem.256:567)；E2B(Carter, Adeno-Associated Virus Helper
Functions,in I CRC Handbook of Parvoviruses(P. Tijssen ed.,1990))；E3(Carter et al.(1983),同上)；和E4(Carter et al.(1983),同上； Carter(1995))。由在E1B编码区中具有突变的腺病毒提供的补充功能的研究产生了相互矛盾的结果，但是E1B55k可能是AAV病毒粒子产生所必需的，而E1B19k则不是(Samulski et al.,(1988)J.Virol.62:206-
210)。另外，国际公开WO 97/17458和Matshushita et al.,(1998)Gene Therapy 5:938-
945描述了编码各种腺病毒基因的补充功能载体。示例性的补充功能载体包括腺病毒VA RNA编码区，腺病毒E4 ORF6编码区，腺病毒E2A 72kD编码区，腺病毒E1A编码区和缺乏完整E1B55k编码区的腺病毒E1B区。例如，在国际公开号WO 01/83797中描述了这种补充功能载体。
[0086] 如本文所使用的，术语“血清型”是区别点，其用于指具有在血清学上与其他AAV血清型不同的衣壳的AAV。血清学特殊性基于与另一种 AAV相比，对一种AAV缺乏抗体之间的交叉反应性来确定。此类交叉反应性差异通常是由于衣壳蛋白序列/抗原决定簇的不同(例如，由于AAV血清型的VP1、VP2和/或VP3序列差异)导致。
[0087] 在传统定义下，血清型意指感兴趣的病毒已经针对对于所有现存和已表征的血清型具有特异性的血清进行了中和活性的测试，并且未发现中和感兴趣的病毒的抗体。随着更多的自然出现的病毒分离物被发现和/或衣壳突变体生成，可能存在或可能不存在与当前存在的血清型中任一种的血清学差异。因此，在新病毒(例如AAV)不具有血清学差异的情况下，这种新病毒 (例如AAV)将是相应血清型的亚组或变体。在许多情况下，中和活性的血清学测试尚未对具有衣壳序列修饰的突变病毒进行，以根据传统血清型定义确定它们是否是另一种血清型。因此，为了方便和避免重复，术语“血清型”广义上是指血清学上不同的病毒(例如AAV)以及可能在给定血清型的亚群或变体内的，不是血清学上不同的病毒(例如AAV)。
[0088] rAAV载体包括任何病毒株系或血清型。作为非限制性示例， rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可基于任何AAV血清型，例如AAV- 1、AAV-2、AAV-3、AAV-4、AAV-5、AAV-6、AAV-7、AAV-8、AAV-9、 AAV-10、AAV-11。此类载体可以基于相同的株系或血清型(或亚组或变体)，或彼此不同。作为非限制性示例，基于一种血清型基因组的rAAV质粒或载体基因组或颗粒(衣壳)可以与包加载体的衣壳蛋白中的一种或多种相同。另外，rAAV质粒或载体基因组可以基于AAV(例如，AAV2)血清型基因组，其不同于包加载体基因组的衣壳蛋白中的一种或多种，在这种情况下，三种衣壳蛋白中的至少一种可以是例如，AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、 AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10，AAV11、Rh10、Rh74、 SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2或其变体。因此，rAAV载体包括与特定血清型以及混合血清型特征的基因/蛋白序列相同的基因/蛋白序列。
[0089] 在各种示例性实施方案中，rAAV载体包含与一种或多种 AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、 AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2衣壳蛋白具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、 98％、99％、99.5％等)同一性的衣壳序列或由其组成。在各种示例性实施方案中，rAAV载体包含与一种或多种AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10或Rh74 ITR具有至少70％或更多(例如，75％、80％、85％、90％、95％、96％、 97％、98％、99％、99.5％等)的序列或由其组成。
[0090] rAAV，例如AAV1、AAV2、AAV3、AAV4、AAV5、AAV6、 AAV7、AAV8、AAV9、AAV10、AAV11、Rh10、Rh74、SEQ ID NO:1和 SEQ ID NO:2以及变体，杂合和嵌合序列，可以使用本领域技术人员已知的重组技术构建，以包括与一个或多个功能性AAV ITR序列侧接的一个或多个异源多核苷酸序列(转基因)。这些载体具有一个或多个全部或部分缺失的野生型AAV基因，但保留至少一个功能性侧接ITR序列，这是将重组载体拯救、复制和包装到rAAV载体颗粒中所必需的。因此，rAAV载体基因组将包括顺式复制和包装所需的序列(例如，功能性ITR序列)。
[0091] 术语“核酸”和“多核苷酸”在本文中可互换使用，以指称所有形式的核酸、寡核苷酸，包括脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA)。核酸包括基因组DNA、cDNA和反义DNA、以及剪接或未剪接的mRNA、rRNA、 tRNA和抑制性DNA或RNA(RNAi，例如小或短发夹(sh)RNA、微 RNA(miRNA)、小或短干扰(si)RNA、反式剪接RNA或反义RNA)。核酸包括天然存在的、合成的和有意修饰或改变的多核苷酸。核酸可以为单链、双链或三链的、线性或环状的，并且可以具有任何长度。在讨论核酸时，可以根据在5'至3'方向上提供序列的惯例在本文中描述具体多核苷酸的序列或结构。
[0092] “异源”核酸序列是指多核苷酸，其插入AAV质粒或载体中，用于将多核苷酸经载体介导转移/递送到细胞中。异源核酸序列不同于AAV 核酸，即相对于AAV核酸是非天然的。一旦转移/递送到细胞中，可以表达载体内包含的异源核酸序列(例如，如果合适的话，转录并且翻译)。替代地，不需要表达在细胞内的在载体内包含的转移/递送的异源多核苷酸。尽管本文在提及核酸序列和多核苷酸时，并未总是使用术语“异源”，但即使在不存在修饰语“异源”的情况下提及核酸序列或多核苷酸也意味着包括异源核酸序列和多核苷酸，尽管省略也如此。
[0093] 由“核酸序列”编码的“多肽”、“蛋白”或“肽”包括全长天然序列，如天然存在的蛋白，以及功能性子序列、修饰形式或序列变体，只要子序列、修饰形式或变体保留一定程度的天然全长蛋白的功能性即可。此类由核酸序列编码的多肽，蛋白和肽可以但不必要与内源蛋白相同，所述内源蛋白是缺陷的，或其在经处理的哺乳动物中表达不充分或不足。
[0094] 本文使用“转基因”以方便地表示旨在或已被引入细胞或生物体的核酸(例如异源的)。转基因包括任何核酸，例如编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸。
[0095] 在具有转基因的细胞中，已经通过细胞的质粒或AAV载体、“转导”或“转染”引入/转移转基因。术语“转导”和“转染”是指将分子 (诸如核酸)引入宿主细胞(例如HEK293)或生物体中的细胞中。转基因可以整合或可以不整合到受体细胞的基因组核酸中。如果引入的核酸整合到受体细胞或生物体的核酸(基因组DNA)中，则其可稳定保持在该细胞或生物体中并且进一步传代到后代细胞或受体细胞的生物体或生物体的细胞中或由后代细胞或受体细胞的生物体或生物体的细胞遗传。
[0096] “宿主细胞”表示例如微生物、酵母细胞、昆虫细胞和哺乳动物细胞，其可以或已经用作AAV载体质粒、AAV辅助构建体、补充功能载体或其他转移DNA的受体。这个术语包括已被转染的原始细胞的后代。因此，“宿主细胞”通常是指已用外源DNA序列转染的细胞。应理解，由于天然的、偶然的或有意的突变，在形态学或在基因组或总DNA补体方面，单亲代细胞的后代不一定与原始亲本完全相同。示例性宿主细胞包括人胚肾(HEK) 细胞如HEK293。
[0097] “转导细胞”是其中已引入转基因的细胞。因此，“转导的”细胞意指在外源分子例如核酸(例如转基因)并入细胞中之后，细胞中的基因变化。因此，“转导的”细胞是其中已引入外源核酸的细胞或其后代。细胞可以繁殖 (培养)，并且表达引入的蛋白或转录的核酸，或者由细胞产生载体，例如 rAAV。对于基因治疗用途和方法，转导细胞可以在受试者中。
[0098] 如本文所用，关于细胞的术语“稳定的”或“稳定整合的”是指核酸序列，例如可选择标记或异源核酸序列，或质粒或载体已(例如，通过同源重组、非同源末端连接、转染等)插入染色体中或者维持在受体细胞或宿主生物中在染色体外，并且维持在染色体中或维持在染色体外持续了一段时间。在培养细胞的情况下，可以在多个细胞传代过程中维持已插入染色体的核酸序列，例如异源核酸序列、或质粒或载体。
[0099] “细胞系”是指在适宜的培养条件下能够连续或延长生长并在体外分裂的细胞群。细胞系可以但不必然是来自单个祖细胞的克隆群。在细胞系中，在这种克隆群体的储存或转移期间以及在组织培养中的延长传代期间，核染色中会发生自发或诱导的变化。因此，源自细胞系的后代细胞可能与祖先细胞或培养物不完全相同。适用于本发明纯化方法的示例性细胞系是 HEK293。
