一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法专利检索-抗营养因子饲料和饲养专利检索查询-专利查询网

一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法

阅读：570发布：2020-05-12

专利汇可以提供一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法，该多功能融合酶可以表达木聚糖酶、植酸酶、果胶酶，葡聚糖酶和纤维素酶，将其用于后期制备相应的转基因动物，该动物将自身分泌这些酶，起到消化饲料中木聚糖、植酸、果胶、葡聚糖酶和纤维素等抗营养因子，达到提高饲料利用率，减少污染排放的功效。同时，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低的问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到多基因高效共表达的目的。，下面是一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种多功能融合酶，其特征在于，所述的多功能融合酶可以表达木聚糖酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶和纤维素酶活性。
2.根据权利要求1所述的多功能融合酶，其特征在于，所述的多功能融合酶基因由木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-果胶酶基因-A3'-纤维素酶基因组成。
3.根据权利要求2所述的多功能融合酶，其特征在于，所述的A3的基因序列如SEQ ID No:5所示。
4.根据权利要求2所述的多功能融合酶，其特征在于，所述的A3'基因序列如SEQ ID No:6所示。
5.根据权利要求2-4任一项所述的多功能融合酶，其特征在于，所述的多功能融合酶基因序列如SEQ ID No:11所示。
6.根据权利要求1所述的多功能融合酶，其特征在于，所述的多功能融合酶具有如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列。
7.一种多功能融合酶真核表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体包括如权利要求5或6所述的多功能融合酶。
8.根据权利要求7所述的多功能融合酶真核表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体的基因序列如SEQ ID No:13所示。
9.根据权利要求8所述的多功能融合酶真核表达载体，其特征在于，所述的真核表达载体的构建方法，包括如下步骤：
候选目的基因的筛选和优化；
连接肽的设计；
目的基因与连接肽连接；
多功能融合酶基因XAPT的合成；
构建CEP112位点定点转XAPT基因表达载体。
10.根据权利要求9所述的多功能融合酶真核表达载体，其特征在于，所述的构建CEP112位点定点转XAPT基因表达载体包括如下步骤：
将XAPT多顺反子替换CEP112-LA340RA3219载体中BEXA顺反子，构建新载体Cep112-mPSP-XAPT；
用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XAPT，然后用inf-npsp引物扩增npsp上游调控区，并替换现有mpsp序列；
构建CEP112位点定点转XAPT基因表达载体Cep112-npsp-XAPT。

说明书全文

一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建

方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法。

背景技术

[0002] 重组融合蛋白的构建需要两个因素：组成蛋白和连接肽。组成蛋白是根据所需融合蛋白产物的功能来进行选择的，在大多数情况下是相对简单的。而选择合适的连接肽却较困难，且在融合蛋白的设计过程中容易被忽略。若功能域不用连接肽直接进行融合会导致一些不良结果，如融合蛋白的错误折叠，产量低或者活性受损等。因此，连接肽的理性设计和选择对于融合蛋白的构建十分重要。

[0003] 柔性连接肽因其灵活的伸展与弯曲性更适用于靶点不同、自身无相互作用的两种蛋白的融合。柔性连接肽一般由分子量小的非极性氨基酸(如甘氨酸)或者极性氨基酸(如丝氨酸或苏氨酸)组成。最典型的一个例子就是由Huston等人提出的(GGGGS)n(一般n≤6)序列，通过调整重复数n，优化GS连接肽的长度使得功能域适当分开或者保持域间的作用。随着柔性连接肽的广泛应用，一些问题随之而来。柔软的连接肽使得两端的功能蛋白可以随意游动，当形成并肩靠拢的构象时，这种“肩并肩”的结构使得融合蛋白整体紧凑缠绕容易形成二聚体，靠拢挤压的构象也使得活性位点可能被缠绕或遮蔽，导致活性的下降。

