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包含用于使赭曲毒素去毒的酰胺酶的食品添加剂

阅读:769发布:2020-06-23

专利汇可以提供包含用于使赭曲毒素去毒的酰胺酶的食品添加剂专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及酰胺酶和包含能够降解赭曲毒素的酰胺酶的 饲料 或 食品添加剂 。,下面是包含用于使赭曲毒素去毒的酰胺酶的食品添加剂专利的具体信息内容。

1.一种分离的酰胺酶,其能够降解赭曲毒素。
2.根据权利要求1所述的酰胺酶,其中所述赭曲毒素是赭曲毒素A。
3.根据权利要求1或权利要求2所述的酰胺酶,其中所述酰胺酶包含如下基酸序列基序中的至少一个,优选至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个,更优选九个:
1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG;
2)G-x-T;
3)G-x-x-x-G-P;
4)G-H-x-D;
5)D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K;
6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P;
7)V-x-A-H-x-x-G-x-x-G;
8)H-x-x-x-x-D;
9)G-V-x-I-x-x-G-T-D。
4.根据权利要求中1至4中任一项所述的酰胺酶,其中所述酰胺酶具有Tim桶结构,所述桶结构包括包含6个组氨酸残基、1个赖氨酸残基和1个天冬氨酸残基的活性位点,其中当将所述酰胺酶和SEQ ID NO∶1的三级结构相比较时所述活性位点中的所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO∶1的位置H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307和D378。
5.根据任一前述权利要求所述的酰胺酶,其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少
50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少
99%纯的。
6.根据任一前述权利要求所述的酰胺酶,其中所述酰胺酶是在pH3-9和21-40℃下温育时可降解赭曲毒素的酰胺酶。
7.根据任一前述权利要求所述的酰胺酶,其中所述酰胺酶包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中任一者的序列,或具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中的任一者具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽。
8.根据任一前述权利要求所述的酰胺酶,其中所述酰胺酶包含:具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列或具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少70%、75%、80%、90%、
95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽;或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含与SEQ ID NO:2具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID NO:2不同的多核苷酸表达所产生的多肽;或由与SEQ ID NO:2相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸,或在严格条件下杂交至SEQ ID NO:2的互补序列或杂交至与所述互补序列具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的序列表达所产生的多肽。
9.根据任一前述权利要求所述的酰胺酶,其中在pH7.0和40℃下所述酰胺酶每毫克蛋白质每分钟解约至少100、至少200、至少300、至少400至约900纳摩尔赭曲毒素A。
10.一种饲料食品添加剂,其包含能够降解赭曲毒素的酰胺酶。
11.根据权利要求10所述的饲料或食品添加剂,其中所述赭曲毒素是赭曲毒素A。
12.根据权利要求10或权利要求11所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶是分离的。
13.根据权利要求10至12中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中至少一个,优选至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个,更优选九个:
1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG;
2)G-x-T;
3)G-x-x-x-G-P;
4)G-H-x-D;
5)D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K;
6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P;
7)V-x-A-H-x-x-G-x-x-G;
8)H-x-x-x-x-D;
9)G-V-x-I-x-x-G-T-D。
14.根据权利要求10至13中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶具有Tim桶结构,所述桶结构包括包含6个组氨酸残基、1个赖氨酸残基和1个天冬氨酸残基的活性位点,其中当将所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三级结构相比较时所述活性位点中的所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1的位置H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307和D378。
15.根据权利要求10至14中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少97%或至少99%纯的。
16.根据权利要求10至15中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶是在pH3-9和21-40℃下温育时可降解赭曲毒素的酰胺酶。
17.根据权利要求10至16中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶包含具有SEQ ID NO∶1、SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶5-11、13、14或15中任一者的序列,或具有与SEQ ID NO∶1、SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶5-11、13、14或15中的任一者具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO∶1、SEQ ID NO∶3或SEQ ID NO∶5-11、13、14或15相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽。
18.根据权利要求10至17中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶包含:
具有SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶3的序列或具有与SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶3具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO∶1或SEQ ID NO∶3相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽;或由包含SEQ ID NO∶2的序列或包含与SEQ ID NO∶2具有至少70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID NO∶2不同的多核苷酸表达所产生的多肽;或由与SEQ ID NO∶2相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸,或在严格条件下杂交至SEQ ID NO∶2的互补序列或杂交至与所述互补序列具有至少
70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的序列表达所产生的多肽。
19.根据权利要求10至18中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中在pH7.0和40℃下所述酰胺酶每毫克蛋白质每分钟水解约至少100、至少200、至少300、至少400至约900纳摩尔赭曲毒素A。
20.根据权利要求10至19中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述酰胺酶是重组的。
21.根据权利要求10至20中任一项所述的饲料或食品添加剂,其包含能够表达所述酰胺酶的重组细胞或孢子。
22.根据权利要求21所述的饲料或食品添加剂,其中所述细胞选自:大肠杆菌、链霉菌属、汉逊酵母属、木霉属(特别是里氏木霉)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、曲霉属(特别是黑曲霉)、植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
23.根据权利要求10至22中任一项所述的饲料或食品添加剂,其还包含至少一种生理上可接受的载体。
24.根据权利要求23所述的饲料或食品添加剂,其中所述生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种:麦芽糖糊精、石灰石()、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖淀粉、Na2SO4、滑石粉和PVA以及它们的混合物。
25.根据权利要求10至24中任一项所述的饲料或食品添加剂,其中所述饲料包含一种或多种另外的酶。
26.根据权利要求25所述的饲料或食品添加剂,其中所述一种或多种另外的饲料用酶选自:涉及蛋白质降解的酶,包括羧肽酶,优选羧肽酶A、羧肽酶Y,黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd,弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶或胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶,和细菌蛋白酶,包括枯草杆菌蛋白酶及其变体,涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶,涉及糖原代谢的蛋白质或酶,淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、过化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶,-葡糖苷酶,包括β-葡糖苷酶,葡糖酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:O2-氧化还原酶,EC 1.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它们的组合。
27.一种饲料或食品材料,其包含根据权利要求10至26中任一项所述的饲料添加剂。
28.一种饲料或食品,其包含根据权利要求27所述的食品或饲料材料。
29.根据权利要求28所述的饲料,其包含一种或多种选自如下的饲料材料:a)谷类,例如小粒谷物(如小麦、大麦、裸麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物如玉蜀黍或高粱
b)来自谷类的副产物,例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳,棕榈仁和柑橘渣;c)青贮饲料;d)得自如下来源的蛋白质:例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻;e)从植物和动物来源获得的油和脂肪;f)矿物质和维生素。
30.根据权利要求28所述的食品,其中所述食品包含谷类,例如玉米、小麦、大麦、高粱、谷类产品,例如粥、面、面包或蛋糕、咖啡、可可、酒、啤酒、干豆、调味料、干果、葡萄汁、奶、奶制品如奶酪、肉或肉制品。
31.根据权利要求28至30中任一项所述的饲料或食品,其以约0.001mg/kg至约10g/kg饲料/食品的水平包含所述酰胺酶。
32.根据权利要求28至31中任一项所述的饲料,其用于单胃动物,优选选自禽、猪、家养宠物、鱼、贝类和甲壳类的单胃动物消费。
33.一种制备根据权利要求28至32中任一项所述的食品或饲料的方法,其包括向食品或饲料材料添加根据权利要求10至27中任一项所述的食品或饲料添加剂。
34.一种制备根据权利要求10至27中任一项所述的食品或饲料添加剂的方法,其包括将所述酰胺酶与至少一种生理上可接受的载体混合。
35.根据权利要求34所述的方法,其中所述至少一种生理上可接受的载体选自如下物质中的至少一种:麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它们的混合物。
36.根据权利要求34或权利要求35所述的方法,其包括均化所述食品或饲料添加剂的额外步骤。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法,其包括将所述食品或饲料添加剂制粒的额外步骤。
38.一种组合物,其包含赭曲毒素污染的材料和赭曲毒素降解酰胺酶。
39.根据权利要求38所述的组合物,其中所述酶为赭曲毒素A降解酰胺酶。
40.根据权利要求38或权利要求39所述的组合物,其中所述材料污染有赭曲毒素A和/或赭曲毒素B。
41.根据权利要求38至40中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶是分离的。
42.根据权利要求38至41中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一个,优选至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个,更优选九个:
1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG;
2)G-x-T;
3)G-x-x-x-G-P;
4)G-H-x-D;
5)D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K;
6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P;
7)V-x-A-H-x-x-G-x-x-G;
8)H-x-x-x-x-D;
9)G-V-x-I-x-x-G-T-D。
43.根据权利要求38至42中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶具有Tim桶结构,所述桶结构包括包含6个组氨酸残基、1个赖氨酸残基和1个天冬氨酸残基的活性位点,其中当将所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三级结构相比较时所述活性位点中的所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1的位置H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307和D378。
44.根据权利要求38至43中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶是至少30%、至少
40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少
97%或至少99%纯的。
45.根据权利要求38至44中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中任一者的序列,或具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中的任一者具有至少70%、75%、80%、90%、95%、
98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、
13、14或15相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽。
46.根据权利要求38至45中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶包含:具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列或具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少10%、20%、
30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽;或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含与SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、
95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID NO:2不同的多核苷酸表达所产生的多肽;或由与SEQ ID NO:2相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸表达所产生的多肽;或由在严格条件下杂交至SEQ ID NO:2的互补序列或杂交至与所述互补序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、
98%、99%同一性的序列的多核苷酸表达所产生的多肽。
47.根据权利要求38至46中任一项所述的组合物,其中在pH7.0和40℃下温育时所述酰胺酶每毫克蛋白质每分钟水解约至少100、至少200、至少300、至少400至约900纳摩尔赭曲毒素A。
48.根据权利要求38至47中任一项所述的组合物,其中所述酰胺酶是重组的。
49.根据权利要求38至48中任一项所述的组合物,其包含能够表达所述酰胺酶的重组细胞。
50.根据权利要求49所述的组合物,其中所述细胞选自大肠杆菌、链霉菌属、汉逊酵母属、木霉属(特别是氏木霉)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、曲霉属(特别是黑曲霉)、植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
51.根据权利要求38至50中任一项所述的组合物,其包含一种或多种另外的酶。
52.根据权利要求51所述的组合物,其中所述一种或多种另外的酶是选自如下的饲料或食品酶:涉及蛋白质降解的酶,包括羧肽酶,优选羧肽酶A、羧肽酶Y,黑曲霉天冬氨酸蛋白酶,优选PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd,弹性蛋白酶,氨基肽酶,胃蛋白酶或胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶,和细菌蛋白酶,包括枯草杆菌蛋白酶及其变体,以及涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶,-葡糖苷酶,包括β-葡糖苷酶,葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:O2-氧化还原酶,EC1.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它们的组合。
53.根据权利要求51或52所述的组合物,其还包含选自霉菌毒素降解酶例如黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酯酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶中的至少一者、霉菌毒素降解生物例如枯草芽孢杆菌或吸收剂(即霉菌毒素结合剂),包括至少一种聚合物,例如微生物细胞壁或诸如膨润土之类的无机物质。
54.根据权利要求38至53中任一项所述的组合物,其中所述组合物是饲料组合物、发酵液或废水
55.根据权利要求38至54中任一项所述的组合物,其以约0.001mg/kg至约10g/kg的水平包含所述酰胺酶。
56.一种减少材料的赭曲毒素污染的方法,其包括向所述材料添加赭曲毒素降解酰胺酶。
57.根据权利要求56所述的方法,其中所述酶是赭曲毒素A降解酶。
58.根据权利要求56或权利要求57所述的方法,其中所述材料污染有赭曲毒素A和/或赭曲毒素B。
59.根据权利要求56至58中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶是分离的。
60.根据权利要求56至59中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一个,优选至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个,更优选九个:
1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG;
2)G-x-T;
3)G-x-x-x-G-P;
4)G-H-x-D;
5)D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K;
6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P;
7)V-x-A-H-x-x-G-x-x-G;
8H-x-x-x-x-D;
9)G-V-x-I-x-x-G-T-D。
61.根据权利要求56至60中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶具有Tim桶结构,所述桶结构包括包含6个组氨酸残基、1个赖氨酸残基和1个天冬氨酸残基的活性位点,其中当将所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三级结构相比较时所述活性位点中的所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1的位置H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307和D378。
62.根据权利要求56至61中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶是至少30%、至少
40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少
97%或至少99%纯的。
63.根据权利要求56至62中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中任一者的序列,或具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中的任一者具有至少70%、75%、80%、90%、95%、
98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、
13、14或15相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽。
64.根据权利要求56至63中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶包含:具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列或具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少10%、20%、30%、
40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽序列;或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含与SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、
90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID NO:2不同的多核苷酸表达所产生的多肽;或由与SEQ ID NO:2相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸表达所产生的多肽;或由在严格条件下杂交至SEQ ID NO:2的互补序列或杂交至与所述互补序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、