[0100] “表达控制元件”是指影响可操作地连接的核酸的表达的核酸序列。控制元件，包括本文所述的表达控制元件，诸如启动子和增强子， rAAV载体可包括一个或多个“表达控制元件”。通常，包括此类元件以有利于适当的异源多核苷酸转录和适当情况下的翻译(例如，启动子、增强子、内含子的剪接信号、维持基因的正确阅读框以允许mRNA的框内翻译和终止密码子等)。这些元件通常以顺式作用，其被称为“顺式作用”元件，但也可以反式作用。
[0101] 表达控制可以在转录、翻译、剪接、信息稳定性等水平下实现。通常，调节转录的表达控制元件靠近转录核酸的5'端(即“上游”)并置。表达控制元件也可位于转录序列的3'末端(即“下游”)处或转录物内(例如在内含子中)。表达控制元件可以邻近或远离转录序列定位(例如，距多核苷酸1-10 个、10-25个、25-50个、50-100个、100-500个或更多个核苷酸)，甚至以相当远的距离定位。然而，由于rAAV载体的长度限制，表达控制元件通常在距离转录核酸1至1000个核苷酸内。
[0102] 在功能上，可操作地连接的核酸的表达至少部分地可由元件(例如启动子)控制，使得元件调节核酸的转录以及适当时调节转录物的翻译。表达控制元件的具体示例是启动子，其通常位于转录序列的5'端。与不存在启动子时表达的量相比，启动子通常增加从可操作地连接的核酸表达的量。
[0103] 如本文所用的“增强子”可以指邻近核酸序列，例如可选择标记，或异源核酸序列定位的序列。增强子元件通常位于启动子元件的上游，但也在序列的下游或序列内起作用且能位于序列的下游或序列内。因此，增强子元件可位于上游或下游，例如，在可选择标记和/或编码治疗性蛋白或多核苷酸序列的异源核酸的100个碱基对、200个碱基对、或300个或更多个碱基对内。增强子元件通常使可操作连接的核酸的表达增加高于由启动子元件提供的表达。
[0104] 术语“可操作地连接”是指将核酸序列表达所必需的调控序列置于相对于该序列的适当位置，以便实现核酸序列的表达。有时将相同的定义施用于表达载体(例如rAVV载体)中核酸序列和转录控制元件(例如启动子、增强子和终止元件)的排列。
[0105] 在与核酸可操作连接的表达控制元件的示例中，所述关系使得控制元件调节核酸的表达。更具体地，例如，可操作地连接的两个DNA序列意指两个DNA以使得至少一个DNA序列能够对另一个序列施加生理效应的这样的关系(顺式或反式)排列。
[0106] 因此，载体的附加元件包括但不限于表达控制(例如启动子/增强子)元件、转录终止信号或终止密码子、侧接序列如AAV ITR序列中的一个或多个拷贝的5'或3'非翻译区(例如聚腺苷酸化(polyA)序列)、或内含子。
[0107] 其他元件包括例如填料或填充物多核苷酸序列，例如以改善包装并减少污染核酸的存在。AAV载体通常接受具有一般为约4kb至约5.2kb或略多的尺寸范围的DNA插入物。因此，对于较短的序列而言，包含填充物或填料以便将长度调整至对于包装入rAAV颗粒的载体中而言可接受的病毒基因组序列的正常大小或接近正常大小。在各种实施方案中，填料/填充物核酸序列是核酸的未翻译(非蛋白编码)区段。对于小于4.7Kb的核酸序列，填料或填充物多核苷酸序列具有当与该序列组合(例如插入载体中)时具有介于约3.0- 5.5Kb之间、或介于约4.0-5.0Kb之间、或介于约4.3-4.8Kb之间的总长度的长度。
[0108] 在一实施方案中，“治疗性蛋白”是可以减缓或减轻由细胞或受试者中蛋白的量不足、缺乏或缺陷引起的症状的肽或蛋白。由转基因编码的“治疗性”蛋白可赋予受试者益处，例如，以纠正遗传缺陷，纠正基因(表达或功能)缺陷等。
[0109] 编码可根据本发明使用的基因产物(例如治疗性蛋白)的异源核酸的非限制性示例包括可用于治疗包括但不限于以下项在内的疾病或病症的那些：“止血”或血液凝固障碍，例如血友病A，具有抑制性抗体的血友病A 患者，血友病B，凝血因子VII、VIII、IX和X、XI、V、XII、II、血管性血友病因子中的缺陷，组合的FV/FVIII缺陷，地中海贫血，维生素K环氧化物还原酶C1缺乏症、γ-羧化酶缺陷；贫血，与创伤、损伤、血栓形成、血小板减少症、中风、凝血障碍、弥漫性血管内凝血(DIC)相关的出血；与肝素、低分子量肝素、五糖、华法林、小分子抗血栓药(即FXa抑制剂)相关的过度抗凝；和血小板功能障碍如Bernard Soulier综合征、Glanzman血小板功能障碍和储存池缺损。
[0110] 可以通过使用重组DNA技术方法来制备核酸分子、诸如克隆的载体、表达载体(例如载体基因组)和质粒。核苷酸序列信息的可用性使得能够通过各种手段制备核酸分子。例如，可使用各种标准克隆、重组DNA技术，经由细胞表达或体外翻译和化学合成技术来制备编码包含载体或质粒的因子IX(FIX)的异源核酸。多核苷酸的纯度可以通过测序、凝胶电泳等来测定。例如，可使用杂交或基于计算机的数据库筛选技术来分离核酸。这些技术包括但不限于：(1)基因组DNA或cDNA库与探针杂交以检测同源核苷酸序列；(2)抗体筛选以检测具有共享结构特征的多肽，例如使用表达文库；(3) 使用能够对感兴趣的核酸序列退火的引物对基因组DNA或cDNA进行聚合酶链式反应(PCR)；(4)针对相关序列对序列数据库进行计算机搜索；和(5)减去的核酸库的差异筛选。
[0111] 当用作组合物的改性剂时，术语“分离的”是指组合物由人工制造或完全或至少部分地从其天然存在的体内环境中分离。通常，分离的组合物基本上不含一种或多种其通常天然与之缔合的物质，例如一种或多种蛋白、核酸、脂质、碳水化合物、细胞膜。
[0112] 关于蛋白，本文中有时使用术语“分离的蛋白”或“分离和纯化的蛋白”。该术语主要指通过表达核酸分子产生的蛋白。另选地，该术语可指已经与可与其天然缔合的其他蛋白充分分离，以便以“基本上纯”的形式存在的蛋白。
[0113] 术语“分离的”不排除由人工制备的组合，例如重组rAAV以及药物制剂。术语“分离的”也不排除组合物的另选物理形式，例如杂合体/嵌合体、多聚体/寡聚体、修饰(例如磷酸化、糖基化、脂质化)或衍生化形式，或在由人工产生的宿主细胞中表达的形式
[0114] 术语“基本上纯的”是指包含至少50-60重量％的感兴趣的化合物 (例如，核酸、寡核苷酸、蛋白等)的制剂。该制剂可包含至少75重量％、或约90-99重量％的感兴趣的化合物。纯度通过适用于感兴趣的化合物的方法 (例如色谱法、琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳、HPLC分析等)测量。
[0115] 当提及具体核苷酸序列或氨基酸序列时，短语“基本上由...组成”是指具有给定序列的特性的序列。例如，当在提及氨基酸序列使用时，该短语包括序列本身和不影响该序列的基本特性和新型特征的分子修饰。
[0116] 本领域中已知的用于产生rAAV病毒粒子的方法：例如，与用一个AAV辅助病毒(例如，腺病毒、疱疹病毒或牛痘病毒)进行的共感染或用重组AAV载体、AAV辅助载体和补充功能载体进行的转染结合，使用AAV载体和AAV辅助序列进行转染。用于产生rAAV病毒粒子的非限制性方法描述于，例如，美国专利No.6,001,650和No.6,004,797、国际申请 PCT/US16/64414(公布为WO 2017/096039)以及美国临时申请No.62/516,432 和62/531,626中。在重组rAAV载体产生(即细胞培养系统中的载体产生)后， rAAV病毒粒子可以从宿主细胞和细胞培养上清液中获得，并如本文所述进行纯化。
[0117] 作为初始步骤，通常可以收获产生rAAV病毒粒子的宿主细胞，任选地与收获细胞培养物上清液(培养基)组合，其中培养了产生rAAV病毒粒子的宿主细胞(悬浮的或贴壁的)。在本文的方法中，收获的细胞和任选的细胞培养上清液可以原样使用、视情况使用或浓缩。此外，如果使用感染来表达补充功能，则可以使残留的辅助病毒失活。例如，腺病毒可以通过加热至约60℃的温度持续例如20分钟或更长时间而失活，这仅使辅助病毒失活，因为AAV是热稳定的，而辅助腺病毒是热不稳定的。
[0118] 通过破坏细胞，例如通过化学或物理手段，例如去污剂、微流化和/或均质化，裂解收获物的细胞和/或上清液，以释放rAAV颗粒。在细胞裂解期间的同时或在细胞裂解之后，可加入诸如全能核酸酶之类的核酸酶以降解污染的DNA。通常，澄清所得裂解物以除去细胞碎片，例如过滤，离心，以产生澄清的细胞裂解物。在特定示例中，用微米直径孔径过滤器(例如， 0.1-10.0μm孔径过滤器，例如，0.45μm和/或孔径0.2μm过滤器)过滤裂解物，以产生澄清的裂解物。
[0119] 裂解物(任选地澄清的)包含AAV颗粒(真正的rAAV载体，和 AAV空衣壳)和与AAV载体的生产/工艺相关的杂质，如来自宿主细胞的可溶性细胞成分，其可尤其包括细胞蛋白、脂质和/或核酸，和细胞培养基成分。然后将任选地澄清的裂解物进行另外的纯化步骤以使用色谱法从杂质中纯化 AAV颗粒(包括真正的rAAV载体)。在第一步色谱法之前，可以用适当的缓冲液稀释或者浓缩澄清的裂解物。
[0120] 如本文所公开的，在细胞裂解、进行任选的澄清和任选的稀释或浓缩之后，使用多个连续色谱法步骤来纯化rAAV颗粒。这些方法通常不包括氯化铯梯度超速离心步骤。
[0121] 如本文所公开的，第一色谱法步骤可以是阳离子交换色谱法或阴离子交换色谱法。如果第一色谱法步骤是阳离子交换色谱法，则第二色谱法步骤可以是阴离子交换色谱法或尺寸排阻色谱法(SEC)。因此，在一种rAAV 纯化方法中，通过阳离子交换色谱法纯化，然后通过阴离子交换色谱法纯化。
[0122] 替代地，如果第一色谱法步骤是阳离子交换色谱法，则第二色谱法步骤可以是尺寸排阻色谱法(SEC)。因此，在另一种rAAV纯化方法中，通过阳离子交换色谱法纯化，然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化。
[0123] 如本文中还公开的，第一色谱法步骤可以是亲和色谱法。如果第一色谱法步骤是亲和色谱法，则第二色谱法步骤可以是阴离子交换色谱法。因此，在另一种rAAV纯化方法中，纯化是通过亲和色谱法，然后是通过阴离子交换色谱法纯化。