[0004] 2A自剪切肽，其上游基因带着一个2A尾巴残基，下游基因带一个p氨酸残基，对蛋白活性存在潜在不良影响，部分蛋白结构也会影响2A自剪切。因此，2A介导的多基因融合表达存在共表达效率不高，多基因融合酶的首尾基因表达不一致的问题。

[0005] 刚性连接肽使用一种成α-螺旋结构的连接肽，其刚性结构有效的控制了两端功能蛋白的相对位置和距离，充分的分隔开不同的结构域，使其相互影响达到最小。最常用的一种刚性连接肽氨基酸序列为EAAAK，其中的Glu(E)-…Lys+(K)形成的盐桥使这种螺旋具有稳定的二级结构，可以通过控制氨基酸排列来有效控制两端蛋白的距离。

[0006] 连接肽最重要的指标是氨基酸链的长度，刘磊等在对白蛋白与干扰素融合蛋白的研究中发现，不同长度的GGGGS连接肽对融合蛋白的表达量和活性有着不同的影响，并不是连接肽越长表达量就越高。

[0007] 刚性肽和柔性肽的缺点，仅用于两个功能蛋白的组合，不能用于2个以上蛋白的组合，在多功能酶构建时单独使用刚性态或柔性肽或2A都会影响其中一个或多个的基因表达或其生物活性。

[0008] 由于饲料中含有大量的抗营养因子，而在饲料中添加这些抗营养因子的酶，不仅成本高，而且饲料加工、储存过程中酶活不稳定，容易失活，也增加了饲料的生产成本和储存成本。若是动物自身可以分泌这些酶，将饲料中的抗营养因子经自身分泌的酶进行消化吸收，不仅可以降低饲料的生产成本，还可以提高饲料的利用率，更可以减少饲料中未消化的氮、磷及其组成的有机化合物的污染排放。

发明内容

[0009] 本公开提供一种多功能融合酶和多功能融合酶真核表达载体及其构建方法，该多功能融合酶可以表达木聚糖酶、植酸酶、果胶酶，葡聚糖酶和纤维素酶，将其用于后期制备相应的转基因动物，该动物将自身分泌这些酶，起到消化饲料中木聚糖、植酸、果胶、葡聚糖、纤维素等抗营养因子，达到提高饲料利用率，减少污染排放的功效。同时，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低的问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到多基因高效共表达的目的。

[0010] 根据本公开的一个方面，提供了多功能融合酶，该多功能酶可以同时表达木聚糖酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶和纤维素酶活性。

[0011] 在某些实施方式中，该多功能融合酶基因由木聚糖酶基因-A3-植酸酶基因-furin-P2A-果胶酶基因-A3'-纤维素酶基因组成。由于在2个以上蛋白共表达时，单纯使用2A或刚性肽都很难实现所有基因共表达，本发明通过组合应用刚性肽A3和2A，解决刚性肽介导两个以上融合蛋白共表达时相互干扰问题；解决2A连接肽多基因共表达效率低的问题，及多基因共表达中2A多肽残基对上游酶蛋白干扰的问题，达到多基因高效共表达的效果。同时，与单纯2A连接肽相比，本发明利用A3和furin P2A构建XAPT显著提高四种酶不同PH条件下的活性，消除2A多肽对上游基因的影响，也避免部分蛋白空间结构抑制2A反应活性的问题，同时还避开对不同蛋白顺序优化繁琐试验过程，酶表达量比2A更高。刚性肽只能用于两种融合酶的构建，本发明将2A和A3巧妙结合，即保留A3优势，又增强融合酶的多基因共表达能力。在融合酶第二和第三号基因连接处采用自剪切效率最高的P2A，同时在其N端添加furin酶识别基序RVKR，RVKR可在细胞器高尔基体高效剪切，仅残留4个氨基酸残基，该设计与一般2A序列，具有更高的剪切效率，对表达产物影响最小。由此，通过本公开设计获得的XAPT基因序列，可以高效表达木聚糖酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶和纤维素酶活性，解决了四种基因共表达的难题，更为以后将其用于转基因动物和酶发酵工业生产来提高基因转移和酶的生产效率提供了基础。同时，在公开号为CN106086068A 专利中公开的，采用2A连接两个基因序列时，两个基因的连接顺序都会影响基因的表达及功能的发挥，而且两个基因的酶活都不及单基因的酶活高；在多基因连接时，若只采用2A连接态，这种位置效应会更加明显，对于每个基因酶活的影响会更加突出。但是本公开采用A3和2A连接态组合使用构建的上述多功能酶基因，可以克服位置效应，每个基因表达的酶活与单基因相当。

