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粘土交织的酵母组合物及其使用方法

阅读:180发布:2020-06-25

专利汇可以提供粘土交织的酵母组合物及其使用方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及包含 酵母 细胞和/或酵母细胞组分的组合物及其生产和使用方法。具体而言,本发明提供了包括改变的细胞壁结构(例如,整合(例如,交织)到细胞壁的粘土和/或粘土组分和/或包括改变的葡聚糖∶甘露聚糖比的细胞壁)的新型酵母,其生产方法以及包含和/或源于该酵母的组合物,及使用该酵母的方法(例如,螯合和/或 吸附 细菌和毒素)。本发明的组合物和方法可用于各种应用,包括饮食(例如,与 饲料 混合或以其他方式喂养动物)、 治疗 、 预防 (例如,与 垫料 来源和/或其他与动物 接触 的材料混合,在食物及饮料加工和制造期间使用,在液体过滤期间使用)及研究应用。,下面是粘土交织的酵母组合物及其使用方法专利的具体信息内容。

1.一种酵母细胞,其包括含有粘土或粘土组分的酵母细胞壁,所述粘土或粘土组分交织到所述酵母细胞壁中。
2.权利要求1的酵母细胞,其中所述酵母细胞在包含粘土的细胞培养基中进行培养。
3.权利要求2的酵母细胞,其中所述粘土是属于酸盐类的矿物粘土或合成粘土。
4.权利要求3的酵母细胞,其中所述粘土选自沸石、膨润土、硅酸盐、蒙脱土、蒙皂石、高岭石,有机粘土及其混合物。
5.权利要求4的酵母细胞,其中所述粘土是硅铝酸盐粘土。
6.权利要求2的酵母细胞,其中细胞培养基中粘土的量为约0.125%至4.0%。
7.权利要求6的酵母细胞,其中细胞培养基中粘土的量为约0.5%至2.0%。
8.权利要求1的酵母细胞,其中所述酵母选自酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、有孢圆酵母属及其组合。
9.权利要求8的酵母细胞,其中所述酵母是酿酒酵母
10.一种包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物。
11.权利要求10的组合物,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物源自在包含粘土的生长培养基中培养的酵母细胞。
12.权利要求10的组合物,其中使用玻璃珠和珠磨式研磨器制备所述酵母细胞壁提取物。
13.权利要求10的组合物,其中使用酶处理制备所述酵母细胞壁提取物。
14.权利要求10的组合物,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物被添加到饲料中。
15.权利要求14的组合物,其中所述饲料选自全混合日粮(TMR)、粮草、颗粒饲料、精料、预混合料、副产品、谷物、酒糟、糖浆、纤维、草料、草、干草、谷粒、叶、粗粉、可溶物及添加物。
16.权利要求10的组合物,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物被添加到有机材料中。
17.权利要求10的组合物,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物被添加到中。
18.权利要求10的组合物,其中通过所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物过滤液体。
19.权利要求18的组合物,其中所述液体是汁液、水、啤酒或酒。
20.权利要求10的组合物,其配制用于喂饲动物界的任何成员。
21.权利要求20的组合物,其中所述成员选自类、、猪、绵羊和山羊、鱼类、甲壳类、骆驼科动物、猫、犬及啮齿类动物物种。
22.权利要求10的组合物,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物螯合一种或多种真菌毒素。
23.权利要求22的组合物,其中所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、玉米赤霉烯、单端孢菌毒素、伏马菌素和赭曲毒素。
24.权利要求22的组合物,其中所述真菌毒素选自:乙酰基蔍草镰刀菌烯二醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基瓜萎镰菌醇、乙酰基新腐皮镰孢醇、乙酰基T-2毒素、扩展到所有黄曲霉毒素,黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2、黄曲霉震颤毒素、细交链孢酸、格链孢菌醇、austdiol、austamide、austocystin、燕麦镰孢菌素+1、白僵菌素+2、bentenolide、brevianamide、丁烯羟酸内酯、丽赤壳菌素、球毛壳菌素、桔霉素、黄绿色青霉素、螺卷毛壳醇、松胞菌素E、环匹阿尼酸、脱乙酰基丽赤壳菌素、脱乙酰基新腐皮镰孢醇、双醋酸脱氧瓜萎镰菌醇、单醋酸脱氧瓜萎镰菌醇、二乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、腐败菌素B、恩镰孢菌素、扩展到所有麦毒素和内生菌,产果镰孢菌素+1、烟曲霉素、伏马菌素、伏马菌素B1、B2和B3、镰刀菌烯酮-X、镰孢红素酮、镰孢菌酸、镰孢素、胶霉毒素、HT-2毒素、甘薯黑疤霉二酮、岛青霉毒素、砖红镰孢菌素+1、番茄菌肽+1、畸形素、麦芽米曲霉素、念珠菌素、单乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、新腐皮镰孢醇、瓜萎镰菌醇、NT-1毒素、NT-2毒素、扩展到所有赭曲毒素,卵孢霉素、草酸、展青霉素、青霉酸、青霉震颤素、杆孢菌素E、红色青霉毒素、瑰天精、rubrosulphin、细皱青霉素、接骨木镰菌素+1、暴霉毒素F、G、H、蔍草镰刀菌三醇、根霉菌胺、stericoncentrated修饰的酵母细胞壁extracttocystin、T-1毒素、T-2毒素、三乙酰氧基蔍草镰刀菌二醇,扩展到所有单端孢菌毒素,木霉菌素、单端孢菌素、trichoverrins、trichoverrols、色酸震颤素、疣孢菌素、震颤真菌毒素、紫红紫素、紫黄素、viriditoxin、黄青霉素、爪哇镰菌素+1、玉米赤霉烯醇类和玉米赤霉烯酮。
25.一种包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的动物饲料,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物以有效螯合真菌毒素的量存在。
26.权利要求25的动物饲料,其中按重量计算,所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物以饲料的约0.0125%至约10%的量存在。
27.权利要求25的动物饲料,其中按重量计算,所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物以饲料的约0.0125%至约4%的量存在。
28.一种减少动物或人类对真菌毒素的生物利用度的方法,其包括:
(a)提供:
(i)包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物,和
(ii)动物或人类所消耗的材料;
(b)将所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物掺入到所述材料中,以产生掺有粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的材料;及
(c)允许所述动物或人类消耗所述掺有粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的材料。
29.权利要求28的方法,其中所述材料是饲料。
30.权利要求29的方法,其中按重量计算,将约0.0125%至约0.4%的所述包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物添加到所述饲料中。
31.权利要求28的方法,其中所述材料是垫料
32.权利要求31的方法,其中按重量计算,将约0.0125%至约99.0%的所述包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物添加到所述垫料中。
33.权利要求28的方法,其中所述材料是液体。
34.权利要求33的方法,其中按重量计算,将约0.0125%至约99.0%的所述包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物添加到所述液体中。
35.权利要求28的方法,其中所述动物选自鸟类、牛、猪、马、绵羊和山羊、鱼类、甲壳类、骆驼科动物、猫、犬及啮齿类动物物种。
36.权利要求28的方法,其中所述包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物螯合一种或多种类型的真菌毒素。
37.权利要求36的方法,其中所述真菌毒素选自黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢菌毒素、伏马菌素、赭曲毒素及其组合。
38.权利要求28的方法,还包括将附加剂掺入所述掺有粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的材料中,其中所述附加剂选自酯酶、环氧酶、酵母和细菌菌株。
39.一种生产商业规模量的粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的方法,其包括:
(a)提供:
(i)酵母起始培养物;和
(ii)酵母细胞培养基,其中所述酵母细胞培养基包括酵母生长所需的营养物及粘土或粘土组分;
(b)将所述酵母起始培养物引入到所述酵母细胞培养基中;
(c)在配置以允许酵母生长的条件下,在工业规模的发酵罐中培养所述酵母,其中在生长期间所述酵母使所述粘土或粘土组分掺入酵母细胞壁中;
(d)添加消泡剂至所述发酵罐中;
(e)裂解粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁;及
(f)将所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁与其他酵母组分分离。
40.权利要求39的方法,其中所述酵母选自酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、有孢圆酵母属及其组合。
41.权利要求39的方法,其中所述粘土是属于硅酸盐类的矿物粘土或合成粘土。
42.权利要求40的方法,其中所述粘土选自沸石、膨润土、硅铝酸盐、蒙脱土、蒙皂石、高岭石、有机粘土及其混合物。
43.权利要求42的方法,其中所述粘土是硅铝酸盐粘土。
44.权利要求39的方法,其中细胞培养基中粘土的量为约0.125%至4.0%。
45.权利要求44的方法,其中细胞培养基中粘土的量为约0.5%至2.0%。
46.权利要求39的方法,其中所述工业规模的发酵罐为1000至500万升。
47.权利要求39的方法,其中添加所述消泡剂以减轻所述粘土对培养过程的影响。
48.权利要求39的方法,其中所述消泡剂选自非硅酮分子消泡剂、油基消泡剂、粉末消泡剂、水基消泡剂、硅酮类消泡剂、聚乙二醇类消泡剂、聚丙二醇类消泡剂和烷基聚丙烯酸酯类。
49.权利要求39的方法,其中所述消泡剂包括非硅酮分子消泡剂。
50.权利要求39的方法,其中所述裂解包括玻璃珠、珠磨式研磨器和/或酶处理。

说明书全文

粘土交织的酵母组合物及其使用方法

[0001] 本发明申请要求保护2009年1月14日递交的美国临时申请61/144,620的优先权,它的全部内容通过引用整合到本文。

技术领域

[0002] 本发明涉及包含酵母细胞和/或酵母细胞组分的组合物及其生产和使用方法。特别地,本发明提供了包含改变的细胞壁结构的新型酵母(例如,粘土和/或粘土组分整合(例如,交织)到细胞壁和/或包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖比例的细胞壁)、其生产的方法、包含和/或源于该酵母的组合物、及使用该酵母的方法(例如,螯合和/或吸附细菌和毒素)。本发明的组合物和方法可用于各种应用,包括饮食(例如,与饲料混合或以其他方式喂饲动物)、治疗预防(例如,与垫料来源(bedding source)和/或其他接触到动物的材料混合,在食物及饮料加工和制造中使用,在液体过滤中使用)及研究应用。
[0003] 发明背景
[0004] 在全球范围内普遍存在真菌,且因为它们通常是微小的,所以难以察觉。真菌毒素是由真菌分泌的次级代谢产物。真菌毒素是由生长于各种农产品的各种真菌种产生的有毒的和/或致癌的化合物。真菌毒素的实例,包括但不限于黄曲霉毒素、伏菌素、赭曲毒素A、脱瓜萎镰菌醇(又名“DON”或“呕吐毒素”)、展青霉素和玉米赤霉烯。真菌毒素通常产生于谷粒及粮草收获之前、之中和之后。一些真菌毒素是致死的,一些引起可识别疾病或健康问题,一些减弱免疫系统但不产生特异于该真菌毒素的症状,一些作为变应原或刺激物,而一些对动物或人类具有未知影响。作物和家禽生产者,及食品和饲料生产者受到真菌毒素污染的最大经济影响。作为植物产品真菌感染的结果,真菌毒素可出现在食物链中,也可直接被人类食用,或由污染的牲畜饲料引入。真菌毒素污染有机材料(例如,垫料)及,且极大地抵抗消化作用中的分解,所以它们以可食用产品(例如,肉、蛋和奶制品)存留于食物链中。世界上没有任何地区逃脱真菌毒素及其对动物和人类健康的负面影响。饲料全球贸易的发展增加了谷物混合引起在既定的饮食中真菌毒素组合的机会,以及罕见的未知真菌毒素存在于既定区域(与其气候条件无关)的机会。
[0005] 用于避免真菌毒素产生的策略包括控制允许真菌毒素产生的要素,控制霉菌生长,及通过足够的采样、检测和定量方法进行食物和饲料的质量控制。然而,真菌毒素污染是不可避免的。
[0006] 为了减少真菌毒素的负面影响,过去已将已知具有吸附特性的无机材料添加到饲料中,所述材料为例如粘土、膨润土酸盐。大量的饲料添加剂螯合动物胃肠道中的一些真菌毒素并使其毒性效应降到最低。然而,添加剂阻碍了许多对动物重要的有益养分(例如维生素、矿物质和基酸)的吸收,因而降低了饮食中的养分浓度。此外,特别是在动物粪便中的饲料添加剂具有极其不利的环境影响。
[0007] 化学制剂,如酸、(例如氨水、苛性钠)、氧化剂(例如过氧化氢、臭氧)、还原剂(例如亚硫酸氢盐)、氯化剂和甲,已被用于降解污染的饲料中的真菌毒素,特别是黄曲霉毒素(参见,例如,Hagler 1991;Phillips等1994;Lemke等2001)。然而,这些技术效率不高,价格昂贵,产生大量化学废物,且通常是不安全的。
[0008] 乳酸菌、丙酸杆菌和双歧杆菌的某些菌株具有与真菌毒素结合的细胞壁结构(参见,例如,Ahokas等1998;El-Nemazi等1998;Yoon等1999),并限制其在动物体内的生物利用度。然而,这些生物过程通常速度缓慢,产生有毒的代谢产物,且效率低。
[0009] 发明概述
[0010] 在一些实施方案中,本发明提供包含酵母细胞壁的酵母细胞,所述酵母细胞壁包含交织其中的粘土或粘土组分。在一些实施方案中,该酵母细胞在包含粘土的细胞培养基中培养。在一些实施方案中,粘土是属于硅酸盐类的矿物粘土或合成粘土。在一些实施方案中,粘土选自沸石、膨润土、硅铝酸盐、蒙脱土、蒙皂石、高岭石、有机粘土及其混合物。在一些实施方案中,粘土是硅铝酸盐粘土。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为约0.125%至约4.0%。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为0.125%至4.0%。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为约0.5%至约2.0%。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为0.5%至2.0%。在一些实施方案中,酵母选自酵母属(Saccharomyces)、假丝酵母属(Candida)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)、有孢圆酵母属(Torulaspora)及其组合。在一些实施方案中,酵母是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。
[0011] 在一些实施方案中,本发明提供包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物。在一些实施方案中,粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物源于在含有粘土的生长培养基中培养的酵母细胞。在一些实施方案中,使用玻璃珠和珠磨式研磨器(bead beater)制备酵母细胞壁提取物。在一些实施方案中,使用酶处理制备酵母细胞壁提取物。在一些实施方案中,将粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物添加到饲料中。在一些实施方案中,饲料选自全混合日粮(Total Mixed Ration,TMR)、粮草、颗粒饲料(pellet)、精料、预混合料、副产品、谷物、酒糟(distiller grain)、糖浆、纤维、草料、草、干草、谷粒(kernel)、叶、粗粉、可溶物及添加物。在一些实施方案中,将粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物添加到有机材料中。在一些实施方案中,将粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物添加到水中。在一些实施方案中,通过粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物过滤液体。在一些实施方案中,液体是汁液、水、啤酒或酒。在一些实施方案中,配制组合物用于喂养动物界的任何成员。在一些实施方案中,动物界的成员选自类、、猪、马、绵羊和山羊、鱼类、甲壳类、骆驼科动物(camelids)、猫、犬及啮齿类动物物种。在一些实施方案中,粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物螯合一种或多种真菌毒素。在一些实施方案中,真菌毒素选自黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢菌毒素、伏马菌素和赭曲毒素。