[0124] 任选地，可以将第三色谱法添加到前述色谱法步骤中。通常，任选的第三色谱法步骤在阳离子交换色谱法、阴离子交换色谱法、尺寸排阻色谱法或亲和色谱法之后。
[0125] 因此，在附加的rAAV纯化方法中，纯化是经由阳离子交换色谱法，随后通过阴离子交换色谱法纯化，然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化来进行的。并且，在更进一步的rAAV纯化方法中，纯化是经由阳离子交换色谱法，然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化，然后通过阴离子交换色谱法纯化来进行的。
[0126] 在另一附加的rAAV纯化方法中，纯化是经由亲和色谱法，然后通过阴离子交换色谱法纯化，然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化来进行的。在另一种rAAV纯化方法中，纯化是经由亲和色谱法，然后通过尺寸排阻色谱法(SEC)纯化，然后通过阴离子交换色谱法纯化来进行的。
[0127] 阳离子交换色谱法用于将AAV颗粒与存在于来自尺寸排阻色谱法的澄清的裂解物和/或柱洗脱液中的细胞和其他组分分离。能够在宽pH范围内结合rAAV颗粒的强阳离子交换树脂的示例包括但不限于任何磺酸基树脂，如通过磺酸盐官能团的存在所指示的，包括芳基和烷基取代的磺酸盐，例如磺丙基或磺乙基树脂。代表性的基质包括但不限于POROS HS，POROS HS 50，POROS XS,POROS SP，和POROS S(可从Thermo Fisher Scientific, Inc.,Waltham,MA获得的强阳离子交换剂)。另外的示例包括Capto S,Capto S ImpAct,Capto S ImpRes(可从GE Healthcare,Marlborough,MA获得的强阳离子交换剂)，和可从Aldrich Chemical Company(Milliwaukee，WI)获得的商用和 系列树脂。弱阳离子交换树脂包括
但不限于任何羧酸基树脂。示例性的阳离子交换树脂还包括羧甲基 (CM)，磷酸(基于磷酸酯官能团)，甲基磺酸酯(S)和磺丙基(SP)树脂。
但不限于任何羧酸基树脂。示例性的阳离子交换树脂还包括羧甲基 (CM)，磷酸(基于磷酸酯官能团)，甲基磺酸酯(S)和磺丙基(SP)树脂。
[0128] 阴离子交换色谱法用于将AAV颗粒与存在于来自尺寸排阻色谱的澄清裂解物和/或柱洗出液中的蛋白、细胞和其他组分分离。阴离子交换色谱也可用于控制洗脱液中AAV空衣壳的量。例如，结合有rAAV载体的阴离子交换柱可以用中等浓度的NaCl洗涤(例如，约100-125mM，例如110- 115mM)，并且空衣壳中的一部分可以在流出物中洗脱，而无需大量洗脱rAAV载体。随后，可以使用较高浓度的NaCl(例如，约130-300mM Nacl)洗脱与阴离子交换柱结合的rAAV载体，从而产生具有减少或消耗的AAV空衣壳量和成比例增加的rAAV量的柱洗脱液。
[0129] 示例性的阴离子交换树脂包括但不限于基于多胺树脂和其他树脂的那些。强阴离子交换树脂的示例包括通常基于季铵化氮原子的那些，包括但不限于季铵盐树脂，如三烷基苄基铵树脂。合适的交换色谱包括但不限于 MACRO PREP Q(可从BioRad，Hercules，Calif.获得的强阴离子交换剂)； UNOSPHERE Q(可从BioRad，Hercules，Calif.获得的强阴离子交换剂)； POROS 50HQ(可从Applied Biosystems，Foster City，Calif.获得的强阴离子交换剂)；POROS XQ(可从Applied Biosystems,Foster City,Calif.获得的强阴离子交换剂)；POROS 50D(可从Applied Biosystems，Foster City，Calif.获得的弱阴离子交换剂)；POROS 50PI(可从Applied Biosystems，Foster City，Calif. 获得的弱阴离子交换剂)；Capto Q、Capto XQ、Capto Q ImpRes和SOURCE 30Q(可从GE healthcare,Marlborough,MA获得的强阴离子交换剂)；DEAE SEPHAROSE(可从Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.获得的弱阴离子交换剂)；Q SEPHAROSE(可从Amersham Biosciences，Piscataway，N.J.获得的强阴离子交换剂)。另外的示例性阴离子交换树脂包括氨基乙基(AE)、二乙基氨基乙基(DEAE)、二乙基氨基丙基(DEPE)和季氨基乙基(QAE)。
[0130] 在各种条件(例如pH和缓冲液体积)下，可以用各种缓冲液平衡、洗涤和洗脱色谱法介质，例如阳离子交换、阴离子交换、尺寸排阻和亲和性。以下旨在描述特定的非限制性实施例，但不旨在限制本发明。
[0131] 可以使用标准缓冲液并根据制造商的说明书平衡阳离子交换色谱法。例如，色谱法介质可以用磷酸盐缓冲液(浓度为5至100mM，或10- 50mM，例如10-30mM)和氯化钠平衡。平衡后，然后加载样品。随后，将色谱法介质洗涤至少一次或多次，例如2-10次。色谱法介质的洗脱是通过高盐缓冲液进行至少一次，但是用相同或更高的盐缓冲液洗脱可以是2次或更多次。
[0132] 用于阳离子交换色谱法的洗涤和洗脱的典型平衡缓冲液和溶液的适宜pH为约pH 3至pH 8，更通常为约pH 4至pH 7.5，例如pH 6.0-6.5、pH6.5-7.0、pH7.0-7.5，或者所述范围内或之间的任何pH值，例如pH 7.0、 pH 7.1、pH 7.2、pH 7.3或pH 7.4。
[0134] 在一实施方案中，首先平衡阳离子交换色谱法介质，施加样品，并用低盐浓度洗涤，例如用10-150mM的NaCl，例如10mM、20mM、25 mM、30mM、35mM、40mM、45mM、50mM、55mM、60mM、60- 125mM，或在这些范围处或之内的任何浓度(例如100mM)的NaCl洗涤。
[0135] 在第一次洗涤之后，可以用较高的盐浓度处理色谱法介质以洗脱杂质，例如用较高的NaCl浓度洗脱杂质，或者用具有较大离子强度的另一种缓冲液洗脱杂质。在从柱中洗脱另外的杂质后，为了洗脱rAAV颗粒，可以使用盐，例如NaCl、KCl、硫酸盐、甲酸盐或乙酸盐来增加缓冲液的离子强度，并回收。在一实施方案中，洗脱是使用高盐浓度，例如200-500mM的 NaCl，或在这些范围处或在这些范围内的任何浓度，例如250mM、 300mM、350mM或400mM。
[0136] 其他成分可以包含在平衡缓冲液和用于洗涤和洗脱的溶液中。例如，用于阳离子交换色谱的洗涤缓冲液可包括阴离子表面活性剂，如肌氨酰 (例如1-10mM)，用于阴离子交换色谱的洗涤缓冲液可包括阳离子表面活性剂，例如十二烷基三甲基氯化铵(例如1-10mM)。
[0137] 用于阴离子交换色谱法的洗涤和洗脱的典型平衡缓冲液和溶液适合在约pH 7.5至pH 12的pH下，更通常约pH 8.0至pH 10，甚至更通常约 pH 8.0至pH 9.0，例如pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4、pH 8.5、pH 8.6、 pH 8.7、pH 8.8、pH 8.9或pH 9.0。
[0138] 用于阴离子交换柱的洗涤和洗脱的合适的平衡缓冲液和溶液通常是阳离子或两性离子的。这些缓冲剂包括但不限于具有以下缓冲试剂的缓冲剂：N-甲基哌嗪；哌嗪；Bis-Tris；Bis-Tris丙烷；三乙醇胺；Tris；N-甲基二乙醇胺；1,3-二氨基丙烷；乙醇胺；乙酸等。为了洗脱样品，使用盐(例如 NaCl、KCl、硫酸盐、甲酸盐或乙酸盐)增加起始缓冲液的离子强度。这种用于洗涤和洗脱的平衡缓冲液和溶液可具有约5-100mM，更通常约10-50mM 的前述缓冲试剂。
[0139] 在一实施方案中，首先将阴离子交换色谱法介质平衡，施加样品，并用低盐浓度洗涤，例如用50-150mM的NaCl，例如50-60mM、60- 70mM、70-80mM、80-90mM、90-100mM、100-100mM，或在这些范围处或之内的任何浓度的NaCl洗涤。在第一次洗涤之后，可以用较高的盐浓度处理色谱法介质以洗脱杂质(例如AAV空衣壳)，例如用较高的NaCl浓度洗脱杂质，或者用具有较大离子强度的另一种缓冲液洗脱杂质。用作第二缓冲液的一个示例是具有浓度为约110mM-125mM(或在这些所述范围处或之内的任何浓度)的NaCl的Tris基缓冲液。
[0140] 在从柱中洗脱另外的杂质后，可以通过使用较高浓度的盐洗脱来回收AAV颗粒。洗脱缓冲液的一个示例是基于Tris的缓冲液，其NaCl浓度为125mM或更高，例如125-150mM、150-200mM或200-250mM NaCl，或在这些陈述的范围处或之内的任何浓度。
[0141] 在阴离子交换色谱法介质洗涤溶液中，可包括聚乙二醇(PEG)。这称为聚乙二醇(PEG)调制柱色谱法。在洗脱AAV载体颗粒之前，可以将 PEG洗涤溶液应用于阴离子交换色谱法介质。
[0142] 通常，这种洗涤溶液中的PEG具有约1,000至80,000g/mol(包括端值)的平均分子量。此类洗涤溶液中PEG的典型量为约0.1％至约20％PEG 或在所述范围处或在所述范围内的任何量，或约1％至约10％PEG或在所述范围处或在所述范围内的任何量。
[0143] 可以使用标准缓冲液并根据制造商的说明书平衡尺寸排阻色谱 (SEC)介质。例如，色谱介质可以用磷酸盐缓冲液(例如，浓度为约1至 5mM，5至50mM，或5至25mM)和NaCl(例如，浓度为50至100mM，100 至150mM，150至200mM，200至250mM，250至300mM或300至400mM 或在所述范围处或在所述范围内的任何量)平衡。
