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生物体中异源类胡萝卜素的产生

阅读:122发布:2020-05-08

专利汇可以提供生物体中异源类胡萝卜素的产生专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且提供了利用外源加入的酶活性产生C40类胡萝卜素化合物的非天然存在的 微 生物 体。还提供了在微生物培养中产生C40类胡萝卜素化合物的方法,以及包含微生物培养中产生的C40类胡萝卜素化合物的 饲料 和 营养补充剂 组合物。,下面是生物体中异源类胡萝卜素的产生专利的具体信息内容。

1.一种包括异源多核苷酸的生物体,所述异源多核苷酸包括编码C40类胡萝卜素生物合成途径的多肽的来自产玉米素副球菌(Paracoccus zeaxanthinifaciens)、伤口埃希菌(Escherichia vulnaris)或菠萝泛菌(Pantoea ananatis)的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与所述C40类胡萝卜素生物合成途径的所述多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,所述异源多核苷酸可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,
其中所述微生物体是来自甲型变形菌纲(Alphaproteobacteria)的细菌细胞,并且其中所述细菌细胞表达所述异源多核苷酸序列以产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
2.根据权利要求1所述的微生物体,其进一步包括表达来自伤口埃希菌的异源基因序列idi的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自伤口埃希菌的idi所编码的多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列。
3.一种微生物体,其衍生自表达C30类胡萝卜素产生的天然途径的亲本微生物体,其中编码C30类胡萝卜素产生的所述天然途径的酶的至少一个基因序列已被破坏或缺失,使得与衍生出所述微生物体的所述母体微生物体相比,所述微生物体中的C30类胡萝卜素产生减少或消除,
其中所述微生物体是来自甲型变形菌纲的细菌细胞。
4.根据权利要求3所述的微生物体,其进一步包括编码异源C40类胡萝卜素生物合成产生途径的多肽的异源多核苷酸,
其中所述微生物体表达所述异源多核苷酸以产生一种或多种C40类胡萝卜素化合物。
5.一种包括异源多核苷酸的微生物体,所述异源多核苷酸含有包括来自阔海褐黄菌(Fulvimarina pelagi)的基因序列crtW的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtW所编码的多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,所述异源多核苷酸可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,
其中所述微生物体是革兰氏阴性细菌细胞,并且
其中所述细菌细胞表达所述异源多核苷酸以产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
6.根据权利要求5所述的微生物体,其进一步包括包括来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtY、crtI和crtB的异源多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtY、crtI和crtB所编码的多肽包括至少约75%序列同一性的多肽的多核苷酸序列。
7.根据权利要求5或6所述的微生物体,其包括来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW和crtZ,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtW和crtZ所编码的多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列。
8.根据权利要求5到7中任一项所述的微生物体,其中所述革兰氏阴性细菌细胞来自变形菌
9.根据权利要求8所述的微生物体,其中所述革兰氏阴性细菌细胞来自甲型变形菌纲。
10.根据权利要求1到2和4到9中任一项所述的微生物体,其中所述细菌细胞表达所述异源多核苷酸以产生至少一种选自虾青素、黄素、玉米素、绿蝇黄质、金盏花黄质、3-羟基海胆、海胆酮、β-胡萝卜素和番茄红素的C40类胡萝卜素化合物。
11.根据权利要求1到10中任一项所述的微生物体,其包括至少一种异源多核苷酸,所述至少一种异源多核苷酸包括包括来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的基因序列crtZ、crtY、crtI、crtB和crtE的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的crtZ、crtY、crtI、crtB和crtE所编码的多肽包括至少约70%同一性的多肽的多核苷酸序列,所述至少一种异源多核苷酸可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,其中所述微生物体产生玉米素。
12.根据权利要求11所述的微生物体,其进一步包括包括来自阔海褐黄海水菌的所述基因序列crtW的异源多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtW所编码的所述多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,
其中所述微生物体产生虾青素。
13.根据权利要求1到10中任一项所述的微生物体,其包括至少一种异源多核苷酸,所述至少一种异源多核苷酸包括来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的基因序列crtY、crtI、crtB和crtE,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的crtY、crtI、crtB和crtE所编码的多肽包括至少约70%同一性的多肽的多核苷酸序列,所述至少一种异源多核苷酸可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,
其中所述微生物体产生β-胡萝卜素。
14.根据权利要求13所述的微生物体,其进一步包括包括来自阔海褐黄海水菌的所述基因序列crtW的异源多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW所编码的所述多肽包括至少约
70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,
其中所述微生物体产生角黄素。
15.一种包括异源多核苷酸的微生物体,所述异源多核苷酸包括编码C40类胡萝卜素生物合成途径的多肽的来自产虾青素鞘醇单胞菌(Sphingomonas astaxanthinifaciens)、产玉米素线西棒菌(Siansivirga zeaxanthinifaciens)或产玉米素中温黄杆菌(Mesoflavibacter zeaxanthinifaciens)的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与所述C40类胡萝卜素生物合成途径的所述多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,所述异源多核苷酸可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,
其中所述微生物体表达所述异源多核苷酸序列以产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
16.根据权利要求15所述的微生物体,其中所述微生物体是细菌细胞。
17.根据权利要求16所述的微生物体,其中所述细菌细胞来自变形菌门。
18.根据权利要求17所述的微生物体,其中所述细菌细胞来自甲型变形菌纲。
19.根据权利要求15到18中任一项所述的微生物体,其包括异源多核苷酸,所述异源多核苷酸包括编码来自产玉米素线西棒菌和/或产玉米素中温黄杆菌的基因序列crtZ、crtY、crtI和crtB的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自产玉米素线西棒菌和/或产玉米素中温黄杆菌的crtZ、crtY、crtI和crtB所编码的多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,
其中所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素、β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。
20.根据权利要求15到18中任一项所述的微生物体,其包括异源多核苷酸,所述异源多核苷酸包括编码来自产虾青素鞘氨醇单胞菌的基因序列crtZ、crtY、crtI、crtB和crtW的多核苷酸序列,或包括具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包括编码与由来自产虾青素鞘氨醇单胞菌的crtZ、crtY、crtI、crtB和crtW所编码的多肽包括至少约70%同一性的多肽的多核苷酸序列,
其中所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素、β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。
21.根据权利要求1到2和4到20中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体能够利用至少一种C1源产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
22.根据权利要求21所述的微生物体,其中所述一种或多种C1碳源包括甲醇、甲烷、甲胺和/或甲酸酯。
23.根据权利要求1到2和4到20中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体能够利用至少一种C2碳源产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
24.根据权利要求所述23的微生物体,其中所述一种或多种C2碳源包括乙醇、乙胺、乙二醇和/或乙酸酯。
25.根据权利要求1到2和4到20中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体能够利用C1和C2碳源的组合产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
26.根据权利要求1到2和4到20中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体能够利用至少一种C1和/或C2醇产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
27.根据权利要求26所述的细菌细胞或微生物体,其中所述至少一种C1和/或C2醇包括甲醇和/或乙醇。
28.根据权利要求1到2和4到20中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体能够利用至少一种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流作为碳源来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
29.根据权利要求28所述的微生物体,其中所述至少一种生物产物发酵和蒸馏工艺物料流包括乙醇啤酒、乙醇、全酒糟、湿饼或湿酿酒颗粒(WDG)、酒糟水、酒糟水糖浆或浓缩酿酒可溶物(CDS)、湿酿酒颗粒及其可溶物(WDGS)和/或干酿酒颗粒及其可溶物(DDGS)。
30.根据权利要求1到2和4到20中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体能够利用一种或多种C1和/或C2碳源与一种或多种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流的组合来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
31.根据权利要求30所述的细菌细胞或微生物体,其中所述一种或多种C1和/或C2碳源包括甲醇和/或乙醇,以及所述一种或多种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流包括酒糟水和/或酒糟水糖浆。
32.根据权利要求1到31中任一项所述的微生物体,其中所述微生物体是甲基杆菌(Methylobacteria)属中的细菌细胞。
33.根据权利要求32所述的微生物体,其中所述细菌细胞是扭脱甲基杆菌(Methylobacterium extorquens)细胞。
34.一种用于产生包括至少一种C40类胡萝卜素化合物的生物质的方法,其包括在适合生长所述细菌细胞或微生物体和产生所述C40类胡萝卜素化合物的条件下在培养基中培养根据权利要求1到2或4到33中任一项所述的微生物体,其中包括所述C40类胡萝卜素化合物的生物质在所述培养中产生。
35.根据权利要求34所述的方法,其包括利用至少一种C1化合物和/或至少一种C2化合物和/或至少一种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流作为用于所述微生物体培养的碳源。
36.根据权利要求34所述的方法,其包括利用至少一种C1和/或C2醇和/或至少一种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流作为用于所述微生物体培养的碳源。
37.根据权利要求34到36中任一项所述的方法,其中所述微生物体属于甲基杆菌属。
38.根据权利要求37中任一项所述的方法,其中所述微生物体是扭脱甲基杆菌。
39.一种包括至少一种C40类胡萝卜素化合物的生物质,其中所述生物质根据权利要求
34到38中任一项所述的方法产生。
40.一种饲料营养补充剂组合物,其包括根据权利要求39产生的生物质,其中所述饲料或营养补充剂包括所述至少一种C40类胡萝卜素化合物。
41.一种产生生物质的方法,其包括在适合生长所述微生物体的条件下在培养基中培养根据权利要求3所述的微生物体,其中所述生物质在所述培养中产生。
42.根据权利要求41所述的方法,其包括利用至少一种C1化合物和/或至少一种C2和/或至少一种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流化合物作为用于所述微生物体培养的碳源。
43.根据权利要求42所述的方法,包括利用至少一种C1和/或C2醇和/或至少一种生物产物发酵和/或蒸馏工艺物料流作为用于所述微生物体培养的碳源。
44.根据权利要求41到43中任一项所述的方法,其中所述微生物体属于甲基杆菌属。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述微生物体是扭脱甲基杆菌。
46.一种根据权利要求41到45中任一项产生的生物质。
47.一种饲料或营养补充剂组合物,其包括根据权利要求46所述的产生的生物质。

说明书全文

生物体中异源类胡萝卜素的产生

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求于2017年6月1日提交的美国临时申请第62/513,892号的权益,,其通过引用整体并入本文。

技术领域

[0003] 本发明涉及微生物体中类胡萝卜素化合物的产生,及在饲料组合物中的用途,特别是用于产养殖、动物饲料和人类营养。

背景技术

[0004] 类胡萝卜素是一类普遍存在且结构多样的天然色素,其颜色从浅黄色到橙色再到红色。类胡萝卜素负责胡萝卜、西红柿、红辣椒、黄水仙和万寿菊的花瓣,以及龙虾、鲑鱼和其它海洋生物的着色。