95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸表达所产生的多肽。
65.根据权利要求56至64中任一项所述的方法,其中在pH7.0和40℃下温育时所述酰胺酶每毫克蛋白质每分钟水解约至少100、至少200、至少300、至少400至约900纳摩尔赭曲毒素A。
66.根据权利要求56至65中任一项所述的方法,其中所述酰胺酶是重组的。
67.根据权利要求56至66中任一项所述的方法,其包含能够表达所述酰胺酶的重组细胞。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述细胞选自大肠杆菌、链霉菌属、汉逊酵母属、木霉属(特别是氏木霉)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、曲霉属(特别是黑曲霉)、植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
69.根据权利要求56至68中任一项所述的方法,还包括添加一种或多种另外的酶。
70.根据权利要求69所述的方法,其中所述一种或多种另外的酶是选自:涉及蛋白质降解的酶,包括羧肽酶,优选羧肽酶、羧肽酶Y,黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd,弹性蛋白酶,氨基肽酶,胃蛋白酶或胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶,和细菌蛋白酶,包括枯草杆菌蛋白酶及其变体,以及涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的酶、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、乙酰酯酶、氨基肽酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、-半乳糖苷酶、葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶,-葡糖苷酶,包括β-葡糖苷酶,葡糖醛酸酶、半纤维素酶、己糖氧化酶、水解酶、转化酶、异构酶、脂解酶、漆酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酸裂解、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:O2-氧化还原酶,EC1.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它们的组合。
71.根据权利要求69或70所述的方法,其还包含选自霉菌毒素降解酶例如黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶中的至少一者、霉菌毒素降解微生物例如枯草芽孢杆菌或吸收剂(即霉菌毒素结合剂),包括至少一种聚合物,例如微生物细胞壁或诸如膨润土之类的无机物质。
72.根据权利要求56至71中任一项所述的方法,其中所述组合物是饲料组合物、发酵液或废水。
73.根据权利要求56至72中任一项所述的方法,其以约0.001mg/kg至约10g/kg的水平包含所述酰胺酶。
74.一种饲料材料,其可通过根据权利要求56至73中任一项所述的方法获得。
75.一种增加动物的生长速率和/或健康的方法,其包括给所述动物饲喂有效量的根据权利要求28至32中任一项所述的饲料。
76.一种重组细胞或孢子,其编码可降解赭曲毒素的酰胺酶。
77.根据权利要求76所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶可降解赭曲毒素A。
78.根据权利要求76或权利要求77所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶是重组的。
79.根据权利要求76至78中任一项所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶是分离的。
80.根据权利要求76至79中任一项所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶包含如下氨基酸序列基序中的至少一个,优选至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个,更优选九个:
1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG;
2)G-x-T;
3)G-x-x-x-G-P;
4)G-H-x-D;
5)D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K;
6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P;
7)V-x-A-H-x-x-G-x-x-G;
8)H-x-x-x-x-D;
9)G-V-x-I-x-x-G-T-D。
81.根据权利要求76至80中任一项所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶具有Tim桶结构,所述桶结构包括包含6个组氨酸残基、1个赖氨酸残基和1个天冬氨酸残基的活性位点,其中当将所述酰胺酶和SEQ ID NO:1的三级结构相比较时所述活性位点中的所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1的位置H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307和D378。
82.根据权利要求76至81中任一项所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶是至少30%、至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少97%或至少99%纯的。
83.根据权利要求76至82中任一项所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶包含具有SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中任一者的序列,或具有与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15中的任一者具有至少70%、75%、80%、
90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:5-11、13、14或15相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽。
84.根据权利要求76至83中任一项所述的细胞或孢子,其中所述酰胺酶包含:具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列或具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少10%、
20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽序列,或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽序列;或由包含SEQ ID NO:2的序列或包含与SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或由于遗传密码子的简并性而与SEQ ID NO:2不同的多核苷酸表达所产生的多肽;或由与SEQ ID NO:2相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸表达所产生的多肽;或由在严格条件下杂交至SEQ ID NO:2的互补序列或杂交至与所述互补序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、
90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸表达所产生的多肽。
85.根据权利要求76至84中任一项所述的细胞或孢子,其中所述细胞选自大肠杆菌、链霉菌属、汉逊酵母属、木霉属(特别是氏木霉)、芽孢杆菌属、乳杆菌属、曲霉属(特别是黑曲霉)、植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
86.根据权利要求3所述的酶、根据权利要求13所述的饲料或食品添加剂、根据权利要求42所述的组合物、根据权利要求60所述的方法或根据权利要求80所述的细胞或孢子,其中所述基序包含:
1 2 3 4 5 6 7
1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-x-G;
8
2)G-x-T;
9 10 11
3)G-x-x -x -G-P;
12
4)G-H-x -D;
13 14 15 16 17- 18 19 20 21 22 23 24 25 26
5)D-G-x -x -x -C-x -x x -x -R-x -x -x -R-x -x -A-x -x -I-K;
27 28 29 30
6)G-G-V-x -S-x -x -D-x -P;
31 32 33 34 35
7)V-x -A-H-x -x -G-x -x -G;
36 37 38 39
8)H-x -x -x -x -D;
40 41 42
9)G-V-x -I-x -x -G-T-D;
其中:
1 2 3 4 5 6 7 8
x=l/m;x=l/m;x=w/i;x=c/v/s/a;x=任何氨基酸;x=f/y/l;x=任何氨基酸;x=y/
9 10 11 12 13 14 15
f;x=t/a/s/v/r;x =i/f/a;x =-任何氨基酸;x =g/s;x =v/e;x =任何氨基酸;x =e/
16 17 18 19 20 21
d/g;x =任何氨基酸;x =任何氨基酸;x =a/g/t;x =v/a;x =任何氨基酸;x =q/m/a;
22 23 24 25 26 27 28
x =l/i/v;x =r/h/c;x =g/n;x =k/r/t/e/d;x =任何氨基酸;x =l/m/v/g;x =任何氨基
29 30 31 32 33 34 35
酸;x =任何氨基酸;x =任何氨基酸;x =a/s/h;x =c/v/a;x =h/q;x =k/r;x =任何氨
36 37 38 39 40 41 42
基酸;x =g/v/a;x =s/t/i;x =y/f/e;x =l/a/i;x =任何氨基酸;x =a/v;x =-l/a。
87.根据权利要求86所述的酶、饲料或食品添加剂、组合物、方法或者细胞或孢子,其中所述基序包含:
1)l/m-P-G-l/m-w-D-c-H-x-H-f-x-G;
2)G-y/f-T;
3)G-t-i-x-G-P;
4)G-H-g-D;
5)D-G-v-x-e-C-x-x-a-v-R-x-q-l-R-r-g-A-k-x-I-K;
6)G-G-V-l/-S-x-x-D-x-P;
7)V-a-A-H-c-h-G-k-x-G;
8)H-g-s-y-l-D;
9)G-V-x-I-a-l-G-T-D。
88.一种饲料或食品添加剂,其包含基本上如本文所述的酰胺酶。
89.一种饲料或食品,其包含基本上如本文所述的饲料添加剂。
90.一种制备饲料或食品的方法,所述饲料或食品基本上如本文所述。

说明书全文

包含用于使赭曲毒素去毒的酰胺酶的食品添加剂

技术领域

[0001] 本发明涉及使霉菌毒素去毒的方法。更具体地讲,本发明涉及酰胺酶和包含至少一种用于使赭曲毒素(尤其是赭曲毒素A)去毒的酰胺酶的饲料和/或食品添加剂。

背景技术

[0002] 霉菌毒素是基本上属于曲霉属(Aspergillus)、青霉素(Penicillium)和镰刀菌属(Fusarium)的真菌的有毒次级代产物。它们可在广泛的农业商品上以及在世界范围的各种农艺、生态和采收后条件下产生。
[0003] 霉菌毒素可在田地中、饲料或食品材料的存储期间,或在食品链的后面的时间点进入食品链中。它们在食品和饲料中积聚是对人和动物健康的一个巨大威胁,因为消费霉菌毒素污染的饮食可能会导致致畸效果、致癌效果和雌激素效果或免疫抑制效果。
[0004] 在1985年,世界卫生组织估计大约25%的世界粮食被霉菌毒素污染(Jelinek等人1989)。由于粮食和谷物全球输入和输出的增加以及不断变化的环境和气候特点,该数字自此以后有可能已经增长。
[0005] 目前有超过400种霉菌毒素有文献记载,但最令人关注的以及因此研究最多的霉菌毒素包括:黄曲霉毒素、脱瓜萎镰菌醇、玉米赤霉烯、伏毒素和赭曲毒素。
[0006] 尽管存在许多产毒素霉菌物种,但仅少数霉菌毒素被视为对人而言是值得注意的。
[0007] 三个真菌属(曲霉属、青霉属和镰刀菌属)最常涉及霉菌毒素污染的情形。真菌的定植、生长和霉菌毒素产生通常受多种因素影响。最重要的因素是温度活度。
[0008] 一般来讲,在温暖区域黄曲霉素是主要的关注点。这是因为产生这些毒素的曲霉属物种可找到热带区域存在的最适条件。相比之下,镰刀菌属和青霉属物种具有较低的最适温度,因此适应于更温和的气候。赭曲毒素、伏马毒素和玉米赤霉烯酮因此在提供这些条件的区域产生。
[0009] 赭曲毒素是一组由曲霉菌属或青霉属的数种真菌作为次级代谢物产生的霉菌毒素,是由香豆素衍生物组成的弱有机酸。有三种公认的赭曲毒素,定为A、B和C。赭曲毒素A是赭曲毒素家族中最丰富的成员,因而最常被检查到,但也是最有毒性的。赭曲毒素A(赭曲毒素A)是谷物和其他富含淀粉的食品中存在的肾毒性的、致畸的和致癌的霉菌毒素。除了谷物和谷物产品外,赭曲毒素A也存在于广泛的其他食品中,包括咖啡、可可、酒、啤酒、干豆、调味料、干果、葡萄汁、猪肾和暴露于受该霉菌毒素污染的饲料的非反刍动物的其他肉和肉产品。许多国家已对食品中的赭曲毒素A水平设定了极限,取决于食品的类型和质量,通常在1至10ppb(份/十亿份)之间。
[0010]
[0011] 赭曲毒素A的分子结构
[0012] 赭曲毒素A产生是由于作物在生长期间在田地中、在采收时、在储存时和在运输时,在有利的环境条件下,特别是在作物未被适当干燥时,发生真菌感染。
[0013] 赭曲毒素A是一种稳定的化合物,其可通过在6M盐酸中回流加热48小时(Van der Merwe等人,1965)或用羧肽酶A(Pitout,1969)水解成赭曲毒素α(OTα)和L-苯基丙酸。OTA转化成赭曲毒素α被视为降低其毒性的途径,因为一般报道称OTα毒性远低于OTA。此外,赭曲毒素α在体内的清除半衰期(9.6小时)短于OTA的清除半衰期(103小时)(Li等人,1997)。
[0014]
[0015] 为了确保食品安全,在食品生产链的若干阶段发展了不同的方法来防止霉菌毒素的摄入。
[0016] 在二十世纪七十年代就已知道,称为羧肽酶A的哺乳动物消化酶能够降解OTA,但该酶的效率低下。事实上在具有羧肽酶A的动物如猪中,由于饲料中存在OTA而导致的OTA毒性是一个问题。此外,已经发现的是OTA可在一定程度上抑制羧肽酶A活性。
[0017] 在本发明之前,还未公开降解包括赭曲毒素A(OTA)在内的赭曲毒素的有效的酶解决方案。已报道了关于OTA降解的除了羧肽酶之外的酶活性,但直至现在还未有人能够鉴别显示OTA降解活性的蛋白质
[0018] 众所周知,称为“AmanoTM脂酶”(日本的AmanoTM公司)的商业脂酶产品具有赭曲毒素降解活性,该脂酶产品是从黑曲霉(A.niger)制备的粗脂酶。
[0019] 该脂酶产品中的OTA降解活性此前被归因于脂酶或蛋白酶活性。例如,Maria A.Stander(J.Agric.Food Chem.(《农业和食品化学杂志》)2000,48,5736-5739)推断说,TMAmano 脂酶的OTA降解活性由脂酶产生。
[0020] Abrunhosa等人(Biotechnology Lett.(《生物技术快讯》),2007,29,1909-1914)描述了具有OTA降解活性的分离自黑曲霉的酶制剂。然而,该酶制剂未纯化至其中活性组分的序列可以在氨基酸或DNA水平上确定的程度。在其他情形中也已报道了类似的问题(Abrunhosa等人,TOXINS(《毒素》),[2010],2,1078-1099)

发明内容

[0021] 本发明是基于发明人所进行的鉴别和分离能够有效降解赭曲毒素,更具体地讲是赭曲毒素A(OTA)的酶的工作。
[0022] 本发明人已发现,与对它们初始的假设相反,来自黑曲霉和构巢曲霉TM
(A.nidulans)的甲酰胺酶以及存在于Amano 脂酶产品中的甲酰胺酶对OTA没有活性,但正如所预期的,确实具有对甲酰胺的活性。
[0023] 本发明人意外地发现,由黑曲霉开放阅读框编码的480个氨基酸的假定蛋白(本文称为酰胺酶2)具有赭曲毒素降解活性,尤其是赭曲毒素A降解活性。
[0024] 此外,本发明人还已意外地发现,包含N末端序列或信号序列且分子量为约51kDa的全长480个氨基酸的酰胺酶2(称为酰胺酶2sig)以及分泌的分子量为约47kDa的438个氨基酸的成熟酰胺酶2(称为酰胺酶2mat)具有赭曲毒素A降解活性。
[0025] 已经发现的是,在酰胺酶2mat中,N末端的42氨基酸被切除,亦即当酰胺酶2被分泌进培养基中时,其N末端的42个氨基酸被黑曲霉肽酶切除而形成成熟的酰胺酶2(即酰胺酶2mat)。
[0026] 本发明人已经分离并克隆了编码负责降解赭曲毒素A的酰胺酶的黑曲霉基因并已鉴别了其晶体结构。他们已鉴定,该基因可编码具有SEQ IDNO:1的序列的多肽(酰胺酶2sig)。他们还已鉴定,该酶通过切除N末端的42氨基酸序列进行翻译后修饰,从而产生SEQ ID NO:3所示的成熟酰胺酶2。
[0027] 根据本发明的第一个方面,提供了能够降解赭曲毒素(更具体地讲是赭曲毒素A)的酰胺酶。
[0028] 根据本发明的第二个方面,提供了包含能够降解赭曲毒素(更具体的讲是赭曲毒素A)的酰胺酶的食品或饲料添加剂。
[0029] 根据本发明的第三个方面,提供了包含本发明的饲料添加剂的食品或饲料材料。
[0030] 根据本发明的第四个方面,提供了包含本发明的饲料材料的食品或饲料。
[0031] 根据本发明第五个方面,提供了制备食品或饲料添加剂的方法,所述方法包括将能够降解赭曲毒素的酰胺酶与至少一种生理上可接受的载体相混合。
[0032] 根据本发明的第六个方面,提供了减少材料中的赭曲毒素污染的方法,所述方法包括将能够降解赭曲毒素的酰胺酶添加至所述材料。
[0033] 根据本发明的第七个方面,提供了包含赭曲毒素污染的材料和能够降解赭曲毒素的酰胺酶的组合物。
[0034] 根据本发明的第八个方面,提供了制备食品或饲料的方法,所述方法包括将根据本发明的食品或饲料添加剂添加至食品或饲料材料。
[0035] 根据本发明的第九个方面,提供提高动物的生长速率和/或健康的方法,所述方法包括给所述动物饲喂有效量的根据本发明的饲料。
[0036] 根据本发明的第十个方面,提供了可降解赭曲毒素的酰胺酶在制备食品或饲料中的用途。
[0037] 根据本发明的第十一个方面,提供了可通过本发明的方法获得的食品或饲料。
[0038] 根据本发明的第十二个方面,提供了包含能够降解赭曲毒素的酰胺酶的重组细胞。
[0039] 在本发明的第十三个方面,提供了酰胺酶,其包含与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3具有至少30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的多肽序列或与SEQ ID NO:1或SEQ IDNO:3相差一个或多个氨基酸氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽;或由与SEQ ID NO:2具有至少30%、35%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的多核苷酸,或与SEQ ID NO:2相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸编码的多肽;并且其中所述多肽不是SEQ ID NO:1。
[0040] 根据本发明的第十四个方面,提供了包含能够降解赭曲毒素A的肽酶PEPAd(SEQ ID NO:12)的食品或饲料添加剂。
[0041] 根据本发明的第十五个方面,提供了包含第十三个方面的饲料添加剂的食品或饲料材料。
[0042] 根据本发明的第十六个方面,提供了包含第十四个方面的饲料材料的食品或饲料。

具体实施方式

[0043] 在下面的描述中,应当理解任何所描述的优选特征均适用于本发明的任何方面,除非另外明确地说明。还应当理解,任何优选的特征均设想在适当时联合使用。
[0044] 还应当理解,在优选的实施方案中术语“赭曲毒素或能够降解赭曲毒素的酰胺酶”是指赭曲毒素A或能够降解赭曲毒素A的酰胺酶。
[0045] 如本文所用,术语“酰胺酶(酰胺水解酶)”是指可水解酰胺的酰胺水解酶超家族的酶。
[0046] 本发明人已从黑曲霉分离和克隆了负责赭曲毒素降解的酰胺酶2。该酶对降解赭曲毒素A特别有效。他们已表明,该酶由编码假定的480个氨基酸的黑曲霉蛋白的开放阅读框(An14g02080,Acc No.XP_001400834)表达,其与未在生物化学方面表征,特别是未关于它们的底物特异性表征的某些细菌酰胺酶具有约40%同一性。
[0047] 数据库搜索表明,该推定的酰胺水解酶(酰胺酶2)与某些二肽酶如从Sargasso Sea分离的环境DNA序列编码的羧肽酶Sgx9355e(Biochemistry(《生物化学》)48(2009):4567-4576)具有36%的氨基酸序列同一性。Sgx9355e的三维结构是已知的,并且其为酰胺水解酶超族(AHS)的成员。酰胺酶2与Sgx9355e的序列比对表明,酰胺酶2为AHS的成员。
[0048] 这是一组具有显著的底物多样性、具有(β/α)8-桶(barrel)(Tim桶)结构折叠的酶。该超家族中的大多数酶可催化C-O、C-N或P-O键的水解。该超家族的成员还未被与水解OTA相联系。
[0049] 应当理解,术语“酰胺酶(即酰胺水解酶)”和“可降解赭曲毒素的酰胺酶”在本文可互换使用,除非另外具体说明或者从上下文显而易见是在讨论不同的酶。
[0050] 术语“酰胺酶”和“可降解赭曲毒素A的酰胺酶”是指可将样品中存在的赭曲毒素A的至少5%、10%、15%、20%、25%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、99%或100%分解成赭曲毒素α。
[0051] 对技术人员将显而易见的是,任何可降解赭曲毒素的酰胺酶将适用于本发明。优选地,用于本发明的任何方面的酰胺酶是可降解至少赭曲毒素A的酰胺酶。
[0052] 优选地,根据本发明的酰胺酶包含至少一个,优选至少两个、至少三个、至少四个、至少五个、至少六个、至少七个、至少八个,更优选九个如下氨基酸序列基序:
[0053] 1)x-P-G-x-x-D-x-H-x-H-x-xG,其中两个His残基是在活性位点;
[0054] 2)G-x-T;
[0055] 3)G-x-x-x-G-P;
[0056] 4)G-H-x-D,其中His残基是在活性位点;
[0057] 5)D-G-x-x-x-C-x-x-x-x-R-x-x-x-R-x-x-A-x-x-I-K,其中Lys残基是在活性位点;
[0058] 6)G-G-V-x-S-x-x-D-x-P,其中Val残基是在活性位点;
[0059] 7)V-x-A-H-x-x-G-x-x-G,其中两个His残基是在活性位点;
[0060] 8)H-x-x-x-x-D,其中His残基是在活性位点;
[0061] 9)G-V-x-I-x-x-G-T-D,其中Asp残基是在活性位点。
[0062] 优选地,所述基序是:
[0063] 1)x1-P-G-x2-x3-D-x4-H-x5-H-x6-x7-G,其中两个His残基是在活性位点;
[0064] 2)G-x8-T;
[0065] 3)G-x9-x10-x11-G-P;
[0066] 4)G-H-x12-D,其中His残基是在活性位点;
[0067] 5)D-G-x13-x14-x15-C-x16-x17-x18-x19-R-x20-x21-x22-R-x23-x24-A-x25-x26-I-K,其 中Lys残基是在活性位点;
[0068] 6)G-G-V-x27-S-x28-x29-D-x30-P,其中Val残基是在活性位点;
[0069] 7)V-x31-A-H-x32-x33-G-x34-x35-G,其中两个His残基是在活性位点;
[0070] 8)H-x36-x37-x38-x39-D,其中His残基是在活性位点;
[0071] 9)G-V-x40-I-x41-x42-G-T-D,其中Asp残基是在活性位点;
[0072] 其中:
[0073] x1=l/m;x2=l/m;x3=w/i;x4=c/v/s/a;x5=任何氨基酸;x6=f/y/l;x7=任何氨基酸;8 9 10 11 12 13 14
x=y/f;x=t/a/s/v/r;x =i/f/a;x =-任何氨基酸;x =g/s;x =v/e;x =任何氨基酸;
15 16 17 18 19 20 21
x =e/d/g;x =任何氨基酸;x =任何氨基酸;x =a/g/t;x =v/a;x =任何氨基酸;x =q/m/
22 23 24 25 26 27 28
a;x =l/i/v;x =r/h/c;x =g/n;x =k/r/t/e/d;x =任何氨基酸;x =l/m/v/g;x =任何氨
29 30 31 32 33 34 35
基酸;x =任何氨基酸;x =任何氨基酸;x =a/s/h;x =c/v/a;x =h/q;x =k/r;x =任何
36 37 38 39 40 41 42
氨基酸;x =g/v/a;x =s/t/i;x =y/f/e;x =l/a/i;x =任何氨基酸;x =a/v;x =-l/a。
[0074] 应当理解,术语“任何氨基酸”是指氨基酸G、A、V、L、I、M、F、W、P、S、T、C、Y、N、Q、D、E、K、R或H,或者非天然氨基酸或氨基酸衍生物中的任一者。