[0144] 平衡后，然后加载样品。随后，回收含有rAAV颗粒的流过物。基于色谱法介质的量和/或柱尺寸，可以添加额外体积的缓冲液(例如磷酸盐缓冲液)以用于rAAV颗粒回收。
[0145] 在特定实施方案中，尺寸排阻色谱法介质的分离范围(分子量)在约10,000和600,000之间，包括端值。适用于尺寸排阻色谱法的特定树脂(介质)包括但不限于多孔纤维素、交联琼脂糖(Sepharose,GE Healthcare, Marlborough,MA)、交联葡聚糖(Sephadex,GE Healthcare,Marlborough,MA)、苯乙烯-二乙烯基苯(Dianon HP-20)、聚丙烯酰胺(Bio Gel)、甲基丙烯酸 (Toyopearl)和可控孔玻璃的颗粒或珠粒。
[0146] 亲和柱通常由与底物连接或缀合的配体组成。配体的具体实例包括AAV结合抗体。此类底物包括琼脂糖凝胶和通常用于此类亲和纯化应用中的其他材料，并且可以制成或可商购获得(例如，AVB SepharoseTM High Performance，GE Healthcare，Marlborough，MA)。
[0147] 亲和色谱柱的用于洗涤和洗脱的适当平衡缓冲液和溶液通常是基于Tris或醋酸盐的。例如，亲和色谱介质可以用Tris缓冲液，例如约1-5 mM、5-50mM或5-20mM，和NaCl，例如约50-100mM，100-150mM， 150-200mM，200-250mM，250-300mM或这些所述的范围处或之内的任何数量平衡。
[0148] 亲和色谱法的典型平衡缓冲液的pH为约pH 7.5至pH 9.0，更通常为约pH 8.0至pH 8.5，甚至更通常pH为例如pH 8.0、pH 8.1、pH 8.2、pH 8.3、pH 8.4，或pH 8.5。
[0149] 平衡后，然后加载样品。随后，通过将缓冲液的pH降低至小于 7.0，从亲和柱中洗脱出rAAV颗粒。洗脱缓冲液可以基于乙酸盐，并且典型地pH小于5.0，更典型地小于4.0，例如小于3.0，更具体地在约2.0至3.0之间，或在这些所述的范围处或之内的任何pH。
[0150] 用于平衡、洗涤和洗脱的缓冲液的体积可以基于色谱法介质的量和/或柱尺寸以实现rAAV颗粒回收。典型的体积为1-10个柱体积。
[0151] 在每个色谱步骤的洗脱/流过之后收集柱洗脱液。可以使用标准技术检测在馏分中的AAV，例如监测260和280nm处的UV吸收。
[0152] 阳离子或阴离子交换色谱法介质的使用，所用介质的性质(即强或弱离子交换剂)以及盐浓度、使用的缓冲液和pH的状况可以根据AAV衣壳(即AAV衣壳血清型或假型)而变化。虽然AAV衣壳结构通常具有诸如尺寸和形状等特征，但衣壳可具有不同的氨基酸序列，这导致分子拓扑和表面电荷分布的细微差异。因此，预期衣壳序列变体可以通过本发明的方法进行纯化，并且可以使用色谱法介质和缓冲液筛选研究以系统方式确定相关方法，以确定是否将对AAV衣壳变体使用不同的条件，以用于rAAV颗粒纯化。
[0153] 如果需要，可以通过超滤/渗滤有效地浓缩来自如本文所述的任何阳离子交换、阴离子交换、尺寸排阻和/或亲和色谱步骤的rAAV颗粒的洗脱液。本领域技术人员可以控制体积的减少。在特定的非限制性示例中，实现的体积减少量在约50％-96.67％之间，包括端值。因此，50％的减少量使体积减少一半，例如，1000ml浓缩至500mL。90％的减少量使体积减小至 10％，例如，2000ml浓缩至200mL。95％的减少量使体积减小至5％，例如，2000ml浓缩至100mL。96.67％的减少量使体积减小至3.33％，2000ml浓缩至66.67mL。
[0154] 超滤/渗滤的非限制性示例是切向流过滤(TFF)。例如，具有对应于100kDa分子量截止值的标称孔径的中空纤维膜，使得当存在于更大体积的洗脱液中时可以制备大量的AAV载体。
[0155] 如果需要，可以稀释包含来自本文所述的阳离子交换、阴离子交换、尺寸排阻或亲和色谱步骤中的任一个的rAAV颗粒的细胞裂解物和柱洗脱液。典型的稀释度范围为25-100％，1-2倍，2-5倍或在这些所述的范围处或之内的任何体积或量。
[0156] 本发明的方法实现了rAAV颗粒的大量回收。例如，本发明的方法实现从宿主细胞和收获的宿主细胞培养上清液中回收全部rAAV载体颗粒中的约40-70％的rAAV颗粒。在另一个示例中，rAAV颗粒以约100mg/mL 的浓度存在于最终(例如，第三柱)洗脱液中。rAAV载体颗粒可以以约1010- 1011颗粒/mL或更多，约1011-1012颗粒/mL或更多，1012-1013颗粒/mL的浓度存在于最终(例如，第三柱)洗脱液中。
[0157] 替代地，如果rAAV载体颗粒浓度较低，则可以浓缩纯化的 rAAV颗粒。例如，可以通过超滤/渗滤(例如TFF)将纯化的AAV颗粒浓缩。如果需要更高浓度的载体，可以通过超滤/渗滤(例如TFF)将纯化的AAV颗粒浓缩至1012-1013颗粒/mL或更多，1013-1014颗粒/mL或更多。
[0158] 在其他实施方案中，当存在的病毒粒子的至少约30％或更多是具有包装的基因组的rAAV颗粒(即真正的rAAV载体颗粒)时，具有被包装的基因组(即，真正的rAAV载体颗粒)的rAAV颗粒“基本上不含”AAV-衣壳化的核酸杂质。基本上不含AAV衣壳化的核酸杂质的具有包装的基因组的 rAAV病毒粒子(即，真正的rAAV载体颗粒)的产量可以是包含AAV衣壳化的核酸杂质的产品的约40％至约20％或更少，约20％至约10％或更少，约10％至约5％或更少，约5％至约1％或小于1％或更少。
[0159] 确定含有转基因的AAV载体的感染滴度的方法是本领域已知的 (参见，例如，Zhen et al.,(2004)Hum.Gene Ther.(2004)15:709)。用于测定空衣壳和具有被包装的基因组的AAV载体颗粒的方法是已知的(参见，例如， Grimm et al.,Gene Therapy(1999)6:1322-1330；Sommer et al.,Molec.Ther. (2003)7:122-128)。
[0160] 为了测定降解/变性的衣壳的存在或数量，可以对纯化的AAV进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，其由能够分离三种衣壳蛋白的任何凝胶组成，例如，梯度凝胶，然后使凝胶运行直至样品分离，并将凝胶印迹到尼龙或硝酸纤维素膜上。然后将抗AAV衣壳抗体用作结合变性衣壳蛋白的一抗(参见，例如，Wobus et al.,J.Virol.(2000)74:9281-9293)。与一抗(primary antibody)结合的二抗含有检测一抗的手段。半定量检测一抗和二抗之间的结合以确定衣壳的量。另一种方法将是使用SEC柱的分析型HPLC或分析型超速离心。
[0161] 除非另有定义，否则本文所用的所有技术和科学术语均具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义。尽管在本发明的实践或测试中可使用与本文描述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料，但本文描述了适宜的方法和材料。
[0162] 本文引用的所有申请、出版物、专利和其他参考文献、基因库 (GenBank)引用和ATCC引文以参考形式全文并入。在冲突的情况下，说明书 (包括定义)将起控制作用。
[0163] 本文公开的所有特征可以以任何组合进行组合。说明书中公开的每个特征结构可由用于相同、等同或相似用途的另选的特征结构替代。因此，除非另有明确说明，否则公开的特征结构(例如，核酸序列、载体、 rAAV载体等)是具有等同或相似特征结构的示例。
[0164] 如本文所用，除非上下文另有明确指示，否则单数形式“一”、“一个”和“该”包括复数指代物。因此，例如，提及“AAV载体”或“AAV 颗粒”包括多个这样的AAV载体和AAV颗粒，并且提及“一细胞”或“宿主细胞”包括多个细胞和宿主细胞。
[0165] 本文所用的术语“约”是指在参考值的±10％内的值。
[0166] 如本文所用的，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或数值范围包括此类范围内的整数和值的分数或范围内的整数。因此，为了说明，提及80％或更多的同一性，包括81％、82％、83％、84％、85％、86％、 87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％等，以及
81.1％、81.2％、 81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
81.1％、81.2％、 81.3％、81.4％、81.5％等，82.1％、82.2％、82.3％、82.4％、82.5％等等。
[0167] 提及具有更多(更大)或更少的整数分别包括大于或小于参考数值的任何数值。因此，例如，提及小于100，包括99、98、97等，一路下降到数值一(1)；并且小于10，包括9、8、7等，一路下降到数值一(1)。
[0168] 如本文所使用的，所述的数值或范围都是包含端值的。此外，除非上下文另有明确指示，否则所有数值或范围包括此类范围内的值和整数的分数，以及此类范围内的整数的分数。因此，为了说明，提及数值范围，诸如1-10包括1、2、3、4、5、6、7、8、9、10，以及1.1、1.2、1.3、1.4、1.5 等等。因此提及1-50的范围包括11、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、 12、13、14、15、