在一些实施方案中,真菌毒素选自乙酰氧基蔍草镰刀菌烯二醇(acetoxyscirpenediol)、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基瓜萎镰菌醇、乙酰基新腐皮镰孢醇、乙酰基T-2毒素、扩展到所有黄曲霉毒素,黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2、黄曲霉震颤毒素(aflatrem)、细交链孢酸(altenuic acid)、格链孢菌醇、austdiol、austamide、austocystin、燕麦镰孢菌素+1、白僵菌素+2、bentenolide、brevianamide、丁烯羟酸内酯、丽赤壳菌素(calonectrin)、球毛壳菌素(chaetoglobosin)、桔霉素、黄绿色青霉素、螺卷毛壳醇、松胞菌素E、环匹阿尼酸、脱乙酰基丽赤壳菌素、脱乙酰基新腐皮镰孢醇、双醋酸脱氧瓜萎镰菌醇、单醋酸脱氧瓜萎镰菌醇、二乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、腐败菌素B、恩镰孢菌素、扩展到所有麦毒素和内生菌,产果镰孢菌素+1、烟曲霉素、伏马菌素、伏马菌素B1、B2和B3、镰刀菌烯酮(Fusarenon)-X、镰孢红素酮(Fusarochromanone)、镰孢菌酸、镰孢素、胶霉毒素、HT-2毒素、甘薯黑疤霉二酮、岛青霉毒素、砖红镰孢菌素+1、番茄菌肽+1、畸形素、麦芽米曲霉素、念珠菌素、单乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、新腐皮镰孢醇、瓜萎镰菌醇、NT-1毒素、NT-2毒素、扩展到所有赭曲毒素,卵孢霉素、草酸、展青霉素、青霉酸、青霉震颤素(penitrem)、杆孢菌素E、红色青霉毒素、瑰天精(rubroskyrin)、rubrosulphin、细皱青霉素、接骨木镰菌素(sambucynin)+1、暴霉毒素F、G、H、蔍草镰刀菌三醇(scirpentriol)、根霉菌胺(slaframine)、stericoncentrated修饰的酵母细胞壁extracttocystin、T-1毒素、T-2毒素、三乙酰氧基蔍草镰刀菌二醇,扩展到所有单端孢菌毒素,木霉菌素、单端孢菌素、trichoverrins、trichoverrols、色氨酸震颤素(tryptoquivalene)、疣孢菌素、震颤真菌毒素(verruculogen)、紫红紫素(viopurpurin)、紫黄素(viomellein)、viriditoxin、黄青霉素、爪哇镰菌素(yavanicin)+1、玉米赤霉烯醇类和玉米赤霉烯酮。
[0012] 在一些实施方案中,本发明提供包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物,其中所述粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物以有效螯合真菌毒素的量存在。例如,在一些实施方案中,按重量计算,粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物存在的量为饲料的约0.0125%至约10%。在一些实施方案中,按重量计算,粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物存在的量为饲料是约0.0125%至约4%。本发明不受限于饲料类型。
[0013] 在一些实施方案中,本发明提供一种减少动物或人类对真菌毒素的生物利用度的方法,其包括:(a)提供:(i)包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物,和(ii)动物或人类所消耗的材料;(b)将粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物掺入到所述材料中,以产生掺有粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的材料;及(c)允许动物或人类消耗掺有粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的材料。在一些实施方案中,所述材料是饲料。在一些实施方案中,按重量计算,将约0.0125%至约0.4%的包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物添加到饲料中。在一些实施方案中,所述材料是垫料。在一些实施方案中,按重量计算,将约0.0125%至约99%的包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物添加到垫料中。在一些实施方案中,材料是液体。在一些实施方案中,按重量计算,将约0.0125%至约99%的包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物添加到液体中。在一些实施方案中,动物选自鸟类、牛、猪、马、绵羊和山羊、鱼类、甲壳类、骆驼科动物、猫、犬及啮齿类动物物种。在一些实施方案中,包含粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的组合物螯合一种或多种类型的真菌毒素。在一些实施方案中,真菌毒素是黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、单端孢菌毒素、伏马菌素、赭曲毒素或其组合。在一些实施方案中,本发明还提供将附加剂掺入到掺有粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的材料中,其中所述附加剂选自酯酶、环氧酶、酵母和/或菌株。
[0014] 在一些实施方案中,本发明提供了一种生产工业规模量的粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁提取物的方法,其包括:(a)提供:(i)酵母起始培养物和(ii)酵母细胞培养基,其中酵母细胞培养基包括酵母生长所需的营养物及粘土或粘土组分;(b)将酵母起始培养物引入到酵母细胞培养基中;(c)在配置以允许酵母生长的条件下,在工业规模的发酵罐中培养酵母,其中在生长期间酵母使粘土或粘土组分掺入到酵母细胞壁;(d)向发酵罐中添加消泡剂;(e)裂解粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁;及(f)将粘土或粘土组分交织的酵母细胞壁与其他酵母组分分离。在一些实施方案中,酵母选自酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属、有孢圆酵母属或其组合。在一些实施方案中,粘土是属于硅酸盐类的矿物粘土或合成粘土。在一些实施方案中,粘土选自沸石、膨润土、硅铝酸盐、蒙脱土、蒙皂石、高岭石、有机粘土或其混合物。在一些实施方案中,粘土是硅铝酸盐粘土。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为约0.125%至约4.0%。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为约0.5%至约2.0%。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为0.125%至4.0%。在一些实施方案中,细胞培养基中粘土的量为0.5%至2.0%。在一些实施方案中,工业规模的发酵罐为1000-500万升。在一些实施方案中,添加消泡剂以减轻粘土对培养过程的影响。在一些实施方案中,消泡剂是非硅酮分子消泡剂、油基消泡剂、粉末消泡剂、水基消泡剂、硅酮类消泡剂、聚乙二醇类消泡剂、聚丙二醇类消泡剂或烷基聚丙烯酸酯类。在一些实施方案中,消泡剂是非硅酮分子消泡剂。在一些实施方案中,裂解包括玻璃珠、珠磨式研磨器和/或酶处理。
附图说明
[0015] 图1示出了A)具有交织于酵母细胞壁的粘土和/或粘土组分的酵母细胞的描绘,及B)(a)无粘土条件下培养的酵母细胞的酵母细胞壁和(b)有粘土条件下生长/培养的酵母细胞的酵母细胞壁的比较说明。
[0016] 图2示出了以下的扫描电子显微照片:(A)膨润土(Fluka);(B)无粘土条件下培养的酵母细胞及酵母细胞壁葡聚糖部分的特写镜头;(C1)存在2%膨润土条件下培养的酵母细胞,以及陷于膨润土层状结构的几个酵母细胞的聚集物形成的细节图;(C2)存在2%膨润土条件下培养的酵母细胞,以及直接在酵母细胞壁结构中的粘土内含物的细节图。
[0017] 图3提供了使用玻璃珠和微型珠磨式研磨器从酵母细胞中制备的酵母细胞壁提取物的特征:在无粘土条件下培养的酵母细胞(只有酵母细胞壁“YCW”)、在存在0.5%粘土条件下培养的酵母细胞(YCW+0.5%)、在存在1%粘土条件下培养的酵母细胞(YCW+1.0%)及在存在2%粘土条件下培养的酵母细胞。此外,真菌毒素玉米赤霉酮对每个样品的吸附百分比。
[0018] 图4提供了使用蛋白酶切从酵母细胞中制备的酵母细胞壁提取物的特征,所述细胞为在无粘土条件下培养的酵母细胞(只有YCW)、在存在1%粘土条件下培养的酵母细胞(YCW+1.0%)及在存在2%粘土条件下培养的酵母细胞。
[0019] 图5示出了酵母细胞的解剖图。
[0020] 图6示出了半工业规模生产的两批CIYCW的组成。
[0021] 图7示出了用半工业规模酵母细胞壁得到的螯合效率的结果,所述酵母细胞壁在具有或不具有蒙皂石粘土的情况下用或不用酶水解提取。在保持恒定的pH值为4.0的反应介质中,包含对AFB1和ZEA的螯合剂产物的水平分别为0.1和0.4%。该试验在37℃和定轨搅拌下于90分钟期间进行,并使用配有荧光检测器的HPLC评估结合的毒素的量。
[0022] 图8示出了用酵母细胞壁得到的螯合效率结果,所述酵母细胞壁用蒙皂石粘土产生并用酶水解提取。在保持恒定的pH值为4.0的反应介质中,包含对AFB1和ZEA的螯合剂产物的水平分别为0.1和0.4%。该试验在37℃和定轨搅拌下于90分钟期间进行,并使用配有荧光检测器的HPLC评估结合的毒素的量。
[0023] 图9示出了用不同酵母细胞壁得到的吸附结果,所述细胞壁来自在具有或不具有MBB02的情况下生长的三种菌株并用或不用酶水解提取。在保持恒定的pH值为4.0的反应介质中,包含对AFB1和ZEA的螯合剂产物的水平分别为0.1和0.4%。该试验在37℃和定轨搅拌下于90分钟期间进行,并使用配有荧光检测器的HPLC评估结合的毒素的量。
