暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用
阅读：757发布：2020-05-08
专利汇可以提供暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提出了 微 生物 和菌剂及其制备方法和应用，所述微生物为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，于2019年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18688。本发明的微生物具有较好的分解 纤维 素能 力 ，可有效地应用于秸秆堆肥中，明显加快堆肥前期起温速度，提高 发酵 温度 ，堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。，下面是暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用专利的具体信息内容。
1.一种微生物，其为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，于2019年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18688。
2.一种菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的微生物。
3.根据权利要求2所述的菌剂，其特征在于，所述微生物的活菌数为100～150亿/克；
任选地，所述菌剂进一步包括辅料，所述辅料含有碳酸钙、草炭土、豆粕和麦麸的至少之一。
4.一种培养基，其特征在于，所述培养基适于培养权利要求1所述微生物，其中，所述培养基含有下列的至少之一：玉米淀粉、蔗糖、豆粕、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠和消泡剂。
5.根据权利要求4所述的培养基，其特征在于，基于所述培养基的总质量，所述培养基包括：
1～5质量％的玉米淀粉、0.5～2质量％的蔗糖、2～6质量％的豆粕、0.1～0.4质量％的酵母粉、0.1～0.5质量％的蛋白胨、0.1～0.5质量％的磷酸氢二钾、0.1～0.5质量％的磷酸二氢钾、0.05～0.2质量％的碳酸钙、0.05～0.2质量％的氯化钠、0.1～0.5质量％的消泡剂，补水至100质量％，pH调节为6.8～7.2。
6.一种制备权利要求2或3所述菌剂的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述微生物利用权利要求4或5所述培养基进行培养，以便得到发酵菌剂；
将所述发酵菌剂进行干燥，以便得到菌粉；以及
任选的，将所述菌粉与辅料进行混合，以便得到所述菌剂。
7.权利要求1所述微生物或权利要求2或3所述菌剂在秸秆堆肥中的应用。
8.一种秸秆堆肥的方法，其特征在于，包括：
将权利要求1所述微生物或权利要求2或3所述菌剂与秸秆进行混合共培养。
9.根据权利要求8所述的秸秆堆肥的方法，其特征在于，包括：
将秸秆、水以及任选的尿素进行混合，使得到的混合料液中碳氮比为(20～30)：1，水分含量为50～70质量％；
将所述微生物或菌剂以1～5质量‰的接种量接种于所述混合料液中进行发酵。
10.一种有机肥料，其特征在于，是通过权利要求8或9所述秸秆堆肥的方法所得到的。
11.权利要求1所述微生物或权利要求2或3所述菌剂在有机废物好氧堆肥中的应用。
12.一种微生物肥料，包括权利要求1所述的微生物或权利要求2所述的菌剂。
13.一种生物农药，包括权利要求1所述的微生物或权利要求2所述的菌剂。
暹罗芽孢杆菌、菌剂及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 随着耕作技术的进步，秸秆的产量越来越多，但是由于秸秆的利用率不大，大都都被焚烧处理，导致资源的浪费，同时也引起了环境的污染。秸秆作为有机肥生产的良好原料，由于缺乏成熟、高效的转化技术，一直没有充分利用。将秸秆还田可以充分利用秸秆中养分资源、改良土壤。还田后的秸秆在土壤微生物作用下发生腐解，秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素等成分转化为植物易于吸收的简单化合物，从而改善土壤理化性质，提高土壤肥力，进而提高作物的产量和质量。
[0003] 然而，目前适用于秸秆堆肥的微生物仍有待研究。
发明内容
[0004] 本发明旨在至少在一定程度上解决现有技术中存在的技术问题至少之一。为此，本发明提出了一种微生物，其为暹罗芽孢杆菌，具有较好的分解纤维素能力，可有效地应用于秸秆堆肥中，明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度。堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0005] 为此，在本发明的一个方面，本发明提出了一种微生物。根据本发明的实施例，所述微生物为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)，于2019年10月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.18688，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