[0012] 在某些实施方式中，该多功能融合酶基因中A3的基因序列如SEQ ID No:5所示。

[0013] 在某些实施方式中，该多功能融合酶基因中A3'的基因序列如SEQ ID No:6所示。

[0014] 在某些实施方式中，该多功能融合酶基因序列如SEQ ID No:11所示。由于2A多肽高效的自剪切功能，可较好实现前后两个蛋白的共表达，被誉为蛋白融合表达最可靠的linker。但是，部分酶蛋白融合2A的C端多肽后功能显著受损，后一个蛋白的表达量降低。多基因共表达时，对蛋白组合顺序要求苛刻，需要繁琐验证排列组合，才能实现低水平的共表达(公开号为CN106086068A专利中已表明此现象)，不利于多功能融合酶的构建。2A序列剪切效率与上游多肽基序有关，部分蛋白氨基酸基序会严重影响2A切割活性，导致2A介导前后两个酶因无法完全切割，导致二级结构折叠异常，还有可能被上游基因信号肽迁移到靶向错误的细胞器，无法正确的加工和分泌，导致功能尚失，表达失败。本公开中，采用A3与2A连接态组合使用的方式来构建4种基因融合表达的多功能融合酶，可以克服2A及A3连接态各自的缺点，使该多功能融合酶可以高效的表达四种酶活，可为获得表达该四种酶的转基因动物做好基础。

[0015] 在某些实施方式中，该多功能融合酶具有如SEQ ID No:12所示的氨基酸序列。连接肽最重要的指标是氨基酸链的长度，不同长度的GGGGS连接肽对融合蛋白的表达量和活性有着不同的影响，并不是连接肽越长表达量就越高。融合酶对柔性肽要求比较苛刻，过长或过短的柔性肽都不利于融合酶活性。分子质量大、结构复杂的蛋白需要的折叠空间也就越大，连接肽也应加长，但过长的肽链可能会增加抗原性，同时也易被酶水解断裂。连接肽过短形成空间位阻效应会影响蛋白的正确折叠，也提高了聚体形成的几率。刚性连接肽由于二级结构的稳固，不可伸展弯曲的特性，常用来固定两端功能蛋白间距，保证功能域的完整。由此，设计的刚性连接态A3/A3'与P2A共同作用连接4个基因，实现4个基因的共表达，A3/A3'与P2A连接态序列经过优化设计，使得木聚糖酶、植酸酶、果胶酶、葡聚糖酶和纤维素酶均可高效表达。

[0016] 根据本公开的另一个方面，提供了一种多功能融合酶真核表达载体，该真核表达载体包括如权利要求5或6所述的多功能融合酶。

[0017] 在某些实施方式中，多功能融合酶真核表达载体的基因序列如SEQ ID No:13所示。

[0018] 根据本公开的再一个方面，提供了一种多功能融合酶真核表达载体的构建方法，其包括如下步骤：

[0019] 候选目的基因的筛选和优化；

[0020] 连接态的设计；

[0021] 目的基因与连接态连接；

[0022] 多功能融合酶基因XAPT的合成；

[0023] 构建CEP112位点定点转XAPT基因表达载体。

[0024] 在某些实施方式中，构建CEP112位点定点转XAPT基因表达载体包括如下步骤：

[0025] 将XAPT多顺反子替换CEP112-LA340RA3219载体中BEXA顺反子，构建新载体Cep112-mPSP-XAPT；

[0026] 用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XAPT，然后用inf-npsp引物扩增npsp上游调控区，并替换现有mpsp序列；