[0024] 定义
[0025] 本文中所使用的术语“酵母”和“酵母细胞”是指真菌界中分类的真核微生物,其具有细胞壁、细胞膜和胞内组分。酵母不形成特定的分类学或系统发育学的分组。目前,大约1500种是已知的;据估计,全部酵母菌种中,仅描述了百分之一。术语“酵母”通常作为酿酒酵母的同义词,但其在子囊菌亚和担子菌亚门的位置示出了酵母的系统发育多样性。芽殖酵母菌(“真酵母”)被划分在酵母菌目。多数酵母菌种通过出芽无性繁殖,但有些菌种通过二分裂繁殖。酵母是单细胞的,但有些菌种通过形成连接出芽细胞的的丝(称为假菌丝)变成多细胞。酵母大小可根据其菌种相差很大,通常测量直径在3-4μm,但有些酵母可达超过40μm。
[0026] 本文中所使用的术语“酵母细胞壁”也被称为“YCW”,是指酵母生物体的细胞壁,其围绕酵母的原生质膜和胞内组分。酵母细胞壁包括酵母细胞壁外层(主要是甘露聚糖)和内层(主要是葡聚糖和几丁质)两者。细胞壁的功能是提供支撑并保护酵母内部(其代谢活性中心)。在酵母细胞壁发生信号转导和识别途径。酵母细胞壁的组成根据酵母的生长条件随菌株发生变化。
[0027] 本文中所使用的术语“酵母细胞壁提取物”是指已破裂或“裂解”(例如,在破裂和裂解阶段)并与酵母细胞的可溶性胞内组分分离的酵母细胞壁。
[0028] 当与酵母细胞壁相关使用时如“分离的酵母细胞壁”或“分离的粘土掺入的酵母细胞壁”或“包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖结构的分离的酵母细胞壁”,术语“分离的”,是指被鉴定并与至少一种其通常在其自然来源中相伴随的组分分离的酵母细胞壁或其组分。因此,分离的酵母细胞壁以与其在自然中存在的不同形式或情形存在(例如,与酵母的胞内组分分离)。相反地,非分离的酵母细胞壁是以其在自然中存在的状态存在的酵母细胞壁或其组分。在一些实施方案中,分离的酵母细胞壁用于描述酵母细胞壁提取物。
[0029] 本文中所使用的术语“纯化的”或“纯化”是指自样品中去除组分。例如,通过去除非酵母细胞壁组分(例如,原生质膜和/或酵母胞内组分)纯化酵母细胞壁或酵母细胞壁提取物;其还通过去除非酵母细胞壁的污染物或其他物质纯化。非酵母细胞壁组分和/或非酵母细胞壁污染物的去除引起样品中酵母细胞壁或其组分百分比的增加。在另一实例中,通过去除非酵母细胞壁组分(例如,原生质膜和/或酵母胞内组分)纯化包含整合/交织到酵母细胞壁的粘土或粘土组分的酵母细胞壁,因此样品中,包含整合/交织到细胞壁的粘土或粘土组分的酵母细胞壁的百分比增加。
[0030] 本文中所使用的术语“浓缩的酵母细胞壁提取物”是指通过一个或多个程序(例如,通过干燥(例如,在干燥和浓缩阶段期间))浓缩的酵母细胞壁提取物。在另一实例中,浓缩的酵母细胞壁提取物是通过去除非酵母细胞壁组分纯化的酵母细胞壁制剂或酵母细胞壁提取物制剂。
[0031] 本文中所使用的术语“修饰的酵母”和“改变的酵母”是指以以下方式培养的酵母,所述方式改变酵母的组成、结构和/或功能(例如,改变酵母细胞壁的组成、结构和/或功能(例如,包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖比例和/或整合/交织到酵母细胞壁的粘土/粘土组分的酵母细胞壁,其与不含有改变的葡聚糖∶甘露聚糖比例和/或非粘土或非粘土组分整合的/交织的酵母细胞壁的功能不同))。
[0032] 本文中所使用的术语“修饰的酵母细胞壁”是指修饰的或改变的酵母的酵母细胞壁。
[0033] 本文中所使用的术语“修饰的酵母细胞壁提取物”是指修饰的或改变的酵母的酵母细胞壁提取物。
[0034] 本文中所使用的术语“浓缩的修饰的酵母细胞壁提取物”本文用于指源于经修饰或改变酵母的浓缩的酵母细胞壁提取物,例如,在美国专利号6,045,834中所描述。
[0035] 本文中所使用的术语“粘土交织的酵母”、“粘土整合的酵母”、“粘土组分交织的酵母”、“粘土组分整合的酵母”是指存在粘土或粘土组分条件下生长或培养的酵母,其已将粘土或粘土组分掺入到或交织到酵母细胞壁中。粘土或粘土组分交织的酵母是修饰的酵母的特殊类型。
[0036] 本文中所使用的术语“交织的”,如在“粘土交织的酵母细胞壁提取物”、“粘土组分交织的酵母细胞壁提取物”等中,是指粘土或粘土组分整合到酵母细胞壁中。尽管机理对实施本发明不是必须的且本发明不限于任何特定的作用机理,但在一些实施方案中,粘土或粘土组分交织到酵母细胞壁发生在酵母生长期间(例如,在其无性繁殖周期(出芽)之后(例如,随着子代细胞生长并形成其酵母细胞壁网络,粘土或粘土组分整合到酵母细胞中))。在一个实例中,葡聚糖和/或几丁质链的延伸提供了整合位点,其涉及出芽期间粘土或粘土组分的整合,导致产生包含整合至其细胞壁中的粘土或粘土组分的子代细胞。在另一实例中,大分子粘土结构将酵母细胞捕获于其层状网络中,其中酵母细胞通过出芽进行进一步将粘土或粘土组分整合到酵母细胞壁。酵母细胞壁整合/交织的粘土和/或粘土组分在提取细胞壁之后,仍然整合/交织到酵母细胞壁中。
[0037] 本文中所使用的术语“粘土交织的酵母细胞壁”、“粘土组分整合的酵母细胞壁”、“粘土组分交织的酵母细胞壁”和“粘土整合的酵母细胞壁”是指存在粘土条件下生长或培养的酵母的酵母细胞壁,该酵母已将粘土或粘土组分掺入到或交织到酵母细胞壁中。
[0038] 本文中所使用的术语“粘土交织的酵母细胞壁提取物”、“粘土组分交织的酵母细胞壁提取物”、“粘土整合的酵母细胞壁提取物”和“粘土组分整合的酵母细胞壁提取物”是指已将粘土或粘土组分整合到或交织到酵母细胞壁中的酵母(例如,其中将由其得到细胞壁提取物的酵母在存在粘土的条件下生长或培养)的酵母细胞壁提取物。
[0039] 本文中所使用的术语“浓缩的交织的酵母细胞壁提取物”和“浓缩的整合的酵母细胞壁提取物”是指存在粘土的条件下生长或培养的酵母的浓缩的酵母细胞壁提取物,该酵母已将粘土或粘土组分掺入到或交织到酵母细胞壁中。
[0040] 本文中所使用的术语“体内”是指在活有机体中进行的研究和/或试验,其发生在生物有机体内。
[0041] 本文中所使用的术语“体外”是指活有机体外的人造环境,以及通常发生在生物体内但使其发生在人造环境中的生物过程或反应。体外环境可包括但不限于试管和细胞培养。
[0042] 本文中所使用的术语“高效液相色谱”和术语“HPLC”是指分离化合物的液相色谱的一种形式。化合物溶解在溶液中。通过将样品混合物柱注射到柱中分离化合物。HPLC仪器包括流动相储器、注射器、分离柱和检测器。柱流出液中存在的分析物通过定量检测折射率、设定波长下的紫外-可见光吸收、合适波长激发的荧光或电化学反应的变化来记录。
[0043] 本文中所使用的术语“扫描电子显微镜”和术语“SEM”是指电子显微镜的一种类型,其在光栅扫描模式下使用高能量电子束扫描样品表面使其成像。电子与组成样品的原子相互作用产生信号,所述信号包含样品表面形貌、组成及其他性质(例如电导率)的信息。
[0044] 本文中所使用的术语“固定剂”是指这样的化学物质,其能够将一种物质固定到另一种物质以“固定”、稳,或者以其他方式将该物质保持在目前的形式以防止其降解或其他变化。通常,固定剂用于扫描电子显微镜(SEM)以制备样品。第一固定剂:本文中所使用的术语“第一固定剂”是指用于“固定”物质的第一种固定剂。第二固定剂:本文中所使用的术语“第二固定剂”是指用于“固定”物质的第二种固定剂。第三固定剂:本文中所使用的术语“第三固定剂”是指用于“固定”物质的第三种固定剂。
[0045] 本文中所使用的术语“分析物”是指原子、分子、原子和/或分子组、物质或化学成分。分析物内部及其本身不能被测量,然而,分析物的外观或性质(物理、化学、生物等)可使用分析方法例如HPLC测定。例如,不能测量“椅子”(分析物组分)内部及其本身,但可测量椅子的高度、宽度等。同样地,不能测量真菌毒素,但可测量与其浓度相关的真菌毒素荧光。
[0046] 本文中所使用的术语“信号”通常用于提及表明反应已经发生(例如,抗体抗原结合)的任何可检测过程。可定性和定量评估信号。“信号”类型的实例包括但不限于放射性信号、荧光信号或比色产物/试剂信号。
[0047] 本文中所使用的术语“生物利用度”是指生物体可利用的或到达体循环的分子或组分的百分数。当静脉施用分子或组分时,其生物利用度为100%。然后,当通过其他途径(如口服)施用分子或组分时,其生物利用度降低(由于不完全的吸收和首过代谢)。
[0048] 本文中所使用的术语“吸收”是指材料“吸收”或“吸取”另一种物质的过程。例如,“吸收”可指通过扩散或渗透将物质吸收或同化进入细胞或跨过组织或器官的过程(例如,通过消化系统吸收营养物或吸收药物进入血流)。
[0049] 本文中所使用的术语“吸附”是指材料被固体或液体(螯合剂和/或吸附剂)螯合和/或聚集在其表面(例如,从而形成分子或原子膜(吸附物))时发生的过程。
[0050] 本文中所使用的术语“螯合”和/或术语“螯合作用”是指两个或更多个相互接触的实体的物理缔合(例如,通过对接或包裹)(例如,从而形成稳定复合物)。缔合的典型形式包括但不限于氢键结合、配位作用及离子对形成。螯合相互作用还可涉及取决于每个实体的立体化学和几何学(例如,进一步定义螯合作用的特异性)的可变数量的化学相互作用(例如,化学键)。当两个或更多个实体螯合时,他们可通过化学键螯合,但也可通过电荷或其他类型的相互作用缔合。
[0051] 本文中所使用的术语“螯合剂(sequestration agent和/或sequestering agent)”是指能够诱导或以其他方式参与螯合作用和/或与第二实体形成复合物的实体。
[0052] 本文中所使用的术语“吸着”是指吸附和吸收。