[0005] 类胡萝卜素是由所有光合生物体以及某些细菌和真菌产生的。类胡萝卜素在光合作用、营养和防光化损伤方面有作用。动物本身不能产生类胡萝卜素,而必须通过饮食获得这些重要的营养化合物。类胡萝卜素包含40(C40)萜类化合物,其最终衍生自异戊二烯生物合成途径,特别衍生自五碳构建单元焦磷酸异戊烯酯(IPP)。所述生物合成途径可以分为两部分:上游异戊二烯途径,其导致IPP的形成;下游类胡萝卜素生物合成途径,其将IPP转化为长链(例如,C30和C40)类胡萝卜素化合物。
[0006] 类胡萝卜素化合物,例如[β-胡萝卜素、虾青素、黄素、玉米素和叶黄素,在工业上用作食品和原料的成分,既起营养作用,又时常增加产品对消费者的吸引。通常将类胡萝卜素,例如虾青素和角黄素,加入到水产养殖饲料中,目的是为水产养殖生物体的肉增色。它们的野生同类因食用甲壳动物或藻类或其它食用了藻类的鱼类中天然存在的类胡萝卜素而具有有色的肉。例如,虾青素被广泛用于鲑鱼养殖,以产生野生鲑鱼肉的橙红色。类胡萝卜素在动物体内的沉积取决于剂量、化学物种、化合物的纯度以及单个生物体的生物学特性 (参见,例如Matthews等人(2006)《比 较生物化学与生理学(Comp.Biochem.Physiol.)》206-14;Per Foss等人,(1984)《水产养殖(Aquaculture)》41(3):213-26)。一些类胡萝卜素也是维生素A的前体。此外,一些类胡萝卜素具有抗氧化特性,并且可能对健康有益,例如,针对心血管问题、不同类型的癌症和某些免疫系统疾病(参见,例如,Jyonouchi等人(1991)《营养与癌症(Nutr.Cancer)》16:93;Giovannucci等人(1995)《美国国立癌症研究所杂志(J.Natl.Cancer Inst.)》87:1767;Miki(1991)《纯粹与应用化学(Pure Appl.Chem)》63:141;Chew等人(1999)《Anticancer Res.(抗癌研究)》19:
1849;Wang等人(2000)《抗菌物和化学疗法(Antimicrob.Agents Chemother.)》44:2452;
Higuera-Ciapara等人(2006)《食品科学与营养学评论(Crit.Rev.in Food Science&Nutr.)》46(2):185-96.)。目前销售几种类胡萝卜素(例如,β-胡萝卜素、番茄红素和叶黄素)作为营养补充剂
[0007] 已经有许多类胡萝卜素在微生物体中产生。例如,专利合作条约申请第WO 02/18617号描述了一种使用代谢单碳底物的微生物体产生类胡萝卜素化合物的方法。编码类胡萝卜素生物合成途径的元素的基因已被克隆并在真菌、酵母和微生物中表达。例如,番茄红素已从基因工程化改造的大肠杆菌和产朊假丝酵母产生(参见,例如,Farmer等人(2001)《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》17:57-61;Wang等人,(2000)《生物技术进展(Biotechnol.Prog.)》16:922-926;Misawa和Shimada(1998)《生物技术杂志
(J.Biotechnol.)》59:169-181;Shimada等人(1998)《应用与环境微生物学
(Appl.Environm.Microbiol.)》64:2676-2680)。玉米素已从重组大肠杆菌和产朊假丝酵母产生(参见,例如,Albrecht等人(1999)《生物技术快报(Biotechnol.Lett.)》21:791-795;
Miura等人(1998)《应用与环境微生物学(Appl.Environm.Microbiol.)》64:1226-1229)。虾青素已从大肠杆菌和红发夫酵母产生(参见,例如,美国专利第5,466,599号)。营养素[β-胡萝卜素已从大肠杆菌、产朊假丝酵母和红发夫酵母产生(参见,例如,Albrecht等人(1999)《生物技术快报(Biotechnol.Lett.)》21:791-795;Miura等人(1998)《应用与环境微生物学(Appl.Environm.Microbiol.)》64:1226-1229;美国专利第5,691,190号)。
[0008] 已在大肠杆菌中表达了来自草生欧文氏菌的编码香叶基香叶基焦磷酸合酶、番茄红素环化酶和八氢番茄红素脱氢酶的基因(参见,例如,美国专利第5,545,816号、第5,656,472号、第5,530,189号和第5,530,188号)。已在大肠杆菌、运动发酵单胞菌和酿酒酵母中表达了来自噬夏孢欧文氏菌的编码诸如香叶基香叶基焦磷酸、八氢番茄红素、番茄红素、β-胡萝卜素和玉米素-二葡糖苷的类胡萝卜素产物的基因(美国专利第5,429,939号)。已重组表达了从黄杆菌中获得的类胡萝卜素生物合成基因,包含crtE,crtB,crtI,crtY和crtZ(参见美国专利第6,124,113号)。
[0009] 尽管上述方法可以产生足够量的类胡萝卜素,但是仍需要改进过程。长期以来特别需要的一种过程是用廉价原料产生有用产量的类胡萝卜素,并产生一种或多种营养素(例如,脂质或蛋白质)。然后可以将所得的富含类胡萝卜素和营养素的微生物或植物生物质加工成用于水产养殖或农业的饲料,或用作人类的营养素来源。
[0010] 有几种利用单碳底物作为唯一能量来源的微生物体。单碳底物的实例包含甲烷、甲醇、甲酸酯、硫醇和甲基化胺。这些生物体被称为甲基营养菌,在本文中也被称为“C1代谢者”。很少有甲基营养菌被成功地用于工业规模产生营养素。尽管单碳底物是具有成本效益的能量来源,但缺乏有关甲基营养菌遗传学的信息以及由此造成的操作难度将其用途主要限于合成天然产物。
[0011] 并且,能够利用由乙醇生产产生的工艺物料流和废液作为替代碳底物是有需要并具有经济效益的。乙醇通常是通过将从植物生物质中提取的糖发酵成“啤酒”来产生的,其中乙醇被去除并通过蒸馏浓缩。来自此蒸馏过程的主要残余物质称为全酒糟。在由干磨玉米粉生产乙醇的过程中,通过离心将全酒糟进一步分离成干固体(湿饼或湿酿酒颗粒(WDG))和称为酒糟水的液体组分。酒糟水进一步蒸发形成酒糟糖浆或浓缩酿酒可溶物(CDS)。通常将这些产品结合在一起形成湿酿酒颗粒及其固体(WDGS),然后进一步干燥形成干酿酒颗粒及其固体(DDGS)以提高保存期限。将WDG、CDS、WDGS和/或DDGS混合到动物饲料中。啤酒、酒糟水和酒糟糖浆含有许多潜在的碳底物,包含醇(丙三醇、乙醇、丁二醇)、碳水化合物(葡萄糖、葡聚糖、木糖、木聚糖、阿拉伯糖、阿拉伯聚糖、半乳糖、半乳聚糖、麦芽糖、纤维素、淀粉)、有机酸(乳酸、乙酸)、蛋白质、肽、基酸和脂肪(参见,例如,Kim等人(2008)《生物资源技术(Bioresource Technology)》99:5165-5176)。
[0012] 还需要用于水产养殖的低成本完全营养。水产养殖是在可控环境中对水生动植物的繁殖、养殖和销售。水产养殖业目前是世界上增长最快的动物蛋白生产行业。世界水产养殖生产大约6000万吨海鲜,年产值超过1100亿美元。目前,鱼类养殖生产了全球所有鱼类消费量的大约一半,并且由于海洋和淡水环境中野生捕捞鱼的产量下降以及需要为不断增长的人口提供更多蛋白质,这一百分比正在增长。水产养殖中生产的种群包含:鲤鱼和其它鲤科鱼类;牡蛎;蚌、蛤和毛蚶;扇贝;小虾和对虾;鲑鱼、鳟鱼和胡瓜鱼;贻贝;以及罗非鱼和其它丽鱼科鱼。
[0013] 某些物种(例如,罗非鱼)可以只食素,而另一些则需要食肉。食肉鱼的饲料通常包括鱼粉和鱼油,这些鱼粉和鱼油衍生自野生的小型远洋鱼(主要是鳀鱼、竹夹鱼、蓝鳕、毛鳞鱼、沙鳗和鲱鱼)。将鱼粉加工成颗粒状或片状饲料,具体取决于将要喂食的鱼的大小(例如,鱼苗、幼鱼、成鱼)。水产养殖饲料组合物的其它组分可包含类胡萝卜素色素、植物蛋白、维生素和矿物质。
[0014] 许多组织认识到鱼粉可用性和水产养殖可持续性的局限性。美国国家海洋与大气管理局和美国农业部合作开展了一项“替代饲料新方案”,以“……标识替代饮食成分,这些成分将减少水产养殖饲料中所含鱼粉的量同时保持养殖海鲜对人类健康的重要益处”(NOAA技术备忘录NMFS F/SPO-124,2011)。
[0015] 美国专利申请公开第2007/0226814号公开了含有至少一种通过发酵微生物体获得的生物质的鱼类食品,其中所述生物质相对于总脂肪酸含量含有至少20%的DHA。提到了不等鞭毛属的微生物体是DHA的来源。美国专利申请公开第2009/0202672号公开了可以将十八碳四烯酸(“SDA”;18:4ω-3)加入到水产养殖饲料中。此脂肪酸可以从转基因植物中获得。遗憾的是,在鱼类中SDA无法有效地转化为DHA。美国专利第7,932,077号公开了重组工程化改造的解脂耶氏酵母可能是大多数动物饲料(包含水产养殖饲料)的有用加入物,因为它提供了必要的ω-3和/或ω-6PUFA,并提供了独特的蛋白质:脂质:碳水化合物组合物以及独特的复杂碳水化合物谱(包括大约1:4:4.6比例的甘露聚糖:β-葡聚糖:甲壳质)。
[0016] 如果不断发展的水产养殖业要维持甚至增加其对世界鱼类供应的贡献,就需要替代水产养殖饲料组合物,这些组合物:(i)通过用非鱼类来源替代鱼粉来减少野生鱼类的投入;(ii)使用不是化学合成的或以其它方式衍生自石油基原料的色素来提供色素沉着。

发明内容

[0017] 提供了用于产生C40类胡萝卜素化合物的微生物体和方法,以及含有C40类胡萝卜素化合物的组合物。
[0018] 一方面,提供了一种微生物体,其包含异源多核苷酸,所述异源多核苷酸包含编码C40类胡萝卜素生物合成途径的多肽的来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌或菠萝泛菌的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与所述C40类胡萝卜素生物合成途径的所述多肽包含至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,其可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,其中所述微生物体是来自甲型变形菌纲的细菌细胞,并且其中所述细菌细胞表达所述异源多核苷酸序列以产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
[0019] 在一些实施例中,所述微生物体进一步包含表达来自伤口埃希菌的所述异源基因序列idi的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自伤口埃希菌的idi所编码的所述多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列。
[0020] 另一方面,提供了一种微生物体,其衍生自表达C30类胡萝卜素产生的天然途径的亲本微生物体,其中编码C30类胡萝卜素产生的天然途径的酶的至少一个基因序列已被破坏或缺失,使得与衍生出其的所述母体微生物体相比,所述微生物体中的C30类胡萝卜素产生减少或消除,其中所述微生物体是来自甲型变形菌纲的细菌细胞。
[0021] 在一些实施例中,所述微生物体进一步包括编码异源C40类胡萝卜素生物合成产生途径的多肽的异源多核苷酸,其中所述微生物体表达所述异源多核苷酸以产生一种或多种C40类胡萝卜素化合物。
[0022] 另一方面,提供了一种微生物体,其包含异源多核苷酸,所述异源多核苷酸含有包含来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtW所编码的所述多肽包含至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,其可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,其中所述微生物体是革兰氏阴性细菌细胞,并且其中所述细菌细胞表达所述异源多核苷酸以产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
[0023] 在一些实施例中,所述微生物体进一步包含包含来自阔海褐黄海水菌的所述基因序列crtY、crtI和crtB的异源多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtY、crtI和crtB所编码的所述多肽包括至少约75%序列同一性的多肽的多核苷酸序列。
[0024] 在一些实施例中,所述的微生物体包含来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW和crtZ,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtW和crtZ所编码的所述多肽包含至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列。
[0025] 在一些实施例中,所述革兰氏阴性细菌细胞来自变形菌。在一些实施例中,所述革兰氏阴性细菌细胞来自甲型变形菌纲。
[0026] 在一些实施例中,本文公开的微生物体表达异源多核苷酸以产生至少一种选自虾青素、角黄素、玉米素、绿蝇黄质、金盏花黄质、3-羟基海胆、海胆酮、β-胡萝卜素和番茄红素的C40类胡萝卜素化合物。
[0027] 在一些实施例中,本文公开的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述至少一种异源多核苷酸包含包含来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的所述基因序列crtZ、crtY、crtI、crtB和crtE的多核苷酸序列,或具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的crtZ、crtY、crtI、crtB和crtE所编码的所述多肽包括至少约70%同一性的多肽的多核苷酸序列,其可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,其中所述微生物体产生玉米素。
[0028] 在一些实施例中,本文公开的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述至少一种异源多核苷酸包含包含来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自阔海褐黄海水菌的crtW所编码的多肽包括至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,其中所述微生物体产生虾青素。
[0029] 在一些实施例中,本文公开的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述至少一种异源多核苷酸包含包含来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的所述基因序列crtY、crtI、crtB和crtE的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌和/或菠萝泛菌的crtY、crtI、crtB和crtE所编码的所述多肽包含至少约70%同一性的多肽的多核苷酸序列,其可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,其中所述微生物体产生β-胡萝卜素。
[0030] 在一些实施例中,本文公开的微生物体包含包含来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW的异源序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自阔海褐黄海水菌的基因序列crtW所编码的所述多肽包含至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,其中所述微生物体产生角黄素。
[0031] 另一方面,提供了一种微生物体,其包含异源多核苷酸,所述异源多核苷酸包含编码C40类胡萝卜素生物合成途径的多肽的来自产虾青素鞘氨醇单胞菌、产玉米素线西棒菌(Siansivirga zeaxanthinifaciens)、或产玉米素中温黄杆菌的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与所述C40类胡萝卜素生物合成途径的多肽包含至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,其可操作地连接到启动子以表达所述多核苷酸序列,其中所述微生物体表达所述异源多核苷酸序列以产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
[0032] 在一些实施例中,所述微生物体是细菌细胞。在一些实施例中,所述细菌细胞来自变形菌门。在一些实施例中,所述细菌细胞来自甲型变形菌纲。