[0075] 在一个更优选的实施方案中,所述基序是:
[0076] 1)l/m-P-G-l/m-w-D-c-H-x-H-f-x-G,其中两个His残基是在活性位点;
[0077] 2)G-y/f-T;
[0078] 3)G-t-i-x-G-P;
[0079] 4)G-H-g-D,其中His残基是在活性位点;
[0080] 5)D-G-v-x-e-C-x-x-a-v-R-x-q-l-R-r-g-A-k-x-I-K,其中Lys残基是在活性位点;
[0081] 6)G-G-V-l/-S-x-x-D-x-P,其中Val残基是在活性位点;
[0082] 7)V-a-A-H-c-h-G-k-x-G,其中两个His残基是在活性位点;
[0083] 8)H-g-s-y-l-D,其中His残基是在活性位点;
[0084] 9)G-V-x-I-a-l-G-T-D,其中Asp残基是在活性位点。
[0085] 对技术人员将显而易见的是,能够降解赭曲毒素的现有技术的羧肽酶不包含任何所述基序并且未显示出与本发明的酰胺酶具有同源性。
[0086] 在一个优选的实施方案中,酰胺酶是分离的酰胺酶,基本上不含生产其的培养基中的其他组分。
[0087] 在一个更优选的实施方案中,酰胺酶是至少30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、97%、99%纯的。
[0088] 在一个更优选的实施方案中,酰胺酶是包含扭曲的Tim样桶结构的酰胺酶,该Tim样桶结构包括包含6个组氨酸残基、1个赖氨酸残基和1个天冬氨酸残基的活性位点,其中当将该酰胺酶和SEQ ID NO:1的三级结构相比较时所述活性位点中的所述氨基酸残基对应于SEQ ID NO:1的位置H111、H113、H191、K246、H287、H289、H307和D378。
[0089] 技术人员将会理解,Tim桶是一保守的蛋白质折叠,由沿肽主链交替的八个α-螺旋和八个平行的β-折叠股(β-strand)组成。Tim桶被视为α/β蛋白质折叠,因为它们在单个结构域中包括交替样式的α-螺旋和β-折叠股。在Tim桶中,螺旋和折叠股(通常各8个)形成螺线管,其环绕弯曲而自身封闭成甜甜圈形状,这在拓扑学上称为超环面(toroid)。平行的β-折叠股形成该甜甜圈的内壁,而α-螺旋形成该甜甜圈的外壁。每个β-折叠股通过包括其中一个螺旋的长右手环区(right-handed loop)与该桶中的下一个相邻的折叠股连接。
[0090] 酰胺酶2的结构可分成两个结构域:核心催化结构域和较小的β-夹心结构域(β-sandwich domain)。催化结构域包含残基107-425,其形成在外表面两侧为α-螺旋的8个平行β-折叠股(β5-7,9-13)的相当扭曲的TIM样桶。折叠股β7的中间在残基182处出现一个扭结,其将该折叠股分成两个单独的折叠股β7a和β7b。该扭结代表了引起该桶扭曲的结构特征。β7a仅具有一个相邻的桶折叠股β6,而折叠股β7b具有与其形成氢键的两个相邻折叠股β8和β9。前者代表连接至桶核心的二级结构元件,在形式上未成为该桶核心的一部分。该桶扭曲的第二个原因是紧接在β13下游的残基375-378与第一个桶折叠股β5没有形成将会闭合该圆圈的经典氢键键合相互作用。因而,结构域核心的总体外观更像平行的β片层(β-sheet)的夹心结构,一个由三个折叠股组成,另一个由七个折叠股组成。在催化结构域的总共13个螺旋(12个α螺旋和1个g螺旋)中,紧接在该桶折叠股和β8后面的那些可指定为桶螺旋,而其余的四个螺旋代表了衬在该桶的顶部和底部的额外的二级结构元件。
[0091] β-夹心结构域包含N末端和C末端二者的残基(43-106,426-480)。由C末端残基形成的三个折叠股(β14-16)是两个片层中较大者的一部分。由N末端残基形成的四个折叠股中,β3属于较小的片层,而长的急剧弯曲的折叠股β1、β2和β4促成这两个片层的形成。仅β1和β4是相互平行的。螺旋转折(Helical turn)γ16和γ17插入在β14和β15之间并且倚靠催化结构域折叠。插入在β3和β4之间的螺旋γ1和α2指向相对的方向并且暴露于溶剂
[0092] 技术人员将会理解,可利用软件包采用它们的默认参数,例如,通过PyMOL(www.Pymol.org)容易地将给定酰胺酶的三级结构与具有图25所示坐标的SEQ ID NO:1的三级结构相比较。
[0093] 对技术人员更显而易见的是,能够降解赭曲毒素的现有技术的羧肽酶不包含在活性位点中包括指明的残基的Tim桶样结构。
[0094] 在一个实施方案中,根据国际生物化学与分子生物学联合会(IUBMB)命名委员会的推荐,酰胺酶是EC3.5.1.X的酶,其中X为该委员会提供的名称编号。
[0095] 技术人员将会理解,现有技术的羧肽酶A和羧肽酶Y分别指定在EC3.4.17.1和3.4.16.5中。
[0096] 在一个优选的实施方案中,酰胺酶是当在pH3-9和21-40℃下温育时可降解赭曲毒素A的酶。
[0097] 将显而易见的是,酰胺酶降解赭曲毒素A的能可用下面的方法章节中描述的OTA降解测定法测定。
[0098] 合适的酰胺酶包含分别显示为SEQ ID NO:1、3、5、6、7、8、9、10、11、13、14和15的来自黑曲霉、黄曲霉(Aspergillus flavus)、柄篮状菌(Talaromyces stipitatus)、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、链霉菌属(Streptomyces)例如玫瑰孢链霉菌(S.roseosporus)、莱廷格热孢菌(Thermotoga lettingae)、砂嗜盐产孢菌(Salinispora arenicola)、禾生小丛壳(Glomerella graminicola)、金龟子绿僵菌(Metarhizium anisopliae)和米曲霉(Aspergillus oryzae)的那些或与SEQ ID NO:1、3、5至11、13、14或15中的任一者具有10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列。
[0099] 在本发明的优选实施方案中,用于本发明的添加剂、食品、饲料、用途和方法的酰胺酶包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3的序列或具有与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:3有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多肽,或者与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO3相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽;或由包含SEQ ID NO:2的多核苷酸或与SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、
70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的多核苷酸,或与SEQ ID NO:2相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸表达而产生的多肽;或由在严格条件下杂交至SEQ ID NO:2的互补序列或杂交至与该互补序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、
80%、90%、95%、97%、98%或99%同一性的序列的序列表达而产生的多肽。
[0100] 在另外优选的实施方案中,根据本发明的酶可催化C-N、C-O或P-O,更优选C-N的化学键断裂。
[0101] 对技术人员将显而易见的是,全长酰胺酶2变体可用任何本领域所熟知的技术制备。耐受N末端序列或信号序列裂解的更稳定的变体可通过突变该肽序列中蛋白酶敏感的肽键来产生。
[0102] 例如,可在SEQ ID NO:1中所示的480个氨基酸的酰胺酶2序列中的如下71个位点中的一个或多个处进行突变,这些突变可能会改变对宿主生物体分泌进其培养基中的信号肽酶、肽酶以及胃蛋白酶的水解作用的敏感性:
[0103] 18313233344255565664697078791071141271281391461471561841851941951972022032202362622642692703043173183253353363363373433443513523543553593603743753
86387388389390391400412420424425435436440446461462462480;
[0104] 在如下44个位点处的突变可能会改变胰蛋白酶耐受性:
[0105] 343648667588899299138141155166231232235239240243246256271279282291299303320322330346351361368395405426445451458461464476;
[0106] 在如下90个位点处的突变可能会改变胰凝乳蛋白酶耐受性:
[0107] 11116192332343953565765707990919810310710811211311412012112412813914414715115415716017918519119520320620921521622123624825426226527028728929530530
73103163183193253263363373443493523553593603633753873893913984014134214254294
36441447455457462463471479480。
[0108] 还应该理解的是,480个氨基酸的酰胺酶2多肽或其变体可在其天冬酰胺(Asn)、丝氨酸(Ser)和苏氨酸(Thr)残基任一者处进行N-和/或O-糖基化以改善溶解性和热稳定性
[0109] 应当理解,如本文所定义的,术语“严格条件”是指在50℃和0.2xSSC{1xSSC=0.15M NaCl、0.015M柠檬酸钠pH7.0}下洗涤。
[0110] 应理解,这些条件还可以是高严格条件,高严格条件在本文中定义为在65℃和0.1xSSC{1xSSC=0.15M NaCl,0.015M柠檬酸钠pH7.0}下洗涤。
[0111] 在另一个优选的实施方案中,酰胺酶通过编码如下多肽的多核苷酸的表达制备:具有包含SEQ ID NO:1、3、5-11、13、14或15或包含与SEQID NO:1、3、5-11、13、14或15具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、97%、98%、99%同一性的序列的氨基酸序列的多肽,或与SEQ ID NO:1、3、5-11、13、14或15相差一个或多个氨基酸添加、缺失和/或置换的多肽。
[0112] 更优选地,酰胺酶由选自如下的多核苷酸编码:
[0113] a)包含SEQ ID NO:2或包含与SEQ ID NO:2具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或与SEQ ID NO:2相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸;
[0114] b)由于遗传密码的简并性而不同于SEQ ID NO:2的多核苷酸;
[0115] c)由在严格条件下杂交至SEQ ID NO:2的互补序列或杂交至与该互补序列具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列的多核苷酸,或与SEQ ID NO:2的互补序列相差一个或多个核苷酸添加、缺失和/或置换的多核苷酸。
[0116] 在另一个优选的实施方案中,提供了载体,该载体包含编码用于本发明的、可降解赭曲毒素A的酰胺酶的多核苷酸。
[0117] 对技术人员将显而易见的是,该载体可以是任何合适的表达载体并且对载体的选择可因载体要插入其中的细胞的类型而异。合适的载体包括pGAPT-PG、pRAX1、pGAMD和pGPT-pyrG1。
[0118] 在一个更优选的实施方案中,载体包含在细胞中。在一进一步的实施方案中,所述细胞为孢子。
[0119] 应当理解,本文所用的术语“孢子”是指真菌或细菌孢子、内孢子或外孢子。
[0120] 根据本发明的细胞可以是任何合适的细胞。更优选地,是任何合适的细菌、真菌或植物细胞。甚至更优选的是,该细胞选自大肠杆菌、链霉菌属(Streptomyces)、汉逊酵母属(Hansenula)、木霉属(Trichoderma)(特别是里氏木霉(T.reesei))、芽孢杆菌属(Bacillus)、乳杆菌属(Lactobacillus)、曲霉属(特别是黑曲霉)、植物细胞和/或芽孢杆菌属、木霉属或曲霉属的孢子。
[0121] 在一个更优选的实施方案中,提供了重组细胞或孢子,其包含编码用于本发明的、可降解赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的酰胺酶的多核苷酸。
[0122] 在另外的优选实施方案中,用于本发明的酰胺酶是重组的。
[0123] 在本发明的一个优选的方面,提供了包含能够降解赭曲毒素的酰胺酶的食品或饲料添加剂。
[0124] 优选地,该酰胺酶将降解至少赭曲毒素A。
[0125] 更优选地,该酰胺酶将还降解至少一种另外的赭曲毒素,更优选地,至少赭曲毒素B。
[0126] 在一个进一步的实施方案中,该酶将还降解除了赭曲毒素B和赭曲毒素C之外的至少一种赭曲毒素衍生物,和/或至少一种麦生物
[0127] 应当理解,麦角生物碱是含有酰胺键的化合物,并且包括例如麦角柯宁碱、麦角异柯宁碱、麦角克碱、麦角异克碱、麦角环肽、麦角隐宁碱、麦角新碱、麦角生碱、麦角胺和麦角异胺。这些化合物对活生物体(包括人和农场动物)是有毒的。
[0128] 对技术人员将显而易见的是,可将这些食品或饲料添加至污染有赭曲毒素的食品或饲料材料以减少动物消费的食品或饲料中存在的毒素水平。赭曲毒素A已知为谷物和其他富含淀粉的食物以及例如咖啡、可可、酒、啤酒、干豆、调味料、干果、葡萄汁、奶和来自非反刍动物的肉产品的重要污染物。赭曲毒素A是肾毒性的、致畸的和致癌的化合物,其即使以低水平存在也可能是有害的。
[0129] 在一更优选的实施方案中,添加剂是饲料添加剂。
[0130] 在优选的实施方案中,食品或饲料添加剂以至少0.001g/kg、至少0.01g/kg、至少0.1g/kg、至少1g/kg、至少5g/kg、至少7.5g/kg、至少10.0g/kg、至少15.0g/kg、至少20.0g/kg、至少25.0g/kg的水平包含酰胺酶。优选地,食品或饲料添加剂包含的酰胺酶的水平使得当添加至食品或饲料材料时,饲料材料包含的酰胺酶的范围为1-500mg/kg、
1-100mg/kg,更优选2-50mg/kg或2-10mg/kg。
[0131] 在本发明的优选实施方案中,当OTA以1μg/ml的浓度存在时,在pH7.0和40℃下酰胺酶每毫克蛋白质每分钟可水解至少10、20、50、100、200、300、500、700、900、1000纳摩尔OTA。
[0132] 更优选地,本发明的食品或饲料添加剂包含能表达能够降解赭曲毒素的酰胺酶的重组细胞。更优选地,该酰胺酶能够降解至少赭曲毒素A。
[0133] 甚至更优选地,该酰胺酶还能够降解至少一种另外的赭曲毒素或赭曲毒素衍生物和/或至少一种麦角生物碱,更优选赭曲毒素B。
[0134] 最优选地,该酰胺酶包含SEQ ID NO:1、SEQ ID NO:3或者SEQ IDNO:5-11、13、14或15或与SEQ ID NO:1、3、5至11、13、14或15具有至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、75%、80%、90%、95%、98%、99%同一性的序列中的任一者。
[0135] 在另一个优选的实施方案中,细胞为曲霉菌细胞或孢子。对技术人员将显而易见的是,曲霉细胞可以是活细胞、死细胞或破坏的细胞。
[0136] 在优选的实施方案中,重组细胞为黑曲霉细胞。更优选地,当与相同物种的非重组细胞相比时,所述细胞具有增加的OTA降解活性。
[0137] 技术人员将会理解,用于本发明的能够降解赭曲毒素A的酰胺酶可作为液体或固体/粒状组合物独立提供。
[0138] 优选地,当所述酶为液体形式时,在培养包含所述酶的细胞之后所述酶被分泌进培养基中。优选地,所述培养基是无细胞的(即已从该培养基分离了细胞)。优选地,对所述培养基进行浓缩。应当理解,可将培养基进行制粒以提供固体酶组合物。
[0139] 还应理解,根据本发明的食物或饲料添加剂可以以溶液的形式提供或者作为固体提供,这取决于用途和/或应用模式和/或施用模式。
[0140] 在另一个实施方案中,所述添加剂可用于预处理将用作食物或饲料的材料。
[0141] 例如,酰胺酶可用于处理液体如由乙醇植物作为副产物产生的液体。在这种情况下,所述添加剂将被添加至液体发酵液以降解存在于用以培养用于乙醇制备的酵母或微生物的培养基中的赭曲毒素A污染物。
[0142] 应当理解,可随后干燥发酵液并饲喂给动物。
[0143] 在一备选的实施方案中,可将添加剂添加至奶,例如污染有OTA的奶。
[0144] 在一个实施方案中,根据本发明的食品或饲料添加剂是在适于消费的液体制剂中,优选这种液体组合物还包含缓冲液、盐、山梨醇和/或甘油中的至少一者。
[0145] 优选地,食品或饲料还包含至少一种生理上可接受的载体。
[0146] 生理上可接受的载体优选选自如下物质中的至少一者:麦芽糖糊精、石灰石()、环糊精、小麦或小麦组分、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它们的混合物。
[0147] 在一个另外的实施方案中,食品或饲料添加可还包含金属离子螯合剂。金属离子螯合剂可选自EDTA或柠檬酸。
[0148] 在一个实施方案中,将酰胺酶在生理学可接受的载体上干燥。
[0149] 在一个实施方案中,将食品或饲料添加剂制粒或与其他酶共同制粒。
[0150] 在优选的实施方案中,用于本发明的酰胺酶可与一种或多种另外的酶联合使用。在优选的实施方案中,所述一种或多种另外的酶选自涉及蛋白质降解的那些,包括羧肽酶(优选羧肽酶A、羧肽酶Y)、黑曲霉天冬氨酸蛋白酶(PEPAa、PEPAb、PEPAc和PEPAd)、弹性蛋白酶、氨基肽酶、胃蛋白酶或胃蛋白酶样蛋白酶、胰蛋白酶或胰蛋白酶样蛋白酶和细菌蛋白酶(包括枯草杆菌蛋白酶及其变体),以及涉及淀粉代谢、纤维降解、脂质代谢的那些、涉及糖原代谢的蛋白质或酶、降解其他污染物的酶、乙酰酯酶、淀粉酶、阿拉伯糖酶、阿拉伯呋喃糖酶、外切肽酶和内切肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、凝乳酶、角质酶、脱氧核糖核酸酶、表异构酶、酯酶、甲酰胺酶、-半乳糖苷酶(例如α或β-半乳醣苷酶)、外切葡聚糖酶、葡聚糖裂解酶、内切葡聚糖酶、葡糖淀粉酶、葡萄糖氧化酶、-葡糖苷酶(例如α或β-葡糖苷酶)、葡糖酸酶、半纤维素酶、水解酶、转化酶、异构酶、漆酶、酚氧化酶、脂酶、裂解酶、甘露糖苷酶、氧化酶、氧化还原酶、果胶酶、果胶酸裂解酶、果胶乙酰酯酶、果胶去聚合酶、肽酶、果胶甲酯酶、果胶分解酶、过氧化物酶、酚氧化酶、植酸酶、多聚半乳糖醛酸酶、鼠李-半乳糖醛酸酶、核糖核酸酶、非洲甜果素、转移酶、转运蛋白、转谷酰胺酶、木聚糖酶、己糖氧化酶(D-己糖:O2-氧化还原酶,EC1.1.3.5)、酸性磷酸酶和/或其他酶或它们的组合。这包括例如可调节所述组合物或饲料的粘度的酶。
[0151] 在一特别优选的实施方案中,所述酶与羧肽酶A联合使用。
[0152] 在一个更优选的实施方案中,所述酶与PEPAd蛋白酶联合使用。
[0153] 在一另外的实施方案中,酰胺酶可与如下物质中的至少一种联合使用:选自霉菌毒素降解酶例如黄曲霉毒素去毒酶、玉米赤霉烯酮酯酶、玉米赤霉烯酮内酯酶、伏马毒素羧基酯酶、伏马毒素氨基转移酶、氨基多元醇胺氧化酶、脱氧瓜萎镰菌醇环氧化物水解酶的去毒酶、霉菌毒素降解微生物例如枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、乳杆菌或吸收剂(即霉菌毒素结合剂)(包括至少一种聚合物,例如微生物细胞壁或诸如膨润土之类的无机物质)。
[0154] 应当理解,所述饲料添加剂可用于任何合适的动物。在一个优选的实施方案中,所述动物是单胃动物,例如,家禽、猪、鱼、贝类和甲壳类(例如虾)、宠物动物(例如猫或狗)。在一个备选的优选实施例中,所述动物是选自例如奶牛或其他牛、绵羊、山羊、骆驼、鹿、美洲驼、羚羊、羊驼或角马的反刍动物。
[0155] 对于技术人员显而易见的是,根据本发明的食品或饲料添加剂可还包含其他组分如稳定剂和/或增量剂和/或其他酶。
[0156] 优选地,根据本发明的食品或饲料添加剂对于最高约70℃、最高约80℃或最高约95℃的热处理是热稳定的。热处理可以进行最多约0.5分钟、最多约5分钟、最多约10分钟、最多约30分钟、最多约60分钟。术语“热稳定的”意指在加热到指定温度之前在添加剂中存在/有活性的酶组分有至少约75%在其冷却到室温后仍存在/有活性。优选地,在加热到指定温度之前在添加剂中存在和有活性的酶组分有至少约80%在其冷却到室温后仍存在和有活性。
[0157] 根据本发明的食品或饲料添加剂可具有超过约30周、超过约40周、超过约50周、超过约1年、超过约1.5年的贮藏期。贮藏期意指在添加剂制备时添加剂中存在和有活性的酶组分有至少约80%仍存在和有活性。
[0158] 优选地,制备根据本发明的食品或饲料添加剂的方法包括混合步骤,该混合步骤包括混合可降解赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的酰胺酶,任选与至少一种生理上可接受的载体一起混合。
[0159] 更优选地,酰胺酶还能够降解至少一种另外的赭曲毒素或赭曲毒素衍生物和/或至少一种麦角生物碱,更优选赭曲毒素B。
[0160] 在一特别优选的实施方案中,将食品或饲料添加剂均化以制备粉末。
[0161] 在一备选的优选实施方案中,如WO2007/044968(以引用方式并入本文中)中所述,将食品或饲料添加剂配制成颗粒(称为TPT颗粒)。
[0162] 在另一个优选实施方案中,当将食品或饲料添加剂配制成颗粒时,颗粒包括涂覆在蛋白质芯上的水合屏蔽盐。这种盐涂层的优点在于使耐热性改善、使贮存稳定性改善和保护免受其他原本会不利影响该酶的食物或饲料添加剂的影响。
[0163] 优选地,用于盐涂层的盐在20℃下具有低于0.25的水活度或大于60%的恒定湿度。
[0164] 优选地,盐涂层包含Na2SO4。
[0165] 制备食物或饲料添加剂的方法还可包括将粉末制粒的另外步骤。粉末可以与本领域已知的其他组分进行混合。可迫使粉末或包含粉末的混合物通过模具,并将所得的料条切成可变长度的合适粒料。
[0166] 任选地,制粒步骤可包括在粒料形成之前进行的蒸汽处理或调理阶段。可将包含粉末的混合物置于调理机中,例如带蒸汽喷射的混合机。将混合物在调理机中加热至指定的温度,如60-100℃,典型的温度将为70℃、85℃、90℃或95℃。停留时间不定,可从数秒钟到数分钟甚至数小时。如5秒钟、10秒钟、15秒钟、30秒钟、1分钟、2分钟、5分钟、10分钟、15分钟、30分钟和1小时。
[0167] 在一个另外的方面,提供了包含本发明的食品或饲料添加剂的食品或饲料材料。应当理解,本发明的食品或饲料适于添加至任何适当的食品或饲料材料。
[0168] 对技术人员显而易见的是,作为预防步骤,可将食品或饲料添加剂添加至任何食品或饲料材料。备选地,可将食品或饲料添加剂添加至已知易于被赭曲毒素(优选赭曲毒素A)污染的食品或饲料材料或添加至已显示污染有赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的食品或饲料材料。还对技术人员将显而易见的是,赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的存在可通过任何合适的手段(例如HPLC、ELISA)或通过使用市售的赭曲毒素检测条(加利福尼亚州富勒顿的Helica Biosystems公司(Helica Biosystems,Inc.,Fullerton CA))来鉴定。
[0169] 本文所用的术语“饲料材料”指待由动物食用的基础饲料材料。还应理解,这可包含例如至少一种或多种未经加工的谷物,和/或经加工的植物和/或动物材料如大豆粉或骨粉。
[0170] 在一些实施方案中,饲料材料将包含如下组分中的一种或多种:a)谷类,例如小粒谷物(例如小麦、大麦、黑麦、燕麦以及它们的组合)和/或大粒谷物例如玉蜀黍或高粱;b)来自谷类的副产物,例如玉米蛋白粉、干酒糟及可溶物(DDGS)、麦麸、小麦粗粉、小麦次粉、米糠、稻壳、燕麦壳、棕榈仁和柑橘渣;c)青贮饲料如玉蜀黍青贮料;d)得自如下来源的蛋白质:例如大豆、向日葵、花生、羽扇豆、豌豆、蚕豆、花、卡诺拉、鱼粉、干血浆蛋白、肉和骨粉、马铃薯蛋白、乳清、干椰肉、芝麻;e)从植物和动物来源获得的油和脂肪;f)矿物质和维生素。
[0171] 本文所用的术语“饲料”是指已将一种或多种饲料添加剂加入其中的饲料材料。根据另一个方面,提供了包含本发明的饲料材料的饲料。
[0172] 技术人员会认识到,不同的动物要求不同的饲料,甚至同一种动物也可能要求不同的饲料,这取决于饲养该动物的目的。
[0173] 优选地,饲料可包含这样的饲料材料,其包含玉蜀黍或玉米、小麦、大麦、黑小麦、黑麦、稻米、木薯、高粱和/或任何副产物,以及富含蛋白质的组分,如大豆粉、油菜籽粉、卡诺拉粉、棉籽粉、葵花籽粉、动物副产物粉以及它们的混合物。更优选地,饲料可包含动物脂和/或植物油
[0174] 任选地,饲料还可含有额外的矿物质(例如钙)和/或额外的维生素。
[0175] 本文所用的术语“食品材料”是指用于人消费的基础食品。应当理解,这可包含谷物、植物或动物材料。
[0176] 在一些实施方案中,食品材料可包含谷类或谷类产品、咖啡、可可、酒、啤酒、干豆、调味料、干果、葡萄汁、奶、肉或肉产品。
[0177] 本文所用的术语“食品”是指已将一种或多种食品添加剂加入其中的食品材料。根据另一个方面,提供了包含本发明的食品材料的食品。