[0053] 本文中所使用的术语“有效量”是指足以引起有益或所需结果的组合物(例如,包含本发明酵母细胞、酵母细胞壁或修饰的酵母细胞壁组分)的量。有效量可与另一种物质在一次或多次给予、施用或一个或多个剂量中施用和/或组合,并且并不意图限于特定制剂或施用途径。
[0054] 本文中所使用的术语“消化”是指将食品、饲料或其他有机化合物转化为可吸收的形式;指通过热和湿度或化学作用软化、分解或破裂。
[0055] 本文中所使用的“消化系统”是指其中可以发生或确实发生消化的系统(包括胃肠系统)。
[0056] 本文中所使用的术语“饲料”是指被动物消耗并对动物饮食提供能量和/或营养的材料。饲料的实例包括但不限于全混合日粮(TMR)、粮草、颗粒饲料、精料、预混合料、副产品、谷物、酒糟、糖浆、纤维、草料、草、干草、谷粒、叶、粗粉、可溶物及添加物。
[0057] 本文中所使用的术语“动物”是指动物界的那些动物。这包括但不限于,牲畜、农畜、家畜、宠物、海洋和淡水动物及野生动物。
[0058] 本文中所使用的术语“施用”(administration)及术语“施用”(administering)是指给予受试者(例如,受试者或体内、体外或离体细胞、组织和器官)物质或治疗处理的行为,所述物质包括药物、前药或其他药剂。施药的典型途径可通过眼睛(眼的)、嘴(口服的)、皮肤(局部的或透皮的)、鼻(鼻的)、(吸入的)、口腔黏膜(含服)、、直肠、阴道、通过注射(例如,静脉注射、皮下注射、瘤内注射、腹膜内注射等)等。
[0059] 本文中所使用的术语“共同施用”(co-administration)和术语“共同施用”(co-administering)是指对受试者和/或材料(例如,饲料)施用至少两种物质或疗法。两种或更多种物质或疗法的共同施用可同时进行,或在第二物质/疗法之前可施用第一物质/疗法。
[0060] 本文中所使用的术语“治疗”是指改善和/或逆转疾病(例如,真菌毒素中毒症)的症状。术语“治疗”是指治疗性治疗和预防或防止措施二者。例如,可从使用本发明的组合物和方法的治疗中受益的受试者包括患有疾病和/或病症(例如,真菌毒素中毒症)的受试者及待预防疾病和/或病症的受试者(例如,使用本发明的预防性治疗)。
[0061] 本文中所使用的术语“处于疾病的险中”是指易患有特定疾病的受试者。这种易患病的体质可是遗传性的(例如,经历疾病(例如可遗传病症)的特定遗传倾向)或由于其他因素所致(例如,年龄、体重、环境条件、暴露于环境中存在的有害化合物等)。
[0062] 本文中所使用的术语“疾病”、术语“感染”和术语“病理状态或反应”是指与活体动物或其任何器官或组织的正常状态的损伤有关的状态、体征和/或症状,其阻碍或改变正常功能的表现,且可以是对环境因素(例如营养不良、工业灾害或气候,包括真菌毒素中毒症)、特定传染物(例如蠕虫、细菌或病毒)、生物体的固有缺陷(例如各种遗传异常)或其组合及其他因素的反应。
[0063] 本文中所使用的术语“真菌毒素中毒症”是指其中真菌毒素通过人体或动物体的抵抗屏障的病况。真菌毒素中毒症可被视为感染或疾病,且可对患者产生有害效应。
[0064] 本文中所使用的术语“真菌毒素”是指由各种真菌种类产生的有毒的和/或致癌的化合物。
[0065] 本文中所使用的术语“患有疾病”是指经历特定疾病的受试者(例如,动物或人类受试者),且不限于任何特定的体征或症状或疾病。
[0066] 本文中所使用的术语“有毒的”是指与接触或施用毒素/毒物之前的相同细胞或组织相比,对受试者、细胞或组织的任何不利的、有毒的、有害的或其他负作用。
[0067] 本文中所使用的术语“酸”如本文所用是指可提供质子和/或接受电子的任何化学化合物。酸包括但不限于:盐酸氢溴酸、硫酸、硝酸、高氯酸、延胡索酸、马来酸、磷酸乙醇酸、乳酸、水杨酸、琥珀酸甲苯-p-磺酸、酒石酸、醋酸、柠檬酸、甲磺酸、乙磺酸、甲酸苯甲酸丙二酸、磺酸、-2-磺酸、苯磺酸等。其他酸例如草酸,尽管其自身不是药学上可接受的,但可用于盐类的制备,所述盐类可用作获得本发明化合物及其药学上可接受的酸加成盐的中间体。
[0068] 本文中所使用的术语“碱”是指可接受质子和/或提供电子或氢氧根离子的任何化学化合物。碱包括但不限于:碱金属(例如钠)氢氧化物、碱土金属(例如镁)氢氧化+物、氨及化学式为NW4 的化合物等,其中W是C1-4烷基。
[0069] 本文中所使用的术语“盐”是指可来源于无机或有机酸和碱的化合物。盐的实例包括但不限于:醋酸盐、己二酸盐、藻酸盐、天冬氨酸盐、苯甲酸盐、苯磺酸盐、硫酸氢盐、丁酸盐、柠檬酸盐、樟脑酸盐、樟脑磺酸盐、环戊烷丙酸盐、二葡萄糖酸盐、十二烷基硫酸盐、乙磺酸盐、延胡索酸盐、flucoheptanoate、甘油磷酸盐、半硫酸盐、庚酸盐、己酸盐、氯化物、溴化物、碘化物、2-羟基乙磺酸盐、乳酸盐、马来酸盐、甲磺酸盐、2-萘磺酸盐、烟酸盐、草酸盐、棕榈酸盐、果胶酯酸盐、过硫酸盐、苯丙酸盐、苦味酸盐、特戊酸盐、丙酸盐、琥珀酸盐、酒+石酸盐、硫代氰酸盐、甲苯磺酸盐、十一酸盐等。盐的其他实例包括与合适阳离子例如Na、+ +
NH4 和NW4(其中W是C1-4烷基)等化合的本发明化合物的阴离子。
[0070] 本文中所使用的术语“药物组合物”是指活性剂(例如,包含本发明活的酵母细胞、酵母细胞壁或修饰的酵母细胞壁组分的组合物)与惰性或活性载体的组合,这使组合物特别地适合体外、体内或离体诊断或治疗应用。
[0071] 本文中所使用的术语“药学上可接受的”和术语“药理学上可接受的”是指基本不会产生比已知有益反应更多的已知不良反应的组合物。
[0072] 本文中所使用的术语“消泡剂”是指用于防止泡沫形成或被添加以使已形成的泡沫破裂的添加剂。“消泡剂”也被称为“防泡剂”和“去泡剂”,是指这样的添加剂,其减少发酵罐中由于通风或搅拌产生的溶液或介质或乳液或肉汤的表面张,从而抑制或改变泡沫的形成。常用的物质是难溶的油类、二甲基聚硅氧烷和其他硅酮,某些醇类例如硬脂酰癸醇、十八醇、磺酸盐类、硬脂酸盐类和二醇类。
[0073] 本文中所使用的术语“细胞”是指可作为生命的功能独立的单位(如在单细胞生物的情况下,例如酵母)或多细胞生物(如植物或动物中)中的亚单位存在的自主的自我复制单位,所述亚单位针对导致生物体作为整体而被特化成执行特定功能。有两种不同类型的细胞:原核细胞和真核细胞。
[0074] 本文中所使用的术语“真核生物”是指其细胞组织成封闭于膜内的复杂结构的生物。“真核生物”区分于“原核生物”。术语“原核生物”是指缺少细胞核或其他膜结合细胞器的生物。术语“真核生物”是指具有表现出真核生物的典型特征的细胞的所有生物,所述典型特征为例如存在由核膜界定的真细胞核(其中存在染色体),存在膜结合细胞器,及真核生物中常见的其他特征。因此,该术语包括但不限于诸如真菌、原生动物及动物等这些生物,。
[0075] 本文中所使用的术语“细胞培养物”是指细胞的任何体外培养物。该术语包括连续细胞系(例如,具有永生的表型)、原代细胞培养物、转化细胞系、有限细胞系(例如,非转化细胞)及任何其他体外维持的细胞群体。
[0076] 本文中所使用的术语“细胞繁殖”是指细胞增殖过程,具有三个主要阶段。细胞繁殖的第一阶段涉及“亲代细胞”DNA的复制。第二阶段是复制的DNA分离成两个大小相同的染色体组。第三阶段是整个细胞的物质分裂,通常称为胞质分裂。真核生物中的细胞繁殖比其他生物更复杂。非真核细胞如细菌细胞通过二分裂繁殖,该过程包括DNA复制、染色体分离和胞质分裂。真核细胞繁殖涉及有丝分裂或被称为减数分裂的更复杂的过程。有丝分裂和减数分裂有时被称为两个“核分裂”过程。二分裂与涉及有丝分裂的真核细胞繁殖相似。两者都导致产生两个子代细胞,其与亲代细胞具有相同数量的染色体。减数分裂用于二倍体生物的特定细胞繁殖过程。其产生4个特别的“子代细胞”(配子),其具有正常细胞DNA数量的一半。然后雄性和雌性配子相结合产生合子,其是再次具有正常数量的染色体的细胞。
[0077] 本文中所使用的术语“酵母繁殖”是指酵母的生殖周期,其具有无性繁殖和有性繁殖周期,然而,酵母中营养体生长的最常见模式是通过“出芽”或“分裂”的无性生殖,其中在“亲代细胞”上形成“子代细胞”。亲代细胞的细胞核分裂成子代细胞核并迁移到子代细胞中。芽继续生长直到其从“亲代细胞”分离,形成一个新的细胞。在高应力条件下,单倍体细胞通常会死亡,然而在相同条件下二倍体细胞可经历孢子形成,进入有性生殖(减数分裂)并产生各种单倍体孢子,其可继续配对(缀合),重新形成二倍体。
[0078] 本文中所使用的术语“出芽”是指真菌(例如,酵母)和原生动物中的一种细胞分裂类型,其中一个“子代细胞”发育为另一个“子代细胞”的更小的突起。通常出芽细胞的位置由“亲代细胞”的极性确定。在一些原生动物中,出芽的子代细胞可位于另一个子代细胞的细胞质内。
[0079] 本文中所使用的术语“子代细胞”是指亲代细胞分裂形成的两个或更多个细胞之一。
[0080] 本文中所使用的术语“亲代细胞”和术语“母细胞”是指通过细胞分裂产生子代细胞的细胞。
[0081] 本文中所使用的术语“接种”是指将微生物或微生物悬浮液(例如,酵母、真菌、细菌等)引入培养基中的行为。接种是将某物引入其生长或繁殖的地方的行为或过程。
[0082] 本文中所使用的术语“接种物”和术语“预接种物”是指用于接种的细胞,如添加以开始培养的细胞。
[0083] 本文中所使用的术语“生长过程”是指适用于酵母细胞的活细胞繁殖,其中措词“细胞生长”是“通过细胞繁殖细胞数量的增长”概念的简写。在细胞繁殖期间,一个细胞(“亲代细胞”或“母细胞”)分裂产生“子代细胞”。
[0084] 本文中所使用的术语“培养酵母”和术语“使酵母生长”是指使酵母增殖和/或繁殖的行为。
[0085] 本文中所使用的术语“离心”是指使用离心器产生的离心力根据大小或密度分离分子,所述离心器施加垂直于轴的力使物体围绕固定轴旋转。离心机利用沉降原理工作,其中使用向心加速度使较大密度和较小密度的物质均匀地分布到不同的密度层。