16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、 1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、
2.5等。
16、17、18、19、20等，最多至并包括50，以及1.1、 1.2、1.3、1.4、1.5等，2.1、2.2、2.3、2.4、
2.5等。
[0169] 提及一系列范围包括将该系列内的不同范围的边界的值组合的范围。因此，为了说明提及的一系列范围，例如范围1-10、10-20、20-30、30- 40、40-50、50-60、60-75、75-100、100-150、150-200、200-250、250-300、 300-400、400-500、500-750、750-1000、1000-
1500、1500-2000、2000- 2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、
5500- 6000、6000-7000、7000-8000、或8000-9000，包括范围10-50、50-100、100- 1000、
1000-3000、2000-4000等。
1500、1500-2000、2000- 2500、2500-3000、3000-3500、3500-4000、4000-4500、4500-5000、
5500- 6000、6000-7000、7000-8000、或8000-9000，包括范围10-50、50-100、100- 1000、
1000-3000、2000-4000等。
[0170] 本文通常使用肯定语言描述多个实施方案和方面来公开本发明。本发明还具体地包括其中全部或部分排除特定主题，诸如物质或材料、方法步骤和条件、方案或程序的实施方案。例如，在本发明的某些实施方案或方面中，排除了材料和/或方法步骤。因此，尽管本发明在本文中一般不就本发明不包括的内容进行表达，但本发明中未明确排除的方面在本文中公开。
[0171] 已经描述了本发明的多个实施方案。然而，在不脱离本发明的精神和范围的情况下，本领域技术人员可对本发明进行各种改变和修改，以使其适应各种用途和条件。因此，以下实施例旨在说明而不是以任何方式限制本发明的范围。实施例
实施例1
示例性第一柱、阳离子交换或亲和性
1.1.阳离子，Poros50 HS(或ThermoFisher的Poros XS)。预处理，平衡，加载物料，洗涤和洗脱
1.1.1.示例性缓冲液列表
1.1.1.1.缓冲液，pH，电导率
a)预处理：注射用水
b)3×稀释缓冲液：60mM磷酸钠，pH 7.3
c)平衡缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.3，100mM NaCl
d)洗涤缓冲液1&3：20mM磷酸钠，pH 7.3，100mM NaCl
e)洗涤缓冲液2：20mM磷酸钠，pH 7.3，100mM NaCl，表面活性剂(5mM)，如肌氨酰
(Sarkosyl)
f)洗脱缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.3，300mM NaCl(可以大于 300mM，例如300-400mM NaCl，例如400mM NaCl)。
g)基于洗脱缓冲液体积(例如，收集在预先确定的峰前体积后的洗脱液)或O.D.A280的
增加(例如基准O.D.A280增加1mAu)收集洗脱物
h)色谱柱汽提液：高盐，如1M NaCl
i)消毒溶液：1M NaCl，1N NaOH
j)储存液：约22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.1.2.示范性的柱制备
1.1.2.1.预处理下流(4CV)WFI
1.1.2.2.平衡下流(4个CV)平衡缓冲液
1.1.3示范性纯化
1.1.3.1.加载物料下流(25CV)样品
1.1.3.2.洗涤1下流(4CV)洗涤1缓冲液
1.1.3.3.洗涤2下流(6CV)洗涤2缓冲液
1.1.3.4.洗涤3下流(8CV)洗涤3缓冲液
1.1.4.示例性批(洗涤)体积由规模、色谱柱尺寸决定
1.1.5.结合能力：2.5-3×加载(Poros50 HS)，有或没有UF(超滤)/DF(渗滤)。
1.1.6.示例性流量：150cm/h-300cm/h
1.1.7.加载能力：10L或以上
1.1.8.预期恢复率：60-90％
1.2.亲和力，AVB-Sepharose HP
1.2.1.缓冲液列表
1.2.1.1.缓冲液(pH，电导率)每批(block)体积
1.2.1.2.示例性缓冲液/解决方案
a)平衡缓冲液：20mM Tris，pH 8.0，250mM NaCl
b)洗脱缓冲液：10mM乙酸钠，pH 2.5，250mM NaCl
c)中和缓冲液：1M Tris-Cl，pH 10.5
d)消毒溶液：PAB(120mM磷酸，167mM乙酸，2.2％苯甲醇)
e)储存溶液：约22.5％的乙醇(18-22.5％)
1.2.2.示例性流率：约150cm/h或以上
1.2.3.预期恢复率：70-90％(AAV病毒粒子衣壳)，15-70％(载体基因组)
实施例2
示例性第二柱，阴离子交换或尺寸排阻
1.3.阴离子，Poros 50HQ(ThermoFisher的Poros XQ)。预处理，平衡，加载物料，清洗和洗脱
：用于双重功能(进一步纯化和空/全载体比例控制)
1.3.1.示例性缓冲液列表
1.3.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)3×(或4×)稀释缓冲液：约60mM(或约80mM)Tris，pH 8.5(例如，稀释后，加载材料的范围为10-50mM Tris，pH 8.0-8.5，100mM NaCl)
c)平衡缓冲液(并洗涤1缓冲液)：20mM Tris，pH 8.5，100mM NaCl
d)洗涤2缓冲液(用于去除AAV空衣壳)：20mM Tris，pH 8.5，115mM NaCl
e)洗脱缓冲液：20mM Tris，pH8.5，NaCl≥120mM，如 200mM NaCl
f)柱汽提缓冲液：1M NaCl
g)消毒液：1N NaOH
h)储存溶液：约22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.3.2.示范性的柱制备
1.3.2.1.预处理下流(5CV)WFI
1.3.2.2.平衡下流(4CV)平衡缓冲液
1.3.3.示例性纯化
1.3.3.1.加载物料下流(50CV)CEX洗脱液&稀释液
1.3.3.2.洗涤1下流(5CV)平衡缓冲液
1.3.3.3.洗脱1(空衣壳去除)下流(3CV)洗脱缓冲液1
1.3.3.4.洗脱2(完全AAV载体回收)下流(3CV)洗脱缓冲液2
1.3.4.示例性流率：150cm/h–300cm/h
1.4.尺寸排除，SEC(例如GE Healthcare的Superdex 200制备级)，可选
1.4.1.示例缓冲液列表
1.4.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)平衡的洗涤&洗脱缓冲液：10mM磷酸钠，pH 7.2，150- 300mM NaCl(较高的NaCl，例如
300mM应该会改善AAV载体(vg)的回收率。
c)根据洗脱缓冲液的体积(例如，在预先确定的峰前体积后收集洗脱液)或O.D.A280增
加，例如基准O.D.A280增加1mAu，收集洗脱液
d)消毒液：0.5N NaOH
e)储存液：22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.4.2.示例性柱制备
1.4.2.1.预处理下流(2CV)WFI
1.4.2.2.平衡下流(2CV)平衡缓冲液(PBS 300)
1.4.3.示例性纯化
1.4.3.1.加载物料下流(0.05CV)
1.4.3.2.洗脱下流(1.5CV)平衡缓冲液(dPBS)
1.4.4.示例性加载量：≤5％的柱体积
1.4.5.示例性流率：45cm/h
1.4.6.根据洗脱缓冲液体积或O.D.A280收集洗脱液。
实施例3
示例性的第三柱、尺寸排阻或阴离子交换。第三柱是任选的，当亲和性柱(例如AVB-
Sepharose HP)是第一柱时，则可能不需要。使用的第三柱也基于使用的第二柱(SEC>HQ或HQ>SEC等)。
1.5.尺寸排除，SEC(例如GE Healthcare提供的Superdex 200制备级)，可选
1.5.1.示例性缓冲区列表
1.5.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)平衡和运行缓冲液：10mM Na-P，pH 7.2，150-300mM NaCl(较高的NaCl，例如300mM应该改善AAV载体(vg)的回收率
c)根据洗脱缓冲液的体积(例如，在预先确定的峰前体积后收集洗脱液)或O.D.A280增
加，例如基准O.D.A280增加1mAu收集洗脱液。
d)消毒液：0.5N NaOH
e)储存溶液：22.5％乙醇
1.5.2.示例性的柱制备
1.5.2.1.预处理下流(2CV)WFI
1.5.2.2.平衡下流(2CV)平衡缓冲液(PBS 300)
1.5.3.示例性纯化
1.5.3.1.加载物料下流(0.05CV)
1.5.3.2.洗脱下流(1.5CV)平衡缓冲液(dPBS)
1.5.4.示例性加载量：≤5％的色谱柱体积
1.5.5.示例性流率：45cm/h
1.5.6.根据洗脱缓冲液体积或O.D.A280收集洗脱液。
1.6.阴离子，Poros 50HQ(ThermoFisher的Poros XQ)，用于双重功能(进一步 rAAV纯
化和空/全rAAV载体比例控制)。预处理，平衡，加载物料，清洗和洗脱