[0178] 在优选的实施方案中,食品或饲料以约0.001mg-10g/kg、0.01mg-10g/kg、0.1mg–10g/kg、0.1mg-5g/kg、1mg-5g/kg、0.5g-1g/kg食品/饲料的水平包含酰胺酶。
[0179] 对于技术人员将很显而易见的是,为了本发明的食品或饲料添加剂能提供所声称的优点,食品/饲料必须是污染有赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的食品/饲料。
[0180] 在另一个方面,提供了生产饲料的方法。饲料通常在饲料磨机中生产,在磨机中首先将原料研磨成合适的粒度,然后与适宜的添加剂混合。饲料随后可以作为糊料或粒料制备;后者通常涉及这样的方法:将温度升高至目标水平,然后使饲料通过模具以制备出特定大小的粒料。让粒料冷却。随后,可添加液体添加剂如脂肪和酶。饲料的制备还可涉及额外的步骤,其包括在制粒之前的挤出或膨胀–特别是通过可包括至少使用蒸汽的合适技术来进行。
[0181] 饲料可以是用于任何合适的动物的饲料。优选地,饲料用于家畜或农场动物。
[0182] 在一个实施方案中,动物为单胃动物,如家禽(例如肉鸡、蛋鸡、肉仔鸡、火鸡、鸭、鹅、水禽)、猪(所有年龄类别)、鱼、水生贝壳类包括诸如虾之类的甲壳类、宠物(例如狗、猫)。
[0183] 在一另外的实施方案中,动物为反刍动物,如牛(例如奶牛、水牛、野牛、牦牛)、绵羊、山羊、骆驼、鹿、美洲驼、羚羊、羊驼或角马。
[0184] 饲料可包含至少0.0001重量%的饲料添加剂。合适的是,饲料可包含至少0.0005重量%、至少0.0010重量%、至少0.0020重量%、至少0.0025重量%、至少0.0050重量%、至少0.0100重量%、至少0.020重量%、至少0.100%、至少0.200%、至少0.250重量%、至少0.500重量%的饲料添加剂。
[0185] 在一个另外的方面,提供了至少一种能够降解赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的酰胺酶在制造食品或饲料中用于降低食品或饲料中的霉菌毒素污染的水平的用途。
[0186] 优选地,酰胺酶还能够降解至少一种另外的赭曲毒素或赭曲毒素衍生物和/或至少一种麦角生物碱,更优选赭曲毒素B。
[0187] 优选地,所述至少一种酰胺酶被配制为食品或饲料添加剂。更优选地,食品或饲料是根据本发明的食品或饲料添加剂。
[0188] 在本发明的另一个方面,提供了包含赭曲毒素(优选赭曲毒素A)污染的材料和本文所述的可降解赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的酰胺酶的组合物。
[0189] 在本发明的一个优选的实施方案中,所述组合物包含能够表达赭曲毒素A降解酰胺酶的重组细胞。
[0190] 应当理解,所述组合物可包含任何合适的赭曲毒素A污染材料。在优选的实施方案中,所述组合物包含食品或饲料材料、发酵过程的发酵液或废产物如DDGS、废水或污染的土壤
[0191] 技术人员将理解,非食品或饲料材料的组合物的赭曲毒素A污染可能是有问题的。例如,来自工业加工的含赭曲毒素A的废水可导致水路污染。
[0192] 本发明还提供的是降低材料中的赭曲毒素污染的方法,包括将能够降解赭曲毒素(优选赭曲毒素A)的酰胺酶添加至受污染的材料。
[0193] 本发明还提供的是可通过本发明方法获得的食品或饲料材料。
[0194] 在本发明的另一个方面,提供了提高动物的生长速率和/或健康的方法,所述方法包括给所述动物饲喂有效量的根据本发明的饲料。
[0195] 如本发明上下文中所用的,术语“健康”是指由饲料中存在的曲毒素水平所导致的赭曲毒素毒性所引起的对动物的不利影响降低。
[0196] 实施例
[0197] 将参考如下实施例和附图进一步描述本发明,其中:
[0198] 图1示出了相同蛋白质浓度的PEPAd(克隆自黑曲霉的Danisco天冬氨酸蛋白酶)、TMAmano 脂酶和牛羧肽酶A分解OTA的能力。活性以OT-α(OTA的产物)面积百分比表示:
面积对应于产物面积除以总面积(OTA加OT-α峰面积)。
[0199] 图2示出了级分中的OT-α面积的百分比和相对的脂酶活性(%),所述级分来自(A):使用苯基琼脂糖填充柱(2.6cm×10cm)和1M硫酸铵至0的梯度的疏水相互作用色谱(HIC)/亲和色谱、(B):HIC后,使用0至1M NaCl梯度的阴离子交换色谱(AEX)Q30柱。
[0200] 图3示出了具有最高OTA降解活性的浓缩AEX级分的SDS-PAGE分析。用胰蛋白酶对标明的带A和带B进行凝胶内消化,将消化的肽在反相HPLC上分离并用MS分析进行肽鉴定。
[0201] 图4图示了在硫酸铵分级分离后,通过HIC/亲和色谱分离OTA活性级分。图4A示出了在苯基琼脂糖柱上的HIC或亲和色谱;图4B示出了在丁基琼脂糖柱上的HIC;图4C示出了从丁基琼脂糖柱收集的级分2-28中的脂酶和OTA活性分布。
[0202] 图5示出了在硫酸铵分级分离、苯基琼脂糖上的HIC/亲和色谱、丁基琼脂糖上的HIC、Source Q30上的AEX以及Amicon centriprep10浓缩器(分子量截止值为10kDa)上的膜分离/浓缩的纯化步骤后,浓缩的OTA活性级分的SDS-PAGE分析。
[0203] 图6示出了图5的膜分离和浓缩的AEX级分中存在的对甲酰胺(图6A)和OTA(图6B)的活性,蛋白质峰在280nm下测定。
[0204] 图7示出了酰胺酶2表达盒的构造。
[0205] 图8示出了携带有酰胺酶2基因的黑曲霉转化株的细胞内蛋白的SDS-PAGE分析。酰胺酶2的蛋白质带用箭头线条指示。
[0206] 图9示出了携带有酰胺酶2基因的黑曲霉转化株的细胞外蛋白的SDS-PAGE分析。酰胺酶2的蛋白质带用箭头线条指示。
[0207] 图10示出了对携带酰胺酶2基因的黑曲霉转化株(1-15)的细胞内和细胞外(发酵液)级分分解OTA的能力进行的筛选。将10μl的细胞内级分或发酵液与25μl1μg/ml OTA、100μl磷酸钠(67mM,pH7.0)混合并在40℃下温育35分钟。在反应结束时,添加130μl含有0.2%乙酸的乙腈来终止该反应。过滤反应混合物并将5μl通过RP-HPLC分析来分析剩余的OTA。wt是指用于转化的亲本菌株;ctrl是指缺失黑曲霉转化株时的反应物。
[0208] 图11示出了来自转基因黑曲霉细胞内制备物的酰胺酶2降解OTA的最适pH。该反应混合物含有蛋白质浓度为155μg蛋白质/ml的5μl酰胺酶2混合物(转化株3、4、7-8、10-11和13-15的细胞内级分的混合物)、0.1ml67mM磷酸盐缓冲液(pH3、4、5、6、7、8和9)、
25μl OTA(1μg/ml)。反应在30℃下进行60分钟,通过添加0.13ml含有0.2%HAC的乙腈终止反应。过滤后将10μl的注射体积用于对剩余的OTA进行RP-HPLC分析。
[0209] 图12示出了来自转基因黑曲霉细胞内制备物的酰胺酶2的热稳定性。1.5ml埃彭道夫管中的预温育混合物含有5μl酰胺酶2混合物(155μg蛋白质/ml)和45μl67mM磷酸盐缓冲液pH7.0。将该样品在80℃下预温育0、5、10、15、20、25和30分钟。冷却至15℃后,添加50μl67mM磷酸盐缓冲液和25μl OTA(1μg/ml)以开始该反应,将该反应物在30℃下温育60分钟,通过添加130μl含有0.2%HAC的乙腈终止反应。过滤后将10μl的注射体积用于对剩余的OTA进行RP-HPLC分析。
[0210] 图13示出了来自在67mM磷酸钠中在pH3-9、70℃下温育的转基因黑曲霉细胞内制备物的酰胺酶2的pH和温度稳定性。该反应混合物含有5μl酰胺酶2混合物(155μg蛋白质/ml)、45μl pH为3、4、5、6、7、8或9的67mM磷酸盐缓冲液。将该反应混合物在70℃下温育30分钟,然后添加2μl0.5mg/ml OTA乙醇溶液和80μl0.2M Mops pH7.0,并将样品在30℃下温育60分钟。通过添加130μl含有0.2%HAC的乙腈终止反应,过滤并通过RP-HPLC分析。
[0211] 图14示出了SDS-PAGE对于AEX级分(A)和通过质谱对AEX后的级分13(B),分析从黑曲霉转化株13的培养液纯化的重组酰胺酶2。
[0212] 图15示出了随酰胺酶蛋白质浓度变化的OTA降解。使用的酰胺酶纯化自转化株13的培养液(438个氨基酸的蛋白质称为酰胺酶2mat)。
[0213] 图16示出了钙离子浓度对从转基因黑曲霉纯化的酰胺酶2mat和AmanoTM脂酶产品的活性的影响。
[0214] 图17:从黑曲霉的细胞内级分提取的酰胺酶2(酰胺酶2sig)对OTA的降解。未见CaCl2或EDTA抑制酰胺酶2sig。
[0215] 图18A示出了单字母格式的来自黑曲霉的酰胺酶2氨基酸序列(480aa)(SEQ ID NO:1)。带单下划线的序列是从图5获得的那些;带双下划线的序列是从图8获得的那些。
[0216] 图18B示出了单字母格式的来自黑曲霉的酰胺酶2的氨基酸序列(480aa)加上其C末端的6个组氨酸残基(SEQ ID NO.4)。
[0217] 图19示出了三字母格式的来自黑曲霉的胺酶2的氨基酸序列(480aa)。OTA降解酰胺酶特征性的结构指示为粗体和带下划线的氨基酸残基:保守残基(粗体)和九个序列基序(带下划线)。
[0218] 图20a示出了形成扭曲的TIM样桶结构的酰胺酶2(SEQ ID NO:1)蛋白四聚物;b示出了8个亚基中的1个的结构。
[0219] 图21示出了酰胺酶2活性位点环境的结构。
[0220] 图22示出了酰胺酶2的单体的晶体坐标。
[0221] 图23示出了表达质粒pTTT-pyrG13-酰胺酶禾生小丛壳的示意图。
[0222] 图24示出了表达质粒pTTT-pyrG13-酰胺酶金龟子绿僵菌的示意图。
[0223] 图25示出了表达质粒pRAX-酰胺酶米曲霉。
[0224] 图26示出了11条酰胺酶序列的比对,显示了9个对降解赭曲毒素的酰胺酶活性而言所必须的序列基序。
[0225] 图27示出了SEQ ID NO:1与已知具有低的赭曲毒素降解活性的羧肽酶A和Y的比对。
[0226] 除非另有定义,否则本文所用的所有技术和科学术语都具有本公开所属技术领域普通技术人员通常理解的含义。Singleton等人,DICTIONARYOF MICROBIOLOGY AND MOLECULAR BIOLOGY(《微生物学和分子生物学词典》),第20版,纽约约翰·威利父子出版公司(John Wiley andSons,New York)(1994)以及Hale&Marham,THE HARPER COLLINSDICTIONARY OF BIOLOGY(《哈珀柯林斯生物学词典》),HarperPerennial,NY(1991)为技术人员提供了本公开中所用的许多术语的综合词典。
[0227] 本公开并不受本文公开的示例性方法和材料的限制,任何与本文所述的那些方法和材料相似或等同的方法和材料都可用于本公开的实施方案的实施或测试。数值范围包括限定该范围的数字。除非另有说明,否则分别是,核酸序列从左至右以5'至3'取向写出;氨基酸序列从左至右以氨基至羧基取向写出。
[0228] 本文提供的标题并非对本公开的各个方面或实施方案的限制,这些方面或实施方案可通过将说明书作为一个整体来参考而得到。相应地,下面就要定义的术语通过将说明书作为一个整体来参考会得到更完全的定义。
[0229] 氨基酸在本文中用氨基酸名称、三字母缩写或单字母缩写来指代。
[0230] 本文所用的术语“同一性”是指与所述氨基酸序列和所述核苷酸序列具有一定的同源性的实体。术语“同一性”在该上下文中指两种酶之间在用下文更详细描述的比对算法将它们的序列进行比对后所得的序列同一性百分数。
[0231] 在本发明的上下文中,同源氨基酸序列被认为包括与所述序列可具有至少30、40、50、60、70、75,80、85或90%同一性,优选至少95、96、97、98或99%同一性的氨基酸序列。通常,同源物将包含相同的活性位点等–例如与主题氨基酸序列的相同。尽管同源性可以相似性(即氨基酸残基具有类似的化学性质/功能)考虑,但在本发明的语境中优选以序列同一性表达同源性。
[0232] 对于氨基酸序列和核苷酸序列,同源性比较可通过眼睛,或更通常地,借助于易于获得的序列比较程序来进行。这些市售的计算机程序可计算两条或更多条序列之间的%同源性。
[0233] %同源性可在连续的序列上计算,即将一条序列与另一条序列进行比对,并将一条序列中的每个氨基酸与另一条序列中的相应氨基酸直接比较,一次一个残基。这称为“不产生空位的”比对。通常,这种不产生空位的比对仅在相对较短数目的残基上进行。
[0234] 尽管这是十分简单和可靠的方法,但其不能考虑,例如,在原本相同的一对序列中,一个插入或缺失将引起后面的氨基酸残基不再对齐,从而在进行全局比对时可能导致%同源性有大的降低。因此,大多数序列比较方法被设计产生最佳的比对,该最佳比对考虑可能的插入和缺失而不会罚掉过多的整体同源性分数。这通过在序列比对中插入“空位”以试图使局部同源性最大化来实现。
[0235] 然而,这些更复杂的方法给比对中出现的每一个空位赋给“空位罚分”使得,对于同样数目的相同氨基酸,具有尽可能少空位的序列比对(反映两条比较序列之间相关性较高)将获得比具有许多空位的序列比对更高的分数。通常使用“仿射空位成本(Affine gap costs)”,其对空位的存在征收相对较高的成本,对空位中每一个后续的残基征收较少的罚分。这是最通常使用的空位打分系统。高的空位罚分将当然会产生具有较少空位的最佳比对。大多数比对程序允许修改空位罚分。然而,当用这种软件进行序列比较时优选使用默认值。例如,当使用GCG Wisconsin Bestfit程序包时,对于氨基酸序列的默认空位罚分为:空位-12,每个空位延伸-4。
[0236] 最大%同源性的计算因而首先需要在考虑空位罚分的情况下产生最佳比对。适用于进行这种比对的计算机程序是GCG Wisconsin Bestfit软件包(Devereux等人1984Nuc.Acids Research(《核酸研究》)12第387页)。可进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST软件包(参见Ausubel等人,1999Short Protocols in Molecular Biology(《简明分子生物学方法》),第4版–第18章)、FASTA(Altschul等人,1990J.Mol.Biol.(《分子生物学杂志》)403-410)和GENEWORKS比较工具包。BLAST和FASTA二者均可用于离线或在线搜索(参见Ausubel等人,1999,Short Protocols in Molecular Biology(《简明分子生物学方法》),第7-58至7-60页)。
[0237] 然而,对于某些应用,优选使用GCG Bestfit程序。一种称为BLAST2Sequences的新工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMSMicrobiol Lett(《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)1999174(2):247-50;FEMS Microbiol Lett《欧洲微生物学会联合会微生物学快报》)1999177(1):187-8和tatiana@ncbi.nlm.nih.gov)。
[0238] 尽管最终的同源性百分数(%)也可以同一性来度量,但比对过程本身通常不是基于要么全有要么全无的成对比较。相反,通常使用标度化相似性打分矩阵,该矩阵基于化学相似性或进化距离给每一成对比较赋给分值。通常使用的这种矩阵的实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序包的默认矩阵。GCG Wisconsin程序通常使用公用默认值或定制的符号比较表(如果提供的话)(对于进一步的细节请参见使用手册)。对于某些应用,优选使用GCG软件包的公用默认值,或者在其他软件的情形中,使用默认矩阵,如BLOSUM62。
[0239] 作为另一种选择,百分比同源性可用DNASISTM(日立软件公司(Hitachi Software))中的多重比对功能,基于类似于CLUSTAL(HigginsDG和Sharp PM(1988),Gene(《基因》)73(1),237-244)的算法计算。
[0240] 一旦该软件产生了最佳比对,则有可能计算%同源性,优选%序列同一性。作为序列比较的一部分该软件通常进行这些计算,并产生数值结果。
[0241] 在本发明的一个优选方面,使用如下软件和设置来计算序列同源性/同一性百分数。对于氨基酸序列,通过AlignX VectorNTI(Vector NTIAdvance9.1,得自美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(InvitrogenCorporation,Carlsbad,California,USA.))针对每个可能的氨基酸序列对计算同一性(同源性)或“阳性”的百分数。设置值是默认参数(空位开放罚分–10,空位延伸罚分0.1)。
[0242] 对于核酸序列,通过得自Informax Inc.(USA)的AlignX VectorNTI程序针对每个可能的核酸序列对计算同一性(同源性)或“阳性”的百分数。设置值是DNA的默认设置值:空位开放罚分:15,空位延伸罚分:6.66(与多序列比对的设置值相同)。
[0243] 优选地,计算全长氨基酸序列的氨基酸同一性(同源性),或者对于核酸而言,编码各自全长氨基酸序列的相应多核苷酸。
[0244] 序列还可具有氨基酸残基的缺失、插入或置换,该缺失、插入或置换产生了沉默改变和导致功能等价的物质。可根据氨基酸性质(如残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两性性质)的相似性作出有意的氨基酸置换,因此按官能团将氨基酸归类在一起是有用的。氨基酸可单独根据它们的侧链归类在一起。但是,更有用的是也将突变数据包括在内。由此衍生的氨基酸组别由于结构原因很可能是保守的。这些组别可以以Venn图表的形式描述(Livingstone C.D.和Barton G.J.(1993)“Proteinsequence alignments:a strategy for the hierarchical analysis of residueconservation(蛋白质序列比对:残基保守性的层次分析策略)”Comput.Appl Biosci.(《计算与应用生物科学》)9:745-756)(Taylor W.R.(1986)“The classification of amino acid conservation(氨基酸保守性的分类)”J.Theor.Biol.(《理论生物学杂志》)119;205-218)。保守置换可例如按照下表作出,该表描述了公认的氨基酸Venn图表归类。
[0245]
[0246] 本发明还涵盖可能发生的同源置换(置换和取代二者在本文中均用于意指现有的氨基酸残基与备选残基的互换),即对等置换,如碱性的置换碱性的,酸性的置换酸性的,极性的置换极性的等等。
[0247] 非同源置换也可以发生,即从一类残基置换为另一类,或者作为另一种选择涉及包括非天然的氨基酸如氨酸(下文称为Z)、二氨基丁酸鸟氨酸(下文称为B)、正亮氨酸鸟氨酸(下文称为O)、吡啶基丙氨酸、噻吩基丙氨酸、基丙氨酸和苯基甘氨酸。
[0248] 置换还可通过非天然氨基酸进行。
[0249] 本文所用的术语“蛋白质”包括蛋白质、多肽和肽。
[0250] 术语“与等同的氨基酸残基”、“与相对应的氨基酸”以及其语法上等价的术语在本文中用于指具有与在特定蛋白质的特定氨基酸序列中指出的相似的位置和作用的蛋白质的氨基酸残基。本领域技术人员将会认识到可比蛋白质中指定残基的等同物。
[0251] 如本文所用,在多肽的语境中术语“性质”或其语法上等价的术语指多肽的可被选择或检测的任何特征或属性。这些性质包括但不限于氧化稳定性、底物特异性、催化活性、热稳定性、温度和/或pH活性谱、饲料加工稳定性和被分泌的能力。
[0252] 如本文所用,术语“氨基酸序列”与术语“多肽”和/或术语“蛋白质”是同义的。在某些情况下,术语“氨基酸序列”与术语“肽”同义。在某些情况下,术语“氨基酸序列”与术语“酶”同义。
[0253] 氨基酸序列可从合适的来源制备/分离,或者其可通过合成制备或者其可通过利用重组DNA技术制备。
[0254] 术语“蛋白质”和“多肽”在本文中可互换使用。在本公开和权利要求书中,使用氨基酸残基的常规一字母和三字母代码。氨基酸的3字母代码遵照IUPACIUB生物化学命名联合委员会(Joint Commission onBiochemical Nomenclature,JCBN)的定义。还应理解,由于遗传密码的简并性,多肽可由不止一种核苷酸序列编码。
[0255] 术语“信号序列”或“信号肽”指可参与该蛋白质的成熟形式或前体形式的分泌的核苷酸和/或氨基酸的任何序列。信号序列的这个定义是功能性定义,意在包括所有那些由该蛋白质基因的N末端部分所编码的、参与蛋白质分泌的实现的氨基酸序列。它们往往但并不普遍地结合在蛋白质的N末端部分或者结合在前体蛋白的N末端部分。
[0256] 所谓“功能性片段”其意指多肽保留该多肽的特征性性质的片段。在本发明的背景下,酰胺酶的功能片段为保留整个蛋白质的酰胺酶裂解能力的片段。
[0257] 术语“分离的”、“回收的”或“纯化的”指从其原始环境中移除出来的材料。术语“基本上纯化的”意指该材料已被纯化至至少相当大的程度。
[0258] 在一个方面,优选地,核苷酸或氨基酸序列为分离的形式。术语“分离的”意指该序列至少实质上不含与该序列在自然界中天然结合或者在自然界中存在的至少一种其他组分。
[0259] 术语的其他定义可在整个本说明书中出现。在更详细地描述示例性的实施方案之前,应理解本公开并不限于所描述的具体实施方案,因为这些实施方案当然是可变的。还应理解,本文所用的术语仅出于描述具体的实施方案的目的,并不意在具有限制意义,因为本发明的范围将仅受所附权利要求的限定。
[0260] 在提供数值范围的情况中,应理解,该范围的上限和下限之间的每个中间数值(至下限的个位的十分之一,除非上下文另有清楚规定)也被具体公开。规定的范围中的任何规定值或中间值与该规定的范围中的任何其他规定值或中间值之间的每个较小范围,被涵盖在本公开内。这些较小范围的上限和下限可独立地被包括或排除在该范围中,而且其中任一个、没有一个或两个界限被包括在较小范围中的每个范围也被涵盖在本公开中,但依据该规定的范围中的任何被具体排除的界限而定。在规定的范围包括界限中的一个或两个的情况中,排除这些被包括的界限中的任一个或两个的范围,也被包括在本公开中。
[0261] 必须指出,本文和所附权利要求书中用到的名词既有单数含义也有复数含义,除非上下文另有清楚规定。因此,例如,提到“基因”则包括多个这种候选物质,而提到“细胞”则包括提到一个或多个细胞以及本领域技术人员知道的它们的等同物,以此类推。
[0262] 本文述及的出版物只是为了它们在本申请的提交日之前的公开内容而提供。本文的任何内容都不能被解释为承认这些出版物构成本文所附权利要求的现有技术。
[0263] 用于本发明的酶可通过固体培养或深层培养来产生,包括分批工艺、补料分批工艺和连续流工艺。培养在培养基中完成,该培养基包含含水矿物盐培养基、有机生长因子、碳和能源物质、分子氧以及当然还有待使用的一种或多种特定微生物物种的起始种菌。
[0264] 除了碳源和能源、氧气、可同化氮和微生物种菌外,还有必要以恰当比例提供合适量的矿质营养素来确保正常的微生物生长,使微生物转化过程中细胞对碳源和能源的同化最大化,以及在发酵培养基中细胞密度最大的情况下获得最大的细胞收率。
[0265] 部分取决于所采用的微生物和底物,含水矿物质培养基可在宽泛的范围内变化,这是本领域已知的。除了氮以外,该矿物质培养基还应该包括合适的可溶性可同化离子形式和化合形式的合适量的磷、镁、钙、、硫和钠,还优选应存在某些痕量元素如酮、锰、钼、锌、和碘等等,同样它们也为可溶性可同化形式,这些全部是本领域已知的。
[0266] 该发酵反应是一有氧过程,其中所需的分子氧通过含有分子氧的气体如空气、富氧空气或甚至基本上纯的分子氧提供,只要维持发酵容器的内容物具有可有效用于帮助微生物物种旺盛生长的合适的氧分压。实际上,通过使用含氧底物,微生物生长的氧需求得以减少。然而,必须提供分子氧用于生长,因为底物的同化以及微生物的相应生长在一定程度上是燃烧过程。
[0267] 尽管通气速率可在相当宽泛的范围内变化,通气通常以这样的速率进行,该速率的范围是每分钟每发酵罐中的液体体积约0.5至10、优选约0.5至7体积(在所采用的压力以及在25℃下)的含氧气体。该量是以提供给反应器的常氧含量的空气计的,就纯氧而言,相应的范围将会是每分钟每发酵罐中的液体体积约0.1至1.7,或优选约0.1至1.3体积(在所采用的压力下以及在25℃下)的氧。
[0268] 微生物转化过程所采用的压力可很大变化。压力通常在约0至50psig,本发明优选约0至30psig的范围内,更优选至少稍高于大气压,这要在设备和操作耗费与所实现的氧溶解度之间权衡。高于大气压是有利的,因为这种压力的确趋于增加含水发酵物中的溶解氧浓度,其继而可有助于增加细胞生长速率。同时要考虑这样一个事实进行权衡:高大气压的确会增加设备和操作费用
[0269] 发酵温度可有一定程度变化,但对于丝状真菌如黑曲霉或里氏木木霉,温度通常将会在约20℃至40℃,通常优选在约25℃至34℃的范围内,这取决于所选择的微生物菌菌株。
[0270] 微生物还需要可同化的氮源。可同化的氮源可以是任何含氮化合物或能够释放适于微生物进行代谢利用的形式的氮。虽然可采用多种有机氮源化合物,例如蛋白质水解产物,通常可利用廉价的含氮化合物如氨、氢氧化铵、尿素和多种铵盐如磷酸铵、硫酸铵、焦磷酸铵、氯化铵或多种其他氨化合物。氨气本身便于大规模操作,并且可通过鼓泡通过含水发酵物(发酵培养基)以合适的量使用。同时,还可采用这种氨来帮助进行pH控制。
[0271] 含水微生物发酵物(发酵混合物)中的pH范围应该是在约2.0至8.0的示例性范围内。对于丝状真菌,pH通常在约2.5至8.0的范围内;对于黑曲霉或里氏木霉,pH通常在约3.0至7.0的范围内。某些微生物的pH范围偏好在一定程度上取决于所采用的培养基,以及取决于特定的微生物,并因而稍微随着培养基的变化而改变,可通过本领域技术人员可容易地确定。