[0033] 在一些实施例中,所述微生物体包括异源多核苷酸,所述异源多核苷酸包含编码来自产玉米素线西棒菌和/或产玉米素中温黄杆菌的所述基因序列crtZ、crtY、crtI和crtB的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自产玉米素线西棒菌和/或产玉米素中温黄杆菌的crtZ、crtY、crtI和crtB所编码的所述多肽包含至少约70%序列同一性的多肽的多核苷酸序列,其中所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素、β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。
[0034] 在一些实施例中,所述微生物体包含异源多核苷酸,所述异源多核苷酸包含编码来自产虾青素鞘氨醇单胞菌的所述基因序列crtZ、crtY、crtI、crtB和crtW的多核苷酸序列,或包含具有其至少约70%序列同一性的多核苷酸序列,或包含编码与由来自产虾青素鞘氨醇单胞菌的crtZ、crtY、crtI、crtB和crtW所编码的所述多肽包括至少约70%同一性的多肽的多核苷酸序列,其中所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素、β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。
[0035] 在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用至少一种C1碳源(例如但不限于甲醇、甲烷、甲胺和/或甲酸酯)产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用至少一种C2碳源(例如但不限于乙醇、乙胺、乙二醇和/或乙酸酯)产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用C1和C2碳源的组合产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用至少一种C1和/或C2醇(例如但不限于甲醇和/或乙醇)产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
[0036] 在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用一种或多种发酵(以产生目标生物产物(例如,醇或生物燃料))工艺物料流作为用于生长的碳源或培养基组分来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物,工艺例如乙醇发酵和/或蒸馏,工艺物料流例如啤酒、湿酒糟、酒糟水和/或酒糟水糖浆。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用多个乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流中的一种与另外的C1和/或C2碳源(例如但不限于甲醇、乙醇、甲烷、甲胺、甲酸酯、乙胺、乙二醇和/或乙酸酯)结合来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用植物生物质和一种或多种醇(例如但不限于甲醇和/或乙醇)发酵产生的乙醇啤酒来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用植物生物质和一种或多种醇(例如但不限于甲醇和/或乙醇)发酵后蒸馏产生的湿酒糟来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用植物生物质和一种或多种醇(例如但不限于甲醇和/或乙醇)发酵后蒸馏产生的酒糟水来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,本文公开的微生物体能够利用植物生物质和一种或多种醇(例如但不限于甲醇和/或乙醇)发酵后蒸馏产生的酒糟水糖浆来产生至少一种C40类胡萝卜素化合物。
[0037] 在一些实施例中,本文公开的微生物体是甲基杆菌属中的细菌细胞,例如但不限于扭脱甲基杆菌细胞。
[0038] 另一方面,提供了一种用于产生包含至少一种C40类胡萝卜素化合物的生物质的方法,其包含在适合生长所述细菌细胞或微生物体和产生所述C40类胡萝卜素化合物的条件下在培养基中培养本文公开的包含用于C40类胡萝卜素的异源多核苷酸的微生物体,其中包含所述C40类胡萝卜素化合物的生物质在所述培养中产生。
[0039] 在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种C1化合物和/或至少一种C2化合物作为用于所述微生物体培养的碳源。在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种C1和/或C2醇作为用于所述微生物体培养的碳源。
[0040] 在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种发酵(以产生目标生物产物(例如,醇或生物燃料))工艺物料流作为用于所述微生物体培养的碳源,工艺例如乙醇发酵和/或蒸馏。在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流作为碳源,与至少一种C1和/或C2化合物结合作为用于所述微生物体培养的碳源。在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流作为碳源,与至少一种C1和/或C2醇结合作为用于所述微生物体培养的碳源。
[0041] 在一些实施例中,所述微生物体属于甲基杆菌属,例如但不限于扭脱甲基杆菌。
[0042] 另一方面,提供了包含至少一种C40类胡萝卜素化合物的生物质,其中所述生物质在包含用于C40类胡萝卜素产生的异源多核苷酸的微生物体中根据本文所述的产生生物质的方法产生。
[0043] 另一方面,提供了一种饲料或营养补充剂组合物,其包含在包含用于C40类胡萝卜素产生的异源多核苷酸的微生物体中根据本文所述的产生生物质的方法来产生的生物质[0044] 另一方面,提供了一种在微生物体中产生生物质的方法,所述微生物体衍生自表达C30类胡萝卜素产生的天然途径的亲本微生物体,其中编码C30类胡萝卜素产生的天然途径的酶的至少一个基因序列已被破坏或缺失,使得与衍生出其的所述母体微生物体相比,所述微生物体中的C30类胡萝卜素产生减少或消除,所述方法包含在适合生长所述微生物体的条件下在培养基中培养所述微生物体,其中所述生物质在所述培养中产生。
[0045] 在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种C1化合物和/或至少一种C2化合物作为用于所述微生物体培养的碳源。在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种C1和/或C2醇作为用于所述微生物体培养的碳源。
[0046] 在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种发酵(以产生目标生物产物(例如,醇或生物燃料))工艺物料流作为用于所述微生物体培养的碳源,工艺例如乙醇发酵和/或蒸馏。在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流作为碳源,与至少一种C1和/或C2化合物结合作为用于所述微生物体培养的碳源。在一些实施例中,所述方法包含利用至少一种乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流作为碳源,与至少一种C1和/或C2醇结合作为用于所述微生物体培养的碳源。
[0047] 在一些实施例中,所述微生物体属于甲基杆菌属,例如但不限于扭脱甲基杆菌。
[0048] 另一方面,提供了生物质,其中所述生物质根据本文所述的在微生物体中产生生物质的方法来产生,所述微生物体衍生自表达C30类胡萝卜素产生的天然途径的亲本微生物体,其中编码C30类胡萝卜素产生的天然途径的酶的至少一个基因序列已被破坏或缺失,使得与衍生出其的所述母体微生物体相比,所述微生物体中的C30类胡萝卜素产生减少或消除。
[0049] 另一方面,提供了一种饲料或营养补充剂组合物,其包含根据本文所述的在微生物体中产生生物质的方法来产生的生物质,所述微生物体衍生自表达C30类胡萝卜素产生的天然途径的亲本微生物体,其中编码C30类胡萝卜素产生的天然途径的酶的至少一个基因序列已被破坏或缺失,使得与衍生出其的所述母体微生物体相比,所述微生物体中的C30类胡萝卜素产生减少或消除附图说明
[0050] 图1示意性地描绘了用于产生C30和C40类胡萝卜素化合物的类胡萝卜素生物合成途径。
[0051] 图2示意性地描绘了产玉米素副球菌中的C40类胡萝卜素生物合成基因簇。
[0052] 图3示出了来自实例1和3中描述的实验的数据。(A)Str01,亲本菌株,扭脱甲基杆菌PA1,产生100%的C30类胡萝卜素;(B)Str06,不产生C30类胡萝卜素并将产玉米素副球菌类胡萝卜素基因簇crtZYIBE整合到细菌染色体中的菌株(A),产生>95%的玉米素;(C)Str03,不产生C30类胡萝卜素并在天然crtEBI的促使下将产玉米素副球菌crtY基因整合到细菌染色体中的菌株(A),产生痕量的β-胡萝卜素;(D)Str05,将产玉米素副球菌crtZYIBE整合到细菌染色体中的菌株(C),产生>95%的玉米素;(E)带有空对照质粒的菌株(C),产生痕量的β-胡萝卜素;(F)带有含有产玉米素副球菌crtYIBE的质粒pD00*的菌株(C),产生>80%的β-胡萝卜素;(G)带有含有产玉米素副球菌crtZYIBE的质粒pD00的菌株(C),产生>
95%的玉米素。
[0053] 图4A示出了实例7中所述菌株的吸收光谱。图4B示出了实例8中所述用甲醇发酵的菌株的吸收光谱。
[0054] 图5示出了实例7中所述菌株的总类胡萝卜素产生。
[0055] 图6示出了如实例7中所述的菌株Str05在甲醇和甲醇/乙醇中的玉米素产生。
[0056] 图7示出了如实例7中所述的菌株Str06在甲醇和甲醇/乙醇中的玉米素产生。
[0057] 图8示出了如实例7中所述的菌株Str05+质粒pD10在甲醇和甲醇/乙醇中的虾青素产生。
[0058] 图9示出了在基本培养基中以甲醇为唯一碳源生长的各种菌株的标准品化合物混合物和提取物的UPLC迹线。迹线示出了在470nm波长或靶向离子处的吸光度。
[0059] a.番茄红素标准品的吸光度迹线。
[0060] b.Str08提取物的吸光度迹线。
[0061] c.Str09提取物的吸光度迹线。保持时间3.12分钟处的次峰预计为角黄素的顺式异构体。
[0062] d.Str06提取物的吸光度迹线。保持时间2.60分钟处的次峰预计为玉米素的顺式异构体。
[0063] e.标准品化合物(所有反式异构体)的参考混合物的吸光度迹线。
[0064] f.Str07提取物的565.24m/z离子的质谱分析迹线。角黄素(C40H52O2)的精确质量为564.40Da。
[0065] g.Str07提取物的580.2m/z离子的质谱分析迹线。绿蝇黄质(C40H52O3)的精确质量为580.39。
[0066] h.Str07提取物的597.4m/z离子的质谱分析迹线。虾青素(C40H52O4)的精确质量是597.38。
[0067] i.Str07提取物的吸光度迹线。
[0068] j.标准品化合物(所有反式异构体)的参考混合物的吸光度迹线:虾青素(保持时间1.96分钟);玉米素(保持时间2.36分钟);角黄素(保持时间2.56分钟);β-胡萝卜素(保持时间4.14分钟)。
[0069] 图10A示出了如实例3中所述的质粒pI的图。图10B示出了如实例1和5中所述的质粒pD的图。图10C示出了如实例2中所述的质粒pA01的图。AarI限制性位点的位置标记为“AarI-RS”。

具体实施方式

[0070] 本文提供了能够产生C40类胡萝卜素化合物(例如,虾青素、角黄素、玉米素、金盏花黄质、3-羟基海胆酮、海胆酮、β-胡萝卜素、番茄红素或它们的任何组合)的非天然存在的微生物体。
[0071] 还提供了工程化改造和培养此些微生物体的方法,使用此些微生物体产生C40类胡萝卜素化合物的方法,以及产生含有C40类胡萝卜素组合物的方法,例如包含所述微生物体的饲料或营养组合物,或包含从此些生物体中回收的C40类胡萝卜素化合物的组合物。
[0072] 本文还提供了其中减少或消除了C30类胡萝卜素产生的非天然存在的微生物体,培养此些微生物体的方法,以及含有所述微生物体的组合物,例如饲料或营养组合物。
[0073] 一方面涉及水产养殖领域。另一方面是宠物食品领域,例如用于猫和狗的宠物食品。再一方面是人类营养和补充剂领域。更具体地,提供了水产饲料、宠物食品和营养补充剂组合物,其包含含有C40类胡萝卜素的微生物生物质和/或来自已经减少或消除了C30类胡萝卜素产生的微生物体的生物质,以及完全蛋白质营养,即含有所施用动物的健康成长所必需的大部分或全部氨基酸。微生物生物质可以与其它成分混合形成饲料的一部分或全部,也可以作为富含蛋白质的粉末直接食用。
[0074] 在一些实施例中,描述了能够以工业规模在廉价C1和/或C2原料(替代(i)蛋白质和(ii)色素组分)上生长的微生物体。
[0075] 在一些实施例中,描述了能够以工业规模在发酵(以产生目标生物产物(例如,醇或生物燃料))工艺物料流(例如廉价的乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流,例如乙醇啤酒、湿酒糟、酒糟水、酒糟水糖浆中的一种或多种)(替代(i)蛋白质和(ii)色素组分)中生长的微生物体。在一些实施例中,描述了能够以工业规模在乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流(例如,乙醇啤酒、湿酒糟、酒糟水、酒糟水糖浆中的一种或多种)(替代(i)蛋白质和(ii)色素组分)结合C1和/或C2原料中生长的微生物体。
[0076] 定义
[0077] 除非本文另外定义,否则本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。Singleton等人,《微生物学和分子生物学词典(Dictionary of Microbiology and Molecular Biology)》第二版,约翰·威利父子出版社(John Wiley and Sons),纽约(1994),以及Hale和Markham,《哈珀·柯林斯生物学词典(The Harper Collins Dictionary of Biology)》,Harper Perennial,纽约(1991)为技术人员提供了本发明中使用的许多术语的通用词典。与本文描述的那些类似或等同的任何方法和物质都可以用于本发明的实践或测试中。
[0078] 除非另有说明,否则本发明的实践将采用分子生物学的常规技术(包含重组技术)。
[0079] 除非上下文另有明确规定,否则“一个/一种(a/an)”和“所述”包含复数指代。
[0080] 如本文使用,术语“多核苷酸”是指任何长度和任何三维结构以及单链或多链(例如,单链、双链、三螺旋等)的核苷酸的聚合形式,其含有脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸和/或脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸的类似物或修饰形式,包含修饰的核苷酸或基或其类似物。因为遗传密码是简并的,所以可以使用多于一个密码子来编码特定氨基酸,并且本发明涵盖编码特定氨基酸序列的多核苷酸。可以使用任何类型的修饰的核苷酸或核苷酸类似物,只要所述多核苷酸在使用条件下保留需要的功能,包含增加核酸酶抗性的修饰(例如,脱氧基、2'-O-Me、硫代磷酸根等)。为了检测或捕获的目的,也可以掺入标记,例如放射性或非放射性标记或锚,例如生物素。术语多核苷酸还包含肽核酸(PNA)。多核苷酸可以是天然存在的或非天然存在的。术语“多核苷酸”、“核酸”和“寡核苷酸”在本文可互换使用。多核苷酸可以含有RNA、DNA或两者,和/或其修饰形式和/或类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分中断。一个或多个磷酸二酯键可以被替代连接基团取代。这些替代连接基团包含但不限于其中磷酸根被P(O)S(“硫代酸根”)、P(S)S(“二硫代酸根”)、(O)NR2(“酰胺化物”)、P(O)R、P(O)0R'、CO或CH2(“甲缩”)取代的实施例,其中每个R或R'独立地为H或取代或未取代的烷基(1-20C),任选地包含醚(--O--)键、芳基、烯基、环烷基、环烯基或芳烷基。并非多核苷酸中的所有键都需要相同。多核苷酸可以是直链或环状的,或包括直链和环状部分的组合。