[0006] 发明人为了获得适用于秸秆堆肥的微生物而进行大量理论分析和实验筛选，考虑到秸秆中的主要成分为纤维素，于是先以具有高产纤维素酶作为筛选指标，初筛到了一些菌株。进一步地，发明人发现，产纤维素酶量及纤维素酶活性接近的菌株对于秸秆堆肥的作用效果也不尽相同。因此，发明人推断某些菌株可能在秸秆堆肥过程中产生某些代谢物以促进堆肥腐熟。同时，发明人发现，秸秆堆肥效果好的菌株并不一定对城市污泥或畜禽粪便等堆肥效果也好，可能是由于处理物的组成成分有所差异造成的。进而，发明人在此基础上进一步优化筛选获得秸秆堆肥效果最佳的微生物—暹罗芽孢杆菌A-2(Bacillus siamensis)，其不仅具有较好的分解纤维素能力，而且秸秆堆肥效果好，可明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度。堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0007] 在本发明的另一方面，本发明提出了一种菌剂。根据本发明的实施例，所述菌剂含有前面所述的微生物。由此，根据本发明实施例的菌剂不仅具有较好的分解纤维素能力，而且秸秆堆肥效果好，可明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度。堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0008] 根据本发明的实施例，上述菌剂还可以具有下列附加技术特征：
[0009] 根据本发明的实施例，所述微生物的活菌数为100～150亿/克。由此，以进一步提高秸秆堆肥效果。在一些实施例中，所述微生物的活菌数为100～120亿/克。在另一些实施例中，所述微生物的活菌数为130～140亿/克。
[0011] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物所描述的特征和优点，同样适用于该菌剂，在此不再赘述。
[0012] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种培养基。根据本发明的实施例，所述培养基适于培养前面所述的微生物，其中，所述培养基含有下列的至少之一：玉米淀粉、蔗糖、豆粕、酵母粉、蛋白胨、磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、碳酸钙、氯化钠和消泡剂。发明人经过大量实验得到上述培养基组成，在此培养基中生长的暹罗芽孢杆菌代谢活性高，可以高产纤维素酶，秸秆堆肥效果好，可明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度，堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0013] 根据本发明的实施例，基于所述培养基的总质量，所述培养基包括：1～5质量％的玉米淀粉、0.5～2质量％的蔗糖、2～6质量％的豆粕、0.1～0.4质量％的酵母粉、0.1～0.5质量％的蛋白胨、0.1～0.5质量％的磷酸氢二钾、0.1～0.5质量％的磷酸二氢钾、0.05～0.2质量％的碳酸钙、0.05～0.2质量％的氯化钠、0.1～0.5质量％的消泡剂，补水至100质量％，pH调节为6.8～7.2。发明人经过大量实验得到上述较优配比，由此，以进一步提高纤维素酶的产量及活性，提高秸秆堆肥效果。
[0014] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物所描述的特征和优点，同样适用于该培养基，在此不再赘述。
[0015] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种制备前面所述菌剂的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述微生物利用前面所述培养基进行培养，以便得到发酵菌剂；将所述发酵菌剂进行干燥，以便得到菌粉；以及任选的，将所述菌粉与辅料进行混合，以便得到所述菌剂。由此，根据本发明实施例的方法获得的菌剂中具有高活性的暹罗芽孢杆菌，可高产纤维素酶，秸秆堆肥效果好，明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度。堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0016] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物和培养基所描述的特征和优点，同样适用于该制备菌剂的方法，在此不再赘述。