[0086] 本文中所使用的术语“浓度”是指每个限定空间的物质的量。浓度通常以每单位体积的质量表示。为稀释溶液,必须添加更多的溶剂或减少溶质的量(例如,通过选择性蒸发喷雾干燥冷冻干燥,例如,浓缩的酵母细胞壁提取物或浓缩的修饰的酵母细胞壁提取物)。相反地,为浓缩溶液,必须添加更多的溶质或减少溶剂的量。
[0087] 本文中所使用的术语“层”是指通常水平的沉积物,所述沉积物以这样的材料层组织起来,该材料成形成在通过针对该材料的密度性能离心而分离后获得的叠加部分或区段。
[0088] 本文中所使用的术语“收获”是指收集或汇集已产生的材料的行为(例如,汇集在酵母生产期间所产生的材料)。
[0089] 本文中所使用的术语“粘土”是指矿物粘土、合成的、有机粘土及其任何混合物。
[0090] 本文中所使用的术语“矿物粘土”是指自然产生的或合成的主要由细颗粒的矿物(硅酸盐)组成的材料,所述矿物通过含水量的可变范围显示可塑性(其可由于因极向引力而陷于结构中的水所致),并可在干燥和/或火烧时被硬化。硅酸盐的实例包括但不限于页硅酸盐、膨润土、沸石、硅铝酸盐、蒙脱土、蒙皂石、高岭石。
[0091] 本文中所使用的术语“有机粘土”和术语“修饰的粘土”是指有机修饰的页硅酸盐,其源自于自然产生的粘土矿物。通过交换有机阳离子(典型的季烷基铵离子)或多聚糖的最初间层阳离子,产生亲有机物质的表面,其由共价连接的有机部分组成。层状结构仍然类似于原页硅酸盐。
[0092] 本文中所使用的术语“干燥”是指喷雾干燥、冷冻干燥、风干、真空干燥或任何其他减少或消除物质中液体的过程。
[0093] 本文中所使用的术语“喷雾干燥”是指一种干燥含液体的物质的常用方法,其使用热气蒸发液体以减少或消除物质中的液体。换言之,通过喷洒或雾化热的干燥空气的气流干燥材料。
[0094] 本文中所使用的术语“冷冻干燥”和术语“升华干燥”和术语“冻干”是指通过升华作用在冷冻状态下从物质中去除溶剂。通过冷冻材料以使其在低于共熔点下被干燥,然后提供升华作用的潜热,来实现冷冻干燥。热量输入的精确控制允许从冷冻状态下干燥,不需要回熔产物。在实际应用中,该过程在减压条件下被加速并精确控制。
[0095] 本文中所使用的术语“干的自由流动的粉末”是指自由流动的干燥粉末。
[0096] 本文中所使用的术语“研磨”是指通过冲压、剪切或摩擦减少颗粒大小。
[0097] 本文中所使用的术语“洗涤”是指去除或清洗(例如,使用任何类型的溶质(例如,蒸馏水、缓冲液或溶剂)或混合物)制剂中的杂质或可溶性多余组分(例如,可洗涤酵母细胞壁提取物以从样品中去除非酵母细胞壁组分)。
[0098] 本文中所使用的术语“酶”是指具有特征性的氨基酸序列的蛋白质或基于蛋白质的分子,所述氨基酸序列折叠产生特异的三维结构,其给予分子独有的特性并作为催化剂或化学物,用于特异性化学反应,使特定的反应物(称作底物)组转化为特定的产物。
[0099] 本文中所使用的术语“肽”,术语“多肽”和术语“蛋白质”是指通过“肽键”共价连接的氨基酸的一级序列。一般地,肽由几个氨基酸组成,通常为2-50个氨基酸,并比蛋白质短。术语“多肽”包括肽和蛋白质。肽、多肽或蛋白质可以是合成的、重组体或自然产生的。通过人工方法体外产生合成肽(例如,不在体内产生)。
[0100] 本文中所使用的术语“蛋白酶”是指各种酶中的任何一种,包括内肽酶和外肽酶,其催化蛋白质水解破坏成肽或氨基酸。
[0101] 本文中所使用的术语“裂解”是指酵母细胞膜及酵母细胞壁的分解或破裂,引起胞内组分的释放。本文中所使用的“裂解”由于物理的/机械的、酶的(包括自溶和水解)或渗透机制(包括“醇休克(alcohol shocking)”和水解)而发生。
[0102] 本文中所使用的术语“自溶”是指通过自身产生的酶裂解部分或整个细胞或组织。
[0103] 本文中所使用的术语“水解”是指加水使化合物分裂成片段的过程(例如,其用于将聚合物分解为更简单的单元(例如,淀粉转化为葡萄糖))。
[0104] 本文中所使用的“醇休克”是指如下产生的渗透应力:通过将醇(例如,乙醇)添加到生长培养基中,以在培养基中的渗透压和在培养基中生长的细胞(例如,酵母细胞)内的渗透压之间产生差异。醇休克可引起培养基中生长的细胞(例如,酵母细胞)的裂解。
[0105] 本文中所使用的术语“渗透”是指溶剂(例如,水)通过半透膜,从低溶质浓度的溶液(高水势)向高溶质浓度的溶液(低水势),沿着溶质浓度梯度的扩散。这是一个物理过程,其中溶剂在不需要输入能量的情况下跨过半透膜(对溶剂是可渗透的,但对溶质不可渗透)移动,所述半透膜分隔两种不同浓度的溶液。溶剂的净流动是从低浓度(低渗)流动到高浓度(高渗)溶液,这倾向于降低浓度的差异。
[0106] 本文中所使用的术语“渗透应力”和术语“渗透压休克”是指细胞周围溶质浓度的突然变化,引起水跨过其细胞膜的流动的快速变化。在上清液中高浓度的盐、底物或任何溶质的条件下,水通过渗透从细胞中抽出。这也抑制底物和辅因子转运到细胞中,从而“休克”细胞。或者,在低浓度溶质下,水大量进入细胞,使其膨胀并胀裂或发生凋亡。
[0107] 本文中所使用的术语“样品”以广义使用,包括从任何来源获得的标本或培养物,及生物和环境样品。生物样品可从动物(包括人类)获得,其包括液体、固体、组织和气体。生物样品包括血液制品,例如血浆、血清等。环境样品包括环境材料,例如表面物质、土壤、水、晶体和工业样品。
[0108] 本文中所使用的术语“复合物”是指通过两个或更多个分离的实体的缔合形成的实体(例如,两个或更多个实体的缔合,其中所述实体是相同或不同的(例如,相同或不同的化学物质))。所述缔合可通过共价键结合或非共价键形成(例如,通过范德华力、静电、电荷相互作用、疏水相互作用、偶极相互作用和/或氢键力(例如,聚氨酯键、酰胺键、酯键及其组合))。
[0109] 发明详述
[0110] 本发明提供新型酵母细胞,其包括被修饰的细胞壁结构(例如,粘土和/或粘土组分交织到酵母细胞壁中和/或改变葡聚糖∶甘露聚糖比);生产所述细胞的方法,包含和/或得自所述细胞的组合物及其使用方法(例如,螯合细菌和真菌毒素)。
[0111] 在一些实施方案中,本发明提供包含交织到细胞壁中(例如,由于在存在粘土条件下培养酵母细胞所致)的粘土和/或粘土组分的酵母细胞壁提取物(例如,分离的、纯化的、修饰的和/或浓缩的细胞壁提取物),和/或包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖结构的酵母细胞壁提取物。在一些实施方案中,将含括交织到酵母细胞壁中的粘土和/或粘土组分的粘土交织的酵母细胞壁提取物和/或包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖结构的酵母细胞壁提取物,混合或以其他方式添加到饲料、有机物质(例如,垫料)和/或水中,从而螯合真菌毒素(例如,在动物的胃肠道中或过滤期间)并消除或降低真菌毒素的负作用。因此,在一些实施方案中,本发明提供显著改善基于酵母细胞壁的材料对真菌毒素的吸附/螯合特性的方法(例如,其在动物消化道中显著吸附和/或螯合各种真菌毒素和/或限制各种真菌毒素的生物利用度(例如,所述真菌毒素在使用以下时不被吸附和/或螯合:仅粘土、仅酵母细胞壁提取物、其中在干混合基础上稍后加入粘土的酵母细胞壁提取物的混合物(combination);和/或除基于粘土的产品外化学移植的多糖材料))。
[0112] 在一些实施方案中,本发明提供一种在存在一种或多种粘土条件下生长的酵母细胞的新型制剂。在一些实施方案中,从在存在一种或多种粘土条件下生长的粘土交织的酵母细胞中提取粘土交织的酵母细胞壁。在一些实施方案中,粘土交织的酵母细胞壁提取物被纯化和/或浓缩。如本文所述,本发明不限于任何特定酵母细胞株或任何特定粘土。在一些实施方案中,粘土来源是标准的商业级粘土来源(例如,选择用于显示在体外、体内和/或离体对真菌毒素的性质,或因其并不显示在体外、体内和/或离体对真菌毒素的性质而选择的粘土来源)。本发明的组合物和方法可用于在各种受试者中吸附和/或螯合真菌毒素。实际上,本发明不限于受试者类型,所述受试者从本文中所述的组合物和方法受益。本发明可有益于所有动物,然而,例示性的受试者包括但不限于人、鸟类、牛、猪、马、绵羊、山羊、犬、猫、鱼类、骆驼科动物、啮齿类动物物种及鱼类和甲壳类受试者。在一些实施方案中,当与有机物质(例如,包括垫料和饲料)和/或水混合,和/或直接喂给受试者时,本发明的组合物减少受试者对真菌毒素的吸收或摄取,从而在受试者中缓解降低的性能、健康和/或减少真菌毒素相关疾病的发病率和病理反应。
[0113] 在一些实施方案中,本发明提供制备和/或产生酵母细胞的方法,所述酵母细胞包括交织到酵母细胞壁中的粘土和/或粘土组分,和/或包括改变的葡聚糖∶甘露聚糖结构。例如,在一些实施方案中,本发明提供在存在粘土条件下产生和/或培养的酵母细胞,其中所述酵母细胞壁包含的葡聚糖∶甘露聚糖比高于(例如高于2.5%、高于5%、高于10%、15%、高于20%、高于25%、高于30%、高于40%、高于50%或更多)无粘土条件下产生/培养的酵母细胞的葡聚糖∶甘露聚糖比(参见,例如,实施例2)。在一些实施方案中,本发明提供了从在存在粘土条件下产生和/或培养的活酵母细胞获得(例如分离、纯化和/或浓缩)的酵母细胞壁提取物,其中所述酵母细胞壁包含的葡聚糖∶甘露聚糖比高于(例如高于2.5%、高于5%、高于10%、15%、高于20%、高于25%、高于30%、高于40%、高于
50%或更多)无粘土条件下产生/培养的酵母细胞的葡聚糖∶甘露聚糖比(参见,例如实施例2)。