[0081] 如本文使用,“多肽”是包含氨基酸并且被本领域技术人员认识为蛋白质的组合物。本文使用了氨基酸残基的常规一字母或三字母密码。术语“多肽”和“蛋白质”在本文可互换使用,是指任何长度的氨基酸的聚合物。所述聚合物可以是直链或支链的,可以包括修饰的氨基酸,并且可以被非氨基酸中断。所述术语还涵盖天然修饰或通过干预修饰的氨基酸聚合物;例如,二硫键的形成、糖基化、脂化、乙酰化、磷酸化或任何其它操作或修饰,例如与标记组分的缀合。所述定义中还包含例如含有一种或多种氨基酸类似物(包含例如非天然氨基酸等)的多肽,以及本领域已知的其它修饰。
[0082] 如本文使用,“载体”是指设计用于将核酸引入一种或多种细胞类型的多核苷酸序列。载体包含克隆载体、表达载体、穿梭载体、质粒、噬菌体颗粒、盒等。
[0083] 如本文使用,术语“表达”是指基于基因的核酸序列产生多肽的过程。所述过程包含转录和翻译。
[0084] 如本文使用,“表达载体”是指含有DNA编码序列(例如,基因序列)的DNA构建体,所述DNA编码序列可操作地连接到一个或多个合适的能够实现在宿主中表达所述编码序列的控制序列。此些控制序列包含影响转录的启动子、控制此转录的任选操纵基因序列、编码合适的mRNA核糖体结合位点的序列以及控制转录和翻译终止的序列。载体可以是质粒、噬菌体颗粒、或者仅仅是潜在的基因组插入物。一旦转化为合适的宿主,载体就可以独立于宿主基因组复制和发挥作用,或者在某些情况下可以整合到基因组本身中。质粒是表达载体的最常用形式。然而,本发明旨在包含具有等同功能并且在本领域中已知的表达载体的其它形式。
[0085] “启动子”是指参与RNA聚合酶结合以启动基因转录的调节序列。启动子可以是诱导型启动子或组成型启动子。“诱导型启动子”是在环境或发育调节条件下有活性的启动子。
[0086] 术语“可操作地连接”是指特定元素的并置或排列,使它们可以共同发挥作用以产生效果。例如,如果启动子控制编码序列的转录,则其可操作地连接到编码序列。
[0087] “转录控制下”是本领域众所周知的术语,其表明多核苷酸序列的转录取决于其可操作地连接到有助于转录启动或促进转录的元素。
[0088] “翻译控制下”是本领域众所周知的术语,其表示在mRNA形成后发生的调节过程。
[0089] “基因”是指参与产生多肽的DNA区段,其包含在编码区域之前和之后的区域以及各个编码区段(外显子)之间的插入序列(内含子)。
[0090] 如本文使用,术语“宿主细胞”或“亲本细胞”在本文中可互换使用,是指可以将用于产生多肽的重组表达载体转染到其中以表达所述多肽的细胞或细胞系。宿主细胞包含单个宿主细胞的后代,并且由于自然、偶然或故意的突变,后代不一定与原始亲代细胞完全相同(在形态上或在总基因组DNA互补序列上)。宿主细胞包含用表达载体体内转染或转化的细胞。
[0091] 术语“重组体”是指经过修饰以改变其序列或表达特征的遗传物质(即核酸,其编码的多肽以及包括此些多核苷酸的载体和细胞),例如通过突变编码序列以产生改变的多肽、将编码序列与另一个基因的编码序列融合、将一个基因置于另一种不同启动子的控制下、在异源生物体中表达基因、以降低或升高的水平表达基因、以不同于其天然表达谱的方式有条件地或组成性地表达基因等等。通常,重组核酸、多肽和基于其的细胞已经被人操纵,使得它们与自然界中发现的相关核酸、多肽和细胞不同。
[0092] “信号序列”是指结合到蛋白质的N-末端部分的氨基酸序列,其有助于从细胞分泌蛋白质的成熟形式。细胞外蛋白的成熟形式缺乏在分泌过程中被切割的信号序列。
[0093] 术语“选择性标志物”或“可选择标志物”是指能够在宿主细胞中表达的基因,其使得易于选择那些含有引入的的核酸或载体的宿主。可选择标志物的实例包含但不限于赋予宿主细胞以代谢优势(例如,营养优势)的抗微生物物质(例如,潮霉素、博来霉素或氯霉素)和/或基因。
[0094] 术语“衍生自”涵盖术语“来源于”、“取自于”、“可取自于”,“分离自”、“产生自”,并且通常表示一种特定物质在另一种物质中找到其起源或具有可以参考另一种指定物质进行描述的特征。
[0095] 术语“培养”是指在合适的生长条件下在液体或固体培养基中生长细胞群,例如微生物细胞。
[0096] 关于多核苷酸或蛋白质,术语“异源”或“外源”是指在特定细胞例如宿主细胞中不天然存在的多核苷酸或蛋白质。所述术语旨在涵盖由天然存在的基因、突变的基因和/或合成的基因编码的蛋白质。相反,关于多核苷酸或蛋白质,术语“同源”是指天然存在于细胞中的多核苷酸或蛋白质。
[0097] 在将核酸序列插入细胞中的上下文中,术语“引入的”包含“转染”、“转化”或“转导”,是指将核酸序列掺入到真核或原核细胞,其中可以将核酸序列掺入到细胞的基因组(例如,染色体、质粒、质体或线粒体DNA)、转变为自主复制子或瞬时表达。
[0098] “转染”或“转化”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞。可以将外源多核苷酸保持为非整合载体,例如质粒,或者可以将其整合到宿主细胞基因组中。术语“使转染”或“转染”旨在涵盖将核酸引入宿主细胞的所有常规技术。转染技术的实例包含但不限于磷酸沉淀、DEAE-葡聚糖介导的转染、脂质转染、电穿孔和显微注射。
[0099] 如本文使用,术语“转化的”、“稳定转化的”和“转基因的”是指细胞具有非天然(例如,异源)核酸序列整合入其基因组中或作为通过多代维持的附加型质粒。
[0100] 如本文使用,术语“回收的”、“分离的”、“纯化的”和“分开的”是指从至少一种与之天然缔合的组分中去除的物质(例如,蛋白质、核酸或细胞)。例如,这些术语可以指大体上或基本上不含以其天然状态发现的通常伴随其的组分的物质,例如完整的生物系统。
[0101] “信号序列”(也称为“前序列”、“信号肽”、“前导序列”或“前导肽”)是指新生多肽的氨基末端处的氨基酸序列,其将多肽靶向分泌途径,并且一旦其被移位到内质网膜中就被从新生多肽上切割下来。
[0102] 相关(和衍生)蛋白质涵盖“变体”蛋白质。变体蛋白质与亲本蛋白质和/或彼此的区别在于小数目的氨基酸残基。在一些实施例中,不同氨基酸残基的数目为约1、2、3、4、5、10、20、25、30、35、40、45或50中的任何一个。在一些实施例中,变体区别在于约1到约10个氨基酸。可替代地或另外地,变体可以与参考蛋白质或核酸具有特定程度的序列同一性,例如,其使用序列比对工具(例如,BLAST、ALIGN和CLUSTAL(参见下文))确定。例如,变体蛋白质或核酸可以与参考序列具有至少约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、
80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%或甚至99.5%的氨基酸序列同一性。
[0103] 如本文使用,术语“类似序列”是指蛋白质内的多肽序列,其相对于参考蛋白质提供相似的功能、三级结构和/或保守残基。例如,在含有α螺旋或β折叠结构的表位区域中,类似序列中的取代氨基酸保持相同的结构元件。在一些实施例中,提供了类似序列,使得变体酶相对于衍生出变体的亲本蛋白表现出相似或改善的功能。
[0104] 如本文使用,“同源蛋白质”是指具有与参考蛋白质相似的功能和/或结构的蛋白质。同源物可以来自进化相关或不相关的物种。在一些实施例中,同源物具有与参考蛋白质相似的四级、三级和/或一级结构,从而可能允许用来自同源物的类似区段或片段置换参考蛋白质中的区段或片段,其与用非同源蛋白质的序列置换区段或片段相比,减少了参考蛋白质的结构和/或功能破坏。
[0105] 如本文使用,“野生型”、“天然”和“天然存在”的蛋白质是在自然界中发现的蛋白质。术语“野生型序列”是指在自然界中发现或天然存在的氨基酸或核酸序列。在一些实施例中,野生型序列是蛋白质工程化改造项目(例如,变体蛋白质的产生)的起点。
[0106] 在至少两个核酸或多肽的上下文中,短语“大体上相似”和“基本上相同”通常是指多核苷酸、多肽或多肽的区域或结构域包括与参考(例如,野生型)多核苷酸、多肽或多肽的区域或结构域相比具有至少约35%、40%、45%、50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或甚至99.5%序列同一性的序列。多肽的区域或结构域可在较长的多肽序列中含有例如至少约20、50、100或200个氨基酸。可以使用已知程序,例如使用标准参数的BLAST、ALIGN和CLUSTAL,来确定序列同一性。(参见,例如,Altshul等人(1990)《分子生物学杂志(J.Mol.Biol.)》215:403-410;Henikoff等人(1989)《美国科学院院报
(Proc.Natl.Acad.Sci.)》89:10915;Karin等人(1993)《美国科学院院报
(Proc.Natl.Acad.Sci.)》90:5873;以及Higgins等人(1988)《基因(Gene)》73:237)。可通过美国国家生物技术信息中心公开获得进行BLAST分析的软件。同样,可以使用FASTA搜索数据库(Pearson等人,(1988)《美国科学院院报(Proc.Natl.Acad.Sci.)》85:2444-2448)。在一些实施例中,大体上相同的多肽区别仅在于一个或多个保守氨基酸取代。在一些实施例中,大体上相同的多肽是免疫交叉反应的。在一些实施例中,大体上相同的核酸分子在严格条件下(例如,在中到高严格性范围内)彼此杂交。
[0107] 术语“类胡萝卜素”在本领域中应理解为是指衍生自类异戊二烯途径中间体的一类结构上不同的色素。类胡萝卜素生物合成的保证步骤是由香叶基香叶基焦磷酸形成八氢番茄红素。类胡萝卜素可以是无环的或环状的,并且可以含有或不含有氧,使得术语类胡萝卜素包含胡萝卜素和叶黄素。通常,类胡萝卜素是具有形式上衍生自五碳化合物IPP的共轭多烯碳骨架的类化合物,包含三萜(C30二脱辅基类胡萝卜素(diapocarotenoid))和四萜(C40类胡萝卜素)以及它们的氧化衍生物和其它化合物,例如C35、C50、C60、C70、C80长度或其它长度。许多类胡萝卜素具有很强的吸光性,其长度范围可能超过C80-C100[参见Sliwka等人(2012)《波兰生物化学报(Acta ABP Biochimica Polonica)》59:1第17-20页;Zeeshan等人(2012)《有机快报(Organic Letters)》14:21第5496-5498页]。二脱辅基类胡萝卜素通常由六个类异戊二烯单元组成,这些类异戊二烯单元以这样的方式连接:类异戊二烯单元的排列在分子中心是相反的,从而使两个中心甲基处于1,6-位置关系,其余非末端甲基处于1,5位置关系。此些C30类胡萝卜素可通过以下方式形式上衍生自具有共轭双键长中心链的无环C30H42结构:(i)氢化、(ii)脱氢、(iii)环化、(iv)氧化、(v)酯化/糖基化、或这些过程的任何组合。C40类胡萝卜素通常由八个类异戊二烯单元组成,这些类异戊二烯单元以这样的方式连接:类异戊二烯单元的排列在分子中心是相反的,从而使两个中心甲基处于1,6-位置关系,其余非末端甲基处于1,5-位置关系。此些C40类胡萝卜素可通过以下方式形式上衍生自具有共轭双键长中心链的无环C40H56结构:(i)氢化、(ii)脱氢、(iii)环化、(iv)氧化、(v)酯化/糖基化、或这些过程的任何组合。此类C40类胡萝卜素还包含某些化合物,这些化合物是由碳骨架的重排或通过(形式上)去除此结构的一部分而产生的。已经在自然界中标识了600多种不同的类胡萝卜素。类胡萝卜素包含但不限于:环氧玉米黄素、金盏花红素、金盏花黄质、虾青素、角黄素、辣椒红素、β-隐黄质、α-胡萝卜素、β-胡萝卜素、β,ψ-胡萝卜素、δ-胡萝卜素、ε-胡萝卜素、海胆酮、3-羟基海胆酮、3'-羟基海胆酮、γ-胡萝卜素、ψ-胡萝卜素、4-酮-Y-胡萝卜素、ζ-胡萝卜素、α-隐黄质、脱氧屈曲黄素、藻黄质、7,8-二脱氢虾青素、二脱氢番茄红素、岩藻黄质、岩藻黄醇、异海绵烯、β-异海绵烯、莴苣黄素、叶黄素、番茄红素、粘球酮(myxobactone)、新黄质、链孢红素、羟基链孢红素、多甲藻黄素、八氢番茄红素、视紫红质、视紫红质-葡糖苷、4-酮-玉红黄质、管藻黄素、球形烯、球状菌素、螺菌黄质、圆酵母素、
4-酮-圆酵母素、3-羟基-4-酮-圆酵母素、脲内酯、乙酸脲内酯、紫黄质、玉米素-β-二葡糖苷、玉米素和C30类胡萝卜素。另外,类胡萝卜素化合物包含这些分子的衍生物,其可以包含羟基、甲氧基、氧代基、环氧基、羧基或醛基官能团。此外,所包含的类胡萝卜素化合物包含酯(例如,糖苷酯、脂肪酸酯)和硫酸酯衍生物(例如,酯化的叶黄素)。
[0108] “类异戊二烯途径”在本领域中理解为是指产生或利用五碳代谢物焦磷酸异戊酯(IPP)的代谢途径。如本文所述,两种不同的途径可以产生共同的类异戊二烯前体IPP——“甲羟戊酸途径”和“非甲羟戊酸途径”。术语“异戊二烯途径”足够全面地涵盖这两种类型的途径。由IPP进行类异戊二烯的生物合成是通过几个五碳异戊二烯亚单元的聚合而发生的。衍生自IPP的类异戊二烯代谢物的化学结构差异很大,包含环状和无环分子。类异戊二烯代谢物包含但不限于单萜、倍半萜、二萜、固醇和聚戊烯醇(例如,类胡萝卜素)。
[0109] 术语“类异戊二烯化合物”是指经由以焦磷酸异戊烯酯(IPP)开头的途径衍生并通过头对尾缩合异戊二烯单元而形成的任何化合物,其长度可以为5、10、15、20、30或40个碳。术语“类异戊二烯色素”是指一类通常具有强吸光性的类异戊二烯化合物。
[0110] 术语“饲料预混合物”是指在任选地在高温下加工成颗粒或薄片形式的水产养殖饲料或动物或宠物食品组合物之前的水产养殖饲料或动物/宠物食品组分的粗混合物。
[0111] 水产养殖饲料组合物被用于生产“水产养殖产品”,其中所述产品是可收获的水产养殖物种(例如,有鳍鱼、甲壳类动物),通常出售给人类食用。例如,鲑鱼在水产养殖中被大量生产,因此是水产养殖产品。水产养殖组合物也可用作水产养殖饲料生物体(例如,小型鱼类如磷虾、轮虫等)的饲料,它们是大型水产养殖生物体(例如,食肉鱼)的食物来源。另外,本文所述的水产养殖组合物可用作观赏鱼、小虾、业余爱好者水产养殖等的饲料,其不意图用作其它生物体的食物。
[0112] 术语“水产养殖肉类产品”是指供人类食用的食物产品,其包括来自如上所定义的水产养殖产品的至少一部分肉。水产养殖肉类产品可以是例如整条鱼或从鱼上切下的鱼片,每种都可以作为食物食用。在一些实施例中,这样的产品可以被称为鱼或海鲜产品。
[0113] 术语“生物质”是指微生物细胞物质。生物质可以天然产生,或可以通过天然宿主或重组产生宿主的发酵产生。生物质可以是全细胞、全细胞裂解物、均质化细胞、部分水解的细胞物质和/或部分纯化的细胞物质的形式。
[0114] 术语“加工的生物质”是指已经进行了另外的加工(例如,干燥、巴氏杀菌、破碎等)的生物质,以下将对其进行详细讨论。
[0115] 术语“C1碳底物”是指缺乏碳碳键的任何含碳分子。实例为甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲酸酯、甲基化胺(例如,单、二和三甲基胺)、甲基化硫醇和二氧化碳。
[0116] 术语“C1代谢者”是指具有使用单碳底物作为能量和生物质唯一来源的能力的微生物体。C1代谢者包含能够在单碳底物上生长的甲基营养菌和/或甲烷营养菌。
[0117] 术语“C2碳底物”是指含有两个连接的碳分子的任何含碳分子。实例包含乙醇、乙胺、乙酸酯、乙酸、乙醛、乙二醇和乙硫醇。也可以将二乙胺和三乙胺视为C2碳底物。
[0118] 术语“甲基营养菌”是指能够氧化不含有碳碳键的有机化合物的生物体。在甲基营养菌能够氧化CEE的情况下,甲基营养菌也是甲烷营养菌。
[0119] 术语“甲烷营养菌”是指能够利用甲烷作为底物的原核生物。甲烷通过好氧降解途径完全氧化为二氧化碳。甲烷营养菌的实例包含但不限于甲基单孢菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属和甲基弯曲菌属。
[0120] 术语“高生长甲烷营养型菌株”是指能够使用甲烷作为其唯一碳和能量来源生长的细菌。
[0121] 术语“革兰氏阴性细菌”是不保留在细菌分化的革兰氏染色法中使用的结晶紫染色的细菌。它们的特征在于它们的细胞被膜,其由夹在内胞质细胞膜和细菌外膜之间的肽聚糖薄细胞壁构成。相反,革兰氏阳性细菌(例如,放线菌门或厚壁菌门中的大多数细菌)由于其相对较厚的肽聚糖细胞壁层而保留了结晶紫。通常,革兰氏阳性细菌是单细胞膜细菌且具有单个脂质双分子层,而革兰氏阴性细菌是双细胞膜细菌且具有两个脂质双分子层。如本文使用,“革兰氏阴性菌”是指除放线菌门、厚壁菌门或软壁菌门中的细菌以外的所有细菌。革兰氏阴性菌门的实例包含变形菌门、产水菌门、拟杆菌门、衣原体门、绿菌门、蓝细菌门、异常球菌-栖热菌门、纤维杆菌门、梭杆菌门、芽单胞菌门、硝化螺旋菌门、浮霉菌门、螺旋体门、互养菌门和疣微菌门。