[0017] 在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述微生物或菌剂在有机废物好氧堆肥中的应用。根据本发明实施例的微生物或菌剂具有高产纤维素酶能力，堆肥效果好，明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度，堆肥后有机废物失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0018] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物和菌剂所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。
[0019] 在本发明的又一方面，本发明提出了前面所述微生物或菌剂在秸秆堆肥中的应用。如前所述，根据本发明实施例的微生物或菌剂具有高产纤维素酶能力，秸秆堆肥效果好，明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度，堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0020] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物和菌剂所描述的特征和优点，同样适用于该应用，在此不再赘述。
[0021] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种秸秆堆肥的方法。根据本发明的实施例，所述方法包括：将前面所述微生物或前面所述菌剂与秸秆进行混合共培养。由此，根据本发明实施例的方法可以提高秸秆堆肥效果，明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度，堆肥后秸秆失重率增加，C/N含量降低，堆肥腐熟程度高，适于规模化应用。
[0022] 根据本发明的实施例，所述秸秆堆肥的方法包括：将秸秆、水以及任选的尿素进行混合，使得到的混合料液中碳氮比为(20～30)：1，水分含量为50～70质量％；将所述微生物或菌剂以1～5质量‰的接种量接种于所述混合料液中进行发酵。由此，在发酵过程中暹罗芽孢杆菌能够高效代谢纤维素酶以将秸秆中的纤维素、半纤维素和木质素分解为小分子物质，从而易于植物吸收，改善土壤理化性质，提高土壤肥力，从而提高作物的产量和质量。
[0023] 本领域技术人员能够理解的是，前面针对微生物和菌剂所描述的特征和优点，同样适用于该秸秆堆肥的方法，在此不再赘述。
[0024] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种有机肥料。根据本发明的实施例，所述有机肥料是通过前面所述秸秆堆肥的方法所得到的。由此，根据本发明实施例的有机肥料中纤维素、半纤维素和木质素已被分解为小分子物质，使得该有机肥料易于植物吸收，改善土壤理化性质，提高土壤肥力，从而提高作物的产量和质量。
[0025] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种微生物肥料，包括前述的暹罗芽孢杆菌或其菌剂。发明人发现，本发明的暹罗芽孢杆菌及含有其的菌剂不仅具有高产纤维素酶能力，堆肥效果好，而且还可以高效防治植物土传病害，有效提高作物产量。由此，可以作为微生物肥料，极具应用前景。
[0026] 在本发明的又一方面，本发明提出了一种生物农药，包括前述的暹罗芽孢杆菌或其菌剂。如前所述，本发明的暹罗芽孢杆菌及含有其的菌剂不仅具有高产纤维素酶能力，堆肥效果好，而且还可以高效防治植物土传病害，有效提高作物产量。由此，可以作为生物农药，极具应用前景。
[0028] 本发明的上述和/或附加的方面和优点从结合下面附图对实施例的描述中将变得明显和容易理解，其中：
[0029] 图1显示了根据本发明一个实施例的暹罗芽孢杆菌的系统发育树示意图；
[0030] 图2显示了根据本发明一个实施例的泡盛曲霉菌的系统发育树示意图。
具体实施方式
[0031] 下面将结合实施例对本发明的方案进行解释。本领域技术人员将会理解，下面的实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件的，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市购获得的常规产品。
[0032] 实施例1菌株的分离与筛选
[0033] (1)产纤维素酶菌株的分离：在中化农业临沂研发中心试验田中搜集腐烂秸秆以及畜禽粪便，称取1g放入100ml无菌水中，150rpm，30℃条件下振荡30min，然后进行梯度稀释至105，选取3个梯度进行涂布，每个梯度3个平行，在30℃培养箱中培养2d后选取不同菌落形态的菌株在LB培养基上划线，定期观察菌落生长情况。然后采用平板划线法，纯化菌株，分别编号保存。
[0034] (2)产纤维素酶菌株的筛选：采用平板水解圈法，制备LB培养基(添加羧甲基纤维素钠)，用牙签将(1)中分离保存到的菌株移植在平板中央，30℃恒温培养48h后吸取2‰的刚果红溶液5ml加入平皿中，20分钟后冲洗干净，观察菌落周围有无水解圈。