[0272] 虽然部分取决于所采用的发酵温度和培养物,发酵罐中的发酵混合物的平均保持时间可有相当大的变化,一般而言其将处于约24至500小时,本发明优选约24至400小时的范围内。优选地,发酵在使得含碳底物可被控制为限制性因素的方式进行,从而为细胞提供了含碳底物的良好转化并避免相当量的未转化底物对细胞的污染。后一种情况对水溶性底物而言没有问题,因为任何剩余的痕量物质均可容易地洗掉。然而,在非水溶性底物的情况下这可能是个问题,需要增加的产物处理步骤如合适的洗涤步骤。如上所述,达到该水平的时间不是关键的,可随特定的微生物和所进行的发酵过程而变化。然而,本领域熟知如何确定发酵培养基中的碳源浓度以及所需的碳源水平是否已经达到。
[0273] 尽管发酵可以分批或连续操作进行,但为了易于控制、产生均一量的产物以及最经济地使用所有设备,分批补料操作是更为优选的。如果需要,可在将含水矿物质培养基供料至发酵罐之前将碳源和能源物质的部分或全部和/或可同化氮源如氨的部分添加至该含水矿物质培养基。优选以预定的速率,或者响应可通过监测例如碳和能量底物的浓度、pH、溶解氧、从发酵罐排出的废气中的氧或二氧化碳而确定的需要来控制引入反应器的每一种料流。多种材料的进料速度可以变化以便获得与碳和能量源的有效利用相一致的尽可能快的细胞生长速率,以相对于底物给料获得尽可能高的微生物细胞产量。
[0274] 在分批操作或优选的分批补料操作中,一开始对所有的设备、反应器或发酵装置、器皿或容器、管线、附带的循环或冷却设备等进行灭菌,通常通过采用蒸汽例如在约121℃下至少约15分钟。然后在存在所有所需的营养物,包括氧和含碳底物的情况下,用所选微生物的培养物接种灭菌过的反应器。所采用的发酵罐的类型不是关键的,但本发明优选的是在15LBiolafitte(Saint-Germain-en-Laye,France)下操作。
[0275] 从发酵液收集和纯化本发明的酶也可通过本领域本身已知的程序进行。发酵液将通常含有细胞碎屑,包括细胞、多种悬浮固体和其他生物质污染物,以及所需的本发明酶产物,优选将它们通过本领域已知的手段从发酵液移除。适用于这种移除的方法包括常规的固体-液体分离技术如,例如离心、过滤、透析、微量过滤、旋转真空过滤或其他已知的方法,以产生无细胞滤液。可能优选的是使用诸如超滤蒸发或沉淀之类的技术进一步浓缩发酵液或无细胞滤液。沉淀上清液或滤液的蛋白质性组分可使用盐,例如硫酸铵来完成。进一步的纯化可任选通过结晶或通过多种色谱分析程序,例如离子交换色谱、亲和色谱或类似的本领域公认的程序来实现。
[0276] 变体/衍生物
[0277] 本发明还涵盖酶的任何氨基酸序列或编码这种酶的任何核苷酸序列的变体、同源物和衍生物。
[0278] 变体氨基酸序列可包括可在序列的任何两个氨基酸残基之间插入的合适的间隔基团,这些间隔基团除了氨基酸间隔物如甘氨酸或β-丙氨酸残基外还包括烷基基团如甲基、乙基或丙基基团。变异的另一种形式(涉及存在类肽(peptoid)形式的一个或多个氨基酸残基)将是本领域技术人员十分了解的。为了避免疑惑,“类肽”用于指其中α-碳取代基处于残基的氮原子而不是α-碳上的变体氨基酸残基。用于制备类肽形式的肽的方法是本领域已知的,例如Simon RJ等人,PNAS(《美国科学院院刊》)(1992)89(20),9367-9371和Horwell DC,Trends Biotechnol.(《生物技术趋势》)(1995)13(4),132-134。
[0279] 其他组分
[0280] 本发明的饲料添加剂或组合物可与其他组分或载体联合使用。
[0281] 饲料用酶的合适载体包括麦芽糖糊精、石灰石(碳酸钙)、环糊精、小麦、麦麸或小麦组分、稻米或米糠、蔗糖、淀粉、Na2SO4、滑石粉、PVA以及它们的混合物。另外,有多种封装技术,包括那些基于脂肪/蜡覆盖、添加植物胶等的技术。
[0282] 其他组分的实例包括如下中的一种或多种:增稠剂胶凝剂、乳化剂、粘合剂、结晶改良剂、甜味剂(包括人造甜味料)、流变改性剂、稳定剂、抗氧化剂、染料、酶、载体、溶媒、赋形剂、稀释剂、润滑剂调味剂、着色物质、助悬剂、崩解剂、制粒粘合剂等。这些其他组分可以是天然的。这些其他的组分可通过使用化学和/或酶学技术来制备。
[0283] 本文所用的术语“增稠剂或胶凝剂”指通过减慢或防止粒子的移动而防止发生分离的产品,所述粒子为不混溶性液体小滴、空气或不溶性固体。
[0284] 本文所用的术语“稳定剂”定义为防止产品(例如食物产品)随时间推移发生变化的成分或成分组合。
[0285] 本文所用的术语“乳化剂”指防止乳液发生分离的成分(例如食物产品成分)。
[0286] 本文所用的术语“粘合剂”指通过物理或化学反应将产品粘合在一起的成分(例如食品成分)。
[0287] 本文所用的术语“晶体改性剂”指影响脂肪或水的结晶的成分(例如食品成分)。
[0288] “载体”或“溶媒”意指适合于化合物施用的材料,包括本领域已知的任何无毒且不会以有害方式与组合物的任何组分发生相互作用的材料,例如任何液体、凝胶、溶剂、液体稀释剂、增溶剂等。
[0289] 营养上可接受的载体的实例包括例如谷物、水、盐、溶液、醇、酮、蜡、石油凝胶、植物油等。
[0290] 赋形剂的实例包括如下中的一种或多种:微晶纤维素和其他纤维素、乳糖(lactose)、柠檬酸钠、碳酸钙、二碱式磷酸钙、甘氨酸、淀粉、乳糖(milk sugar)和高分子量聚乙二醇。
[0291] 崩解剂的实例包括如下中的一种或多种:淀粉(优选玉米、马铃薯或木薯淀粉)、淀粉乙醇酸钠、交联羧甲基纤维素钠和某些复合硅酸盐。
[0292] 制粒粘合剂的实例包括如下中的一种或多种:聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、羟丙基纤维素(HPC)、蔗糖、麦芽糖、明胶和阿拉伯胶。
[0293] 润滑剂的实例包括如下中的一种或多种:硬脂酸镁、硬脂酸、山嵛酸甘油酯和滑石。
[0294] 稀释剂的实例包括如下中的一种或多种:水、乙醇、丙二醇和丙三醇以及它们的组合。
[0295] 其他的组分可同时使用(例如当它们混合在一起时或者甚至当它们通过不同的途径递送时)或者依序使用(例如它们可通过不同的途径递送)。
[0296] 本文所用的术语“适于动物或人消费的组分”意指这样的化合物,其作为添加剂被添加到或可添加到本发明的组合物中,该添加剂可对消费者有营养好处,可以是纤维替代物,或者对消费者具有一般有益的作用。
[0297] 举个例子,所述组分可以是益生元如藻酸盐、黄原胶、果胶、刺槐豆胶(LBG)、菊粉、瓜尔豆胶、半乳寡聚糖(GOS)、果寡聚糖(FOS)、乳蔗糖、大豆寡糖、帕拉金糖、异麦芽寡聚糖、葡寡聚糖和木寡聚糖。
[0298] 分离的
[0299] 在一个方面,优选的是,用于本发明的酰胺酶是分离的形式。术语“分离的”意指酰胺酶至少实质上不含与该脂解酶在自然界中天然结合且在自然界中存在的至少一种其他组分。术语“分离”可意指酰胺酶是至少实质上不含至少一种该酰胺酶在其中产生的培养基中的其他组分。本发明的酰胺酶可以实质上不含一种或多种污染物的形式提供,所述污染物可能原本与该酰胺酶相关联或该酶可与所述污染物质一起产生。
[0300] 因而,例如,其可能实质上无细胞或一种或多种潜在污染性多肽和/或核酸分子。可通过在发酵期间或发酵后从发酵液分离出细胞使得酰胺酶保留在发酵液中来分离酰胺酶。可通过使发酵液接受通过真空过滤进行的细胞分离来分离酰胺酶。
[0301] 在一个实施方案中,术语“分离的”意指从发酵液分离酰胺酶使得其实质上不含存在于产生该酰胺酶的培养基中的其他组分。
[0302] 纯化的
[0303] 在一个方面,优选的是,用于本发明的酰胺酶是纯化的形式。术语“纯化的”意指给定组分以高水平存在。理想的是该组分为组合物中存在的主要组分。优选地,其以至少约30%、40%、50%、60%、或至少约65%、或至少约70%、或至少约75%、或至少约80%、或至少约85%、或至少约90%、或至少约95%、或至少约97%、或至少约99%的水平存在,所述水平是相对于所考虑的总组合物以干重/干重计来测定。对于一些实施方案,该量是至少约85%,所述水平是就所考虑的总组合物以干重/干重计来测定。
[0304] 浓缩物
[0305] 在一个方面,优选的是,用于本发明的酰胺酶是作为浓缩物使用。浓缩物可以是该酶已分泌进其中的培养基的浓缩形式。优选地,浓缩物可以是该酶已分泌进其中并且其中已移除细胞的培养基的浓缩形式。
[0306] 材料和方法
[0307] 赭曲毒素A来自Fluka(目录号32937-5MG)。羧肽酶A来自牛胰腺(西格玛公司(Sigma),目录号No.C9268)。包括市售的酰胺酶在内的所有其他酶和试剂均来自西格玛公TM司、罗氏(Roche)、默克公司(Merck)和丹尼斯克公司(Danisco)。Amano 脂酶来自日本名古屋的天野酶公司(AmanoEnzyme Inc.,Nagoya,Japan)。包括苯基琼脂糖、辛基琼脂糖、丁基琼脂糖、阴离子交换、凝胶过滤(PD10柱)在内的所有色谱介质和蛋白质纯化仪 explorer均来自通用电气医疗公司(GE Healthcare)。微量滴定板来自丹麦的Nunc A/S公司和美国康宁公司(Corning,USA)。微板读数器来自美国伯腾公司(Biotek,USA)。玉米粉从当地市场获得,而基于大豆-玉米的饲料从丹麦科灵的宁丹尼斯技术学院(The Danish Technological Institute,Kolding,Denmark)获得。
[0308] 霉菌毒素降解测定法:
[0309] 测量甲酰胺酶活性的方法
[0310] 所用的溶液:美格兹密公司甲酸测定试剂盒(K-form05/06)1号瓶,添加4ml milliQ水以制备磷酸钾缓冲液pH7.6。在5℃下保持;2号瓶,添加5.2ml水以获得正确的NAD浓度(在-20℃下保持);3号瓶,是FDH,使用前摇动(在5℃下保持)。甲酰胺是来自西格玛公司的99.80%液体产品(F9037)(在5℃下保持)并原样使用而不进行进一步稀释。
[0311] 测定程序:向96孔半区紫外透射微量滴定板添加:
[0312] 10μl磷酸钾缓冲液(pH7.6)(来自试剂盒的溶液1),
[0313] 10μl NAD(来自试剂盒的溶液2),
[0314] 2.5μl甲酸脱氢酶(FDH)(来自试剂盒的溶液3),
[0315] 1.6μl100%(v/v)甲酰胺溶液(来自西格玛公司,F9037)。
[0316] 100μl milliQ水。
[0317] 在微板读数器中于37℃,每分钟读取340nm下的OD增加值并在每次读取之前摇动15-60分钟。读取时间间隔:1分钟。
[0318] 5分钟读取后,添加5μl-20μl黑曲霉制备物(视活性而定)。获得反应速率(最大线性斜率)。
[0319] 对照:不添加甲酰胺酶,而是添加缓冲液或水或不具有甲酰胺酶活性的细胞提取物。
[0320] OTA的酶促降解测定。该测定法中所采用的缓冲液为:50mM醋酸钠缓冲液(pH4、4.5、5和5.5);50mM MES缓冲液(pH6、6.5和7);0.2M Mops-NaOH(pH7.0)、50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5、8和8.5)。将5mg赭曲毒素A(OTA)(西格玛公司,产品编号32937)溶解于乙醇/水(60/40)中制备赭曲毒素A溶液(1mg/mL),在–20℃下保存。筛选测定法用
15μL OTA溶液和不同的酶浓度(例如0.1-5mg/ml)以300μL的最终体积进行。在连续搅动下于37℃进行酶反应20小时±1小时。用注射器式滤器(0.20μm)过滤样品用于HPLC分析。HPLC仪由Dionex P580和连接至Dionex RF-2000荧光检测器(λex=333nm;
λem=460nm)和257nm的DionexUVD340U UV检测器的Dionex ASI-100动取样机组成。洗脱是通过nucleosil100-5C18柱(250×4.6mm,5μm粒度;Chrompack),采用流速为0.6mL/min的水/乙腈/乙酸(100:100:1,v/v/v)。将该柱保持在30℃下,并连接至保护柱
(C18,1mm,Optimize technologies)。通过235nm下的紫外光以及荧光(激发波长为278nm,发射波长为440nm)二者来监测OTA及其降解产物。
[0321] 黑曲霉制备物的OTA活性测定法该反应混合物由245μL稀释于50mMMes-NaOH缓冲液(pH7.0)中的OTA(1μg/mL)和5μL样品(黑曲霉发酵液、无细胞提取物、硫酸铵分级分离和色谱后的级分或来自黑曲霉的产品)组成。反应在40℃下进行30分钟至2小时。在95℃下加热5分钟用以终止反应。用注射器式滤器(0.20mm)过滤样品并将5μL注射进HPLC仪中。
[0322] 脂酶和酯酶测定法。使用购自西格玛公司的对硝基苯基丁酸酯(pNPB)作为底物来测定脂酶和酯酶活性。将5微升40mM的pNPB乙腈溶液添加至165μL50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5)和5μL酶溶液并用于测试OTA降解。跟踪410nm下的光密度60分钟。
[0323] 蛋白酶活性测定法(培养皿法)。用装有100mM磷酸氢二钠缓冲液(pH6)中的1%酪蛋白、1%琼脂糖的板确认蛋白酶活性。将板在37℃下温育过夜,通过在装有酶的孔周围显出发白的环来揭示蛋白酶活性。
[0324] 蛋白质浓度测定法。用伯乐公司(Bio-rad)蛋白质测定试剂,根据生产商提供的程序基于Bradford的方法来测定蛋白质浓度。将BSA用作标准品,在595nm下测量微量滴定板中的OD,每份样品一式两份给予。
[0325] 从黑曲霉纯化OTA降解活性
[0326] 样品制备:硫酸铵分级分离。将5克Amano脂酶溶解于100mL50mMTris/HCl缓冲液(pH7.5)中。添加对应于40%饱和度的量的硫酸铵,使晶体溶解。3500rpm下离心10分钟后,收集上清液并添加硫酸铵以达到60%饱和度。通过搅拌使晶体溶解并再次离心该溶液。将对应于来自40%至60%硫酸铵饱和度的沉淀物的离心沉淀物溶解于4×40mL50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(tricine)、1M硫酸铵(pH7)中并用0.22μm过滤器过滤。
[0327] 疏水相互作用色谱(HIC)。将来自硫酸铵分级分离的样品注射并施加至用含有1M硫酸铵的50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(pH7)(缓冲液A)平衡的苯基琼脂糖FF、丁基琼脂糖或辛基琼脂糖CL4B柱。将连接至 纯化仪系统的柱用缓冲液A(10mL/min)洗涤并用线性梯度的50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸(缓冲液B)洗脱结合的蛋白质。收集10mL的级分并用于OTA活性测定法或甲酰胺酶测定法。
[0328] 阴 离子 交 换 色 谱(AEX)。 汇 集 具 有高 OTA转 化 率的 级 分 并 在 于20mMTris-HCl,pH7.5(缓冲液A)中平衡的PD10柱上脱盐。将脱盐的样品施加至在缓冲液A(10ml/min)中平衡的Source Q30柱。用缓冲液A洗涤柱子并用缓冲液A中0-1M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质(缓冲液B与含有1M NaCl的缓冲液A相同)。在该梯度洗脱期间,各级分收集5ml。
[0329] 蛋白质的浓度。将通过阴离子交换色谱获得的具有OTA降解活性的级分用带有再TM生纤维素膜(截留分子量为10kDa)的Amicon Centriprep 浓缩器浓缩。
[0330] 最适pH测定。将5微升酶溶液与245μL1μg/mL的稀释于如下不同缓冲液中的OTA合并:50mM醋酸钠缓冲液(pH4、4.5、5和5.5);50mMMES-NaOH缓冲液(pH6、6.5和7);50mM Tris-HCl缓冲液(pH7.5、8和8.5)。反应在37℃下进行30分钟,通过在95℃下加热
5分钟来终止。
[0331] 最适温度。在最适pH下将5微升酶溶液与245μL OTA1μg/mL混合并在20、30、40、60、70℃下温育30分钟。通过在95℃下加热5分钟来终止反应。
[0332] 温度稳定性。将酶溶液在不同温度(30、40、60、70、80和90℃)下温育1小时,将5μL与245μL OTA1μg/mL混合用于在最适条件下进行赭曲毒素降解反应。通过在95℃下加热5分钟来终止反应。未温育对照。
[0333] SDS-PAGE。为了分离和分析蛋白质,使用了十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。将40微升样品与10μL5x上样缓冲液(含有DDT和SDS),并煮沸5分钟。将20μL上样至NuPAGE4-12%Bis-Tris凝胶(美国英杰公司(Invitrogen,USA))。根据生产商的程序运行电泳。用考马斯亮蓝对凝胶进行染色
[0334] 质谱。用手术刀从凝胶(同上)切取所关注的蛋白质并转移至埃彭道夫管。用酶(主要是胰蛋白酶酶)消化该蛋白质。消化后,提取肽并通过HPLC-MS/MS分析。将MS/MS谱自动搜索蛋白质数据库以进行鉴定和表征。
[0335] 甲酰胺酶和酰胺酶2的抑制测定法。将一片蛋白酶抑制剂混合物(PIC)片剂(德国曼海姆的罗氏应用科学公司(Roche Applied Science,Mannhein,Germany))溶解于1.5mL milliQ水中以获得7x母液。对于甲酰胺酶抑制测定法,不用通常采用的100μL milliQ水,而是将20μL7x PIC母液和80μLmilliQ水与甲酰胺酶活性测定法章节中列出的其他组分混合。对于OTA降解活性,将35μL7x PIC溶液与210μL OTA1μg/mL和5μL酶溶液混合。制备125mM EDTA母液并将可获得10mM和50mM最终浓度的适当体积与OTA1μg/mL和5μL酶混合。对于对照,用milliQ水替代抑制剂溶液进行甲酰胺酶活性测定法或用MES-NaOH pH7缓冲液替代抑制剂溶液进行OTA降解活性测定法。
[0336] 结果
[0337] 实施例1OTA活性筛选
[0338] 研究了包括多种脂酶、蛋白酶和酰胺酶在内的30种酶的降解赭曲毒素A的能TM力(表1)。仅羧肽酶A和来自黑曲霉的脂酶(Amano A)能够分解OTA,如以前所报道的(Pitout,1969;Stander等人,2000)。此外,来自黑曲霉的天冬氨酸蛋白酶pepAd2(丹尼斯克公司)显示了OTA转化活性,但该活性效率低。为了便于比较这三种酶,测定了PEPAd的TM
蛋白质浓度并制备了相同浓度(1mg/ml)的羧肽酶A和Amano 脂酶A的酶溶液。进行降解TM
动力学(图1)。图1显示Amano 脂酶A和羧肽酶A的OTA降解动力学相似。37℃下进行7小时反应后,不可见OTA峰,意味着OTA完全转化。对于PEPAd,即使在反应1天后未达到完TM
全转化。Amano 脂酶A产品为不同酶的混合物,主要活性是脂酶。除了PEPAd,其他黑曲霉天冬氨酸蛋白酶PEPAa、PEPAb和PEPAc(Wang,2010)、猪弹性蛋白酶和酵母羧基肽酶Y全部
2+
显示出一定的对OTA的活性。这是第一次显示除了金属蛋白酶(即羧肽酶A,其为Zn 依赖性蛋白酶)、丝氨酸蛋白酶(弹性蛋白酶)和羧肽酶Y之外的天冬氨酸蛋白酶能够分解OTA。
表1中列出的其他蛋白酶、脂酶和酰胺酶不能分解OTA(数据未示出)。
[0339] 表1.针对赭曲毒素A降解所筛选的酶
[0340]
[0341]
[0342] 实施例2从黑曲霉发酵液或过滤过的发酵液(无细胞)纯化赭曲毒素A降解活性。
[0343] 首先,采用硫酸铵沉淀。将数种浓度的硫酸铵施加至黑曲霉蛋白粗提物。在上清液和离心沉淀物中测定OTA降解活性。通过增加硫酸铵浓度,将OTA降解活性从上清液转移至离心沉淀物。在60%硫酸铵时,全部的降解活性存在于离心沉淀中。这表明,来自40%至60%硫酸铵产生的沉淀物的酶能够水解霉菌毒素。在相同盐浓度(60%)下,离心沉淀物中保留有轻微的脂酶活性(数据未示出)。
[0344] 将来自40%至60%硫酸铵的级分用作起始材料用于进一步的赭曲毒素降解酶纯化。将如上所述的疏水相互作用色谱(HIC)和随后进行的阴离子交换色谱(AEX)用于从OTA降解活性分离脂酶活性。将活性级分悬浮于含有1M(NH4)2SO4的50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸-HCl(pH7.0)(缓冲液A)中。
[0345] 图2A示出了在将从苯基琼脂糖获得级分与OTA反应1小时后获得的OT-α面积百分比。该图显示级分no.51至no.64的OTA降解活性增加,而最高的脂酶/酯酶活性存TM在于no.65-68中。该观察结果表明,赭曲毒素降解活性显然与Amano 脂酶产品中的脂酶/酯酶活性无关(先前已表明OTA降解活性是由于脂酶活性,Stander等人,2000)。降解OTA的蛋白质在90%至100%缓冲液B(50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸-HCl(pH7.0))之间洗脱,从而表明苯基琼脂糖色谱介质显然起到亲和介质的作用。OTA也含有苯基,OTA降解酶必须能够结合来自OTA的或这里使用的分离介质的苯基。就存在于从该步骤获得的所有级分中的脂酶/酯酶活性而言,其在100%缓冲液B时洗脱。这是意料之中的,因为脂酶/酯酶进行脂质和甘油三酯的水解,脂质和甘油三酯不是十分疏水性的底物,因而与像苯基琼脂糖的疏水基质紧密结合。
[0346] 图2B示出了在AEX级分与OTA反应30分钟后获得的OT-α面积的百分比。最高的OTA活性存在于级分no.26中。然而,在这些级分中相对的脂酶活性也是最高的。这表明,AEX步骤不能将脂酶/酯酶与OTA降解活性分离,以前的研究者在他们纯化OTA降解活性的尝试中将AEX用作唯一的色谱步骤(Abrunhosa等人,2007)。
[0347] 概括地说,图2A和2B表明脂酶/酯酶不是如以前推定的那样(Stander等人,2000)是负责降解OTA的酶(图2A),将脂酶/酯酶活性与OTA降解活性分离不能用AEX实现,TM
以前的研究者使用AEX来试图从Amano 脂酶纯化降解OTA的酶(Abrunhosa等人,2007)。
以前的研究者未显示,通常被视为根据蛋白质的疏水性不同来分离蛋白质的疏水相互作用色谱介质的苯基琼脂糖色谱介质可以在这里用作OTA降解活性的亲和分离介质。
[0348] 在用硫酸铵分级分离然后在苯基琼脂糖和AEX上进行HIC/亲和色谱来纯化后,含有OTA降解活性的级分仍具有一定的脂酶/酯酶活性。图4示出了对图2B的AEX纯化程序中获得的OTA活性级分的SDS-PAGE分析结果。可以看出,在凝胶上存在两个主要的带:A和B。通过质谱对那些带进行部分测序,然后在蛋白质数据库中进行同源搜索表明,带A包含至少3种蛋白质,分别对应:
[0349] 1-来自米曲霉的预测乙酰胺酶/甲酰胺酶,45,012Da(27%覆盖度)
[0350] 2-来自烟曲霉(Aspergillus fumigatus)的甲酰胺酶,45,277Da(24%覆盖度)[0351] 3-来自构巢曲霉的甲酰胺酶,44,907Da(20%覆盖度)
[0352] 并且,带B包含至少3种对应如下的蛋白质:
[0353] 1-来自米曲霉的乙醛酸/羟基丙酮酸还原酶,39,603Da(34%覆盖度)
[0354] 2-来自泡盛曲霉(Aspergillus awamori)的乙酰酯酶,32,640Da(9%覆盖度)[0355] 3-来自黑曲霉的内切-1,4-β-木聚糖酶A前体,35,486Da(17%覆盖度)。
[0356] 根据图4中指示的结果,似乎有可能分解OTA的酶是黑曲霉甲酰胺酶。另外鉴定的酶理论上与OTA降解没有关系。对黑曲霉甲酰胺酶的进一步纯化在开始进行。
[0357] 实施例3赭曲毒素A降解酶的改善的纯化
[0358] 进一步改善通过HIC和AEX进行的纯化未能通过使用不同的缓冲剂和不同的梯度程序来实现。使用苯基琼脂糖的纯化可被视为亲和步骤,因为OTA分子具有苯基,然而,杂质具有高度疏水性而紧紧地与苯基琼脂糖介质结合,因而洗脱很晚(图4A)。当采用辛基琼脂糖和丁基琼脂糖时,OTA降解活性级分存在于未吸附的流通级分(flow-through fraction)中。这表明,其具有低的疏水性且其与苯基琼脂糖的紧密结合是因为亲和性质(图4A),而杂质具有高度疏水性,其紧密结合且较晚洗脱(图4B),与苯基-琼脂糖的情形一样。
[0359] 使用硫酸铵分级分离(AS)、苯基-琼脂糖上进行的HIC/亲和色谱(HIC1)、丁基-琼脂糖上进行的HIC(HIC2)以及AEX进一步改善该程序,将活性成分浓缩并用截止分子量为10kDa的分子筛脱盐。将图4上所示的浓缩并脱盐的级分5和6在SDS-PAGE上分析(图5)。从凝胶上分离蛋白质带并用胰蛋白酶消化。将消化物在RP-HPLC上分离并用MS分析以鉴别蛋白质带的身份。
[0360] MS结果表明,在4个纯化步骤后,OTA降解活性不限于一个单个带,而是鉴别了如下酶(以强度次序):甲酰胺酶(51%序列覆盖度)、甲酰胺酶降解产物(由蛋白酶引起的)(30%)、与细菌酰胺酶具有相似性的未注解的黑曲霉蛋白质序列
(An14g02080,XP_001400834)(25%)、谷氨酰转肽酶(17%)和醛糖1-表异构酶(14%)。根据这些结果,所鉴别的最有可能分解OTA的酶被认为是图3和5中的结果所指示的黑曲霉甲酰胺酶,然后是与细菌酰胺酶具有相似性的未注解的黑曲霉蛋白质序列和谷氨酰转肽酶,这三种酶全部具有针对C-N键的活性,OTA分子中存在该键。
[0361] 实施例4所鉴别的可能具有分解OTA的潜能的酶的表征。
[0362] 根据图3、4、5和6的结果,对这两种推定的曲霉菌甲酰胺酶和谷氨酰转肽酶以及假定蛋白An14g02080(XP_001400834)开始进行进一步的研究。
[0363] 以前还未对该推定的曲霉菌起源的甲酰胺酶的生化性质(包括底物特异性)进行表征,但其已从构巢曲霉克隆并表达,如β-半乳糖苷酶活性的活性所间接表明的(Fraser等人,2001)。甲酰胺酶已知涉及乙醛酸代谢和二羧酸代谢以及氮代谢。其在水的存在下将甲酰胺转化为甲酸和氨气(甲酰胺+H2O→甲酸+NH3)。如上面的材料和方法章节中所指出的,用美格兹密公司的甲酸试剂盒测定了甲酰胺酶活性的存在。