[0114] 因此,本发明提供来自在存在粘土条件下培养的酵母的新型粘土交织的酵母细胞壁提取物及其产生方法。在一些实施方案中,产生酵母细胞的方法包括在存在一种或多种粘土的条件下培养酵母细胞以改变或以其他方式修饰酵母细胞壁(例如,以增加酵母细胞壁吸附和/或螯合真菌毒素的能力(例如,由于用粘土和/或粘土组分交织和/或包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖结构的酵母细胞壁)),所述酵母细胞包括但不限于酵母属、假丝酵母属、克鲁维酵母属和有孢圆酵母属的种。在一些实施方案中,本发明提供一种或多种基于粘土的材料与酵母细胞培养基的混合(例如,如实施例1、5和6中所述),所述基于粘土的材料包括但不限于:硅酸盐(例如,网硅酸盐组(沸石、石英长石);页硅酸盐(例如,高岭石、埃洛石、dicktite、nacrit、温(chysotile)、叶蛇纹石、利蛇纹石、滑石)、叶蜡石、蒙皂石(例如,蒙脱土、贝得石、绿脱石;蛭石、micasantigorite、白母、伊利石、多硅白云母、黑云母);海泡石、坡缕石、绿坡缕石),和/或水合硅酸铝(例如,蒙脱土、膨润土)。本发明提供活酵母细胞将粘土和/或粘土组分掺入到酵母细胞壁结构中(例如,如图1A、1B和图2所示出的)。在一些实施方案中,与酵母细胞培养基混合的一种或多种粘土存在的浓度约为总生长培养基的0.075%、0.1%、0.125%、0.25%、0.5%、1%、2%、4%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、12%、15%或更多。在一些实施方案中,与酵母细胞培养基混合的一种或多种粘土的量不超过酵母细胞在其中生长的反应器的最终含量的2%。在一些实施方案中,选择添加到酵母细胞培养基中的粘土的量,其不会引起酵母细胞培养基的膨胀(例如,约为2.0%或更少)。在一些实施方案中,选择添加到酵母细胞培养基中的粘土的量,其产生从包含以下粘土量的酵母中收获的酵母细胞壁提取物,所述粘土量已被规章批准用作非药用动物饲料中的饲料添加剂(例如,不超过总定量的2%)。在一些实施方案中,食品级的防泡剂或消泡剂添加到细胞培养基中(例如,包括但不限于非硅酮分子消泡剂、油基消泡剂(例如,矿物油、植物油、轻油或不溶于发沫培养基的其他油类)或基于硅酮化合物的消泡剂(例如,递送作为油基或水基乳剂))。在一些实施方案中,添加蜡(例如,乙烯二硬脂酰胺(EBS)、石蜡、酯蜡或脂肪醇蜡)和/或疏水性二氧化硅以改善发沫培养基中的乳化作用和扩散作用。
[0115] 在本发明的实施方案研发期间进行的实验确定许多对于在存在一种或多种粘土条件下的酵母细胞生长重要的因素。例如,在一些实施方案中,优选维持粘土支持材料与水3
的(w/v)关系(例如,对应于g/cm(g/cc))为3%或低于3%(例如,以避免达到固体或半固体状态(例如,由于粘土材料的水吸附和保持力))。因此,水可溶胀性水合硅酸铝的吸水作用是影响本发明的培养基制剂中粘土支持材料与水的比例的限制因素。在一些实施方案中,将所用的培养基和培养瓶灭菌,并按照标准程序实现微生物接种。例如,在一些实施方案中,在无菌去离子水的瓶中使用活性干酵母制备预先接种物,并在约25-30℃(例如,
28℃)培养一段时间(例如20min)。在一些实施方案中,预先接种物的接种在无菌条件下进行(例如,约30℃下)。在一些实施方案中,监测并维持pH和葡萄糖水平。在一些实施方案中,在生长过程中逐步增加对培养基的搅动(例如,100至500rpm)。在一些实施方案中,在无菌条件下,在生长过程中将一种或多种粘土添加到培养基中(例如,当少于一半、大约一半、多于一半的培养基营养物被消耗时)。
[0116] 在一些实施方案中,由于与酵母细胞培养基混合的粘土的量增加(例如,按照取决于所用一种或多种粘土的类型的量),粘土材料的膨胀性质抑制酵母细胞生长。
[0117] 在一些实施方案中,将酵母在粘土混合的酵母细胞培养基中生长提供应激生长中的酵母的条件。虽然本发明不限于任何特定的作用机理,且作用机理的理解对于实施本发明是不必要的,但在一些实施方案中,由粘土混合的细胞培养基向酵母施加的应激使酵母产生更多的葡聚糖,引起葡聚糖∶甘露聚糖比增加。
[0118] 在一些实施方案中,本发明提供在存在一种或多种粘土条件下培养的酵母细胞,其不仅使粘土和/或粘土组分交织到酵母细胞壁,而且还显示改变的细胞壁组成(例如,以改变的葡聚糖∶甘露聚糖比、总蛋白质含量和/或残余量为特征)。例如,本发明提供的酵母细胞包含的葡聚糖∶甘露聚糖比高于(例如高于2.5%、高于5%、高于10%、15%、高于20%、高于25%、高于30%、高于40%、高于50%或更多)无粘土条件下培养的酵母细胞的葡聚糖∶甘露聚糖比(参见,例如,实施例2)。与无粘土条件下产生的酵母细胞和/或酵母细胞壁提取物的总蛋白质含量相比,本发明还提供包含增加的总蛋白质含量(例如,
100%、200%、300%、400%、500%或更高的增加的蛋白质含量)的酵母细胞和酵母细胞壁提取物(参见,例如,实施例2)。
[0119] 在一些实施方案中,本发明提供了包含交织到酵母细胞壁中的粘土和/或粘土组分和/或包含改变的葡聚糖∶甘露聚糖比的结构的酵母细胞壁提取物,其与常规组合物相比,提供了更优的真菌毒素螯合性能。本发明不限于任何从酵母中产生酵母细胞壁提取物的具体方法,所述酵母在存在一种或多种粘土条件下培养。实际上,可利用各种程序产生酵母细胞壁提取物,包括但不限于:使用玻璃珠和珠磨式研磨器、酶(例如,蛋白酶(例如,木瓜蛋白酶))处理、机械裂解、自溶和水解、及其他本领域已知的方法(参加,例如,Peppler,H.J.1979.Production of yeasts and yeast products.第 157 页,载 于:Microbial Technology & Microbial Processes、第1卷(第2版)、Academic Press)。在裂解和提取之后,洗涤粘土和/或粘土组分交织的/整合的酵母细胞壁以去除胞内组分及纯化并浓缩提取物。得到的提取物可通过任何一种本领域常见的多种方法干燥,所述方法包括但不限于:冷冻干燥和/或喷雾干燥(例如,以形成吸湿的不溶于水的粉末)。
[0120] 因此,在一些实施方案中,本发明提供包括直接交织到酵母细胞壁的粘土和/或粘土组分的酵母细胞壁提取物。在一些实施方案中,包含本发明酵母细胞壁提取物的组合物包含少于约0.5%粘土、0.5-1%、1-2%、2-5%、5-10%、10-15%、15-20%、20-30%、30-40%、40-50%、50-60%、60-70%、70%或更多作为酵母细胞壁提取物的部分的粘土和/或粘土组分(根据w/w%),所述本发明酵母细胞壁提取物包含直接整合到酵母细胞壁的粘土和/或粘土组分。在一些实施方案中,增加培养基中粘土的量使酵母细胞壁提取物中粘土和/或粘土组分含量增加。
[0121] 在一些实施方案中,收集添加到酵母细胞生长培养基中未被掺入酵母细胞的粘土,并用于随后的酵母细胞生长过程(例如,回收未掺入的粘土材料)。例如,粘土相比于酵母的沉淀性质促进粘土的回收。实际上,在本发明的实施方案研发期间进行的实验产生了两个可回收层:(i)只含有粘土材料的底层(99%);及(ii)包含掺入到酵母中的粘土部分的顶层。因此,虽然机理对于实现本发明不是必须的且本发明不限于任何具体作用机理,但在一些实施方案中,本发明提供将粘土颗粒直接包含在酵母细胞壁内和/或上(例如,这使酵母细胞壁提取物制备过程继续存在(例如,通过粘土或粘土组分直接交织到酵母细胞壁的葡聚糖聚合物链中))。在其它实施方案中,在培养期间和出芽时,粘土部分俘获酵母细胞,与子代细胞一起,酵母细胞被具有宏观结构的粘土包埋,然后酵母裂解,通过洗涤去除其胞内组分。在一些实施方案中,葡聚糖链生长在粘土的层状结构之间。
[0122] 在一些实施方案中,酵母细胞或酵母细胞壁组分(例如,如本文所述产生和分离的酵母细胞壁提取物(例如包含交织到酵母细胞壁中的粘土或粘土组分,和/或包含改变的葡聚糖和/或甘露聚糖结构)),与一种或多种其他物质组合,所述其他物质包括但不限于酶(例如酯酶、环氧酶)、细菌、酵母或酵母组分、粘土等(例如在与饲料混合之前,掺入颗粒饲料,和/或喂养动物))。
[0123] 在一些实施方案中,本发明利用包含改变的酵母细胞壁结构(例如交织到酵母细胞壁中的粘土和/或粘土组分,和/或包含改变的葡聚糖和/或甘露聚糖结构的细胞壁)的酵母细胞,包含所述酵母细胞的组合物,和/或源于所述酵母细胞的组合物,其与本文所描述的一种或多种方法和/或材料一起使用,用于以下组合物和/或方法中,所述组合物和/或方法用于减少、去除和/或消除真菌毒素(例如,本文所述的物理、混合、化学、微生物学的方法(例如以吸附和/或螯合细菌和毒素))。例如,在一些实施方案中,将酵母细胞或酵母细胞壁组分(例如,如本文中所述制备的酵母细胞壁提取物(例如包含交织到酵母细胞壁的粘土或粘土组分,和/或包含改变的葡聚糖和/或甘露聚糖结构))与一种或多种本文所描述的物理、混合、化学或微生物学方法,用于螯合真菌毒素。