1.6.1.示例性缓冲液列表
1.6.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)3×(或4×)稀释缓冲液：60mM(或80mM)Tris，pH 8.5(例如，稀释后，加载材料的范围为10-50mM Tris，pH 8.0-8.5，100mM NaCl)
c)平衡缓冲液(并洗涤1缓冲液)：20mM Tris，pH 8.5，100mM NaCl
d)洗涤2缓冲液(用于去除AAV空衣壳)：20mM Tris，pH 8.5，115mM NaCl
e)洗脱缓冲液：20mM Tris，pH8.5，NaCl≥120mM，如 200mM NaCl
f)柱汽提缓冲液：1M NaCl
g)消毒液：1N NaOH
h)储存溶液：22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.6.2.示范性的柱制备
1.6.2.1.预处理下流(5CV)WFI
1.6.2.2.平衡下流(4CV)平衡缓冲液
1.6.3.示例性纯化
1.6.3.1.加载物料下流(50CV)CEX洗脱液&稀释液
1.6.3.2.洗涤1下流(5CV)平衡缓冲液
1.6.3.3.洗脱1(空衣壳去除)下流(3CV)洗脱缓冲液1
1.6.3.4.洗脱2(完全AAV载体回收)下流(3CV)洗脱缓冲液2
1.6.4.示例性流率：150cm/h–300cm/h
实施例4
在柱纯化之前的示例性细胞裂解和制备。
1.化学或物理细胞裂解
1.1示例性化学裂解方法
1.6.5.Triton X-100或等效的非离子表面活性剂
i.终浓度0.1％-1％
ii.孵育时间，最长1小时
iii.叶轮的搅拌速度通常约为400～600rpm(或更高)
iv.孵育温度为约25-37℃(例如37℃)
1.6.6.苯甲酰酶
i.终浓度，≥50U/mL，如100U/mL
ii.可以与表面活性剂同时或相继进行处理。
iii.MgCl2浓度为1.0-5.0mM(例如2mM)
1.1.3.附加的盐以有助于在过滤步骤期间或之后回收AAV载体
II.NaCl的最终浓度为200-400mM(例如300mM)
III.可以使用NaCl，与NaCl等效的其他盐
1.7.示例性的物理裂解方法(微流化，均质化等)
1.7.1.操作条件(基于10L贴壁细胞培养物，其可放大至更大体积)
i.压强约≤5,000psi
ii.温度约18-25℃
1.7.2.预处理&追赶(chasing)缓冲液
i.缓冲液，pH，电导率
全部取决于第一柱的加载条件；在大多数情况下，DF缓冲液与第一柱中用于平衡的缓
冲液相同或等效。如果HS是第一柱，则PBS可能是通用缓冲液)
对于苯甲酸酶处理，pH和电导率均应在苯甲酸酶工作条件范围内(例如，约pH 6.5-
8.5，电导率>15mS/cm)。用于DNA消化的典型苯甲酸酶量为 100-200U/mL。应添加2mM的MgCl2以进行适当的消化。
ii.体积
：预处理的体积必须大于系统的保留体积(最可能是保留体积的三倍)。
：追赶(chasing)量是样本量的5-10％。
2.切向流过滤(TFF，又名UF/DF)，任选的 2.1.使用空心纤维滤芯的TFF
2.1.1.在10L细胞培养物的情况下
i.TFF在细胞裂解前执行
ii.过滤器，例如10升的GE中空纤维滤芯UFP-100-C-9A(1.2m2)
iii.容量。初步数据表明20升应与相同的UFP-100-C-9A中空纤维滤芯一起使用。
iv.细胞裂解前或裂解后的TFF。细胞裂解前的TFR
v.最大压强。TMP.在细胞裂解前≥5psig(细胞裂解后5-10psi)
vi.用于预处理或追赶的缓冲液。(在阳离子HS的情况下)作为第一柱， pH 7-7.5/100-
150mM NaCl是合适的缓冲液，20mM磷酸盐缓冲液，在(阴离子 HQ)的情况下作为第一柱的，
20mM Tris，pH 7.5-8.5/100-150mM NaCl是合适的缓冲液。
2.1.2.如果在SEC柱前超滤以浓缩纯化的AAV载体的中间体
i.TFF以浓缩阴离子交换(Poros 50HQ)洗脱液至约占SEC柱体积的5％
ii.材料：Poros 50HQ洗脱液0.75柱体积
iii.配置：中空纤维UFP-C-100-4MA(起始体积为10升时)
iv.冲洗体积(保持体积)：～45mL
v.平衡缓冲液：PBS300(10mM Na-P，pH 7.2/300mM NaCl)
vi.消毒缓冲液：1N NaOH
vii.贴壁细胞培养物的相同条件是适用的。
vii.TFF可以在细胞裂解之前或细胞裂解之后进行。
2.1.3.TFF以用于最终配方和去除分子量小的杂质
i.材料：Poros50 HQ洗脱液(或SEC载体峰)
ii.配置：中空纤维UFP-C-100-4MA(起始体积为10升时)
iii.冲洗量(保持量)：～45mL
iv.平衡缓冲液：PBS180(10mM Na-P，pH 7.3/180mM NaCl)
v.渗滤缓冲液：PBS180(10mM Na-P，pH 7.3/180mM NaCl)
vi.消毒缓冲液：1N NaOH
vii.目标浓度：1.0E+13vg/mL
viii.渗滤：体积是超滤目标体积的12倍(5.0E12vg/mL)
2.2.使用螺旋缠绕膜模块或平板模块替代切向流(ATF)或TFF是使用中空纤维滤芯的
TFF的替代方案
3.澄清和过滤
3.1.深度过滤器
i.过滤器选项包括Clarisolve 20MS(0.5-20μM)，Sartoclear DL系列(10- 1μM)或
Millistak C0HC或D0HC(0.65-8μM)
ii.容量可以是1L/25cm2。
2 2
iii.最大流速，约250mL/min/25cm (10mL/min/cm)
iv.最大工作压强约32psig
v.关于PBS300的调节缓冲液可能很好
vi.过滤步骤数(一到两步，先粗过滤，然后精过滤)：可能一步：粗过滤
3.2.Millipore SHC(0.5/0.2μM)或Sartopore 2(0.45/0.2μM，Sartorius)
i.容量约500mL/500cm2(0.2％Triton X-100有一点帮助，增加10-20％)
ii.最大流率约1000mL/min/500cm2(2mL/min/cm2)
iii.最大工作压强约35psig
iv.对于调节缓冲液，例如PBS300
v.最后一步，容量可能会受到限制(大约需要55个最大Sartopore 2(1.8m2))；如果这
是第二过滤步骤，则可以增加容量
3.3如果是10L规模的贴壁细胞培养物
i.Sartopore 2MaxiCaps(1.2m2)可用于10L培养体积
ii.同一过滤器可用于20L培养体积物。
iii.预处理和追赶缓冲液的电导率可以为约15-30mS/cm，以防止AAV载体与膜之间的
潜在相互作用。
实施例5
1.0基于为500-600ml rAAV收获体积开发的工艺，1.2升及更大体积rAAV载体生产的理
想开发标准
1.1从1.2L生物反应器悬浮培养物中收获的rAAV载体(例如LK03-FVIII)
工艺标准 单位 用于分析的测定法
收获时的产量(滴度) ≥5x1010vg/mL qPCR
1.2从1.2L生物反应器悬浮培养物中纯化rAAV载体
实施例6
2.0从1.2L生物反应器悬浮培养物中收获rAAV载体(例如LK03-FVIII)
2.1工艺流程图
2.1.1以下是rAAV载体下游工艺的收获部分的示例性工艺流程图：
2.2工艺流程说明
2.2.1以下是rAAV载体下游工艺的收获部分的示例性工艺流程说明：
*LMH＝升/平方米/小时
2.3收获操作过程开发研究中变化的参数
2.3.1为开发rAAV载体下游工艺的收获部分评估了以下参数：
实施例7
如本文所公开的，可以以各种顺序选择和使用裂解方法、柱数和柱的类型。
4.0用于1.2L生物反应器悬浮培养物的色谱工艺
4.1在rAAV载体(例如LK03-FVIII)色谱工艺开发研究期间变化的参数
4.1.1为rAAV载体下游工艺的色谱部分开发了以下选项：
4.2示例性的非限制性色谱柱纯化顺序(A-E)：
A)第一柱，阳离子(Poros 50HS)→第二柱，阴离子(例如Poros 50HQ)
B)第一柱，阳离子(Poros 50HS)→第二柱，阴离子(例如Poros 50HQ)→第三柱，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)，
C)第一柱，阳离子(Poros 50HS)→第二柱，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)→第三柱，阴离子(例如，Poros 50HQ)
D)第一柱，亲和性(AVB Sepharose HP)→第二柱，阴离子(例如Poros 50HQ)→第三柱
(任选)，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)
E)第一柱，亲和性(AVB Sepharose HP)→第二柱，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)→
第三柱(任选)，阴离子(例如Poros 50HQ)
实施例8
代表性的AAV衣壳(VP1)蛋白。
AAV-SPK VP1衣壳(SEQ ID NO:1)
AAV-LK03 VP1衣壳(SEQ ID NO:2)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPV NAADAA
ALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLG LVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAP TSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQI SSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQ NDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRS SFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGT TNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNP GPAMASHKDDEEKFFPMHGNLI FGKEGTTASNAELDNVMI TDEEE IRTTNPVATEQYGTVANNLQ S SNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKI PHTDGHFHPS PLMGGFGLKHPPPQIMIK NTPVPANPPTTFS PAKFASFI TQYSTGQVSVE IEWELQKENSKRWNPE IQYTSNYNKSVNVDFTV DTNGVYSEPRPI
GTRYLTRPL。
实施例1
示例性第一柱、阳离子交换或亲和性
1.1.阳离子，Poros50 HS(或ThermoFisher的Poros XS)。预处理，平衡，加载物料，洗涤和洗脱
1.1.1.示例性缓冲液列表
1.1.1.1.缓冲液，pH，电导率
a)预处理：注射用水
b)3×稀释缓冲液：60mM磷酸钠，pH 7.3
c)平衡缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.3，100mM NaCl
d)洗涤缓冲液1&3：20mM磷酸钠，pH 7.3，100mM NaCl
e)洗涤缓冲液2：20mM磷酸钠，pH 7.3，100mM NaCl，表面活性剂(5mM)，如肌氨酰
(Sarkosyl)
f)洗脱缓冲液：20mM磷酸钠，pH 7.3，300mM NaCl(可以大于 300mM，例如300-400mM NaCl，例如400mM NaCl)。
g)基于洗脱缓冲液体积(例如，收集在预先确定的峰前体积后的洗脱液)或O.D.A280的
增加(例如基准O.D.A280增加1mAu)收集洗脱物
h)色谱柱汽提液：高盐，如1M NaCl
i)消毒溶液：1M NaCl，1N NaOH
j)储存液：约22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.1.2.示范性的柱制备
1.1.2.1.预处理下流(4CV)WFI
1.1.2.2.平衡下流(4个CV)平衡缓冲液
1.1.3示范性纯化
1.1.3.1.加载物料下流(25CV)样品
1.1.3.2.洗涤1下流(4CV)洗涤1缓冲液
1.1.3.3.洗涤2下流(6CV)洗涤2缓冲液
1.1.3.4.洗涤3下流(8CV)洗涤3缓冲液
1.1.4.示例性批(洗涤)体积由规模、色谱柱尺寸决定
1.1.5.结合能力：2.5-3×加载(Poros50 HS)，有或没有UF(超滤)/DF(渗滤)。
1.1.6.示例性流量：150cm/h-300cm/h
1.1.7.加载能力：10L或以上
1.1.8.预期恢复率：60-90％
1.2.亲和力，AVB-Sepharose HP
1.2.1.缓冲液列表
1.2.1.1.缓冲液(pH，电导率)每批(block)体积
1.2.1.2.示例性缓冲液/解决方案
a)平衡缓冲液：20mM Tris，pH 8.0，250mM NaCl
b)洗脱缓冲液：10mM乙酸钠，pH 2.5，250mM NaCl
c)中和缓冲液：1M Tris-Cl，pH 10.5
d)消毒溶液：PAB(120mM磷酸，167mM乙酸，2.2％苯甲醇)
e)储存溶液：约22.5％的乙醇(18-22.5％)
1.2.2.示例性流率：约150cm/h或以上
1.2.3.预期恢复率：70-90％(AAV病毒粒子衣壳)，15-70％(载体基因组)
实施例2
示例性第二柱，阴离子交换或尺寸排阻
1.3.阴离子，Poros 50HQ(ThermoFisher的Poros XQ)。预处理，平衡，加载物料，清洗和洗脱
：用于双重功能(进一步纯化和空/全载体比例控制)
1.3.1.示例性缓冲液列表
1.3.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)3×(或4×)稀释缓冲液：约60mM(或约80mM)Tris，pH 8.5(例如，稀释后，加载材料的范围为10-50mM Tris，pH 8.0-8.5，100mM NaCl)
c)平衡缓冲液(并洗涤1缓冲液)：20mM Tris，pH 8.5，100mM NaCl
d)洗涤2缓冲液(用于去除AAV空衣壳)：20mM Tris，pH 8.5，115mM NaCl
e)洗脱缓冲液：20mM Tris，pH8.5，NaCl≥120mM，如 200mM NaCl
f)柱汽提缓冲液：1M NaCl
g)消毒液：1N NaOH
h)储存溶液：约22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.3.2.示范性的柱制备
1.3.2.1.预处理下流(5CV)WFI
1.3.2.2.平衡下流(4CV)平衡缓冲液
1.3.3.示例性纯化
1.3.3.1.加载物料下流(50CV)CEX洗脱液&稀释液
1.3.3.2.洗涤1下流(5CV)平衡缓冲液
1.3.3.3.洗脱1(空衣壳去除)下流(3CV)洗脱缓冲液1
1.3.3.4.洗脱2(完全AAV载体回收)下流(3CV)洗脱缓冲液2
1.3.4.示例性流率：150cm/h–300cm/h
1.4.尺寸排除，SEC(例如GE Healthcare的Superdex 200制备级)，可选
1.4.1.示例缓冲液列表
1.4.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)平衡的洗涤&洗脱缓冲液：10mM磷酸钠，pH 7.2，150- 300mM NaCl(较高的NaCl，例如
300mM应该会改善AAV载体(vg)的回收率。
c)根据洗脱缓冲液的体积(例如，在预先确定的峰前体积后收集洗脱液)或O.D.A280增
加，例如基准O.D.A280增加1mAu，收集洗脱液
d)消毒液：0.5N NaOH
e)储存液：22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.4.2.示例性柱制备
1.4.2.1.预处理下流(2CV)WFI
1.4.2.2.平衡下流(2CV)平衡缓冲液(PBS 300)
1.4.3.示例性纯化
1.4.3.1.加载物料下流(0.05CV)
1.4.3.2.洗脱下流(1.5CV)平衡缓冲液(dPBS)
1.4.4.示例性加载量：≤5％的柱体积
1.4.5.示例性流率：45cm/h
1.4.6.根据洗脱缓冲液体积或O.D.A280收集洗脱液。
实施例3
示例性的第三柱、尺寸排阻或阴离子交换。第三柱是任选的，当亲和性柱(例如AVB-
Sepharose HP)是第一柱时，则可能不需要。使用的第三柱也基于使用的第二柱(SEC>HQ或HQ>SEC等)。
1.5.尺寸排除，SEC(例如GE Healthcare提供的Superdex 200制备级)，可选
1.5.1.示例性缓冲区列表
1.5.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)平衡和运行缓冲液：10mM Na-P，pH 7.2，150-300mM NaCl(较高的NaCl，例如300mM应该改善AAV载体(vg)的回收率
c)根据洗脱缓冲液的体积(例如，在预先确定的峰前体积后收集洗脱液)或O.D.A280增
加，例如基准O.D.A280增加1mAu收集洗脱液。
d)消毒液：0.5N NaOH
e)储存溶液：22.5％乙醇
1.5.2.示例性的柱制备
1.5.2.1.预处理下流(2CV)WFI
1.5.2.2.平衡下流(2CV)平衡缓冲液(PBS 300)
1.5.3.示例性纯化
1.5.3.1.加载物料下流(0.05CV)
1.5.3.2.洗脱下流(1.5CV)平衡缓冲液(dPBS)
1.5.4.示例性加载量：≤5％的色谱柱体积
1.5.5.示例性流率：45cm/h
1.5.6.根据洗脱缓冲液体积或O.D.A280收集洗脱液。
1.6.阴离子，Poros 50HQ(ThermoFisher的Poros XQ)，用于双重功能(进一步 rAAV纯
化和空/全rAAV载体比例控制)。预处理，平衡，加载物料，清洗和洗脱
1.6.1.示例性缓冲液列表
1.6.1.1.缓冲液，pH，电导率，每批体积
a)预处理：注射用水
b)3×(或4×)稀释缓冲液：60mM(或80mM)Tris，pH 8.5(例如，稀释后，加载材料的范围为10-50mM Tris，pH 8.0-8.5，100mM NaCl)
c)平衡缓冲液(并洗涤1缓冲液)：20mM Tris，pH 8.5，100mM NaCl
d)洗涤2缓冲液(用于去除AAV空衣壳)：20mM Tris，pH 8.5，115mM NaCl
e)洗脱缓冲液：20mM Tris，pH8.5，NaCl≥120mM，如 200mM NaCl
f)柱汽提缓冲液：1M NaCl
g)消毒液：1N NaOH
h)储存溶液：22.5％的乙醇(例如18-22.5％)
1.6.2.示范性的柱制备
1.6.2.1.预处理下流(5CV)WFI
1.6.2.2.平衡下流(4CV)平衡缓冲液
1.6.3.示例性纯化
1.6.3.1.加载物料下流(50CV)CEX洗脱液&稀释液
1.6.3.2.洗涤1下流(5CV)平衡缓冲液
1.6.3.3.洗脱1(空衣壳去除)下流(3CV)洗脱缓冲液1