[0364] 当用AEX步骤中获得的级分进行该测定法时,在级分25至30中观察到甲酰胺酶TM(图6A)。这是第一次指出,真菌和真菌制备物(包括从黑曲霉制备的Amano 脂酶产品)具有将甲酰胺分解成甲酸和氨气的活性甲酰胺酶。同样重要的是,使用设计用于纯化OTA活性的纯化步骤对甲酰胺活性进行纯化,从而表明真菌甲酰胺酶可分解OTA。当对测试甲酰胺活性的相同级分测定OTA的降解时,级分26至32转化率增加(图6B)。从图6A和图6B可以看出,两种活性存在于相同的级分中。根据数据,可进一步假设以前还未表征的黑曲霉甲酰胺酶或曲霉甲酰胺酶具有OTA降解活性。
[0365] 实施例5携带有构巢曲霉甲酰胺酶基因的黑曲霉转化株中的甲酰胺酶和OTA降解活性的分析
[0366] 分析了黑曲霉甲酰胺酶转化株的甲酰胺酶活性和OTA降解活性。可从表2中看出的,在15个转化株中的12个中检测到甲酰胺酶活性。出乎意料的是,黑曲霉甲酰胺酶明显不能分解OTA,这从具有高的甲酰胺酶活性但具有低的或不具有OTA降解活性的转化株可以看出。这表明,真菌甲酰胺酶可能不具有OTA降解活性,但通过4个纯化步骤与OTA活性一起纯化。
[0367] 有趣的是,通过将外来DNA(如就构巢曲霉甲酰胺酶基因而言)整合进黑曲霉基因组中,本发明人已成功地通过未知的机制产生具有OTA降解活性的转化株,与用于转化黑曲霉的亲本菌株相比其OTA降解活性更高,参见例如转化株7#、2#、8#、11#、15#。注意,16#为野生型(亲本菌株)。对照为不添加发酵液的反应物。将发酵液用于所有这些测定法。反应混合物含有10μl发酵液、50μl OTA(1μg/ml)、100μl磷酸钠(67mM,pH7或pH9)。对于对照,用10μl水代替10μl来自摇瓶发酵罐发酵中的5天期培养物。在反应结束时,添加至160μl乙腈来终止反应,过滤并注射10μl用于HPLC分析。
[0368] 根据曲霉的甲酰胺酶不能分解OTA这一意外的发现,本发明人进行了进一步研究来鉴别OTA降解的第二候选,即在本文中定为酰胺酶2的假定黑曲霉蛋白(An14g02080、XP_001400834),是否具有OTA降解活性。
[0369] 实施例6推定的酰胺酶2基因表达质粒的构建
[0370] 来自黑曲霉的推定的酰胺酶2基因编码480个氨基酸的酰胺酶蛋白(SEQ ID NO:1)。为了构建黑曲霉酰胺酶2基因的重组表达质粒,将两个引物
GGAGATCTATCATGGTCCGCCGAATTG 和 AATCTAGACTAGTGATGGTGATGGTGATGCAGAAAAGGATTACGTG用于Pfu Ultra II PCR反应,该反应使用从黑曲霉UVK143菌株获得的基因组
DNA模板(Ward等人,Appl.Microbiol.Biotechnol.(《应用微生物学和生物技术》),
39:738-743,1993)。该PCR反应使用这两个引物进行30个循环的95℃下30秒、50℃30秒和72℃下1分钟。在72℃下进行5分钟的最后延伸,使反应物冷却至4℃。所得的PCR扩增子的编码区的核苷酸序列(无His标签)以SEQ ID NO:2列出。用Qiagen离心柱纯化该PCR片段。将其用限制性酶BglII和XbaI消化并克隆进已用BglII和XbaI消化过的pGAPT质粒载体(参见例如美国专利no.6,426,410)中。通过DNA测序确认所得的质粒即pGAPT-酰胺酶2(图7中示出)具有插入在黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和塔宾曲霉(A.tubingensis)葡糖淀粉酶终止子之间的包含黑曲霉酰胺酶2的重组基因。对应的所编码的蛋白质序列在SEQ ID No.4中示出,其对应于SEQ ID No.1,不同的是在该蛋白质的c末端添加了六个组氨酸残基来帮助蛋白质纯化。
[0371] 实施例7重组酰胺酶2生产菌株的构建
[0372] 使用PEG介导的原生质体融合转化方案,用pGAPT-酰胺酶2质粒转化黑曲霉的AP4菌株(Berka等人,Gene(《基因》)86:153-162,1990)。该转化方案利用Campbell方法的修改形式(参见Campbell等人,Curr.Genet.(《当代遗传学》)16:53-56(1989)),使用来自哈茨木霉(Trichoderma harzianum)(西格玛公司,L1412)的溶解酶。获得超过一百个转化株,将三十个转化株在MM板上选择。选择对照AP4亲本菌株和十五个转化株先在CMA板上培养,将含有来自CMA板的菌丝体和孢子二者的菌丝体琼脂转移至装有30ml培养基的摇瓶。将转化株在28℃下培养6天。将来自对照AP4菌株和全部十五个转化株的菌丝体离心沉淀物用水洗涤至少一次。将菌丝体离心沉淀物悬浮于CelLytic Y溶胞试剂(西格玛公司,C4482)中。室温下提取细胞内蛋白2小时。将悬浮液离心,将15μl含有提取的细胞内蛋白的上清液用SDS-PAGE凝胶分析(图8)。将培养物发酵液在microfuge中离心10分钟,将15μl上清液(细胞外蛋白)用SDS-PAGE凝胶分析(图8)。
[0373]
[0374] 表3示出了用于在具有30ml培养基的250ml硅化烧瓶中培养黑曲霉及其转化株2
的培养基(/升)。首先将黑曲霉菌株在CMA板中培养3-5天,将2cm 琼脂块转移至烧瓶并
30℃下培养5天。对于野生型(对照菌株或亲本菌株620),补加0.5mg/ml的尿苷。
[0375]
[0376] 可将菌株在CMA板(/升)中培养:
[0377]
[0378] 图8.带有酰胺酶2基因的黑曲霉的细胞内蛋白的SDS-PAGE分析。酰胺酶2的蛋白质带用箭头线条指示。M为分子标记,AP4为黑曲霉亲本菌株。转化株从1至15编号。
[0379] 图9示出了携带有酰胺酶2基因的黑曲霉的细胞外蛋白的SDS-PAGE。酰胺酶2的蛋白质带用箭头线条指示。酰胺酶2带上面的其他主要带是由黑曲霉分泌的α-淀粉酶和葡糖淀粉酶。上样至凝胶的样品是不同转化株的发酵液。
[0380] 为了确认SDS-PAGE上分离的酰胺酶2带确实是酰胺酶基因的产物,将带切出,通过胶内消化用胰蛋白酶消化。将消化物通过RP-HPLC分离并通过质谱分析。这显示了存在于该推定的酰胺酶2序列(SEQ ID NO:1)(图18A)中的4条氨基酸序列。鉴定的四条序列是:
[0381] 1.EALQNGY;
[0382] 2.ALPAGEVLGSY;
[0383] 3.GAGPL;
[0384] 4.SVGPQAPL。
[0385] 实施例8就酰胺酶2的OTA降解和生化、催化参数对酰胺酶2的表征
[0386] 如图10中所示,测定了15个携带有推定的蛋白质编码基因(酰胺酶2)的黑曲霉的转化株加上亲本菌株(野生型)的细胞内和细胞外级分(发酵液)二者分解OTA的能力。图10出人意料地显示,来自Genbank的编码黑曲霉基因的假定蛋白(An14g02080,Acc No.XP_001400834)编码具有OTA降解活性的活性酶,并且在细胞内和细胞外均发现该活性酶。可以看出,最好的转化株是转化株3、4、7、11、13和14,因为在与细胞内或细胞外级分(发酵液)温育后未留下可检测的OTA(即低于2pbb的可检测水平)。与亲本菌株(野生型)黑曲霉相比,转化株8、10和15也具有高许多的OTA降解活性。
[0387] 至少在pH3至9之间在降解OTA方面重组酰胺酶2是活性的。图11显示,在pH7.0下该酶活性最高,其次是pH6和8;pH5和9。
[0388] 从图12可见,重组酰胺酶2明显是热稳定性的,因为当与其中未添加酶的对照相比,在80℃下预温育5-30分钟后超过80%的活性得以保留。将5μl酶加上45μl67mM磷酸钠(pH7.0)的反应混合物在80℃下温育0-30分钟,然后另外添加50μl磷酸盐缓冲液和25μl1μg/ml OTA,并在30℃下温育60分钟。通过添加130μl含有0.2%乙酸(v/v)的乙腈来终止反应。将反应混合物过滤并注射(10μl)用于HPLC分析。Ctrl为其中未添加酰胺酶的对照。
[0389] 此外,在pH6至9之间重组酰胺酶2在70℃下是相当稳定的。该稳定性随着pH降低而降低(图13)。在pH7.0和30℃下测定活性。该预温育混合物含有5μl酰胺酶2混合物(155μg蛋白质/ml)、45μl67mM磷酸盐缓冲液(pH3、4、5、6、7、8和9)。将样品在70℃下预温育30分钟。在冷却至30℃后,添加2μl0.5mg/ml OTA的乙醇溶液和80μl0.2M Mops-NaOH(pH7.0),将该反应物在30℃下温育60分钟。通过添加130μl含有0.2%HAC的乙腈来终止反应,过滤并注射于RP-HPLC上,其中注射5μl来监测剩余的OTA。
[0390] 实施例9从携带酰胺酶2基因的黑曲霉的发酵液纯化重组酰胺酶2mat
[0391] 将具有高OTA活性的转化株13的发酵液(图10)用于通过如下所述的硫酸铵分级分离、苯基琼脂糖上的亲和色谱、丁基-琼脂糖上的HIC和AEX来纯化重组酰胺酶2mat。
[0392] 1)(NH4)2SO4分级分离。通过搅拌向40ml携带黑曲霉酰胺酶2基因的黑曲霉发酵液添加(NH4)2SO4至40%饱和度。以3500rpm离心10分钟后,收集上清液,通过搅拌添加(NH4)2SO4至60%饱和度,并再次离心该溶液。将对应于40至60%(NH4)2SO4饱和度的离心沉淀物溶解于40ml含有1M(NH4)2SO4的50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸-HCl(pH7.0)中并用0.22μm过滤器过滤。
[0393] 2)疏水相互作用/亲和色谱。将来自上面步骤的经过滤的样品上样至苯基琼脂糖FF柱(2.6×10cm)。在用含有1M(NH4)2SO4的三(羟甲基)甲基甘氨酸-HCl(pH7.0)洗涤后,用50mM三(羟甲基)甲基甘氨酸-HCl(pH7.0)中1M至0M(NH4)2SO4的线性梯度,以10ml/min的流速将活性级分洗脱,每管10ml。在 系统上进行纯化。
[0394] 3)阴离子交换色谱。汇集活性级分并在于20mM TrisHCl,pH7.5(缓冲液A)中平衡的PD10柱上脱盐。将脱盐的样品施加至在缓冲液A(10ml/min)中平衡的Source Q15柱。用缓冲液A洗涤柱子并用缓冲液A中0-1M NaCl的线性梯度洗脱结合的蛋白质。在梯度洗脱期间,各级分收集5ml。在SDS-PAGE上分析活性级分(图14A),该分析表明酰胺酶2mat基本上纯化至均质。该活性与SDS-PAGE上分子量刚好低于49kDa的蛋白质带相关(图14)。
通过Maldi-tof测量进行质谱分析表明,该蛋白质带可能具有47214Da(±2%)的质量(图
14B)。对级分12的N末端测序表明,酰胺酶2mat的N末端以STDEAKVTI(SEQ ID NO.33)开始。具有6个组氨酸残基的全长480aa酰胺酶2据估计分子量为51,983Da,而在C末端具有6个组氨酸残基的N末端截短42个氨基酸的酰胺酶2分子量为47,338Da。这表明,分泌进黑曲霉发酵液中的酰胺酶2(即酰胺酶2mat)是已被培养液中的信号肽酶或其他肽酶加工而在酰胺酶2sig中的Ala-Ser的肽键之间裂解产生的酰胺酶2。
[0395] 实施例10酰胺酶2的底物特异性
[0396] Km/Vm测定:
[0397] 通过使用Lineweaver-Burk计算方法,使用酰胺酶2mat的AEX步骤中获得的级分,该酶降解OTA的动力学常数Km和Vm分别0.29μM/min和13μM。
[0398] 赭曲毒素B降解:
[0399] 将在AEX后获得的酰胺酶2mat的酶溶液以相同的浓度在最适条件下对赭曲毒素B进行测试。相比于OTA,对赭曲毒素B的降解速率为8%。
[0400] 实施例11纯酰胺酶2mat分解OTA的活性
[0401] 从携带酰胺酶2基因的黑曲霉的发酵液纯化的酰胺酶2mat随其浓度变化的赭曲毒素A(OTA)降解活性在图15中示出。从图15中可以看出,OTA的降解是酰胺酶2mat浓度依赖性的。还可以看出,与浓度为160ng/ml的OTA的酰胺酶2mat一起30分钟后,OTA降低83%。根据图15的线性区,在1μg/ml反应混合物的OTA浓度、pH7.0和40℃下,酰胺酶2mat的比活性计算值为每毫克蛋白质每分钟催化900纳摩尔OTA。图15的反应在0.1Mops-NaOH(pH7.0)中和40℃下进行30分钟,然后添加等体积的含有0.2%乙酸的乙腈来终止该反应,并如“材料和方法”章节中所述,在C18柱上进行RP-HPLC分析。
[0402] 实施例12黑曲霉中存在的细胞内和细胞外酰胺酶2之间对Ca2+的敏感性的差异。
[0403] 据观察,从AmanoTM脂酶产品或从携带有酰胺酶2基因的转基因黑曲霉的发酵液纯化的酰胺酶2(即酰胺酶2mat)水解OTA的活性均被8mMCaCl2抑制了约40%的活性(图16),而转基因黑曲霉的酰胺酶2细胞内级分(酰胺酶2sig)未明显受8mM的CaCl2抑制(图17)。2+
结果表明,失去酰胺酶2的N末端导致对Ca 抑制敏感。通过以等摩尔量添加包括EDTA在
2+ TM
内的二价螯合剂克服了Ca 引起的抑制。还已知的是,Amano 脂酶产品中的OTA降解活性对EDTA敏感。该实施例表明,添加诸如EDTA之类的螯合剂可有助于酰胺酶2在含有二价离子中的体系中的使用。柠檬酸及其他有机酸如丙酸广泛用作饲料添加剂并且可螯合二价离子或三价离子,从而减轻它们对酰胺酶2mat的抑制。另一方面,额外的EDTA也抑制重组酰胺酶2mat(数据未示出)。这些结果说明,酰胺酶2mat可用于使OTA去毒,但由于其对二价或三价金属离子以及对诸如EDTA之类的螯合剂的敏感性而具有一定的局限性,而发现酰胺酶2sig对二价或三价金属离子和对像EDTA之类的螯合剂敏感性较低(见下文),从而表明全长酰胺酶2比存在于黑曲霉发酵液中的分泌的或经加工的或成熟的酰胺酶2(即酰胺酶2mat)重要。
[0404] 实施例13从黑曲霉的细胞内级分提取的酰胺酶2(酰胺酶2sig)对OTA的降解。
[0405] 该实施例表现了使用敏感性较低形式的酰胺酶2即酰胺酶2sig的优点。可以从图17看出,与酰胺酶2mat(图16)相比,20mM CaCl2或20mM EDTA对酰胺酶2sig不具有抑制性。这为在包含螯合剂的添加剂中使用酰胺酶2sig来使OTA去毒提供了明显的优势。该反应物含有60μlmops-NaOH(0.2M,pH7.0)、20mM CaCl2、20mM EDTA、从携带有酰胺酶基因的黑曲霉细胞提取的酰胺酶2sig(0.46μg蛋白质)、2μl25μg/ml OTA和加至120μl的最终体积的水。该反应在37℃下进行30分钟,通过添加150μl含有0.2%乙酸的乙腈终止该反应。注射5μl在C18柱上用RP-HPLC对OTA及其产物OT-α(=OTα)进行分析。阳性对照(PC)除了缓冲液、酰胺酶和OTA外不含有添加剂。空白对照仅含有缓冲液和OTA。
[0406] 实施例14通过从黑曲霉的细胞内级分提取的酰胺酶2sig(酰胺酶2sig)降解玉米粉和DDGS(干酒糟及可溶物)中的OTA。
[0407] 玉米是OTA的主要携带物,在生物乙醇生产中其可进一步被带至DDGS中并在其中浓缩。玉米和DDGS被广泛用作饲料成分。DDGS中的霉菌毒素水平是限制可添加至饲料的DDGS量的常见因素。这里的实施例表明了酰胺酶2sig在降解玉米粉和DDGS中的OTA的能力:
[0408] 对于玉米粉,向50mg玉米粉添加210μl水、8μl OTA(25μg/ml)和20μl酰胺酶2sig(3.1μg蛋白质),混合并在37℃下温育22小时。OTA浓度从开始时的800ppb降低至最后的14ppb。上面的材料和方法章节中描述了OTA的HPLC分析。
[0409] 对于DDGS,将1g悬浮于10ml水中,用NaOH将pH调节至6.7。向210μl该浆料添加8μl OTA(25μg/ml)和20μl酰胺酶2sig(3.1μg蛋白质),混合并在37℃下温育22小时。OTA浓度从开始时的800ppb降低至最后的5ppb。上面的材料和方法章节中描述了OTA的HPLC分析。
[0410] 实施例15通过酰胺酶2mat降解奶中的OTA。
[0411] 已知的是,包括奶和奶酪在内的许多食品可被OTA污染。该实施例测试了用酰胺酶2mat降解奶中的OTA。
[0412] 将 0.15ml来 自 丹 麦 奥 尔 胡 斯 的 阿 拉 福 兹 公 司 (Arla Foods Amba,Aarhus,Denmark)的低脂奶(100ml中含1.5%脂肪,蛋白质3.4g,碳水化合物4.7g,钙120mg,磷95mg)、3μl OTA(2.5μg/ml)、7.5μl含有0.22μg蛋白质的纯化的酰胺酶2mat(来自携带酰胺酶2基因的黑曲霉的发酵液)混合并在40℃下反应2.5小时。2.5小时温育后,OTA从开始47ppb降低至不可检测的水平(<2ppb)。上面的材料和方法章节中描述了OTA的HPLC分析。
[0413] 实施例16酰胺酶2mat对玉米粉中的OTA的去毒
[0414] 1.5ml埃 彭 道 夫 管 (C1-3)中 的 反 应 混 合 物 包 含 60mg玉 米 粉、200μlMops-NaOH(0.2M pH7.0)、40μl酰胺酶2混合物(其为具有酰胺酶2基因的黑曲霉转化株3、4、7、8、10、11、13、14和15的等体积发酵液的混合物)、20μl OTA(0.5mg/ml)。三种组分的总体积为260μl;最终的OTA为38μg/ml或38ppm(ppm,份/一百万份)。对照:
对照管(C-4-6)与C1-3相同,不同的是酰胺酶制备物(发酵液)用水替代。
[0415] 反应在30℃下伴随摇动进行20小时,然后添加等体积的含有0.2%乙酸的乙腈260μl以终止该反应并提取OTA。离心并过滤后,用HPLC分析滤液。HPLC结果表明,剩余的OTA不可检测(低于2ppb),从而表明酰胺酶2mat能够将玉米粉中的OTA从38ppm减少至低于2ppb。
[0416] 实施例17酰胺酶2mat对基于玉米-大豆的饲料中的OTA的去毒。
[0417] 酰胺酶2mat与OTA污染的基于大豆-玉米的饲料(其组成在表3中给出)的测试与用于玉米粉的测试完全一样,即管S1-3(实验管)装有发酵液而对于管S5-6(对照)用水代替发酵液。温育20小时后,OTA水平从38ppm降低至6.6ppm,降低6倍或82%。
[0418] 表3.所用的基于玉米/大豆的饲料的组成
[0419]玉米膳食成分 百分比
玉米 60.01%
大豆粉48 31.52%
大豆油 4.00%
盐 0.40%
DL-甲硫氨酸 0.20%
石灰石 1.16%
磷酸二钙 1.46%
VIT/MIN 1.25%
总计 100%
[0420] 实施例18酰胺酶2的晶体结构解析
[0421] 如表4中所示,获得了15个酰胺酶2的晶体。
[0422] 对晶体AM7和AM15进行x射线衍射测定,这两个酰胺酶2(氨基酸45-480)晶体的结构以 分辨率解析。
[0423] 据显示,酰胺酶2具有类似于图20中所示的Tim桶结构的结构和如图21中所示的活性位点。AM7晶体组的解析的晶体结构的数据汇总在下面列出。
[0424] 数据集:am7
[0425]
[0426] 利用Phaser并分析5个最相似结构的系综来解析结构。
[0427] 据发现,酰胺酶2(SEQ ID NO:1)的活性位点包括至少如下残基:His111、His113、His191、Lys246、His287、His289、His307、Asp378和Val253。其可容纳至少两个金属离子用于催化/结构目的,从而形成所谓的双核金属中心。
[0428] 四聚体形式的酶的一个单体的坐标在图22中示出。
[0429]
[0430] 表5.酰胺酶2的结构元件
[0431] 颜色编码:白色=较小的夹心结构域,深灰色=催化桶结构域,浅灰色=桶折叠股和桶螺旋;螺旋α7也可被视为桶螺旋
[0432]
[0433] 实施例19来自真菌物种禾生小丛壳M1.001和金龟子绿僵菌ARSEF23的酰胺酶在里氏木霉中的表达。
[0434] 为了表达来自禾生小丛壳M1.001和金龟子绿僵菌ARSEF23的酰胺酶,由生命技术公司(德国)将这两种基因合成为针对在里氏木霉中表达而经密码子优化的序列并克隆进pDonor221载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)中。在每个基因的3'编码区添加6个组氨酸密码子用于纯化目的。为了使这两种酰胺酶在里氏木霉中表达,通过重组反应将它们的编码序列克隆进Gateway相容目的载体pTTT-pyrG13(在WO2010141779A1和PCT/US10/57531中描述)中。该载体含有里氏木霉cbhI衍生的启动子和终止子区(使得所关注基因能进行强的诱导型表达)、构巢曲霉amdS和pyrG选择标记(使得转化株能以乙酰胺作为唯一的氮源或在不存在尿苷时或这两种情况下生长)和里氏木霉端粒区(使得能在真菌细胞中维持非染色体质粒)。cbhI启动子与终止子区被旁侧为基于噬菌体λ的特异性重组位点attR1、attR2的氯霉素抗性基因CmR和致死性大肠杆菌基因ccdB分隔开。这种构造使得能直接选择含有通过 重组反应而处于正确取向
的cbhI调控元件控制下的所关注基因的重组株。
TM
[0435] 使用LR clonase II酶混合物根据英杰公司的方案,在每种酰胺酶基因的pEntry克隆和目的载体pTTT-pyrG13之间进行LR重组反应。如供应商(英杰公司)所描述的,将所产生的重组产物转化至大肠杆菌MaxEfficiency DH5α,在含有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT琼脂板(16g/L细菌用胰蛋白胨(Difco,USA)、10g/L细菌用酵母提取物(Difco,USA)、
5g/LNaCl、16g/L细菌用琼脂(Difco,USA))上选择含有表达构建体pTTT-pyrG13-酰胺酶禾生小丛壳和pTTT-pyrG13-酰胺酶金龟子绿僵菌的克隆。在将细菌培养物在含有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中培养后,将分离的质粒用于限制性酶切分析并将具有正确限制性酶切特征的克隆用于转化四种主要的纤维素酶cbhI、cbhII、eglI、eglII缺失的里氏木霉2830pyrG缺陷菌株(WO2010141779A1)。最后的表达质粒pTTT-pyrG13-酰胺酶禾生小丛壳和pTTT-pyrG13-酰胺酶金龟子绿僵菌在图23-25中示出。
[0436] 如所指明的,使用稍作修改的PEG-原生质体方法,将0.5-2μg每种表达质粒转化进里氏木霉中。对于原生质体制备,伴随以150rpm摇动,将孢子在木霉基本培养基MM(20g/L 葡 萄 糖、15g/L KH2PO4,pH4.5、5g/L(NH4)2SO4、0.6g/L MgSO4x7H2O、0.6g/L CaCl2x2H2O、1ml1000X里氏木霉痕量元素溶液{5g/L FeSO4x7H2O、1.4g/L ZnSO4x7H2O、1.6g/LMnSO4xH2O、
3.7g/L CoCl2x6H2O})中在24℃下培养16-24小时。通过离心收获萌发的孢子并用50mg/ml Glucanex G200(瑞士诺维信公司)溶液处理以裂解真菌细胞壁。通过标准方法对原生质体进行进一步制备,如 等人[Gene(《基因》)61(1987)155-164]所述。
[0437] 大体来讲,用2ml的25%PEG溶液处理总体积为200μl的含有大约1μg DNA和7
1-5x10 个原生质体的转化混合物,用2体积1.2M山梨醇/10mM Tris,pH7.5/10mM CaCl2溶液稀释,与含有1M山梨醇和20mM乙酰胺的3%选择顶层琼脂糖MM(与上文所述相同的基本培养基,但是用乙酰胺替代(NH4)2SO4)相混合,并倾倒于含有乙酰胺的2%选择琼脂糖上。
将板在28℃下温育5-7天,然后转化株生长并开始孢子形成。
[0438] 将从转化板收获的孢子混合物(106个孢子/ml)用于接种装有生产培养基的摇瓶(/1L):甘氨酸生产培养基(4.7g/L(NH4)2SO4、33g/L1,4-哌嗪双(丙磺酸),pH5.5、6.0g/L甘氨酸、5.0g/L KH2PO4、1.0g/L CaCl2x2H2O、1.0g/L MgSO4x7H2O、2.5ml/L的400X里氏木霉痕量元素、20g/L葡萄糖、6.5g/L槐糖)。作为对照,在相同的条件下但存在10mM尿苷,培养里氏木霉2830接受株。在30℃和200rpm下发酵5天后,收获培养物并将细胞外和细胞内提取物二者进行酶分析。
[0439] 实施例20.米曲霉酰胺酶在黑曲霉GICC#2445菌株中的表达
[0440] 为了在黑曲霉中表达来自米曲霉的推定的酰胺酶基因,使用该基因特异性的引物从米曲霉RIB40基因组DNA(获自美国真菌遗传资源保藏中心(Fungal Genetics Stock Collection,FGSC,USA))扩增酰胺酶编码序列,所述引物在5'和3'端具有attB1和attB2位点以用于通过Gateway方法进行后续克隆。此外,反向引物含有编码6xHis的三联体以便于纯化所表达的蛋白质。
[0441] 使用如下引物组:
[0442] 正向引物5’GGGACAAGTTTGTACAAAAAAGCAGGCTCACCATGCACCGGATGCTCACAGACGACAGAC3’
[0443] 反向引物5’ACCACTTTGTACAAGAAAGCTGGGTCTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGTGATTTAATCAGCATGCCGCCACGC3’。