[0122] 术语“工艺物料流”(例如,“乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流”)是指在从生物质中提取的糖发酵为目标生物产物(例如,乙醇)、蒸馏以去除并浓缩生物产物(例如,乙醇)、或固体分离和干燥所得残余物的过程中产生的产物或废液。实例包含啤酒(例如,乙醇啤酒)、醇(例如,乙醇)、全酒糟、湿饼或湿酿酒颗粒(WDG)、酒糟水、酒糟水糖浆或浓缩酿酒可溶物(CDS)、湿酿酒颗粒及其可溶物(WDGS)和干酿酒颗粒及其可溶物(DDGS)。
[0123] 术语“乙醇啤酒”是指将含有糖的生物质发酵成含有增加的乙醇含量的液体的结果。
[0124] 术语“全酒糟”是指通过蒸馏“乙醇啤酒”去除或浓缩乙醇而产生的残余物或剩余物。
[0125] 术语“湿饼”或“湿酿酒颗粒”或“WDG”是指通过离心分离的“全酒糟”的固体成分。
[0126] 术语“酒糟水”是指通过离心从固体“湿饼”或“湿蒸馏谷物”中分离出来的“全酒糟”的液体成分。
[0127] 术语“酒糟水糖浆”或“糖浆”或“浓缩酿酒固体”或“CDS”是指浓缩的“酒糟水”,其中液体(例如,水)被去除。
[0128] 术语“湿酿酒颗粒及其可溶物”或“WDGS”是指“酒糟水糖浆”与“湿酿酒颗粒”的组合
[0129] 术语“干酿酒颗粒及其固体”或“DDGS”是指已进一步干燥的“湿酿酒颗粒及其可溶物”。
[0130] 微生物体
[0131] 提供了非天然存在的微生物体,用于产生C40类胡萝卜素化合物和/或用于减少或消除C30类胡萝卜素化合物的产生。在一些实施例中,本文的非天然存在的例如重组微生物体包含例如细菌、酵母、古细菌,其已被工程化改造以表达至少一种(即一种或多种)用于生物合成一种或多种C40类胡萝卜素化合物的酶,并在适合生长微生物和产生类胡萝卜素的条件下培养时产生C40类胡萝卜素化合物。
[0132] 本文所述的非天然存在的微生物体包含一种或多种外源多核苷酸,其编码并表达用于生物合成C40类胡萝卜素化合物的一种或多种酶或酶活性。外源多核苷酸可以包含用于生物合成C40类胡萝卜素化合物的一种或多种酶或酶活性的一种或多种编码序列,其可操作地连接到一种或多种启动子以在非天然存在的微生物体中表达。此些启动子可以包含但不限于PR和PmxaF。在一些实施例中,对多核苷酸进行密码子优化以在微生物体中表达。
[0133] 在一些实施例中,非天然存在的微生物体包含一种或多种外源多核苷酸,其编码用于C40类胡萝卜素生物合成的一种或多种酶或酶活性,如本文所述,其已被修饰以相对于衍生出其的宿主细胞中的酶或酶活性的稳定性和/或活性,或相对于野生型酶或酶活性的稳定性和/或活性改善稳定性和/或活性。例如,非天然存在的微生物体可以表达用于C40类胡萝卜素生物合成的酶的变体,其具有比衍生出其的野生型酶更高的稳定性和/或活性。
[0134] 在一些实施例中,衍生出本文所述的非天然存在的微生物体的宿主细胞产生一种或多种C30类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,非天然存在的微生物体包含编码用于C30类胡萝卜素生物合成的酶的一个或多个基因的缺失或失活。在一些实施例中,宿主细胞是扭脱甲基杆菌,并且衍生自宿主细胞的非天然存在的微生物体包含编码宿主细胞中鲨烯合酶、二脱辅基八氢番茄红素合酶、二脱辅基八氢番茄红素去饱和酶、C30类胡萝卜素氧化酶、糖基转移酶或磷脂丙三醇乙酰转移酶的一种或多种基因的缺失或修饰。在一些实施例中,扭脱甲基杆菌PA1中涵盖Mext_3434到Mext_3441的区域的缺失或置换去除了C30类胡萝卜素氧化酶、二脱辅基八氢番茄红素去饱和酶、糖基转移酶和磷脂丙三醇乙酰转移酶,导致C30类胡萝卜素产生的完全阻断。
[0135] 在某些实施例中,宿主细胞包括所述途径中的一个或多个内源基因,并且所加入的外源基因补充了产生C40类胡萝卜素化合物的内源途径。
[0136] 本文中的微生物体可以是细菌或真菌。在一些实施例中,微生物体是来自变形菌门的细菌微生物体。在一些实施例中,所述微生物体是来自甲型变形菌纲的细菌微生物体。在一些实施例中,微生物体是革兰氏阴性细菌。
[0137] 可以衍生出非天然存在的微生物体的属的非限制性实例包含甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属、嗜甲基菌属、甲基菌属、生丝微菌属、黄杆菌属、芽孢杆菌属、副球菌属、诺卡氏菌属、节杆菌属、红假单胞菌属、假单胞菌属、念珠菌属、汉逊酵母属、毕赤酵母属、球拟酵母属、红酵母属、埃希菌属和酵母属。可以衍生出非天然存在的微生物体的微生物物种的非限制性实例包含扭脱甲基杆菌(例如,菌株AMI、DM4、DSMZ1340、CM4、PA1或BJ001(以前称为杨甲基杆菌(Methylobacterium populi)))、耐辐射甲基杆菌、结瘤甲基杆菌、甲基杆菌属4-46和大肠杆菌。
[0138] 在一些实施例中,非天然存在的微生物体是甲基营养型细菌。
[0139] 在各种实施例中,可以将用于C40类胡萝卜素生物合成的基因掺入宿主微生物体中以产生C40类胡萝卜素。例如,可以将基因crtZ、crtY、crtI、crtB、crtE、idi和crtW中的一个或多个或编码具有其功能上等同活性的多肽的多核苷酸引入(例如,转化)到宿主细胞中,从而产生产生C40类胡萝卜素化合物的细胞。这些基因的不同子集或其功能等同物的引入会导致产生不同的主要C40类胡萝卜素化合物。例如,表达crtZYIBE会产生玉米素。表达crtYIBE会产生β-胡萝卜素。表达crtIBE会产生番茄红素。表达crtYIBEW会产生角黄素和/或海胆酮。表达crtZYIBEW会产生虾青素。表达产虾青素鞘氨醇单胞菌的crtZYIBW会在菌株中产生虾青素,所述菌株在质粒或第二整合位点上表达天然或异源crtE。表达产玉米素线西棒菌或产玉米素中温黄杆菌的crtZYIB会在菌株中产生玉米素,所述菌株表达质粒或第二整合位点上的天然或异源crtE。表达来自阔海褐黄海水菌的crtYIB和crtWZ会在菌株中产生虾青素,所述菌株表达质粒或第二整合位点上的天然或异源crtE。引入宿主微生物体中的基因或其功能等同物可以衍生自相同或不同的微生物物种或菌株。
[0140] 在一些实施例中,宿主微生物体可以是经工程化改造以减少或消除天然C30类胡萝卜素产生的非天然存在的微生物体,其在一些实施例中可以增加对C40类胡萝卜素化合物的通量。
[0141] 在一些实施例中,与不包含或不表达idi基因或其功能等同物的相同细胞相比,可掺入基因idi或编码具有功能上等同的异戊烯二磷酸δ-异构酶活性的多肽的多核苷酸,其可以增加类胡萝卜素合成。
[0142] 在一个实施例中,非天然存在的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码产玉米素副球菌或菠萝泛菌(例如,菠萝泛菌ATCC 19321)的基因crtZ、crtY、crtI、crtB和/或crtE或伤口埃希菌的crtZ、crtY、crtI、crtB、crtE和/或idi所编码一种或多种多肽,或编码与产玉米素副球菌或菠萝泛菌(例如,菠萝泛菌ATCC 19321)的crtZ、crtY、crtI、crtB和/或crtE或伤口埃希菌的crtZ、crtY、crtI、crtB、crtE和/或idi所编码的多肽具有至少大约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%氨基酸序列同一性并保留其用于产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的一种或多种多肽。在一些实施例中,所述异源多核苷酸包含与产玉米素副球菌或菠萝泛菌(例如,菠萝泛菌ATCC 19321)的基因序列crtZ、crtY、crtI、crtB和/或crtE或伤口埃希菌的crtZ、crtY、crtI、crtB、crtE和/或idi具有至少大约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%核苷酸序列同一性的一种或多种多核苷酸序列。在一些实施例中,所述微生物体是细菌微生物体。在一些实例中,所述细菌微生物体可以来自甲型变形菌纲。在一个实例中,所述细菌微生物体来自甲基杆菌属,例如,扭脱甲基杆菌。在一些实施例中,对异源多核苷酸的编码序列进行密码子优化以在微生物体中表达,例如,进行密码子优化以在扭脱甲基杆菌中表达。
[0143] 在一个实施例中,所述微生物体包含并表达来自产玉米素副球菌、菠萝泛菌(例如,菠萝泛菌ATCC 19321)和/或伤口埃希菌的异源crtZYIBE,或具有其至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性并保留其功能活性的多肽,并且所述微生物体产生玉米素。在一些实施例中,所述微生物体进一步包含并表达异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码crtW基因(例如,来自阔海褐黄海水菌的crtW基因),或与阔海褐黄海水菌的crtW所编码的多肽具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽,或具有与阔海褐黄海水菌的crtW的多核苷酸序列具有至少约70%序列同一性的多核苷酸序列的多肽,并且所述微生物体产生虾青素。在一些实施例中,所述微生物体进一步包含并表达异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码idi基因(例如,来自伤口埃希菌的idi基因),或与伤口埃希菌的idi所编码的多肽具有至少约70%同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽,或具有与伤口埃希菌的idi的多核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的多核苷酸序列的多肽,并且所述微生物体比不包含idi基因或其功能等同物的相同微生物体产生更大量的C40类胡萝卜素化合物。
[0144] 在一个实施例中,所述微生物体包含并表达来自产玉米素副球菌、菠萝泛菌(例如,菠萝泛菌ATCC 19321)和/或伤口埃希菌的异源crtYIBE,或具有其至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性并保留其功能活性的多肽,并且所述微生物体产生β-胡萝卜素。在一些实施例中,所述微生物体进一步包含异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码crtW基因(例如,来自阔海褐黄海水菌的crtW基因),或与阔海褐黄海水菌的crtW所编码的多肽具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽,或具有与阔海褐黄海水菌的crtW的多核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性的多核苷酸序列的多肽,并且所述微生物体产生角黄素和/或海胆酮。在一些实施例中,所述微生物体进一步包含并表达异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码idi基因(例如,来自伤口埃希菌的idi基因),或与伤口埃希菌的idi所编码的多肽具有至少约70%、75%、80%、85%、
90%、95%、98%或99%同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽,或具有与伤口埃希菌的idi的多核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、
98%或99%序列同一性的多核苷酸序列的多肽,并且所述微生物体比不包含idi基因或其功能等同物的相同微生物体产生更大量的C40类胡萝卜素化合物。
[0145] 在一个实施例中,所述微生物体包含并表达来自产玉米素副球菌、菠萝泛菌(例如,菠萝泛菌ATCC 19321)和/或伤口埃希菌的异源crtIBE,或具有其至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性并保留其功能活性的多肽,并且所述微生物体产生番茄红素。在一些实施例中,所述微生物体进一步包含并表达异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码idi基因(例如,来自伤口埃希菌的idi基因),或与伤口埃希菌的idi所编码的多肽具有至少约70%同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽,或具有与伤口埃希菌的idi的多核苷酸序列具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、
98%或99%序列同一性的多核苷酸序列的多肽,并且所述微生物体比不包含idi基因或其功能等同物的相同微生物体产生更大量的C40类胡萝卜素化合物。
[0146] 在一个实施例中,所述非天然存在的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码阔海褐黄海水菌的基因crtYIB和crtWZ所编码的多肽,或与阔海褐黄海水菌的crtYIB和crtWZ所编码的多肽具有至少约75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽,并且所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素或β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。在一些实施例中,所述异源多核苷酸包含与阔海褐黄海水菌的基因序列crtYIB和crtWZ具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%核苷酸序列同一性的多核苷酸序列。在一些实施例中,所述微生物体是细菌微生物体。在一些实例中,所述细菌微生物体可以是革兰氏阴性细菌微生物体。在一个实例中,所述细菌微生物体可以来自变形菌门。在一个实例中,所述细菌微生物体可以来自甲型变形菌纲。在一个实例中,细菌微生物体来自甲基杆菌属,例如,扭脱甲基杆菌。在一些实施例中,对异源多核苷酸的编码序列进行密码子优化以在微生物体中表达,例如,进行密码子优化以在扭脱甲基杆菌中表达。
[0147] 在一个实施例中,所述非天然存在的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码产虾青素鞘氨醇单胞菌(例如,产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298)的基因crtZ、crtY、crtI、crtB和/或crtW所编码的一种或多种多肽,或与产虾青素鞘氨醇单胞菌(例如,产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298)的crtZ、crtY、crtI、crtB和/或crtW所编码的多肽具有至少约70%氨基酸序列同一性并保留其用于产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的多肽。在一些实施例中,所述异源多核苷酸包含与产虾青素鞘氨醇单胞菌(例如,产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298)的基因序列crtZ、crtY、crtI、crtB和/或crtW具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%核苷酸序列同一性的一种或多种多核苷酸序列。
在一个实施例中,所述微生物体包含并表达来自产虾青素鞘氨醇单胞菌的异源crtZYIBW,或具有其至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性并保留其功能活性的多肽,并且所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素、β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。在一些实施例中,所述微生物体表达产虾青素鞘氨醇单胞菌的crtY、crtI和crtB,或具有其至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%序列同一性并保留其功能活性的多肽,并且所述微生物体产生β-胡萝卜素。在一些实施例中,crtW被表达以产生角黄素。在一些实施例中,crtZ被表达以产生玉米素。在一些实施例中,crtW和crtZ被表达以产生会产生虾青素的基因产物的比例。在一些实施例中,所述微生物体是细菌微生物体。在一些实例中,所述细菌微生物体可以来自变形菌门,任选地来自甲型变形菌纲。在一个实例中,细菌微生物体来自甲基杆菌属,例如,扭脱甲基杆菌。在一些实施例中,对异源多核苷酸的编码序列进行密码子优化以在微生物体中表达,例如,进行密码子优化以在扭脱甲基杆菌中表达。