[0027] 构建CEP112位点定点转XAPT基因表达载体Cep112-npsp-XAPT。

[0028] 本公开的有益效果：

[0029] 1)本公开设计构建xynB-A3-APPA-furin-P2A-pg7fnss-A3'-TeEG(XAPT)融合酶，具有共表达酸性木聚糖酶，植酸酶，果胶酶和葡聚糖酶和纤维素酶五种酶活性，囊括饲料中消除主要抗营养因子所需要水解酶，对提高饲料转化率具有重要价值。该设计提高了基因表达效率，若将其用于转基因动物和酶发酵工业生产，能显著提高基因转移和酶的生产效率，具有重要的经济价值；

[0030] 2)与单纯2A连接肽相比，本发明获得XAPT显著提高四种酶不同PH条件下的活性，消除2A多肽对上游基因的影响，也避免部分蛋白空间结构抑制2A反应活性的问题，同时还避开对不同蛋白顺序优化繁琐试验过程；

[0031] 3)刚性肽只能用于两种融合酶的构建，本发明将2A和A3巧妙结合，即保留A3优势，又增强融合酶的多基因共表达能力；

[0032] 4)本发明在融合酶第二和第三号基因连接处采用自剪切效率最高的P2A，同时在其N端添加furin酶识别基序RVKR，RVKR可在细胞器高尔基体高效剪切，仅残留4个氨基酸残基，该设计与一般2A序列，具有更高的剪切效率，对表达产物影响最小。

[0033] 5)本公开携带XAPT由猪CEP112位点高效定点整合载体运载，可高效制备转基因猪，快速获得整合位置一致的转基因家系，培育转基因猪新品种。附图说明

[0034] 图1为pxynB-A3-APPA-furin-P2A-ppg7fns-A3'-TeEG(XAPT)结构示意图；

[0035] 图2为木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)双顺反子优化组合与表达结果：A.木聚糖酶-植酸酶双顺反子优化组合设计示意图；B.xynB的pH范围；C.appA的pH范围；D.xynB的pH稳定性(39.℃，2h)；appA的pH稳定性(39.℃，2h)；

[0036] 图3为果胶酶(pg7fns)-纤维素酶(TeEGⅠ)双顺反子优化组合与表达结果：A.pg7fns-TeEGⅠ双顺反子优化组合设计示意图；B.果胶酶最适pH酶活比较；C.纤维素酶最适pH酶活比较；D.葡聚糖酶的最适pH酶活比较；

[0037] 图4为多顺反子XAPT在pK15细胞中表达检测结果；

[0038] 图5为Cep112-npsp-XAPT质粒图。

具体实施方式

[0039] 一、目的基因的筛选

[0040] 分别将来源于黑曲霉的木聚糖酶基因xynB(Guo et al.,2013)，来源于大肠杆菌的植酸酶基因appA，来源于蟋蟀的纤维素酶基因TeEGⅠ(Kim et al.,2008)，来源于耐热真菌沙栖梭孢壳XZ7的果胶酶基因pg7fns(Tu et al.,2014)。经SignalP 4.1Server预测信号肽后，分别去掉其自身的信号肽，然后根据猪密码子偏好进行优化，并将猪或牛来源的腮腺分泌蛋白(parotid secretory protein,PSP)信号肽(signal peptide，sp)序列分别添加到密码子优化后的候选基因的氨基酸序列的N端，如pigPSP-SP-xynB,pigPSP-SP-appA,pigPSP-SP-teEGⅠ,bosPSP-sp-pg7fns,分别简写为pSPxyn,pSPappA，pSPTeEG,bSPpg7，密码优化后的成熟肽基因分别命名为pxyn(基因序列如SEQ ID No:1所示),pappA(基因序列如SEQ ID No:2所示),pTEGI(基因序列如SEQ ID No:3所示)，ppg7fnss(基因序列如SEQ ID No:4所示)。