1.6.3.4.洗脱2(完全AAV载体回收)下流(3CV)洗脱缓冲液2
1.6.4.示例性流率：150cm/h–300cm/h
实施例4
在柱纯化之前的示例性细胞裂解和制备。
1.化学或物理细胞裂解
1.1示例性化学裂解方法
1.6.5.Triton X-100或等效的非离子表面活性剂
i.终浓度0.1％-1％
ii.孵育时间，最长1小时
iii.叶轮的搅拌速度通常约为400～600rpm(或更高)
iv.孵育温度为约25-37℃(例如37℃)
1.6.6.苯甲酰酶
i.终浓度，≥50U/mL，如100U/mL
ii.可以与表面活性剂同时或相继进行处理。
iii.MgCl2浓度为1.0-5.0mM(例如2mM)
1.1.3.附加的盐以有助于在过滤步骤期间或之后回收AAV载体
II.NaCl的最终浓度为200-400mM(例如300mM)
III.可以使用NaCl，与NaCl等效的其他盐
1.7.示例性的物理裂解方法(微流化，均质化等)
1.7.1.操作条件(基于10L贴壁细胞培养物，其可放大至更大体积)
i.压强约≤5,000psi
ii.温度约18-25℃
1.7.2.预处理&追赶(chasing)缓冲液
i.缓冲液，pH，电导率
全部取决于第一柱的加载条件；在大多数情况下，DF缓冲液与第一柱中用于平衡的缓
冲液相同或等效。如果HS是第一柱，则PBS可能是通用缓冲液)
对于苯甲酸酶处理，pH和电导率均应在苯甲酸酶工作条件范围内(例如，约pH 6.5-
8.5，电导率>15mS/cm)。用于DNA消化的典型苯甲酸酶量为 100-200U/mL。应添加2mM的MgCl2以进行适当的消化。
ii.体积
：预处理的体积必须大于系统的保留体积(最可能是保留体积的三倍)。
：追赶(chasing)量是样本量的5-10％。
2.切向流过滤(TFF，又名UF/DF)，任选的 2.1.使用空心纤维滤芯的TFF
2.1.1.在10L细胞培养物的情况下
i.TFF在细胞裂解前执行
ii.过滤器，例如10升的GE中空纤维滤芯UFP-100-C-9A(1.2m2)
iii.容量。初步数据表明20升应与相同的UFP-100-C-9A中空纤维滤芯一起使用。
iv.细胞裂解前或裂解后的TFF。细胞裂解前的TFR
v.最大压强。TMP.在细胞裂解前≥5psig(细胞裂解后5-10psi)
vi.用于预处理或追赶的缓冲液。(在阳离子HS的情况下)作为第一柱， pH 7-7.5/100-
150mM NaCl是合适的缓冲液，20mM磷酸盐缓冲液，在(阴离子 HQ)的情况下作为第一柱的，
20mM Tris，pH 7.5-8.5/100-150mM NaCl是合适的缓冲液。
2.1.2.如果在SEC柱前超滤以浓缩纯化的AAV载体的中间体
i.TFF以浓缩阴离子交换(Poros 50HQ)洗脱液至约占SEC柱体积的5％
ii.材料：Poros 50HQ洗脱液0.75柱体积
iii.配置：中空纤维UFP-C-100-4MA(起始体积为10升时)
iv.冲洗体积(保持体积)：～45mL
v.平衡缓冲液：PBS300(10mM Na-P，pH 7.2/300mM NaCl)
vi.消毒缓冲液：1N NaOH
vii.贴壁细胞培养物的相同条件是适用的。
vii.TFF可以在细胞裂解之前或细胞裂解之后进行。
2.1.3.TFF以用于最终配方和去除分子量小的杂质
i.材料：Poros50 HQ洗脱液(或SEC载体峰)
ii.配置：中空纤维UFP-C-100-4MA(起始体积为10升时)
iii.冲洗量(保持量)：～45mL
iv.平衡缓冲液：PBS180(10mM Na-P，pH 7.3/180mM NaCl)
v.渗滤缓冲液：PBS180(10mM Na-P，pH 7.3/180mM NaCl)
vi.消毒缓冲液：1N NaOH
vii.目标浓度：1.0E+13vg/mL
viii.渗滤：体积是超滤目标体积的12倍(5.0E12vg/mL)
2.2.使用螺旋缠绕膜模块或平板模块替代切向流(ATF)或TFF是使用中空纤维滤芯的
TFF的替代方案
3.澄清和过滤
3.1.深度过滤器
i.过滤器选项包括Clarisolve 20MS(0.5-20μM)，Sartoclear DL系列(10- 1μM)或
Millistak C0HC或D0HC(0.65-8μM)
ii.容量可以是1L/25cm2。
2 2
iii.最大流速，约250mL/min/25cm (10mL/min/cm)
iv.最大工作压强约32psig
v.关于PBS300的调节缓冲液可能很好
vi.过滤步骤数(一到两步，先粗过滤，然后精过滤)：可能一步：粗过滤
3.2.Millipore SHC(0.5/0.2μM)或Sartopore 2(0.45/0.2μM，Sartorius)
i.容量约500mL/500cm2(0.2％Triton X-100有一点帮助，增加10-20％)
ii.最大流率约1000mL/min/500cm2(2mL/min/cm2)
iii.最大工作压强约35psig
iv.对于调节缓冲液，例如PBS300
v.最后一步，容量可能会受到限制(大约需要55个最大Sartopore 2(1.8m2))；如果这
是第二过滤步骤，则可以增加容量
3.3如果是10L规模的贴壁细胞培养物
i.Sartopore 2MaxiCaps(1.2m2)可用于10L培养体积
ii.同一过滤器可用于20L培养体积物。
iii.预处理和追赶缓冲液的电导率可以为约15-30mS/cm，以防止AAV载体与膜之间的
潜在相互作用。
实施例5
1.0基于为500-600ml rAAV收获体积开发的工艺，1.2升及更大体积rAAV载体生产的理
想开发标准
1.1从1.2L生物反应器悬浮培养物中收获的rAAV载体(例如LK03-FVIII)
工艺标准 单位 用于分析的测定法
收获时的产量(滴度) ≥5x1010vg/mL qPCR
1.2从1.2L生物反应器悬浮培养物中纯化rAAV载体
实施例6
2.0从1.2L生物反应器悬浮培养物中收获rAAV载体(例如LK03-FVIII)
2.1工艺流程图
2.1.1以下是rAAV载体下游工艺的收获部分的示例性工艺流程图：
2.2工艺流程说明
2.2.1以下是rAAV载体下游工艺的收获部分的示例性工艺流程说明：
*LMH＝升/平方米/小时
2.3收获操作过程开发研究中变化的参数
2.3.1为开发rAAV载体下游工艺的收获部分评估了以下参数：
实施例7
如本文所公开的，可以以各种顺序选择和使用裂解方法、柱数和柱的类型。
4.0用于1.2L生物反应器悬浮培养物的色谱工艺
4.1在rAAV载体(例如LK03-FVIII)色谱工艺开发研究期间变化的参数
4.1.1为rAAV载体下游工艺的色谱部分开发了以下选项：
4.2示例性的非限制性色谱柱纯化顺序(A-E)：
A)第一柱，阳离子(Poros 50HS)→第二柱，阴离子(例如Poros 50HQ)
B)第一柱，阳离子(Poros 50HS)→第二柱，阴离子(例如Poros 50HQ)→第三柱，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)，
C)第一柱，阳离子(Poros 50HS)→第二柱，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)→第三柱，阴离子(例如，Poros 50HQ)
D)第一柱，亲和性(AVB Sepharose HP)→第二柱，阴离子(例如Poros 50HQ)→第三柱
(任选)，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)
E)第一柱，亲和性(AVB Sepharose HP)→第二柱，尺寸排阻(例如Superdex 200PG)→
第三柱(任选)，阴离子(例如Poros 50HQ)
实施例8
代表性的AAV衣壳(VP1)蛋白。
AAV-SPK VP1衣壳(SEQ ID NO:1)
AAV-LK03 VP1衣壳(SEQ ID NO:2)
MAADGYLPDWLEDNLSEGIREWWALQPGAPKPKANQQHQDNARGLVLPGYKYLGPGNGLDKGEPV NAADAA
ALEHDKAYDQQLKAGDNPYLKYNHADAEFQERLKEDTSFGGNLGRAVFQAKKRLLEPLG LVEEAAKTAPGKKRPVDQSPQEPDSSSGVGKSGKQPARKRLNFGQTGDSESVPDPQPLGEPPAAP TSLGSNTMASGGGAPMADNNEGADGVGNSSGNWHCDSQWLGDRVITTSTRTWALPTYNNHLYKQI SSQSGASNDNHYFGYSTPWGYFDFNRFHCHFSPRDWQRLINNNWGFRPKKLSFKLFNIQVKEVTQ NDGTTTIANNLTSTVQVFTDSEYQLPYVLGSAHQGCLPPFPADVFMVPQYGYLTLNNGSQAVGRS SFYCLEYFPSQMLRTGNNFQFSYTFEDVPFHSSYAHSQSLDRLMNPLIDQYLYYLNRTQGTTSGT TNQSRLLFSQAGPQSMSLQARNWLPGPCYRQQRLSKTANDNNNSNFPWTAASKYHLNGRDSLVNP GPAMASHKDDEEKFFPMHGNLI FGKEGTTASNAELDNVMI TDEEE IRTTNPVATEQYGTVANNLQ S SNTAPTTRTVNDQGALPGMVWQDRDVYLQGPIWAKI PHTDGHFHPS PLMGGFGLKHPPPQIMIK NTPVPANPPTTFS PAKFASFI TQYSTGQVSVE IEWELQKENSKRWNPE IQYTSNYNKSVNVDFTV DTNGVYSEPRPI
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