[0148] 在一个实施例中,所述非天然存在的微生物体包含至少一种异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码产玉米素线西棒菌(例如,产玉米素线西棒菌CC-SAMT-1)或产玉米素中温黄杆菌(例如,产玉米素中温黄杆菌DSM 18436)的基因crtZ、crtY、crtI和/或crtB所编码的一种或多种多肽,或与产玉米素线西棒菌(例如,产玉米素线西棒菌CC-SAMT-1)或产玉米素中温黄杆菌(例如,产玉米素中温黄杆菌DSM 18436)的crtZ、crtY、crtI和/或crtB所编码的多肽具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%氨基酸序列同一性并保留其产生C40类胡萝卜素化合物的功能活性的一种或多种多肽。在一些实施例中,所述异源多核苷酸包含与产玉米素线西棒菌(例如,产玉米素线西棒菌CC-SAMT-1)或产玉米素中温黄杆菌(例如,产玉米素中温黄杆菌DSM18436)的基因序列crtZ、crtY、crtI和/或crtB具有至少约70%、75%、80%、85%、90%、95%、98%或99%核苷酸序列同一性的一种或多种多核苷酸序列。在一个实施例中,所述微生物体包含并表达来自产玉米素线西棒菌(例如,产玉米素线西棒菌CC-SAMT-1)或产玉米素中温黄杆菌(例如,产玉米素中温黄杆菌DSM 18436)的异源crtZYIB,或具有其至少约70%序列同一性并保留其功能活性的多肽,并且所述微生物体产生虾青素、角黄素、玉米素、番茄红素、β-胡萝卜素或这些C40类胡萝卜素的中间体。在一些实施例中,所述微生物体是细菌微生物体。在一些实例中,所述细菌微生物体可以来自变形菌门,任选地来自甲型变形菌纲。在一个实例中,所述细菌微生物体来自甲基杆菌属,例如,扭脱甲基杆菌。在一些实施例中,对异源多核苷酸的编码序列进行密码子优化以在微生物体中表达,例如,进行密码子优化以在扭脱甲基杆菌中表达。
[0149] 微生物体的转化
[0150] 用于在宿主细胞中引入和表达外源多核苷酸的许多转化方案和构建体是本领域已知的。
[0151] 在某些实施例中,遗传修饰将利用自由复制的质粒载体进行克隆。这些可能包含开发用于甲基杆菌的小IncP载体。这些载体可以包含用于克隆的pCM62、pCM66或pHC41。(Marx和Lidstrom(2001)《微生物学(Microbiology)》147:2065-2075;Chou等人(2009)《公共科学图书馆遗传学(PLoS Genetics)》5:el000652)。
[0152] 在某些实施例中,遗传修饰将利用自由复制的表达质粒,例如pCM80、pCM160、pHC90或pHC91。(Marx和Lidstrom(2001)《微生物学(Microbiology)》147:2065-2075;Chou等人(2009)《公共科学图书馆遗传学(PLoS Genetics)》5:el000652)。
[0153] 在某些实施例中,遗传修饰将利用自由复制的表达质粒,所述表达质粒具有对诱导分子(例如,cumate或脱水四环素)的水平响应的能力。这些包含pHC115、pLC290、pLC291。(Chou等人(2009)《公共科学图书馆遗传学(PLoS Genetics)》5:el000652;Chubiz等人(2013)《BMC研究笔记(BMC Research Notes)》6:183)。
[0154] 在某些实施例中,遗传修饰将利用可循环使用的抗生素标志物系统,例如cre-lox系统。这可能包含使用开发用于扭脱甲基杆菌的pCM157、pCM158、pCM184、pCM351系列质粒。(Marx和Lidstrom(2002)《生物技术(BioTechniques)》33:1062-1067)。
[0155] 在某些实施例中,遗传修饰将利用转座子诱变。这可能包含mini-Tn5递送系统,例如在扭脱甲基杆菌中证明的pCM639(D'Argenio等人(2001)《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》183:1466-1471)。(Marx等人(2003)《细菌学杂志(J.Bacteriol.)》185:669-673)。
[0156] 在某些实施例中,遗传修饰将利用直接引入染色体基因座中的表达系统。这可能包含开发用于扭脱甲基杆菌AM1的pCM168、pCM172和pHC01质粒。(Marx和Lidstrom(2001)《微生物学(Microbiology)》147:2065-2075;Lee等人(2009)《进化(Evolution)》63:2813-2830)。
[0157] 在某些实施例中,由于sacB表达提供的蔗糖敏感性,遗传修饰将利用基于sacB的系统进行等位基因的无标记交换。这可能包含最初用扭脱甲基杆菌测试的pCM433载体。(Marx等人(2008)《BMC研究笔记(BMC Research Notes)》1:1)。
[0158] 微生物培养
[0159] 提供了产生生物质的方法。所述方法包含在适合生长微生物体和产生包含一种或多种本文所述的C40类胡萝卜素化合物的生物质的的条件下在培养基中培养本文所述的微生物体。在一些实施例中,产生一种或多种C40类胡萝卜素化合物,虾青素、角黄素、玉米素、绿蝇黄质、金盏花黄质、3-羟基海胆酮、海胆酮、β-胡萝卜素和番茄红素或其组合。
[0160] 本文中的微生物体是非天然存在的,并且含有至少一种异源多核苷酸,所述异源多核苷酸编码用于微生物体中C40类胡萝卜素产生的一种或多种异源酶。在一些实施例中,所述微生物体仅通过异源多核苷酸所编码的酶产生C40类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,所述微生物体通过异源多核苷酸所编码的酶和母体微生物体基因组所编码的天然酶的组合产生类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,所述微生物体还通过亲本微生物体中的天然生物合成途径产生一种或多种C30类胡萝卜素化合物。在一些实施例中,所述亲本微生物体的天然C30类胡萝卜素途径已经被破坏或缺失,使得与亲本微生物体相比,C30类胡萝卜素产生减少或消除。
[0161] 培养基包含碳源、氮源、无机物质(例如,无机盐)和微生物体生长所需的任何其它物质(例如,维生素、氨基酸等)。
[0162] 碳源可以包含糖,例如葡萄糖、蔗糖、乳糖、果糖、海藻糖、甘露糖、甘露醇和麦芽糖;有机酸,例如乙酸、乳酸、富酸、柠檬酸、丙酸、苹果酸、丙酮酸丙二酸琥珀酸抗坏血酸;醇,例如甲醇、乙醇、丙醇、丁醇、戊醇、己醇、异丁醇和丙三醇;油或脂,例如大豆油、米糠油、橄榄油、玉米油、芝麻油、亚麻子油等。碳源的加入量根据碳源的种类而变化,例如,每升培养基约1到约100gm或约2到约50gm。
[0163] 在各个实施例中,培养条件可以包含以下一种或多种:培养基的通气(例如,造成约5%到约50%的溶解氧浓度);培养基的温度(例如,约20℃到约50℃的温度);碳源,包括或由或基本上由以下组成:一种或多种醇(例如,甲醇、乙醇、丙三醇或其组合);或半连续或连续发酵条件。
[0164] 在一些实施例中,将C1碳底物提供给能够将此底物转化为有机产物的微生物体(例如,甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属的微生物体)。在某些实施例中,C1碳底物选自甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲基化胺、甲基化硫醇和二氧化碳。在某些实施例中,C1碳底物选自甲醇、甲醛和甲基化胺。在某些实施例中,C1碳底物是甲醇。
[0165] 在一些实施例中,将C2碳底物提供给能够将此底物转化为有机产物的微生物体(例如,甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属的的微生物体)。在某些实施例中,C2碳底物选自乙胺、乙酸酯、乙酸、乙醛、乙二醇和乙硫醇。二乙胺和三乙胺视也可以视为C2碳底物。在某些实施例中,C1碳底物选自甲醇。
[0166] 在一些实施例中,将一种或多种C1和C2碳底物一起或依次提供给能够将此底物转化为有机产物的微生物体(例如,甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属的的微生物体)。在某些实施例中,C1和C2源可以包含甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲基化胺、甲基化硫醇、二氧化碳、乙醇、乙胺、乙酸酯、乙酸、乙醛、乙二醇、乙硫醇、二乙胺或三乙胺。在一些实施例中,C1和C2源分别是甲醇和乙醇。
[0167] 在一些实施例中,将一种或多种发酵(以产生目标生物产物(例如,醇或生物燃料))工艺物料流(例如,乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流)作为碳底物提供给微生物体,所述微生物体能够将此底物转化为有机产物(例如,甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属的的微生物体)。在某些实施例中,所述乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流选自乙醇啤酒、乙醇、全酒糟、湿饼或湿酿酒颗粒(WDG)、酒糟水、酒糟水糖浆或浓缩酿酒可溶物(CDS)、湿酿酒颗粒及其可溶物(WDGS)和干酿酒颗粒及其可溶物(DDGS)中的一种或多种。在某些实施例中,所述乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流选自酒糟水或酒糟水糖浆。在某些实施例中,所述乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流是酒糟水糖浆。
[0168] 在一些实施例中,将一种或多种C1、一种或多种C2或一种或多种C1和C2碳底物一起或依次随同一种或多种发酵(以产生目标生物产物(例如,醇或生物燃料))工艺物料流(例如,乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流)提供给微生物体,所述微生物体能够将此底物转化为有机产物(例如,甲基杆菌属、甲基单胞菌属、甲基杆菌属、甲基球菌属、甲基弯曲菌属、甲基环孢菌属、甲基微菌属的微生物体)。在某些实施例中,C1、C2或C1和C2源以及乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流可以包含甲烷、甲醇、甲醛、甲酸、甲基化胺、甲基化硫醇、二氧化碳、乙醇、乙胺、乙酸酯、乙酸、乙醛、乙二醇、乙硫醇、二乙胺、三乙胺、乙醇啤酒、乙醇、全酒糟、湿饼或湿酿酒颗粒(WDG)、酒糟水、酒糟水糖浆或浓缩酿酒可溶物(CDS)、湿酿酒颗粒及其可溶物(WDGS)和干酿酒颗粒及其可溶物(DDGS)。在一些实施例中,C1和C2源分别是甲醇和乙醇,并且乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流是酒糟水。在一些实施例中,C1和C2源分别是甲醇和乙醇,并且乙醇发酵和/或蒸馏工艺物料流为酒糟水糖浆。
[0169] 氮源可以单独地或组合地包含硝酸、硝酸铵、氯化铵、硫酸铵、磷酸铵、氨、尿素、废酵母细胞等。氮源的加入量根据氮源的种类而变化,例如每升培养基约0.1到约30gm或约1到约10gm。
[0170] 无机盐可以单独地或组合地包含磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸镁、氯化镁、硫酸、硫酸亚铁、氯化铁、氯化亚铁、硫酸锰、氯化锰、硫酸锌、氯化锌、硫酸氯化钙、碳酸钙、碳酸钠、硫酸钠等。无机盐的量根据无机盐的种类而变化,例如,每升培养基约0.00001到约10gm。
[0171] 特殊所需物质,例如维生素、核酸、酵母提取物、蛋白胨、肉提取物、麦芽提取物、玉米浆、大豆粉、干酵母等,可单独地或组合地包含。特殊所需物质的使用量根据物质的种类而变化,例如,每升培养基约0.2gm到约200gm或约3gm到约10gm。
[0172] 在一些实施例中,培养条件包含碳源,所述碳源包括或由或基本上由以下组成:一种或多种醇,例如但不限于甲醇、乙醇和/或丙三醇或其组合,例如甲醇和乙醇的组合。
[0173] 在一些实施例中,采用产生需要的C40类胡萝卜素水平的培养条件。例如,可以实现生物质中总C40类胡萝卜素水平为0.1-1%(w/v)或更高。
[0174] 在一些实施例中,将培养基的pH调节到约2到约12或约6到约9的pH。培养基可进一步包含一种或多种缓冲剂以将培养物维持在需要的pH。许多缓冲剂是本领域已知的,包含磷酸盐、碳酸盐、乙酸盐、PIPES、HEPES和Tris缓冲剂。用于给定微生物体的合适的缓冲液可以容易地通过本领域普通技术人员确定。对于甲基杆菌,一种常见的培养基,如Lee等人(2009)《进化(Evolution)》63:2813-2830所述,是一种磷酸盐缓冲的培养基,其由1mL痕量金属溶液(向1升去离子水中依次加入以下物质:12.738gm EDTA二钠盐二水合物、4.4gm ZnSO-7H2O、1.466gm CaCl2-2H2O、1.012gm MnCl2-4H2O、0.22gm(NH4)6Mo7O24-4H2O、0.314gm CuSO4-5H2O、0.322gm CoCl2-6H2O和0.998gm Fe3(SO4)2-7H2O;每次加入后保持pH 5.0)、100mL磷酸盐缓冲液(25.3g K2HPO4和22.5g NaH2PO4在1升去离子水中的溶液)、100mL硫酸盐溶液(5gm(NH4)2(SO4)和0.98gm Mg(SO4)2在1升去离子水中的溶液)和799mL去离子水组成。所有组分分别进行高温杀菌,然后集中到一起。最近开发出来的一种与扭脱甲基杆菌一起使用的替代培养基利用了有机缓冲液,并具有柠檬酸盐螯合的痕量金属混合物。在通过振荡或通气/搅动提供的有氧条件下,在15℃到40℃,优选20℃到35℃的温度下培养通常1到20天,优选1到4天。甲基杆菌的常规做法是在30℃下进行。制作M-PIPES培养基的方案在Delaney等人(2013)《公共科学图书馆综合(PLoS One)》8:e62957的表S1中描述。USSN61/
863,701中的图2示出了为与扭脱甲基杆菌一起使用而优化的培养基的示例性配方。
[0175] 为了生成微生物体如甲基杆菌的密集培养物,使用分批补料法可能是有利的。甲醇在0.1-10%v/v(~24.7mM-2.47M)下可以很好地耐受,因此此加入步长(step size of addition)可以重复使用。乙醇在0.1-20%v/v(~1.71mM-3.42M)下可以很好地耐受,因此此加入步长可以重复使用。关键的是,在甲醇和/或乙醇上培养期间pH水平会下降,因此使用碱(如KOH、NH4OH或NaOH)对于保持pH值在6.5左右非常重要。通气可以经由物理搅动(例如,叶轮)、经由过滤空气或纯氧气的鼓泡或组合方式实现。为了降低产生成本,可以将缓冲液从磷酸盐或PIPES替换为碳酸盐缓冲的培养基。
[0176] 在一些实施例中,使用“充排式(fill and draw)”方法,其中当培养物在600nm处达到需要的光密度(例如,约50到约200)时,去除一部分培养基(例如,约10%到约90%),然后用等同量的新鲜培养基代替,从而将C40类胡萝卜素在培养物中维持在相对恒定的水平,从而产生含有需要水平的C40类胡萝卜素的生物质。
[0177] 在一些实施例中,使用“连续”方法,其中连续加入新鲜培养基,同时以相同速率连续去除培养基和微生物体,以保持培养体积相对恒定,从而产生含有需要水平的C40类胡萝卜素的生物质。
[0178] 可以例如通过常规手段(例如,离心或过滤)从培养物中分离微生物细胞。细胞可以整体分离,也可以裂解以释放其内容物以进行提取或进一步处理。可以用合适的溶剂对细胞或培养基进行提取。
[0179] 组合物
[0180] 提供了组合物,其用作水产养殖中的饲料、或用作动物饲料、或用作含有来自如本文所述培养的微生物体细胞的加工的或未加工的生物质的人类营养补充剂,以及饲料或营养补充剂组合物的制备方法。