[0041] 二、构建木聚糖酶-植酸酶-果胶酶-纤维素酶多顺反子基因序列

[0042] 利用A3刚性肽，分别将木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)，果胶酶(pg7fns)-纤维素酶(TeEGⅠ)连接构建双功能融合酶，去掉A3上游基因终止密码子，同时去掉A3C端下游基因信号肽。经优化突变后的A3序列如下：

[0043] A3(SEQ ID No:5)：GAGGCTGCCGCCAAAGAAGCTGCCGCCAAGGAGGCTGCCGCCAAG[0044] A3'(SEQ ID No:6)：GGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGAGGCCGCCGCCAAGGG[0045] 经优化后A3连接的双功能酶基因序列为xynB-A3-APPA与pg7fns-A3'-TeEGI。将上述融合设计多功能酶顺反子经猪密码子优化，去除稀有密码子，选择猪细胞使用频率较高的密码子。

[0046] 并分别将多顺反子内A3重复序列和猪腮腺蛋白信号肽再次优化，以减少重复序列对多顺反子结构稳定性的影响，优化后的序列进行人工合成。优化后的pxynB-A3-APPA基因序列如SEQ ID No:7所示，氨基酸序列如SEQ ID No:8所示；优化后的ppg7fns-A3'-TeEGI基因序列如SEQ ID No:9所示，氨基酸序列如SEQ ID No:10所示。

[0047] 利用Furin酶识别基因序列和高效自剪切P2A序列，将pxynB-A3-APPA，ppg7fns-A3'-TeEGI，连接构建多功能顺反子pxynB-A3-APPA-furin-P2A-ppg7fns-A3'-TeEGI(XAPT)(基因序列如SEQ ID No:11所示，基因结构图谱如图1所示；氨基酸序列如SEQ ID No:12所示)克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体多克隆位点BamHI/EcoRI上。

[0048] 利用P2A分别将木聚糖酶(xynB)-植酸酶(appA)，果胶酶(pg7fns)-纤维素酶(TeEGⅠ)，连接构建双功能酶pxynB-p2A-pAPPA、ppg7fns-p2A-pTeEG，克隆到pcDNA3.1(+)真核表达载体上多克隆位点,作为对照组。

[0049] 三、木聚糖酶-植酸酶-果胶酶-纤维素酶真核表达载体构建

[0050] 将优化后的多功能酶顺反子XAPT插入真核表达载体pcDNA3.1多克隆位点BamHI/EcoRI上，经酶切和测序鉴定，多功能酶顺反子XAPT真核表达载体pCD-XAPT构建成功。

[0051] 四、木聚糖酶-植酸酶-果胶酶-纤维素酶多功能酶的体外表达与功能验证[0052] 将pCD-XAPT真核表达载体按照转染试剂盒LipofectamineTM LTX+PLUSTM Reagent(invitrogen)说明书瞬时转染猪肾pK15细胞系，48-72h，收集细胞上清液作为粗酶液测定酶活，检测其酶活力及其pH耐受力。酶活测定方法和定义参考纤维素酶《NYT/912-2004》、木聚糖酶《GBT/23874-2009》、植酸酶《GBT/18634-2009》、果胶酶测定方法参考张飞等(2004)《果胶酶果胶酶活力的测定方法研究》。

[0053] 1、木聚糖酶(xynB)和植酸酶(appA)融合酶表达分析

[0054] 将木聚糖酶(xynB)和植酸酶(appA)分别用furin-P2A和A3融合，并在猪pK15细胞表达，结果显示，融合后A3连接的融合酶成功表达木聚糖酶和植酸酶双功能酶，且其表达木聚糖酶和植酸酶在pH2.0～pH6.5均具有较高的生物学活，其中pxynB-A3-appA的木聚糖酶活性，在pH2.0～5.0稍高于pxynB-p2A-pappA，在pH5.0后略低于后者，但pxynB-A3-appA表达的木聚糖酶对pH2.0～pH7.0耐受能力明显高于pxynB-p2A-pappA。pxynB-A3-appA表达的植酸酶在不同pH缓冲液中活性和耐受性均优于pxynB-p2A-pappA，结果如图2所示。