[0035] 根据水解圈大小筛选获得5株水解圈较大的菌株，其中畜禽粪便三株编号为：A-2、A-3和A-5；腐烂秸秆两株：B-13和B-14，这些菌株在不同培养时间(24h、36h、48h、60h)下水解圈直径和菌落直径参见表1。
[0036] 表1不同培养时间菌株水解圈及菌落直径
[0037]
[0038] (3)以步骤(2)筛选获得的5株菌株作为实验菌株进行如下秸秆堆肥研究：
[0039] 1)小麦秸秆制备：从田间选取新鲜小麦秸秆，晒干，剪切成1cm左右的小段，烘干备用。
[0040] 2)摇瓶培养：配制LB液体培养基，于500ml三角瓶中装入250ml培养液，同时加入10g制备步骤1)获得的小麦秸秆，灭菌，冷却后分别接种初筛获得的5株菌株，在45℃，
170rpm条件下培养7天。
170rpm条件下培养7天。
[0041] 3)失重率测定：将上述培养完成的小麦秸秆，用四层纱布过滤，冲洗干净，烘干称重，记作m1，失重率(％)＝m1/10g，该结果即为菌株对秸秆的失重率，以不接种菌株的处理为空白对照。
[0042] 计算公式为：
[0043] (1)秸秆失重率(％)＝(W1-W2)/W1×100％
[0044] (2)小麦秸秆的失重率(％)＝菌株处理的小麦秸秆失重率-空白对照的小麦秸秆失重率。其中，W1为秸秆降解前质量，W2为秸秆降解后质量。
[0045] 最终，选择菌株A-2作为目标菌株，其失重率高达9.5％，表明其具有较好的秸秆堆肥效果。
[0046] 表2小麦秸秆失重率
[0047] A-2 A-3 A-5 B-13 B-14
失重率(％) 9.5 6.5 7.4 12 5.8
失重率(％) 9.5 6.5 7.4 12 5.8
[0048] 实施例2
[0049] 对A-2菌株进行如下鉴定：
[0050] (1)微生物学特性：LB培养基上37℃培养2d形成大小4mm左右的菌落、边缘整齐、凸起、白色粘性半透明。最适生长温度37℃，耐盐(NaCl)浓度为14％，生长pH为4.0-9.0，最适为7.0。
[0051] (2)分子生物学特性：由分子生物学16SrDNA序列形成的菌株系统发育树显示，该菌株与Bacillus siamensis strain XSG14同源性最为接近，故经分子生物学鉴定和微生物学特性分析，认定该菌株为暹罗芽孢杆菌(Bacillus siamensis)。
[0052] 该菌株16SrDNA序列如下，系统发育树参见图1。
[0053] TCTCGTGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGGCATGCTGATCCGCGATTACTAGCGATTCCAGCTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGAACTGAGAACAGATTTGTGGGATTGGCTTAACCTCGCGGTTTCGCTGCCCTTTGTTCTGTCCATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGTCATAAGGGGCATGATGATTTGACGTCATCCCCACCTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCACCTTAGAGTGCCCAACTGAATGCTGGCAACTAAGATCAAGGGTGGCGCTCGTTGCGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACGACAACCATGCACCACCTGTCACTCTGCCCCCGAAGGGGACGTCCTATCTCTAGGATTGTCAGAGGATGTCAAGACCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCACCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCCTTTGAGTTTCAGTCTTGCGACCGTACTCCCCAGGCGGAGTGCTTAATGCGTTAGCTGCAGCACTAAGGGGCGGAAACCCCCTAACACTTAGCACTCATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTCGCTCCCCACGCTTTCGCTCCTCAGCGTCAGTTACAGACCAGAGAGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTCCACATCTCTACGCATTTCACCGCTACACGTGGAATTCCACTCTCCTCTTCTGCACTCAAGTTCCCCAGTTTCCAATGACCCTCCCCGGTTGAGCCGGGGGCTTTCACATCAGACTTAAGAAACCGCCTGCGAGCCCTTTACGCCCAATAATTCCGGACAACGCTTGCCACCTACGTATTACCGCGGCTGCTGGCACGTAGTTAGCCGTGGCTTTCTGGTTAGGTACCGTCAAGGTACCGCCCTATTCGAACGGTACTTGTTCTTCCCTAACAACAGAGCTTTACGATCCGAAAATTCATCACTCACGCGGCGTTGCTCCGTCAGACTTTCGTCCATTGCGGAAGATTCCCTACTGCTGCCTCCCGTAGGAGTCTGGGCCGTGTCTCAGTCCCAGTGTGGCCGATCACCCTCTCAGGTCGGCTACGCATCGTTGCCTTGGTGAGCCGTTACCTCACCAACTAGCTAATGCGCCGCGGGTCCATCTGTAAGTGGTAGCCGAAGCCACCTTTTATGTTTGAACCATGCGGTTCAAACAACCATCCGGTATTAGCCCCGGTTTCCCGGAGTTATCCCAGTCTTACAGGCAGGTTACCCACGTGTTACTCACCCGTCCGCCG(SEQ ID NO：1)