[0181] 在一些实施例中,饲料组合物或营养补充剂包含通过如本文所述培养一种或多种微生物体产生的(即通过如本文所述培养会产生需要的C40类胡萝卜素水平的本文所述的非天然存在的微生物而产生的)含有C40类胡萝卜素的生物质。
[0182] 在C30类胡萝卜素的生物合成途径被破坏或缺失的一些实施例中,饲料组合物或营养补充剂含有生物质,所述生物质不含有C30类胡萝卜素,或与衍生出所述微生物体的亲本菌株产生的生物质相比,在相同培养条件下生含有降低水平的C30类胡萝卜素。
[0183] 在一些实施例中,微生物细胞产生聚羟基链烷酸酯(PHA),例如聚羟基丁酸酯(PHB),并且组合物在掺入组合物的生物质中含有PHA(例如,PHB)。在一些实施例中,组合物含有一种或多种C40类胡萝卜素并含有PHA(例如,PHB)。
[0184] 在各个实施例中,组合物含有虾青素、角黄素、玉米素、绿蝇黄质、金盏花黄质、3-羟基海胆酮、海胆酮、β-胡萝卜素和番茄红素中的一种或多种或其组合。
[0185] 在某些实施例中,掺入饲料或营养补充剂组合物中的生物质可以为干燥或大体上上干燥的形式,例如含有少于约20%、10%、5%或2%的水分。在某些实施例中,通过去除大体上所有的上清液,例如通过过滤、沉淀或离心来分离培养物。在某些实施例中,培养物的收集和生物质的进一步处理包含细菌裂解步骤,例如通过使用去污剂或超声。在某些实施例中,处理过的微生物细胞维持大体上整个细胞膜。在一些实施例中,很大一部分(例如,大于约5%、10%、20%、30%、50%或80%)的细菌细胞可以在加工后的生物质中维持活力。
[0186] 饲料组合物可以含有以重量计至少约1%的生物质。在某些实施例中,饲料组合物被优化以供鱼、海鲜、人、家禽、猪、或其它动物食用。例如,饲料可以包含EPA、DHA和一种或多种必需氨基酸中的一种或多种。
[0187] 还提供了制备饲料组合物的方法。在一些实施例中,所述方法包含:(a)在合适的培养基中培养至少一种如上所述的非天然存在的微生物体;(b)浓缩培养基以提供生物质;(c)任选地提供另外的饲料组分;(d)用生物质生产饲料组合物。在某些实施例中,步骤(b)包含离心。在某些实施例中,步骤(b)包含使生物质沉降。在某些实施例中,步骤(b)包含过滤。在某些实施例中,所述方法还包含在步骤(a)之后用化学试剂(例如,表面活性剂或溶剂)预处理生物质以破坏生物质的细胞膜。在某些实施例中,所述方法还包含在步骤(a)之后机械破坏生物质的细胞膜。
[0188] 可掺入富含一种或多种C40类胡萝卜素化合物的单细胞蛋白质的如本文所述生产的饲料的实例包含,例如宠物食品(例如,猫粮、狗粮等),观赏鱼类、养殖鱼类或甲壳类动物等的饲料,农场饲养动物(包含牲畜,还包含水产养殖中饲养的鱼类或甲壳类动物)的饲料。生物质的状态可以在整个细胞中裂解或部分加工。如本文所述产生的富含C40类胡萝卜素的生物质或富含C40类胡萝卜素的蛋白质也可以掺入供人类食用的食物或维生素补充剂中,任选地与另外的热量或营养补充剂一起。如本文所述生产的掺入包含一种或多种C40类胡萝卜素化合物的食品或饲料材料或包含一种或多种C40类胡萝卜素化合物的生物质优选对生物体(预期的接受者)是可口的。此食品或饲料材料可以具有当前对于食物材料已知的任何物理性质(例如,固态、液态、软质)。在一些实施例中,如本文所述生产的饲料将经历造粒过程,例如以小于约1%、5%、10%、20%、25%、30%、40%、50%、60%或75%的包合率通过热或冷挤压过程。在其它情况下,如本文所述产生的富含C40类胡萝卜素的生物质或富含C40类胡萝卜素的蛋白质可以100%直接食用或与另一种物质以液体、焙烤食品或其它形式一起使用,包含但不限于各种类型的片剂、胶囊剂、饮剂、含漱剂等。
[0189] 在一些实施例中,饲料或营养组合物或掺入饲料或营养组合物中的生物质包含以重量计约0.0001%到约1%的C40类胡萝卜素。在一些实施例中,最终饲料组合物中C40类胡萝卜素为以重量计0.00001%到0.0001%。
[0190] 在一些实施例中,最终饲料中所有C40类胡萝卜素由本文所述的微生物体的生物质提供。在一些实施例中,最终饲料组合物中至少1%(w/w)的C40类胡萝卜素由本文所述的微生物体的生物质提供。
[0191] 在一些实施例中,本文所述的饲料或营养组合物包含多种微生物体,微生物体各自产生不同水平的本文所述的不同C40类胡萝卜素化合物,它们可以一起培养或可以单独培养并组合用于生产饲料或营养组合物。
[0192] 还提供了生产鱼或海鲜的方法,包含养殖鱼或海鲜,并向鱼或海鲜提供饮食,所述饮食包含本文所述的饲料组合物。
[0193] 以下实施例旨在说明而非限制本发明。
[0194] 实例
[0195] 在下面的实例中使用的载体和核苷酸序列在表1中提供。基因或基因簇起源由天然生物体的首字母标注。
[0196] 表1
[0197]
[0198] 表2提供了以下实例中使用的菌株清单以及与类胡萝卜素产生相关的基因型。
[0199] 表2
[0200]
[0201] 表3示出了如以下实例中所述的,各种生物体的crtYIB和crtIBZY簇在大肠杆菌和具有和不具有天然C30类胡萝卜素产生途径的扭脱甲基杆菌中类胡萝卜素的产量。C30类胡萝卜素的产量是以最佳产生分离株的干燥细胞为基准报告的。
[0202] 表3
[0203]
[0204] 表4提供了如以下实例中所述的具有各种基因的基于质粒的过表达的各种整合菌株的类胡萝卜素产量。crtE*表示非功能性突变体。
[0205] 表4
[0206]
[0207] 表5提供了如以下实例中所述的在各种培养基组合物上,在扭脱甲基杆菌中整合途径的类胡萝卜素产量。
[0208] 表5
[0209]
[0210] 实例1
[0211] 概述:将产玉米素副球菌crtZYIBE基因与先前在扭脱甲基杆菌中表征的组成型启动子克隆成质粒。将质粒转化到具有和不具有天然C30类胡萝卜素途径的扭脱甲基杆菌中。发酵这些带有质粒的菌株产生玉米素。
[0212] 经由聚合酶链反应(PCR)在几个部分中扩增产玉米素副球菌ATCC 21588crtZYIBE基因(SEQ ID NO:9),并引入了在靶序列中天然存在的AarI识别位点的连接点。由于此基因簇由两个会聚操纵子组成(图2),因此经由PCR扩增了来自扭脱甲基杆菌mxaF基因(SEQ ID NO:3)的启动子区域,以促使crtE基因的表达。所有扩增引物设计有18-25个碱基对结合区域以及包含识别位点、间隔区域和限制位点的突出端,使得可以通过AarI Gateway克隆进行限制和连接。在位于AarI识别位点的连接点引入单核苷酸多态性(SNP),以在不改变编码的氨基酸的情况下去除识别。
[0213] 通过AarI Gateway组装法将操纵子片段和pmxaF连接到载体pD中(图10B),所述载体含有衍生自病毒启动子pR的启动子-RBS区域pR-faeRBS(SEQ ID NO:4)和来自扭脱甲基杆菌基因fae的RBS区域。基因以其天然会聚结构与pR-faeRBS下游的crtZYIB和pmxaF下游的crtE组装在一起。(图10C示出了质粒pA01的图作为实例示意图。)载体骨架衍生自质粒pLC291(参见Chubiz等人(2013)《BMC研究笔记(BMC Research Notes)》6(1):183,其包含基因kanR(赋予卡那霉素抗性)、复制起点ColEI(使得大肠杆菌将质粒维持在高拷贝数)和营养复制的IncP起点(oriV)(使扭脱甲基杆菌将质粒维持在低拷贝数(扭脱甲基杆菌无法识别ColEI起点))。
[0214] 将连接产物转化为New England Biolab的10-β感受态大肠杆菌细胞,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0215] 将命名为pD00的经验证的质粒的转化到感受态扭脱甲基杆菌PA1(分类学ID:419610)变体中。在这些研究中测试的所有扭脱甲基杆菌PA1菌株均衍生自命名为Str01的菌株,此菌株扭脱甲基杆菌包含两个缺失,分别是celABC和crtCDF缺失,它们分别减少了液体培养物中细胞的絮凝和消除了螺菌黄质途径。在这项研究中使用的菌株命名为Str03,包含在整合到crtBI基因座(Mext_3011-Mext_3012)中的异源pR启动子上的天然crtEBI基因以及整合在hpt基因座的同样表达在的异源pR启动子上的产玉米素副球菌crtY的过表达。
另外,Str03缺失类胡萝卜素簇,并且不产生天然C30化合物。大多数转化的菌落在固体培养基上呈黄色,但是已标识出橙色突变体并进行了分离以进行研究。突变质粒命名为pD00*。
[0216] 将分离出的菌落挑入3-5mL预培养物中,在30℃振荡生长3天,然后将250-500μL转移到烧瓶中的25-50mL基本培养基中,在30℃振荡发酵2-3天(选择卡那霉素以维持质粒)。所有发酵中使用的基本培养基均改良自Choi等人,(1989)《韩国应用微生物学与生物技术杂志(Kor.J.Appl.Microbiol.Bioeng.)》17:392-396。除非另有说明,每天两次向培养物以
0.5%甲醇进料作为碳源。
[0217] 通过分光光度法测量在1cm路径长度上600nm处的吸光度以估计细胞密度,并通过离心收获0.1-10mL培养物。根据内部数据,使用0.3mg/(OD600*mL)的转换值由吸光度计算收获的总生物量。
[0218] 从细胞沉淀中提取类胡萝卜素并进行如下分析:将细胞沉淀重悬于甲醇中,与等体积的氯仿混合,然后超声处理以裂解。离心去除细胞碎片,并将所得的上清液完全干燥。通过超声处理将残余物重悬于二氯甲烷和乙酸乙酯(1:4的比例)中,通过离心再次去除碎片,并将所得的上清液完全干燥。超声处理后,将残余物重悬于1:1的甲醇氯仿混合物中,离心去除残留的碎片,并通过UPLC进行分析。
[0219] 将1-4μL的细胞提取物注入到Waters Acuity超高效液相色谱(UPLC)系统上。在保持在32℃的C18色谱柱上,分析物用超纯水(含0.1%甲酸)、甲醇(含0.1%甲酸)和乙腈进行梯度分离。通过可调UV(TUV)检测器(470nm波长)和质谱标识化合物。通过将UV信号与虾青素、玉米素、角黄素和β-胡萝卜素的标准曲线进行比较,可以定量得到的色谱峰。带有空对照载体的亲本菌株Str03产生痕量β-胡萝卜素,而带有pD00质粒的此菌株比对照载体产生玉米素,并且而带有pD00*的菌株比对照载体产生更多的β-胡萝卜素(图3(E-G))。
[0220] 实例2
[0221] 概述:将来自产玉米素副球菌、伤口埃希菌、菠萝泛菌、阔海褐黄海水菌、产虾青素鞘氨醇单胞菌、产玉米素线西棒菌和产玉米素中温黄杆菌中的crtYIB或crtIBZY基因簇与来自产玉米素副球菌的启动子区域克隆成具有来自产玉米素副球菌的crtE的质粒。将所述质粒转化到具有和不具有天然C30类胡萝卜素途径的扭脱甲基杆菌和大肠杆菌BL21中。发酵这些带有质粒的菌株产生β-胡萝卜素和玉米素。
[0222] 类胡萝卜素产生基因在产玉米素副球菌、伤口埃希菌、菠萝泛菌、阔海褐黄海水菌、产虾青素鞘氨醇单胞菌、产玉米素线西棒菌和产玉米素中温黄杆菌菌株中被标识出。经由聚合酶链反应(PCR)在几个部分中扩增crtYIB或crtIBZY基因簇(表1中的SEQ ID),并引入了在靶序列中天然存在的AarI识别位点的连接点。用相邻的非编码启动子区域(命名为HP2(SEQ ID NO:8))扩增来自产玉米素副球菌的crtE基因(SEQ ID NO:14)。如实例1,在连接点引入SNP以在不改变编码的氨基酸的情况下去除天然存在的AarI位点,并且设计延伸引物以通过AarI Gateway克隆法实现限制和连接。
[0223] 使用AarI Gateway组装法将每个簇与HP2-crtE片段组装到载体pA中,所述载体含有在产玉米素副球菌crtZYIBE簇上游的非编码启动子区域(命名为HP1(SEQ ID NO:7)),并与实例1中所述的质粒pD共享其它骨架特征。如在pD00中一样,片段以会聚操纵子结构排列(图10C示出了质粒pA01的图作为示实例示意图)。
[0224] 将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0225] 将经验证的质粒引入到扭脱甲基杆菌PA1(分类学ID:419610)变体中。变体Str02含有扭脱甲基杆菌类胡萝卜素簇,而不含有bch簇,而变体Str04缺失类胡萝卜素簇,并且不产生天然C30化合物。将质粒也转化到感受态大肠杆菌BL21中。
[0226] 将分离出的扭脱甲基杆菌转化菌落挑入24深孔板中的3mL基本培养皿中,盖上透气膜,并在30℃振荡生长三天。将分离出的大肠杆菌转化菌落挑入带盖试管中的3mL LB培养基中,并在37℃振荡生长过夜。
[0227] 如实例1中所述收获培养物,并通过适合靶C40化合物的简化方法按以下方式从细胞沉淀中提取出来:将细胞沉淀重悬于甲醇中,与等体积的乙酸乙酯混合,并超声处理以裂解。离心去除细胞碎片,必要时将所得的上清液在甲醇:乙酸乙酯(1:1)中稀释,并按实例1的方法通过UPLC进行分析。带有空对照载体的亲本菌株未产生可检测出的C40类胡萝卜素,而带有质粒的菌株则产生β-胡萝卜素或玉米素(表3)。
[0228] 实例3
[0229] 概述:将产玉米素副球菌crtZYIBE基因与来自产玉米素副球菌的操纵子的上游和下游的非编码区域克隆成整合质粒。在C30基因簇区域中使用无痕整合(scarless integration)方法将所述盒整合到扭脱甲基杆菌中。发酵这些菌株产生玉米素。
[0230] 用PCR在具有天然存在的AarI位点(SEQ ID NO:9)处的连接点的片段中扩增具有上游和下游非编码区域(HP1和HP2)的产玉米素副球菌crtZYIBE操纵子。MEXT 3434(SEQ ID NO:5)上游和MEXT 3441(SEQ ID NO:6)下游(侧接产生C30的基因簇区域)的500个碱基对的侧接区域被设计为靶向将操纵子插入扭脱甲基杆菌染色体。
[0231] 与实例1中一样,在不改变编码的氨基酸的情况下将SNP引入crtZ和crtB的连接点以去除天然存在的AarI位点,并且设计延伸引物以通过AarI Gateway克隆法实现限制和连接。
[0232] 通过Gateway组装法将操纵子片段与侧接区域组装,以在质粒pI(SEQ ID NO:1;图10A)中形成整合盒,所述质粒在大肠杆菌中复制,但在扭脱甲基杆菌中不复制,并且包含卡那霉素抗性盒(一种sacB反选择盒)以及在用于在大肠杆菌进行维持的复制起点ColEI。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0233] 通过电穿孔将所得质粒pI08引入扭脱甲基杆菌的几个菌株中,包含实例1中所述的Str01(加入了crtZYIBE盒,其命名为Str06)和Str03(加入了crtZYIBE盒,其被命名为Str05)。在卡那霉素选择性培养基上选择整合子并在蔗糖培养基平板上传代以去除标志物。选择黄色分离株,并通过PCR验证整合基因座。
[0234] 如实例1中所述,使经验证的整合菌株和亲本菌株在不使用抗生素的情况下生长并评估玉米素的产生。亲本菌株不产生玉米素,而整合菌株产生玉米素(图3(A-D))。
[0235] 实例4
[0236] 概述:将伤口埃希菌idi基因克隆到质粒上,并转化到玉米素产生菌株中。与对照质粒发酵相比,带有此质粒的发酵将玉米素的产量提高多达70%。
[0237] 使用AarI Gateway延伸引物经由PCR扩增伤口埃希菌的基因idi(SEQ ID NO:37)。通过Gateway组装法将所述基因组装到质粒pB中以生成pB09,所述质粒pB含有启动子区域HP2并与实例1中所述质粒pD共享其它骨架特征。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0238] 将经验证的idi质粒和空对照质粒转化入整合玉米素产生菌株Str06。如实例2所述,使转化子与卡那霉素一起生长并评估玉米素的产生。与对照质粒发酵相比,具有idi过量表达的发酵产生了更高的玉米黄质产量(表4)。
[0239] 实例5
[0240] 概述:将阔海褐黄海水菌crtWZ基因与先前在扭脱甲基杆菌中表征的组成型启动子克隆成质粒。将质粒转化到扭脱甲基杆菌中,并分析带有质粒的菌株的发酵物中类胡萝卜素的含量。带有此质粒的扭脱甲基杆菌产生~1200ppm的虾青素。
[0241] 如实例1所述,用Gateway延伸引物通过PCR扩增来自阔海褐黄海水菌的crtW和crtZ基因。将来自阔海褐黄海水菌的基因片段连接到质粒pD中以使用Gateway组装法生成pD10,所述质粒pD含有启动子/RBS对pR-faeRBS(SEQ ID NO:4)。载体骨架如实例1中所述,并含有卡那霉素抗性盒和用于在扭脱甲基杆菌复制的oriV。通过PCR验证插入并验证序列。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0242] 将经验证的质粒转化到来自实例3的菌株Str05中,在卡那霉素存在下生长分离的菌落,并按实施例2所述评估虾青素的产生。实例7中描述了用此带有质粒的菌株进行的发酵。