[0444] 所有PCR反应均用高保真Phusion DNA聚合酶(Finnzymes OY公司,芬兰埃斯波(Espoo,Finland))在供应商推荐的标准条件下扩增。在0.8%琼脂糖凝胶上分离所扩增的DNA片段后,将其用 ExtractPCR clean-up试剂盒(Macherey-NagelGmbH&co.KG,德国杜仑(Duren,Germany))纯化,根据供应商的推荐将150ng与pDonor221载体(美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)重组。在含有50μg/ml卡那霉素的2xYT琼脂板上选择携带含有米曲霉酰胺酶的pEntry克隆的大肠杆菌DH5α菌落。通过其限制性酶切消化特征分析分离自细菌细胞的质粒的插入物的存在,并用ABI3100序列分析仪(应用生物系统公司(AppliedBiosystems))通过序列分析来检验。根据美国加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司的方案,通过后续的Gateway LR反应,将所得的pEntry-酰胺酶米曲霉质粒用于克隆进如专利US07459299中所述的目的载体pRAXdest2中。如供应商(英杰公司)所述,将所形成的重组产物转化至大肠杆菌Max Efficiency DH5α,在含有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT琼脂板(16g/L细菌用胰蛋白胨(Difco,USA)、10g/L细菌用酵母提取物(Difco,USA)、5g/LNaCl、16g/L细菌用琼脂(Difco,USA))上选择含有表达构建体pRAX-酰胺酶米曲霉(图25)的克隆。在含有100μg/ml氨苄青霉素的2xYT培养基中培养细菌培养物后,将分离的质粒用于进行限制性酶切分析,然后用ABI3100序列分析仪(应用生物系统公司)测序。除了细菌序列之外,最终的表达质粒pRAX2-酰胺酶米曲霉还含有处于黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和终止子的控制之下的米曲霉酰胺酶编码区、作为选择标记的构巢曲霉pyrG基因和用于在真菌细胞中自主复制的构巢曲霉AMA1序列。
[0445] 使用本领域已知的或专利US07459299中描述的普通转化程序,将0.5-2ug该质粒转化进杰能科公司开发的黑曲霉泡盛变种(A.niger var awamori)GICC#2445菌株中。该菌株缺失内源性的葡糖淀粉酶glaA基因且在pyrG基因中带有突变从而使得能针对尿苷营养型选择转化株。将黑曲霉转化株在MM培养基(与用于里氏木霉转化的相同的基本培养基,但将10mMNH4Cl而不是乙酰胺用作氮源)上37℃下培养4-5天,将来自不同转化板的6
总孢子群体(10 个孢子/ml)用于接种摇瓶,该摇瓶装有生产培养基(/1L):12g胰蛋白胨;
8g大豆蛋白胨;15g(NH4)2SO4;12.1gNaH2PO4xH2O;2.19g Na2HPO4x2H2O;1g MgSO4x7H2O;1ml Tween80;
[0446] 150g麦芽糖;pH5.8。在30℃和200rpm下发酵5天后,收获培养物并将细胞外和细胞内提取物二者进行酶分析。
[0447] 实施例21.来自三种另外的真菌的酰胺酶用于降解赭曲毒素
[0448] 来自禾生小丛壳(GMGM)、金龟子绿僵菌和米曲霉的推定的酰胺酶序列均显示出赭曲毒素A降解活性。
[0449] 表6示出了在里氏木霉和黑曲霉中胞内表达的来自禾生小丛壳、金龟子绿僵菌和米曲霉的三种真菌酰胺酶的活性。将OTA用作底物的反应混合物由75μl磷酸盐(67mM,pH7)、5μl OTA(2.4μg/ml)和20μl细胞内无细胞级分。反应在23℃下进行17小时,通过添加0.15ml乙腈终止反应,使用5μl的注射体积进行HPLC分析。
[0450] 表6
[0451]
[0452] 表中的数据表明,来自禾生小丛壳的酰胺酶对赭曲毒素具有最高活性,而来自米曲霉的酰胺酶对该底物具有较低的活性。
[0453] 实施例22推定的酰胺酶序列的序列比较
[0454] 用AlignX VectorNTI程序(英杰公司)采用默认参数(空位开放罚分-10,空位延伸罚分0.1),对全长的多肽序列进行序列比较。从表7中可以看出,该推定的酰胺酶可具有低的总体同源性。然而,如从图26可以看出的,SEQ ID NO:5-11、13、14和15的全部多肽与酰胺酶2(SEQ ID NO:1和3)具有相同的基序。
[0455] 将这些序列用Multalin版本5.4.1(F.CORPET,1988,Nucl.Acids Res.(《核酸研究》),16:10881-10890)进行比对。所用的参数为:blosum62,空位权重:12,空位长度权重:2,共有序列水平:高=90%低=50%,共有序列符号:!为IV中的任一者,$为LM中的任一者,%为FY中的任一者,#为NDQEBZ中的任一者。序列及它们的网站登录号(在括号中)的描述:
[0456] 此外,如实施例21(表6)中所示,SEQ ID NO:13-15具有赭曲毒素降解活性。
[0457] 表7
[0458]序列ID NO 与SEQ ID NO:1(全长)的同一性百分数
SEQ ID NO:5 41.8%
SEQ ID NO:6 42.4%
SEQ ID NO:7 42.4%
SEQ ID NO:8 40.7%
SEQ ID NO:9 36.5%
SEQ ID NO:10 28.2%
SEQ ID NO:11 36.5%
SEQ ID NO:13 56.1%
SEQ ID NO:14 53.4%
SEQ ID NO:15 34.6%
[0459] 11条序列的共同序列基序具有如下共有序列:
[0460] 1)l/m-P-G-l/m-w/i-D-c/v/s/a-H-x-H-f/y/l-xG,其中两个His残基是在活性位点;
[0461] 2)G-y/f-T;
[0462] 3)G-t/a/s/v/r-i/f/a-x-G-P;
[0463] 4)G-H-g/s-D,其中His残基是在活性位点;
[0464] 5)D-G-v/e-x-e/d/g-C-x-x-a/g/t-v/a-R-x-q/m/a-l/i/v-R-r/h/c-g/n-A-k/r/t/e/d-x-I-K,其中Lys残基是在活性位点
[0465] 6)G-G-V-l/m/v/g-S-x-x-D-x-P,其中Val残基是在活性位点;
[0466] 7)V-a/s/h-A-H-c/v/a-h/q-G-k/r-x-G,其中两个His残基是在活性位点;
[0467] 8)H-g/v/a-s/t/i-y/f/e-l/a/i-D,其中His残基是在活性位点;
[0468] 9)G-V-x-I-a/v-l/a-G-T-D,其中Asp残基是在活性位点。
[0469] SEQ ID NO:1是来自黑曲霉的酰胺酶2,SEQ5是来自黑曲霉的假定蛋白(XP_001400981),SEQ ID NO:6是来自黄曲霉的假定蛋白(XP_002385313),SEQ ID NO:7是来自柄篮状菌的假定蛋白(XP_002477972),SEQ ID NO:8是来自粗糙脉孢菌的假定蛋白(XP_962238),SEQ ID NO:9是来自玫瑰孢链霉菌的推定酰胺水解酶(ZP_04712156),SEQ ID NO:10是来自莱廷格热孢菌的推定酰胺水解酶(YP_001470371),SEQ ID NO:11是来自砂嗜盐产孢菌的推定酰胺水解酶(YP_001536995),SEQ ID NO:13是来自禾生小丛壳的推定酰胺水解酶(EFQ25792),SEQ ID NO:14是来自金龟子绿僵菌的推定酰胺水解酶(EFZ00058),SEQ ID NO:15是来自米曲霉的假定蛋白(XP_001826758)。
[0470] 实施例23SEQ ID NO:1与具有赭曲毒素降解活性的羧肽酶的序列比较
[0471] 已知有两种具有低赭曲毒素降解活性的羧肽酶,即牛羧肽酶A和酵母羧肽酶Y(Luís Abrunhosa,Robert R.M.Paterson和Armando Biodegradation ofOchratoxin A for Food and Feed Decontamination(对赭曲毒素进行生物降解以使食品和饲料去污染),Toxins(《毒素》)2010,2,1078-1099)。
[0472] 已确认了这些酶的赭曲毒素降解活性。然而,可从图27看出,这些酶与SEQ ID NO:1不具有同源性并且不含有与赭曲毒素降解能力相关的9个基序中的任一者。此外,这些酶不具有酰胺酶类型的Tim桶结构。
[0473] 序列表
[0474] SEQ ID NO:1
[0475] 来自黑曲霉的酰胺酶2sig
[0476]
[0477] SEQ ID NO.2
[0478] 序列类型:DNA;DNA名称:含有酰胺酶2基因的DNA,长度:1443,生物体:黑曲霉[0479] ATGGTCCGCC GAATTGCTTC AGCTACACCT ATGGTGCAATCGCCCATGTC GCCATTGGGC ACAACATACT GCGTCCGTCCTAATCCTGTT TCACTGAATC TTCAAAGAAG ACCTCTCGTGATCGCATCAA CAGACGAGGC CAAGGTCACT ATAATATATGCCGGACTATT AATCCCTGGC GACGGAGAACCTCTGCGCAATGCTGCCCTA GTCATCAGCG ATAAGATCAT CGCGTTCGTTGGATCCGAAG CCGACATCCC TAAGAAATAC CTCCGGTCCACGCAGTCTAC TCATCGTGTC CCCGTGCTCA TGCCTGGTTTGTGGGATTGC CACATGCATT TTGGCGGGGA TGACGATTATTACAACGATT ATACATCTGG TCTGGCCACT
CATCCAGCATCATCAGGTGC TCGACTAGCC CGTGGTTGCT GGGAAGCATTGCAGAATGGG TATACATCCT ACCGCGACCT AGCCGGATACGGGTGCGAGG TCGCAAAGGC GATCAATGAT GGCACTATCGTTGGTCCAAA CGTGTACTCG TCTGGCGCTG CACTCAGTCAGACAGCTGGA CACGGCGATA TCTTCGCTCT
TCCAGCAGGCGAAGTACTGG GGAGTTATGG AGTAATGAAC CCACGCCCTGGGTACTGGGG GGCAGGGCCG CTATGTATCG CCGATGGCGTAGAGGAGGTC CGACGAGCAG TGAGGTTGCA GATCCGTCGCGGTGCAAAGG TTATCAAAGT GATGGCCTCT GGGGGTGTCATGTCGCGAGA CGATAATCCC AACTTTGCAC
AGTTCTCTCCAGAAGAACTG AAGGTGATAG TGGAAGAGGC GGCTCGACAGAACCGGATCG TTTCTGCACA TGTGCATGGC AAGGCGGGGATTATGGCTGC TATCAAAGCA GGCTGCAAGA GTCTGGAGCATGTGTCTTAT GCTGACGAGG AGGTCTGGGA GCTCATGAAAGAGAAGGGAA TTTTGTATGT GGCCACACGC
TCGGTTATTGAAATCTTTCT GGCTAGTAAT GGAGAGGGGT TGGTGAAAGAGTCGTGGGCC AAGTTGCAGG CCCTTGCCGA TTCGCATTTGAAAGCTTATC AGGGAGCTAT TAAGGCGGGT GTTACCATTGCGTTGGGAAC GGATACCGCC CCCGGTGGTC CTACCGCACTTGAGTTGCAG TTTGCCGTCG AGAGAGGAGG
TATGACGCCGTTGGAGGCCA TCAAAGCCGC AACTGCGAAC GCTCCCCTGTCAGTTGGTCC ACAAGCACCG TTGACGGGTC AGCTTCGCGAGGGGTATGAG GCAGATGTGA TTGCGTTGGA GGAGAATCCATTGGAGGACA TCAAAGTCTT TCAGGAGCCG AAGGCAGTTACCCACGTCTG GAAGGGAGGG AAACTGTTCA
AAGGTCCAGGTATTGGTCCG TGGGGAGAAG ATGCACGTAA TCCTTTTCTGTAG
[0480] SEQ ID No3
[0481] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:酰胺酶2mat,长度:438,生物体:黑曲霉[0482] SerThrAspGluAlaLysValThrIleIleTyrAlaGlyLeuLeuIleProGlyAspGly
[0483] GluProLeuArgAsnAlaAlaLeuValIleSerAspLysIleIleAlaPheValGlySer
[0484] GluAlaAspIleProLysLysTyrLeuArgSerThrGlnSerThrHisArgValProVal
[0485] LeuMetProGlyLeuTrpAspCysHisMetHisPheGlyGlyAspAspAspTyrTyrAsn
[0486] AspTyrThrSerGlyLeuAlaThrHisProAlaSerSerGlyAlaArgLeuAlaArgGly
[0487] CysTrpGluAlaLeuGlnAsnGlyTyrThrSerTyrArgAspLeuAlaGlyTyrGlyCys
[0488] GluValAlaLysAlaIleAsnAspGlyThrIleValGlyProAsnValTyrSerSerGly
[0489] AlaAlaLeuSerGlnThrAlaGlyHisGlyAspIlePheAlaLeuProAlaGlyGluVal
[0490] LeuGlySerTyrGlyValMetAsnProArgProGlyTyrTrpGlyAlaGlyProLeuCys
[0491] IleAlaAspGlyValGluGluValArgArgAlaValArgLeuGlnIleArgArgGlyAla
[0492] LysValIleLysValMetAlaSerGlyGlyValMetSerArgAspAspAsnProAsnPhe
[0493] AlaGlnPheSerProGluGluLeuLysValIleValGluGluAlaAlaArgGlnAsnArg
[0494] IleValSerAlaHisValHisGlyLysAlaGlyIleMetAlaAlaIleLysAlaGlyCys
[0495] LysSerLeuGluHisValSerTyrAlaAspGluGluValTrpGluLeuMetLysGluLys
[0496] GlyIleLeuTyrValAlaThrArgSerValIleGluIlePheLeuAlaSerAsnGlyGlu
[0497] GlyLeuValLysGluSerTrpAlaLysLeuGlnAlaLeuAlaAspSerHisLeuLysAla
[0498] TyrGlnGlyAlaIleLysAlaGlyValThrIleAlaLeuGlyThrAspThrAlaProGly
[0499] GlyProThrAlaLeuGluLeuGlnPheAlaValGluArgGlyGlyMetThrProLeuGlu
[0500] AlaIleLysAlaAlaThrAlaAsnAlaProLeuSerValGlyProGlnAlaProLeuThr
[0501] GlyGlnLeuArgGluGlyTyrGluAlaAspValIleAlaLeuGluGluAsnProLeuGlu
[0502] AspIleLysValPheGlnGluProLysAlaValThrHisValTrpLysGlyGlyLysLeu
[0503] PheLysGlyProGlyIleGlyProTrpGlyGluAspAlaArgAsnProPheLeu
[0504] SEQ ID No.4
[0505] 黑曲霉的酰胺酶2+c末端的6个组氨酸
[0506] MVRRIASATPMVQSPMSPLGTTYCVRPNPVSLNLQRRPLVIASTDEAKVTIIYAGLLIPGDGE[0507] PLRNAALVISDKIIAFVGSEADIPKKYLRSTQSTHRVPVLMPGLWDCHMHFGGDDDYYNDYTS[0508] GLATHPASSGARLARGCWEALQNGYTSYRDLAGYGCEVAKAINDGTIVGPNVYSSGAALSQTA[0509] GHGDIFALPAGEVLGSYGVMNPRPGYWGAGPLCIADGVEEVRRAVRLQIRRGAKVIKVMASGG[0510] VMSRDDNPNFAQFSPEELKVIVEEAARQNRIVSAHVHGKAGIMAAIKAGCKSLEHVSYADEEV[0511] WELMKEKGILYVATRSVIEIFLASNGEGLVKESWAKLQALADSHLKAYQGAIKAGVTIALGTD[0512] TAPGGPTALELQFAVERGGMTPLEAIKAATANAPLSVGPQAPLTGQLREGYEADVIALEENPL[0513] EDIKVFQEPKAVTHVWKGGKLFKGPGIGPWGEDARNPFLHHHHHH
[0514] SEQ ID No.5
[0515] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:420,生物体:黑曲霉
[0516] MetHisArgProLeuThrAspSerThrPheTyrArgIleAsnAlaAspIleLeuIlePro
[0517] GlyArgGlyAlaProIleAlaArgGlyAlaValValTrpLysSerLysThrIleLeuTyr
[0518] SerGlyProGlnHisGluValProValGluTyrGlnAspAlaValThrThrHisValPro
[0519] ValAlaMetProGlyMetTrpAspCysHisIleHisPheLeuGlyAlaThrAlaAlaThr
[0520] MetAspSerIleValAsnThrProGlnAlaLeuAlaGlyAlaArgSerValProTyrLeu
[0521] TyrAlaThrIleIleAlaGlyPheThrSerValArgGluValGlyGlyTyrGlyCysGlu
[0522] LeuAlaLysValIleAspGluGlyArgIleProGlyProThrIleTyrGlyAlaHisSer
[0523] AlaIleSerMetThrAlaGlyHisGlyAspValHisGlyValAsnProGluGlyLeuArg
[0524] AspLeuCysThrHisGlyLeuProLeuThrIleAlaAspGlyValProGluCysLeuGln
[0525] AlaValArgLysGlnLeuArgHisGlyAlaArgIleIleLysValCysAlaSerGlyGly
[0526] ValValSerAlaIleAspAspProGlnHisGlnGluPheSerPheGluGluLeuLysAla
[0527] IleValAspGluAlaAlaArgAlaArgArgValValAlaAlaHisCysHisGlyLysAla
[0528] GlyIleMetAsnAlaLeuArgAlaGlyCysArgThrIleGluHisGlySerTyrLeuAsp
[0529] GluGluAlaIleAspLeuMetLeuGluLysGlyAlaMetLeuValAlaThrArgSerVal
[0530] IleGluSerGlyLeuAlaMetArgAspLeuPheThrProGlySerTyrGlnLysLeuLeu
[0531] GluValAlaAspThrHisLysArgAlaTyrGluLeuAlaValArgArgGlyValProIle
[0532] AlaLeuGlyThrAspGlnPheIleSerSerAspAsnProAlaLeuGlyTyrGlyArgAsn
[0533] GlyLysGluLeuValTyrAlaValAlaAlaGlyMetThrProLeuAlaAlaIleGluAla
[0534] AlaThrAlaAsnGlyProLeuThrLeuGlyAspGlnAlaProLysSerGlyGlnLeuArg
[0535] GluGlyPheAspAlaAspIleIleAlaLeuThrAlaAsnProLeuGluAsnIleIleVal
[0536] ValSerAspProLysAsnValThrHisValTrpArgTyrGlyLysLeuValLysSerAsn
[0537] SEQ ID NO.6
[0538] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:419,生物体:黄曲霉
[0539] MetHisArgMetLeuThrAspAspArgLeuTyrArgValAspAlaAspLeuLeuIlePro
[0540] GlyLysGlyAspProIleProHisGlyAlaValValTrpGlnCysLysThrIleArgTyr
[0541] AlaGlyProArgSerGluValProAlaGluPheGlnGlyAlaThrThrThrHisValPro
[0542] ValValMetProGlyMetTrpAspCysHisIleHisPheLeuGlyAlaThrAlaAlaThr
[0543] MetAsnAlaIleValAspThrProGlnAlaLeuAlaGlyAlaArgSerValProAspLeu
[0544] HisAlaThrValMetAlaGlyPheThrSerValArgGluValGlyGlyTyrGlyCysAsp
[0545] LeuAlaLysAlaValGlyGluGlyArgIleProGlyProAsnIleTyrSerSerHisSer
[0546] AlaIleSerMetThrAlaGlyHisGlyAspValHisGlyValHisArgAspSerLeuLeu
[0547] AspLeuCysAlaHisGlyLeuProLeuThrIleAlaAspGlyValProGluCysLeuLeu
[0548] AlaValArgLysGlnLeuArgArgGlyAlaThrValIleLysValCysAlaSerGlyGly
[0549] ValValSerAlaIleAspAspProGlnHisGlnGluPheSerPheGluGluLeuLysAla
[0550] IleValAspGluAlaAlaArgAlaArgArgValValAlaAlaHisCysHisGlyLysAla
[0551] GlyIleMetAsnAlaLeuArgAlaGlyCysArgThrIleGluHisGlySerPheLeuAsp
[0552] GluGluAlaValGluLeuMetLysGluLysGlyAlaIleLeuValAlaThrArgSerVal
[0553] IleGluSerGlyLeuAlaMetLysAspLeuPheThrProSerSerTyrGlnLysLeuLeu
[0554] GluValAlaAspAlaHisArgLysAlaTyrGlnLeuAlaIleSerArgGlyValThrIle
[0555] AlaLeuGlyThrAspGlnPheIleSerSerAspAsnProMetIleGlyTyrGlyArgAsn
[0556] GlyHisGluValArgTyrAlaValAspAlaGlyLeuThrProLeuAlaAlaIleGluAla
[0557] AlaThrAlaAsnGlyProLeuThrLeuGlyTyrGlnAlaProGlnSerGlyGlnLeuLys
[0558] GluGlyTyrAspAlaAspIleIleAlaValArgGluAsnProLeuGluAsnValAlaVal
[0559] LeuSerAsnSerLysAsnValThrHisValTrpArgGlyGlyMetLeuIleLysSer
[0560] SEQ ID NO.7
[0561] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:405,生物体:柄篮状菌
[0562] MetArgValArgLeuLysAlaSerIleLeuIleProGlyArgGlyGluProIleGluAsn
[0563] GlyAlaLeuIleIleAspGlyProLysIleAlaTrpValGlyGlnGlnSerAlaIlePro
[0564] ThrLysTyrGlnAspValAspPheGluTyrLeuProValLeuMetProGlyLeuTrpAsp
[0565] CysHisThrHisPheMetGlyLeuSerAspGluSerAspThrMetGlnAlaValPheGly
[0566] SerAlaAlaLeuAlaGlyAlaIleAlaAlaLysGluLeuGluThrAlaLeuMetAlaGly
[0567] PheThrThrIleArgGluValGlyGlyValAlaGlyGluIleTyrProAlaIleLysAsn
[0568] GlyThrIleValGlyProAsnValTyrSerSerIleGlyValLeuGlyIleThrGlyGly
[0569] HisSerAspValHisAsnValProIleGluAlaValIleAlaLysArgAsnGluGlyThr
[0570] PheValValCysAspGlyValSerAspCysIleLysThrValArgMetMetValArgArg
[0571] GlyAlaThrLeuIleLysIleCysAlaThrGlyGlyValGlySerLeuLeuAspAspPro
[0572] GluAspAlaGlnPheSerProGluGluIleLysAlaIleValAspGluAlaAlaArgSer
[0573] LysArgIleValAlaAlaHisCysHisGlyLysGluGlyIleMetAsnAlaLeuHisAla
[0574] GlyValHisThrIleGluHisGlySerTyrLeuAspGluGluValAlaAlaLeuMetLys
[0575] GluLysLysAlaLeuPheValSerThrArgLeuIleIleGluGluGlyLeuLysAsnPro