[0055] 2、果胶酶(pg7fns)-纤维素酶(TeEGⅠ)融合酶表达分析

[0056] 将果胶酶(pg7fns)和纤维素酶(TeEGⅠ)通过不同linker融合，结果显示，ppg7fns-A3'-TeEGⅠ能同时表达果胶酶，纤维素酶和葡聚糖酶功能，且其最适pH条件下，相应功能酶的活性均高于ppg7fns-p2A-pTeEGⅠ。ppg7fns-A3'-TeEGⅠ表达的果胶酶和葡聚糖酶在不同pH缓冲液中，酶活走势与相应单体酶酶活变化基本一致，结果如图3所示。

[0057] 3、多顺反子XAPT在pK15细胞中表达检测

[0058] 分别用电转和脂质体化学转染方法，将多顺反子XAPT的真核表达载体导入PK15细胞，于48h后收集细胞上清培养液，测定其表达情况，结果显示，多顺反子XAPT成功表达出木聚糖酶，植酸酶，葡聚糖酶和纤维素酶及果胶酶活性五种酶功能活性，四种酶活与单体酶活相当，但是具有更好的PH耐受能力，且有更好的PH适应性，结果如图4所示。

[0059] 五、定点整合到CEP112位点转木聚糖酶-植酸酶-果胶酶-纤维素酶(XAPT)基因表达载体构建

[0060] 首先将XAPT多顺反子替换前期研究载体CEP112-LA340RA3219(来源于第“201711477805.5”号“一种定点整合外源DNA转基因猪的构建方法”，公开号“108285906A”专利)中的BEXA顺反子，构建了新载体Cep112-mPSP-XAPT，在其基础上，用PacI和sexAI线性化Cep112-mPSP-XAPT，然后用inf-npsp引物扩增npsp上游调控区，并替换现有序列，npsp(-11.5kb～-5.7kb)在原mpsp(-11.1kb～-5.7kb)基础上延长了调控区序列395bp，构建Cep112-npsp-XAPT载体(序列如SEQ ID No:13所示)，经酶切验证，切割条带大小与预期相符，经过测序验证，确定成功获得一个能在猪唾液腺中特异表达XAPT四种功能酶的转基因载体，质粒图谱如图5所示。六、转木聚糖酶-植酸酶-果胶酶-纤维素酶(XAPT)基因猪的获得[0061] 将构建成功的Cep112-npsp-XAPT载体转染猪成纤维细胞系，获得表达XAPT多顺反子的阳性细胞系，将阳性细胞系作为供核细胞进行核移植，通过体细胞克隆的方法获得转XAPT基因猪。

[0062] 对获得的转XAPT基因猪进行基因及测序水平的鉴定，采集阳性猪的唾液，进行检测，发现转XAPT基因猪均可高效的表达植酸酶，木聚糖酶，果胶酶和纤维素酶，且酶的活性与转单基因猪酶的活性相当。

[0063] 以上所述的仅是本发明的一些实施方式。对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于发明的保护范围。

标题	发布/更新时间	阅读量
AAV载体柱纯化方法	2020-05-08	297
一种氨基酸强化型发酵酶解豆粕及其应用	2020-05-08	422
植物乳杆菌DP189及其应用	2020-05-14	531
一种用于豆粕发酵的发酵酶解剂及其应用	2020-05-08	585
新型抗TRKB抗体	2020-05-13	609
一种降解抗营养因子的熟化保育饲料制备方法	2020-05-13	74
防治果树腐烂病的涂干制剂及其制备方法	2020-05-14	135
一种固态联合发酵红枣渣、柑橘皮渣、马铃薯渣生物饲料及其制备方法	2020-05-13	90
淫羊藿苷在制备治疗血管性痴呆疾病的药物中的应用	2020-05-14	551
一种骨骼肌细胞模型的构建方法和测定方法	2020-05-08	792