[0243] 实例6
[0244] 概述:将产虾青素鞘氨醇单胞菌crtW基因克隆到质粒中,并与pD10一起转化到产生玉米素的扭脱甲基杆菌中。发酵带有质粒的菌株产生虾青素。
[0245] 如实例1中所述将来自产虾青素鞘氨醇单胞菌的crtW(SEQ ID NO:20)用Gateway延伸引物经由PCR扩增。将所述基因用Gateway组装法连接在质粒pC中以生成pC11,所述质粒pC含有启动子pmxaF(SEQ ID NO:3)并与实例2中所述的质粒pA共享其它骨架特征。
[0246] 将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0247] 将经验证的pD10和pC11转化到Str06中,如实例3中所述。转化子与卡那霉素一起生长,并如实例2中那样评估类胡萝卜素的产生。带有这些质粒的发酵产生了虾青素和混合前体(表4)。
[0248] 实例7
[0249] 概述:如实例1所述,通过只以甲醇或以甲醇和乙醇一起进料,发酵玉米素和虾青素产生菌株。与只以甲醇进料相比,在以甲醇和乙醇一起进料的培养物中,玉米素和虾青素的产量发生了变化。
[0250] 将来自实例3的玉米素产生菌株Str05和Str06以及来自实例5的带有质粒的菌株在带有甲醇的固体基本培养基上敲击以分离单个菌落。
[0251] 将来自每个平板的三个单菌落挑入带有0.5%甲醇的3-5mL基本培养基中,并在30℃下生长3天。将含有0.5%甲醇或0.25%甲醇和0.1%乙醇的基本培养基的烧瓶接种1%的预培养物(每种预培养物用于接种一个甲醇烧瓶和一个甲醇/乙醇烧瓶)。
[0252] 对培养物取样,并在一天后以等同于起始量(0.4%甲醇或0.25%甲醇和0.1%乙醇)的另外的碳丸进料。三天和四天后再取样。通过600nm处的吸光度测量细胞密度。
[0253] 使用适合于高滴定度培养的简化方法从细胞提取物中收获类胡萝卜素:将1mL培养物沉淀并去除上清液。将沉淀重悬于乙醇中,然后用等体积的乙酸乙酯和超声处理裂解。通过离心去除细胞碎片。
[0254] 如实例2中所述从细胞沉淀中提取类胡萝卜素。图6和图7中分别示出了在甲醇和甲醇/乙醇上菌株Str05和Str06的玉米素产量。图8中示出了在甲醇和甲醇/乙醇上菌株Str05+质粒pD10的虾青素产量。
[0255] 将最终时间点的等分试样用乙酸乙酯稀释10倍,并以1nm的间隔从350-800nm波长测量吸光度。绘制代表性的吸收光谱(图4A),其示出了某些样品的相对类胡萝卜素水平和本领域已知的类胡萝卜素化学差异的峰(Rodriguez(2001)《食物中类胡萝卜素分析指南(A Guide to Carotenoid Analysis in Foods)》)。总类胡萝卜素是根据文献中报道的峰吸光度和消光系数估算的(Davies(1976)类胡萝卜素,见:T.W.Goodwin(版)《植物色素化学与生物化学(Chemistry and Biochemistry of Plant Pigments)》,Academic Press,伦敦,第38-165页)。结果如图5所示。
[0256] 实例8
[0257] 概述:生成产生虾青素、角黄素和番茄红素的菌株。将阔海褐黄海水菌crtW基因整合到扭脱甲基杆菌玉米素产生菌株中。将crtZ基因和crtZY基因从虾青素菌株中去除。在以下六个条件下发酵整合菌株:具有甲醇单独进料或甲醇和乙醇共进料的基本培养基;或用2%酒糟糖浆与甲醇单独进料、甲醇和乙醇共进料、甲醇单独进料或无补充碳制成的培养基。
[0258] 通过PCR扩增阔海褐黄海水菌crtW、pR-faeRBS片段和与MEXT_3010(SEQ ID NO:51)和MEXT_3011(SEQ ID NO:52)重叠的两个侧接区域。如实例1中,设计延伸引物以通过AarI Gateway克隆法实现限制和连接。
[0259] 将启动子和crtW通过Gateway组装法与侧接区域组装,以在质粒pI中形成整合盒。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。通过电穿孔将质粒引入Str06。在卡那霉素选择性培养基上选择整合子,并将其传到蔗糖培养基平板上以去除标志物。选择橘红色分离株,并通过PCR验证整合基因座。经验证的整合菌株命名为Str07。
[0260] 与MEXT 3434-HP1区域(SEQ ID NO:5和7)和crtY区域(SEQ ID NO:11)重叠的缺失片段被设计成从STR07中缺失crtZ基因。用PCR扩增片段。如实例1中,设计延伸引物以通过AarI Gateway克隆法实现限制和连接。通过Gateway组装法来组装缺失片段,以在质粒pI中形成缺失盒。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。通过电穿孔将质粒引入Str07。在卡那霉素选择性培养基上选择整合子,并将其传到蔗糖培养基平板上以去除标志物。通过PCR筛选分离株是否存在crtZ,并对基因座进行测序以确认缺失。经验证的缺失菌株命名为为Str09。
[0261] 用PCR扩增仅由带有上下游非编码区(HP1和HP2)的crtIBE基因组成的产玉米素副球菌crtZYIBE操纵子的截短部分,并组装到具有MEXT_3434(SEQ ID NO:5)上游和MEXT_3441(SEQ ID NO:6)下游的500个碱基对侧接区域的pI中,如实例1中所述。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。通过电穿孔将质粒引入Str07,以取代全长crtZYIBE_Pz途径。在卡那霉素选择性培养基上选择整合子,并将其传到蔗糖培养基平板上以去除标志物。选择粉色分离株,并通过PCR验证整合基因座。经验证的菌株命名为Str08。
[0262] 将整合的类胡萝卜素产生菌株Str08、Str09、Str06和Str07用甲醇在固体基本培养基上敲击以分离单个菌落。将来自每个平板的一个菌落挑入含0.5%甲醇的5mL基本培养基预培养物中,并在30℃下生长3天。用无菌水和矿物质溶液将浓缩酒糟糖浆制成最终培养基组合物(2%酒糟糖浆,并补充(NH4)2SO4、KH2PO4和Na2HPO4)。在酒糟培养基中不补充任何物质(酒糟)或补充0.25%甲醇(酒糟+甲醇)、0.1%甲醇和0.0625%乙醇(酒糟+共进料)或0.125%乙醇(酒糟+乙醇)。用0.5%甲醇作为唯一碳源或用0.125%甲醇和0.2%乙醇(共进料)制备基本培养基。四种预培养物中的每一种都用于接种每种培养基的一个烧瓶,并整体在30℃振荡生长3天。如实例2中所述,通过在发酵结束时在600nm处的吸光度来测量细胞密度,并评估类胡萝卜素的产生。如实施例7一样,对来自基本培养基甲醇进料的培养物的提取物的吸收光谱进行了测量。代表性的吸收光谱绘制在图4B中。
[0263] 表5和图9报告了由甲醇进料的样品的吸收光谱计算的总类胡萝卜素含量和由所有样品的UPLC迹线计算的单个类胡萝卜素含量。Str06产生玉米素;Str07主要产生虾青素,还产生一些角黄素和另一种分子(根据质谱数据预测是绿蝇黄质);Str08生产番茄红素,Str09生产角黄素。
[0264] 实例9
[0265] 概述:产虾青素鞘氨醇单胞菌、阔海褐黄海水菌、伤口埃希菌和产玉米素中温黄杆菌的crtZ基因克隆到具有来自产玉米素副球菌的crtY基因的质粒中。将质粒转化到实例8的番茄红素产生菌株中。发酵这些带有质粒的菌株产生虾青素。
[0266] 将来自产虾青素鞘氨醇单胞菌(SEQ ID NO:16)、阔海褐黄海水菌(SEQ ID NO:50)、伤口埃希菌(SEQ ID NO:32)和产玉米素中温黄杆菌(SEQ ID NO:27)的crtZ基因用如实例1所述的Gateway延伸引物经由PCR扩增。将产玉米素副球菌的crtY(SEQ ID NO:11)也用Gateway延伸引物和faeRBS(SEQ ID NO:4)扩增。使用Gateway组装法将每个crtZ与FaeRBS-crtY片段连接到质粒pA中。将连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。
[0267] 将经验证的质粒pA15-18转化到实例8的Str08中。将转化子与卡那霉素一起生长,并如实例1中那样评估类胡萝卜素的产生。带有这些质粒的发酵产生了虾青素和混合前体(表4)。
[0268] 实例10
[0269] 概述:来自实例8的具有非产生表型的虾青素产生菌株的后代被标识出在crtE基因中具有无效突变。在质粒上表达的大肠杆菌和菠萝泛菌crtE基因对非产生者的互补恢复了虾青素的产生。
[0270] 将虾青素产生菌株Str07在基本培养基中生长至高密度,并将其传代以使得在平板培养前能随机突变。选择灰白色菌落,并对类胡萝卜素基因进行测序。标识出在crtE基因具有移码突变的白色分离株,并将其命名为Str10。
[0271] 如实例1中所述,将来自伤口埃希菌和来自菠萝泛菌的crtE基因(分别为SEQ ID NO:36和SEQ ID NO:43)使用Gateway延伸引物经由PCR进行扩增,并使用Gateway组装法将其连接到质粒pB中。将伤口埃希菌基因的连接产物转化到感受态大肠杆菌细胞中,筛选单个菌落以正确组装,并通过小量制备法提取质粒DNA并测序。将经验证的质粒pB19转化到Str10中。将菠萝泛菌基因的连接产物直接转化到Str07中,并筛选含有pB20的菌落中的橙色菌落。
[0272] 转化子与卡那霉素一起生长,并如实例2中那样评估类胡萝卜素的产生。带有这些质粒的发酵产生了虾青素和混合前体(表4)。
[0273] 尽管为了清楚理解起见,通过图示和实例对上述发明进行了详细描述,但是对于本领域技术人员显而易见的是,在不脱离所附权利要求书中所描述的本发明的精神和范围的前提下可以进行某些改变和修改。因此,所述描述不应被解释为限制本发明的范围。
[0274] 本文引用的所有出版物、专利和专利申请均通过引用整体并入本文用于所有目的,其程度如同具体地和单独地指示每个单独的出版物、专利或专利申请通过引用如此并入。
[0275] 核苷酸和氨基酸序列
[0276] SEQ ID NO:1
[0277] pKB40-质粒序列(图10A)
[0278]
[0279] SEQ ID NO:2
[0280] pKB127-质粒序列(图10B)
[0281]
[0282]
[0283] SEQ ID NO:3
[0284] pmxaF-启动子
[0285] 来源:扭脱甲基杆菌PA1
[0286]
[0287] SEQ ID NO:4
[0288] Pr-faeRBS–来自MEXT_1384的启动子-核糖体结合位点
[0289]
[0290] SEQ ID NO:5
[0291] 侧翼1-MEXT_3434上游的500bp侧接区域
[0292] 来源:扭脱甲基杆菌PA1
[0293]
[0294] SEQ ID NO:6
[0295] 侧翼2-MEXT_3441下游的500bp侧接区域
[0296] 来源:扭脱甲基杆菌PA1
[0297]
[0298] SEQ ID NO:7
[0299] CrtZ、pPzZ、HP1
[0300] 来源:产玉米素副球菌
[0301]
[0302] SEQ ID NO:8
[0303] crtE、pPzE、HP2
[0304] 来源:产玉米素副球菌
[0305]
[0306] SEQ ID NO:9
[0307] crtZYIBE、PzC40簇
[0308] 来源:产玉米素副球菌
[0309]
[0310] SEQ ID NO:10
[0311] crtZ_Pz
[0312] 来源:产玉米素副球菌
[0313]
[0314] SEQ ID NO:11
[0315] crtY_Pz
[0316] 来源:产玉米素副球菌
[0317]
[0318] SEQ ID NO:12
[0319] crtI_Pz
[0320] 来源:产玉米素副球菌
[0321]
[0322] SEQ ID NO:13
[0323] CrtB_Pz
[0324] 来源:产玉米素副球菌
[0325]
[0326] SEQ ID NO:14
[0327] CrtE_Pz
[0328] 来源:产玉米素副球菌
[0329]
[0330] SEQ ID NO:15
[0331] crtZYIBW、Sa C40簇
[0332] 来源:产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298
[0333]
[0334] SEQ ID NO:16
[0335] crlZ_Sa
[0336] 来源:产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298
[0337]
[0338] SEQ ID NO:17
[0339] CrlY_Sa
[0340] 来源:产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298
[0341]
[0342] SEQ ID NO:18
[0343] crtI_Sa
[0344] 来源:产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298
[0345]
[0346] SEQ ID NO:19
[0347] crtB_Sa
[0348] 来源:产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298
[0349]
[0350] SEQ ID NO:20
[0351] crtW_Sa
[0352] 来源:产虾青素鞘氨醇单胞菌DSM 22298
[0353]
[0354] SEQ ID NO:21
[0355] crtZYIB、Sz簇
[0356] 来源:产玉米素线西棒菌CC-SAMT-1
[0357]
[0358]
[0359] SEQ ID NO:22
[0360] crtZ_Sz
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[0381] 来源:产玉米素中温黄杆菌DSM 18436
[0382]
[0383] SEQ ID NO:28
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[0385] 来源:产玉米素中温黄杆菌DSM 18436
[0386]
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[0389] 来源:产玉米素中温黄杆菌DSM 18436
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[0393] 来源:产玉米素中温黄杆菌DSM 18436
[0394]
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[0406] 来源:伤口埃希菌
[0407]
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[0447]
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[0451]
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[0455]
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[0457] crtY_Fp
[0458] 来源:阔海褐黄海水菌
[0459]
[0460] SEQ ID NO:47
[0461] crtI_Fp
[0462] 来源:阔海褐黄海水菌
[0463]
[0464] SEQ ID NO:48
[0465] crtB_Fp
[0466] 来源:阔海褐黄海水菌
[0467]
[0468] SEQ ID NO:49
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[0470] 来源:阔海褐黄海水菌
[0471]
[0472] SEQ ID NO:50
[0473] crtZ_Fp
[0474] 来源:阔海褐黄海水菌
[0475]
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[0477] 侧翼3、MEXT_3010
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[0481] 侧翼3、MEXT_3011
[0482] 来源:扭脱甲基杆菌PA1
[0483]
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