[0054] 同时，为了知晓B-13菌株的种属类型，发明人也对其进行了如下鉴定：
[0056] (2)分子生物学特性：
[0057] 该菌株ITS序列如下，系统发育树参见图2。由此，鉴定出该菌株为泡盛曲霉菌(Aspergillus awamori)。
[0058] AACGGGAGGGCGGGTCTTTGGGCAACCTCCCATCCGTGTCTATTGTACCCTGTTGCTTCGGCGGGCCCGCCGCTTGTCGGCCGCCGGGGGGGCGCCTCTGCCCCCCGGGCCCGTGCCCGCCGGAGACCCCAACACGAACACTGTCTGAAAGCGTGCAGTCTGAGTTGATTGAATGCAATCAGTTAAAACTTTCAACAATGGATCTCTTGGTTCCGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAACTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAGTCTTTGAACGCACATTGCGCCCCCTGGTATTCCGGGGGGCATGCCTGTCCGAGCGTCATTGCTGCCCTCAAGCCCGGCTTGTGTGTTGGGTCGCCGTCCCCCTCTCCGGGGGGACGGGCCCGAAAGGCAGCGGCGGCACCGCGTCCGATCCTCGAGCGTATGGGGCTTTGTCACATGCTCTGTAGGATTGGCCGGCGCCTGCCGACGTTTTCCAACCATTCTTTCCAGGTTGACCTCGGATCAGGTAGGGATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAAGCCGGAGGAATTTTCTTCCTTTT(SEQ ID NO：2)[0059] 实施例3微生物菌剂的制备
[0060] 步骤1：将平皿中保存的暹罗芽孢杆菌株A-2，用接种环接种至含有250ml LB培养液的三角瓶中，30℃、170rpm于恒温培养箱中培养36h。
[0061] 步骤2：将上述发酵菌液接种至中试发酵罐中(10L—50L—500L)，37℃培养，发酵完成后进行喷雾干燥，分装，活菌数为100-150亿/g。与碳酸钙混合复配，形成活菌数为100亿/g的菌粉，即制得用于堆肥使用的暹罗芽孢杆菌A-2菌剂。中试培养基配方为：玉米淀粉3％，蔗糖1％，豆粕4.5％，酵母粉0.2％，蛋白胨0.2％，磷酸氢二钾、磷酸二氢钾各0.3％，碳酸钙、氯化钠0.1％，消泡剂0.3％，补水至100质量％，pH调节为7.0。
[0062] 实施例4微生物菌剂的应用
[0063] 下面以玉米秸秆为例，说明本发明微生物菌剂在高温好氧堆肥上的应用。
[0064] 高温好氧堆肥物料为玉米秸秆，添加尿素调节C/N比约为25:1，加水混匀，控制水分在60％左右，按2‰的比例接种实施例3制备的微生物菌剂，充分混合后进行堆置发酵。同时以不添加本发明的菌剂为对照。堆肥时间为60d，每天检测堆体温度，间隔7d翻堆一次，待堆温达到65℃时翻堆，每7d采用多点四分法取样检测堆肥腐熟度指标，对堆肥结束时的样品检测其养分等理化指标。结果见表3和表4。
[0065] 从表3和表4可知，暹罗芽孢杆菌A-2菌剂可明显加快堆肥前期起温速度，提高发酵温度，延长高温持续时间。堆肥后秸秆失重率增加，C/N降低，含水率减少，堆肥腐熟程度高。结果说明暹罗芽孢杆菌A-2制备的微生物菌剂有利于秸秆高温好氧堆肥，提高发酵效率，可作为菌剂使用，应用于秸秆堆肥，作为生物肥料或生物农药，具有广泛的应用前景。
[0066] 表3暹罗芽孢杆菌剂对堆肥温度的影响
[0067]试验处理 最高温度(℃) 至最高温度的时间(d) 高温期(>55℃)
不接种 65 6 7
接种 72 4 9
不接种 65 6 7
接种 72 4 9
[0068] 表4暹罗芽孢杆菌剂对秸秆腐熟度的影响
[0069] 试验处理 失重率％ C/N 含水率 发芽指数％不接种 35 20:1 32.1 101.5
接种 45 18:1 29.2 118.7
接种 45 18:1 29.2 118.7
[0070] 在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
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