[0576] LysLeuTrpProProSerSerTyrArgLysLeuThrLysIleSerGluAlaHisLysLys
[0577] AlaTyrAlaLeuAlaValLysSerGlyValLysIleValLeuGlyThrAspTrpThrAla
[0578] GlyGluAsnGlyLysGluLeuAlaTyrAlaValGluAlaGlyMetSerProLeuGluAla
[0579] IleGluAlaSerThrAlaArgCysProGluThrLeuGlySerHisPheAlaProLeuSer
[0580] GlyGlnLeuLysGluGlyTyrGlyAlaAspValIleAlaValAlaSerAsnProLeuAsp
[0581] AspIleLysValLeuGlyGluProLysAsnIleThrHisValTrpLysGlyGlyLysLeu
[0582] TyrLysGlyThrLeu
[0583] SEQ ID NO8
[0584] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:440,生物体:粗糙脉孢菌
[0585] MetGlnIleLysValThrLeuProAsnAspThrIleAsnArgAspSerValAspAspArg
[0586] AlaSerTyrHisGlyIleLeuAlaAspValLeuIleProGlyArgGlyGluProLeuLys
[0587] AsnGlyAlaLeuValValLysAspSerValIleGluTrpValGlyProSerAspGluIle
[0588] ProSerGluTyrSerSerIleArgValSerArgValProValLeuMetProGlyMetTrp
[0589] AspValHisThrHisTyrGluGlyValGlyValAlaGlnGlyIleArgGluSerMetLys
[0590] ProPheLeuProGlyThrAlaThrLeuIleGlyAlaValIleValAspAspMetArgArg
[0591] ThrLeuMetAlaGlyPheThrSerIleArgGluLeuGlyGlyTyrAlaGlyAspValAla
[0592] ProAlaIleAspMetGlyAlaIleValGlyProHisValTyrAlaAlaMetSerLeuLeu
[0593] SerIleThrGlyGlyHisGlyAspLeuHisAspValProLeuArgThrValLeuAspAla
[0594] CysAlaAsnGlySerSerSerCysPheLeuCysAspGlyValAspGlyCysIleAsnAla
[0595] ValArgGlnGlnIleArgArgGlyAlaLysValIleLysValCysSerThrGlyGlyVal
[0596] LeuSerLeuAsnAspGlnProGluAspThrGlnPheSerAlaGluGluLeuArgAlaIle
[0597] ValGlnGluAlaLysArgSerSerArgValValAlaAlaHisAlaHisGlyLysProGly
[0598] IleMetAlaAlaLeuAspAlaGlyValLysSerIleGluHisGlySerPheLeuAspGlu
[0599] GluValAlaAlaLysMetLysGluLysAspAlaIleLeuValProThrArgHisValVal
[0600] GluGlyMetAlaAlaAsnAsnAspAspLeuAspProArgGlnArgAlaLysLeuGluArg
[0601] ThrMetGlnLeuSerArgAspSerIleLysLeuAlaHisArgMetGlyValLysIleAla
[0602] LeuGlyThrAspThrPheArgSerAspLysAsnHisAlaValAlaHisGlyLysAsnAla
[0603] MetGluLeuArgTyrAlaIleGluAlaGlyMetThrProLeuGlnAlaIleGluMetAla
[0604] ThrAlaThrProProGluThrLeuGlyProGlnAlaArgLysSerGlyGlnLeuLysAla
[0605] GlyTyrAspAlaAspLeuIleAlaIleSerSerAsnProLeuGluAspIleGluIleLeu
[0606] IleAspProAspAsnIleThrHisValTrpLysGlyGlyValLeuPheLysCysProGln
[0607] SEQ ID NO.9
[0608] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:413,生物体:玫瑰孢链霉菌
[0609] MetGluHisArgIleAspAlaAspLeuLeuIleProGlyAlaGlyGluProThrValAsn
[0610] GlySerValValHisAlaAspGlyArgIleArgPheAlaGlyProThrAlaGluLeuPro
[0611] ArgGluHisArgAlaLeuGluProThrArgValAlaThrLeuLeuProGlyLeuTrpAsp
[0612] CysHisValHisPheAlaGlyIleArgGlyArgValSerThrGluGluLeuMetLeuThr
[0613] ProGluThrLeuAlaValValArgSerValLysAspAlaGluThrAlaLeuArgAlaGly
[0614] PheThrSerValArgAspMetGlyGlyHisGlyCysValLeuAlaGluAlaValArgGlu
[0615] GlyThrPheThrGlyProAsnIleTyrSerAlaAsnGlnValIleGlyGlnThrGlyGly
[0616] HisSerAspAlaHisArgLeuProTyrArgTrpValThrAspProCysArgSerGlyGly
[0617] ThrLeuArgIleAlaAspGlyValAspGluCysValArgAlaValArgLeuGlnLeuArg
[0618] AlaGlyAlaGluLeuIleLysIleCysThrSerGlyGlyValLeuSerGluValAspAsn
[0619] ProValHisGlnGlnTyrArgSerGluGluLeuAsnAlaIleValThrGluAlaAlaArg
[0620] AlaAspArgValValAlaAlaHisCysHisGlyArgAlaGlyIleLeuAlaAlaIleAsp
[0621] AlaGlyCysHisThrValGluHisGlyThrGluIleAspGluArgThrAlaAspLeuMet
[0622] AlaGluArgGlyMetThrLeuValProThrArgThrIleTyrGluAlaPheArgGlnAsp
[0623] ValAlaAlaLeuProProAlaTrpArgAspArgPheAlaLeuMetAlaGluArgHisLeu
[0624] ThrAlaIleGlyIleAlaHisArgAlaGlyValThrIleAlaLeuGlyThrAspLeuGly
[0625] ThrSerAspArgGlyGlyProLeuSerTrpGlyGlyHisGlySerGluPheAlaHisLeu
[0626] ValSerAlaGlyLeuSerProLeuGluAlaIleLysAlaAlaThrAlaHisGlyProGly
[0627] ThrLeuGlyProArgAlaProArgSerGlyArgLeuGluAlaGlyTyrAspAlaAspLeu
[0628] LeuAlaValAspGlyAsnProLeuAlaAspIleThrValLeuAlaAspProAspArgIle
[0629] ThrArgValTrpLysSerGlyGluProValProSerGly
[0630] SEQ ID NO.10
[0631] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:407,生物体:莱廷格热孢菌
[0632] GluSerAlaValPheIleGluGlyAlaArgIleLeuAlaValGluLysIleLysArgSer
[0633] GlnIleProSerGlyPheThrGlnIleAspLeuGlnGlyArgTyrLeuMetProGlyLeu
[0634] IleAspAlaHisLeuHisLeuAlaGlyMetArgSerGlyAspMetValLysGluHisLeu
[0635] LeuThrProTyrGluThrLeuValAlaArgThrValThrAspLeuLysSerLeuIleGlu
[0636] AlaGlyPheThrThrValValAspAlaGlyGlySerIleAlaIleAsnLeuLysLysAla
[0637] IleGlnGluGlyThrIleAlaGlyProArgIleValAlaAlaGlyHisSerLeuSerGln
[0638] ThrPheGlyHisGlyAspGluHisPheLeuProIleAspTyrValAspProArgThrSer
[0639] LysPheLysGlyGlyPheGlySerLeuIleCysAspGlyValAlaGluCysIleLysAla
[0640] AlaArgTyrAlaLeuArgCysGlyAlaAspPheIleLysIleMetAlaThrGlyGlyVal
[0641] LeuSerGluArgAspArgProGluTyrThrGlnPheThrValGluGluIleLysAlaIle
[0642] ValGluGluAlaAsnHisAlaArgLysPheValHisAlaHisAlaGlnGlyLysAspGly
[0643] IleMetAsnAlaLeuLeuGlyGlyValLysValIleAlaHisAlaIleTyrIleAspAsp
[0644] GluSerCysLysLeuAlaLysGluLysAsnAlaIleIleValProThrLeuSerIleVal
[0645] GluHisLeuIleIleHisGlyLysGlnIleGlyAlaProGluTrpGlyLeuArgLysSer
[0646] GluGluValTyrLysIleHisValGluAsnIleLysLysAlaTyrGluHisGlyValLys
[0647] IleAlaAlaGlyThrAspPheIleGlyGlyThrLysAlaPheLysHisGlyGluAsnAla
[0648] LeuGluIleLeuLeuLeuValAspLysIleGlyMetLysProGluGlnAlaLeuLeuSer
[0649] AlaThrLysValAlaAlaGluAlaAlaGlyLeuSerGlnLeuValGlySerIleAspLys
[0650] GlyLysLeuAlaAspLeuLeuIleValGluAspAsnProLeuSerAsnValLysIleLeu
[0651] MetAspHisSerLysIleSerAlaValPheLysGluGlyIleLeuPheLysAspLysIle
[0652] GlyLeuGluLysTyrPheAsn
[0653] SEQ ID NO.11
[0654] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:推定的酰胺酶2同源物,长度:408,生物体:砂嗜盐产孢菌
[0655] MetIleGluCysIleGluAlaAspGlnLeuIleProGlyArgGlyGluProValAlaAsn
[0656] AlaValValValLeuGluAspAlaThrIleArgTyrAlaGlyProAlaGluHisAlaPro
[0657] LysValAlaGluAlaArgArgSerArgAlaHisThrValLeuProGlyLeuTrpAspSer
[0658] HisValHisPheMetGlyLeuArgSerAlaAspValGlyIleLeuProGlnGluProVal
[0659] AlaLeuArgAlaAlaArgThrValAlaAspLeuArgAlaAlaLeuAspAlaGlyPheThr
[0660] SerValArgGluValGlyGlyLeuGlyLeuAspLeuAlaArgAlaValGluGluGlyThr
[0661] AlaValGlyProSerValTyrAlaAlaGlyCysAlaLeuSerThrThrGlyGlyHisGly
[0662] AspLeuHisSerTyrProLeuAlaTrpMetGluGluPheAlaArgHisGlyGlyGluLeu
[0663] ArgLeuAlaAspGlyGluAlaGluCysValArgAlaValArgGluGlnLeuArgArgAsn
[0664] AlaLysValIleLysValTyrAlaSerGlyGlyValLeuSerGluValAspHisProIle
[0665] HisArgGlnPheThrAspArgGluLeuArgAlaIleValGluValAlaGlyLeuAlaAsp
[0666] ArgValValAlaAlaHisCysHisGlyLysProGlyMetMetAlaAlaIleGluAlaGly
[0667] ValArgThrIleGluHisGlyThrTyrLeuAspGluGluValAlaAlaAlaMetArgGlu
[0668] ThrGlyAlaIleLeuValThrThrArgThrIleMetGlnGluLeuIleAspSerArgAla
[0669] LeuProProTyrAlaLeuArgLysLeuGluSerIleValAspArgHisAlaGluAlaIle
[0670] ValIleAlaArgGluSerGlyValArgIleAlaAlaGlyThrAspValAlaLeuThrGly
[0671] AlaGluLeuProAspSerTrpGlyArgAsnGlyArgGluLeuProLeuLeuAlaGluIle
[0672] GlyPheSerProLeuGluValIleGluAlaAlaThrAlaAlaAlaProAlaThrLeuGly
[0673] ProGlnAlaProArgSerGlyGlnLeuValGluGlyTyrAspAlaAspValIleThrLeu
[0674] AspAlaAspProLeuAlaAspIleGlyValLeuAlaLysProAlaHisIleThrGlyVal
[0675] TrpLysAlaGlyCysArgValAla
[0676] SEQ ID NO.12.
[0677] 序列类型:蛋白质;蛋白质名称:pepAd2(蛋白酶),长度:480,生物体:黑曲霉[0678] MetHisLeuProGlnArgLeuValThrAlaAlaCysLeuCysAlaSerAlaThrAlaPhe
[0679] IleProTyrThrIleLysLeuAspThrSerAspAspIleSerAlaArgAspSerLeuAla
[0680] ArgArgPheLeuProValProAsnProSerAspAlaLeuAlaAspAspSerThrSerSer
[0681] AlaSerAspGluSerLeuSerLeuAsnIleLysArgIleProValArgArgAspAsnAsp
[0682] PheLysIleValValAlaGluThrProSerTrpSerAsnThrAlaAlaLeuAspGlnAsp
[0683] GlySerAspIleSerTyrIleSerValValAsnIleGlySerAspGluLysSerMetTyr
[0684] MetLeuLeuAspThrGlyGlySerAspThrTrpValPheGlySerAsnCysThrSerThr
[0685] ProCysThrMetHisAsnThrPheGlySerAspAspSerSerThrLeuGluMetThrSer
[0686] GluGluTrpSerValGlyTyrGlyThrGlySerValSerGlyLeuLeuGlyLysAspLys
[0687] LeuThrIleAlaAsnValThrValArgMetThrPheGlyLeuAlaSerAsnAlaSerAsp
[0688] AsnPheGluSerTyrProMetAspGlyIleLeuGlyLeuGlyArgThrAsnAspSerSer
[0689] TyrAspAsnProThrPheMetAspAlaValAlaGluSerAsnValPheLysSerAsnIle
[0690] ValGlyPheAlaLeuSerArgSerProAlaLysAspGlyThrValSerPheGlyThrThr
[0691] AspLysAspLysTyrThrGlyAspIleThrTyrThrAspThrValGlySerAspSerTyr
[0692] TrpArgIleProValAspAspValTyrValGlyGlyThrSerCysAspPheSerAsnLys
[0693] SerAlaIleIleAspThrGlyThrSerTyrAlaMetLeuProSerSerAspSerLysThr
[0694] LeuHisSerLeuIleProGlyAlaLysSerSerGlySerTyrHisIleIleProCysAsn
[0695] ThrThrThrLysLeuGlnValAlaPheSerGlyValAsnTyrThrIleSerProLysAsp
[0696] TyrValGlyAlaThrSerGlySerGlyCysValSerAsnIleIleSerTyrAspLeuPhe
[0697] GlyAspAspIleTrpLeuLeuGlyAspThrPheLeuLysAsnValTyrAlaValPheAsp
[0698] TyrAspGluLeuArgValGlyPheAlaGluArgSerSerAsnThrThrSerAlaSerAsn
[0699] SerThrSerSerGlyThrSerSerThrSerGlySerThrThrThrGlySerSerThrThr
[0700] ThrThrSerSerAlaSerSerSerSerSerSerAspAlaGluSerGlySerSerMetThr
[0701] IleProAlaProGlnTyrPhePheSerAlaLeuAlaIleAlaSerPheMetLeuTrpLeu
[0702] SEQ ID NO:13
[0703] 生物体禾生小丛壳M1.001(真菌),472aa
[0704] 1mggsfrpnya dgpeppfspt kkttlviikt sllipgdgep lkdgalviss kviawvgpqs[0705] 61slpseyadsp hrsytvpylm pglwdchahf ggespnddgg ndpyqvfite hpaasgarlt[0706] 121rgcwlalqrg ytslrdvagl gcevsraied gsivgpnvys sgsglsqlag hgdifslpag[0707] 181dvllnlgvsq itpghfgtha tmivdgvdec rravrlqirr gakcikvmas ggvmsrddnp[0708] 241nyaqfsaael etiveeatrq nrvvaahvhg kagilaaina gvttlehasf adrecidlik[0709] 301ekgivyiatr ivvhlllstg gkglpptvwe kaklvaknhm taykmaiesg vqialgtdtg[0710] 361pgynmatele caveagmsnl eaikaatang plsvggqapk tgqlkvgyea dvigllqnpv[0711] 421edvkvlqkvd nvgwvwkggk lfkgpgvgpw geepgvwedi tgvsrlrctt gy
[0712] SEQ ID NO:14
[0713] 生物体金龟子绿僵菌ARSEF23。485aa,
[0714] 1mtrrviphse saesvddaqh vsgriystgf giavrtgqpq sqdddaetgv kkvfytivmt[0715] 61kllipgdgep ikdaalvvkn kiidwvgrqa dlpneytekp hklhnvpylm pglwdchvhf[0716] 121agsngereae egstglsfla dhpttagarl argcwdaiqr gytsmrdlag fgceiskaie[0717] 181dgviigpniy sagaclsqla ghgdvfalpa gdallnlgla svkagqfgag msclvdgvde[0718] 241crrgvrlqir rgakcikvma sggvlsrddn plyaqfsree ldtivseakr mertvaahvh[0719] 301gkpgilqave agvtsvehvs fadqecidli kdrgtifvgt rtivnlllds kgegmpkkmw[0720] 361ekaklvgths legykkaika gctialgtdt epgfnmaiel qyaveagmss leaikaatan[0721] 421gpltvagqap ltgqlkagye admigvcdnp vedvkvlqkk snigwvwkggklfkgpgigp[0722] 481wgeel
[0723] SEQ ID NO:15
[0724] 米曲霉酰胺水解酶
[0725] Mhrmltddrlyrvdadllipgkgdpiphgavvwqcktiryagprsgvptefqgattthvpvvmpgmwdchihflgataatmnaivdtpqalagarsvpdlhatvmagftsvrevggygcdlakavgegripgpniysshsaismtaghgdvhgvhrdslldlcahglpltiadgvpecllavrkqlrrgakvikvcasggvvsaiddpqhqefsfeelkaivdeaararrvvaahchgkagimnalragcrtiehgsfldeeavglmkekgailvatrsviesglamkdlftpssyqkllavadahrkayqlaisrgvtialgtdqfissdnpmigygrnghevryavdagltplaaieaatangpltlgyqapqsgqlkegydadiiavrenplenvavlsnsknvthvwrggmliks
[0726] SEQ ID NO:16
[0727] 牛羧肽酶A(419aa)。登录号:NP777175。西格玛公司产品号:C0261。
[0728] 1mqgllilsvl lgaalgkedf vghqvlrita adeaevqtvk eledlehlql dfwrgpgqpg[0729] 61spidvrvpfp slqavkvfle ahgiryrimi edvqslldee qeqmfasqsr arstntfnya[0730] 121tyhtldeiyd fmdllvaehp qlvsklqigr syegrpiyvl kfstggsnrp aiwidlgihs[0731] 181rewitqatgv wfakkftedy gqdpsftail dsmdifleiv tnpdgfafth sqnrlwrktr[0732] 241svtssslcvg vdanrnwdag fgkagasssp csetyhgkya nsevevksiv dfvkdhgnfk[0733] 301aflsihsysq lllypygytt qsipdkteln qvaksaveal kslygtsyky gsiittiyqa[0734] 361sggsidwsyn qgikysftfe lrdtgrygfl lpasqiipta qetwlgvlti mehtlnnly[0735] SEQ ID NO:17
[0736] 来自面包酵母酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的羧肽酶Y,532aa,登录号:EDV11788。西格玛公司产品号:C3888。
[0737] 1mkaftsllcg lglsttlaka islqrplgld kdvllqaaek fglnldldhl lkeldsnvld[0738] 61awaqiehlyp nqvmsletst kpkfpeaikt kkdwdfvvkn daienyqlrv nkikdpkilg[0739] 121idpnvtqytg yldvededkh fffwtfesrn dpakdpvilw lnggpgcssl tglffelgps[0740] 181sigpdlkpig npyswnsnat vifldqpvnv gfsysgssgv sntvaagkdv ynflelffdq[0741] 241fpeyvnkgqd fhiagesyag hyipvfasei lshkdrnfnl tsvlignglt dpltqynyye[0742] 301pmacgeggep svlpseecsa medslerclg liescydsqs vwscvpatiy cnnaqlapyq[0743] 361rtgrnvydir kdceggnlcy ptlqdiddyl nqdyvkeavg aevdhyescn fdinrnflfa[0744] 421gdwmkpyhta vtdllnqdlp ilvyagdkdf icnwlgnkaw tdvlpwkydeefasqkvrnw[0745] 481tasitdevag evksykhfty lrvfngghmv pfdvpenals mvnewihggf sl
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