[0124] 本发明不受限于螯合的真菌毒素类型。实际上,本发明的组合物(例如粘土交织的酵母细胞壁提取物)可用于吸附和/或螯合各种真菌毒素,包括但不限于乙酰氧基蔍草镰刀菌烯二醇、乙酰基脱氧瓜萎镰菌醇、乙酰基瓜萎镰菌醇、乙酰基新腐皮镰孢醇、乙酰基T-2毒素、扩展到所有黄曲霉毒素,黄曲霉毒素B1、B2、G1和G2、黄曲霉震颤毒素、细交链孢酸、格链孢菌醇、austdiol、austamide、austocystin、燕麦镰孢菌素+1、白僵菌素+2、bentenolide、brevianamide、丁烯羟酸内酯、丽赤壳菌素、球毛壳菌素、桔霉素、黄绿色青霉素、螺卷毛壳醇、松胞菌素E、环匹阿尼酸、脱乙酰基丽赤壳菌素、脱乙酰基新腐皮镰孢醇、双醋酸脱氧瓜萎镰菌醇、单醋酸脱氧瓜萎镰菌醇、二乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、腐败菌素B、恩镰孢菌素、扩展到所有麦角毒素和内生菌,产果镰孢菌素+1、烟曲霉素、伏马菌素、伏马菌素B1、B2和B3、镰刀菌烯酮-X、镰孢红素酮、镰孢菌酸、镰孢素、胶霉毒素、HT-2毒素、甘薯黑疤霉二酮、岛青霉毒素、砖红镰孢菌素+1、番茄菌肽+1、畸形素、麦芽米曲霉素、念珠菌素、单乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、新腐皮镰孢醇、瓜萎镰菌醇、NT-1毒素、NT-2毒素、扩展到所有赭曲毒素,卵孢霉素、草酸、展青霉素、青霉酸、青霉震颤素、杆孢菌素E、红色青霉毒素、瑰天精、rubrosulphin、细皱青霉素、接骨木镰菌素+1、暴霉毒素F、G、H、蔍草镰刀菌三醇、根霉菌胺、stericoncentrated修饰的酵母细胞壁extracttocystin、T-1毒素、T-2毒素、三乙酰氧基蔍草镰刀菌二醇,扩展到所有单端孢菌毒素,木霉菌素、单端孢菌素、trichoverrins、trichoverrols、色氨酸震颤素、疣孢菌素、震颤真菌毒素、紫红紫素、紫黄素、viriditoxin、黄青霉素、爪哇镰菌素+1、玉米赤霉烯醇类、玉米赤霉烯酮、玉米赤霉烯酮类及其亚族和/或衍生物。在一些实施方案中,利用本发明的组合物和方法吸附和/或螯合黄曲霉毒素、玉米赤霉烯酮、赭曲毒素、单端孢菌毒素、烟曲霉毒素、展青霉素和/或与内生菌相关麦角,以及上述真菌毒素可能的缀合物和代谢物。与历史或传统方法相比,使用本发明的优点在本发明的开发过程中进行的实验中证明。例如,如本文所述,使用以下组合物的缺点在于,与本发明相比,这类组合物及其使用方在对减少真菌毒素的的负作用方面是较低效率的手段,并且缺点更多:(1)仅包含粘土的组合物,(2)仅包含酵母细胞壁提取物的组合物,以及(3)包含添加有粘土的酵母细胞壁提取物的组合物。然而,与传统组合物(例如仅包含粘土的组合物,仅包含酵母细胞壁提取物的组合物,以及包含添加有粘土的酵母细胞壁提取物的组合物,参见实施例2-3)相比,本发明的粘土交织的酵母细胞壁提取物(例如包含交织到酵母细胞壁的粘土和/或粘土组分,和/或包含改变的葡聚糖和/或甘露聚糖结构)显示出意想不到的螯合各种真菌毒素的能力,并还显示出显著增加的吸附真菌毒素的能力。因此,本发明提供以下组合物和方法,其显示出在传统组合物和方法中并未发现的针对各种真菌毒素的意想不到和更优的螯合和/或吸附性质。因此,本发明提供基于粘土交织的酵母细胞壁的材料及其制备和使用方法,以提供在动物和人的消化道内螯合真菌毒素的有效方法(例如,通过吸附存在于饲料、其他有机物和/或水中的真菌毒素),同时还对有益的营养物质具有更低的吸附或不吸附,并且对环境具有较少或没有负面影响。
[0125] 在一些实施方案中,本发明的优选外形是干燥的自由流动的粉末,其适用于直接添加到饲料、其他有机物(例如垫料)中或者作为动物的直接添加物。
[0126] 可以将本发明的组合物添加至任何有机物(例如用于动物的垫料、饲料,用于人的食物)和/或水(例如,用于动物和/或人类消耗的水、环境水(例如池塘、湖泊、水库、鱼缸等的水)),以从该物质中去除真菌毒素。当直接掺入到动物饲料中时,本发明的组合物添加量的范围为饲料重量的约0.0125%至约0.4%。当掺入到其他有机物中(例如,动物垫料)时,本发明的组合物添加量的范围为约0.0125%至约99.9%。当掺入到液体(例如水(例如过滤水))中时,本发明的组合物添加量的范围为约0.0125%至约100%。在一些实施方案中,本发明的组合物添加到饲料中的量为饲料重量的约0.025%至约0.2%。或者,本发明的组合物作为添加物直接喂给动物(例如,以每动物每天约2.5-约20克的量)。本领域技术人员立刻明白的是,待喂饲的量随着动物的种类、大小、添加本发明组合物的饲料的类型、垫料材料、水源等而变化。
[0127] 本发明的组合物可以喂给任何物动物和人。当与饲料混合或者用作饲料添加剂时,本发明的组合物降低动物对真菌毒素的生物利用度、真菌毒素的吸收或摄取,改善性能和/或健康,并降低发病率。在一些实施方案中,当本发明的组合物添加到与动物和人接触的有机材料(例如,垫料)时,本发明的组合物降低真菌毒素的生物利用度(例如,降低动物对真菌毒素的吸收和/或摄取),从而改善性能和健康,并降低发病率。在一些实施方案中,本发明的组合物添加到意图被动物或人类使用(例如用于消耗或其他目的)的水中,从而降低真菌毒素的生物利用度(例如,降低动物或人类受试者对真菌毒素的吸收和/或摄取),改善性能和健康,并降低发病率(例如,本发明的组合物降低真菌毒素的生物利用度、吸收或摄取)。在一些实施方案中,本发明的组合物添加到用于人类消耗的水(例如用于制造汁液、酒、瓶装水、咖啡、茶、牛奶或其他类型的消耗液体的水)中。在一些实施方案中,本发明的组合物添加到环境水(例如池塘、湖泊、水库、河流、溪流、灌溉渠,用于养鱼或其他类型水生物的池等)中。因此,在一些实施方案中,本发明的组合物(例如,包含整合到细胞壁的粘土或粘土组分的酵母细胞壁提取物)用于过滤液体(例如,消耗液体(例如用于饮料生产的水、饮料))。例如,在一些实施方案中,将本发明的组合物用作过滤器,或应用于过滤器,其中通过包括本发明的组合物的过滤器处理液体(例如,消耗液体(例如橙汁、苹果汁、李子汁、葡萄柚汁、蔓越橘汁、或其他类型的汁液、啤酒、酒、蒸馏液等)),其中所述组合物去除液体中的一种或多种类型的真菌毒素。
[0128] 如实施例1-4所示,在存在粘土的条件下,酵母的培养使酵母细胞壁对真菌毒素的吸附显著增加(例如从不使用粘土培养酵母时的6.917%,达到分别向培养基中添加1.0和2.0%的粘土培养时的73.553%和79.337%,所述培养基不含酵母细胞壁内层的葡聚糖的特定提取物(参见例如实施例2))。此外,随着粘土的添加,葡聚糖∶甘露聚糖比从1.066增加到1.366。尽管甘露聚糖降低,但细胞壁的蛋白质浓度增加。此外,残留的组分(例如,表示在提取过程中存在于酵母细胞壁中的葡聚糖、甘露聚糖、蛋白质,粘土,N-乙酰葡萄糖胺和/或几丁质的损失)在粘土存在区域和表面区域中增加。尽管对于实现本发明,机理不是必须的,且本发明不受限于任何特定的作用机理,但在一些实施方案中,因为生长环境和条件的改变,增加是由于增加了涉及酵母代偿机理的几丁质组分。此外,本发明的组合物(包含来自改变的酵母细胞(例如包含交织到酵母细胞壁的粘土和/或粘土组分和/或含有改变的葡聚糖和/或甘露聚糖结构的细胞壁的酵母细胞)的酵母细胞壁提取物)提供了显著和意外的吸附和/或螯合真菌毒素的能力(例如,玉米赤霉烯酮(例如,与常规组合物仅44.7%的效能相比显示79.33%的效能,所述常规组合物包含其中在干混合基础上稍后添加粘土的酵母细胞壁提取物的混合物,参见实施例1-4))。
[0129] 研究了使用蛋白酶切提取粘土交织的酵母细胞的粘土交织的酵母细胞壁的可备选方法的应用(参见实施例3)。粘土交织的酵母细胞壁的内层(葡聚糖)的特异性提取增加了粘土交织的酵母细胞壁对于真菌毒素(例如,玉米赤霉烯酮)的螯合和吸附特性。此外,在包括1.0%和2.0%的粘土的细胞培养基中培养的酵母细胞,显著增加粘土交织的酵母细胞壁对于真菌毒素(例如,玉米赤霉烯酮)的螯合和吸附活性。例如,包含其中在干混合基础上稍后添加粘土的酵母细胞壁提取物的混合物的传统组合物螯合真菌毒素的有效率为44.7%,而使用本发明的组合物获得的螯合真菌毒素的有效率为85.89%,并且黄曲霉毒素B1的吸附从2.65增加至53.70%(参见,例如,实施例3)。
[0130] 在一些实施方案中,本发明提供了生产包括粘土交织的酵母细胞壁的酵母细胞的方法。在一些实施方案中,生产各种规模的包括粘土交织的酵母细胞壁的酵母细胞(例如,测试规模、批量规模、中试规模、预生产规模、生产规模、商业规模、工业规模)。在一些实施方案中,酵母在发酵罐中生长。发酵罐可以是任何合适的尺寸(例如5升、10升、25升、50升、100升、500升、1千升、5千升、10千升、50千升、100千升、500千升、1百万升等),以生产用于本发明的所需规模的酵母(例如测试规模、中试规模、工业规模等)。在一些实施方案中,用于酵母生长的培养基可具有根据本发明的用于酵母生长的任何合适组成。
合适的营养成分是源、氮源、磷源、镁源、硫源、源和微量元素。在一些实施方案中,添加到培养基中的营养成分浓度(来源化合物的%w/w)范围为(按重量计的百分比):碳源0.01-20%(例如0.05-10%)、氮源0.001-10%(例如0.001-3%)、磷源0.001-5%(例如0.01-0.5%)、镁源0.001-0.2%(例如0.001-0.2%)、硫源0.01-0.25%(例
如0.01-0.25%)、钾源0.001-05%(例如0.01-0.25%)、有机氮源0.001-5%(例如
0.01-5%),并过量添加微量元素。在一些实施方案中,酵母培养基包括水、碳源(例如糖、葡萄糖、右旋糖、蔗糖、糖蜜等)、合适的氮源(例如氨,尿素等)、氨基酸源(例如蛋白胨等)、盐类(例如氯化钠次氯酸(calcium hipochloride)、氯化镁、硫酸镁、硫酸锌等)、以及粘土或粘土组分的来源(例如沸石、膨润土、硅铝酸盐、蒙脱土、蒙皂石、高岭石、有机粘土、其混合物等)。在一些实施方案中,酵母培养基的组分可以任何适合酵母细胞生长的量存在(参见例如实施例5)。在一些实施方案中,酵母培养基中粘土的存在,对标准的酵母生长方案带来意料之外的复杂性。在一些实施方案中,培养基中粘土的存在导致发酵罐中出现不寻常的大量起泡。在一些实施方案中,本发明在细胞培养基中提供了消泡剂(例如,非硅酮分子消泡剂、油基消泡剂(例如矿物油、植物油、轻油等)、粉末消泡剂(例如硅石)、水基消泡剂、硅酮基消泡剂、聚乙二醇聚丙二醇共聚物、烷基聚丙烯酸酯等)。在一些实施方案中,对于增加本发明的规模而言,需要消泡剂。在一些实施方案中,消泡剂的使用与放大本发明组合物的生产的能力增加有关。
[0131] 试验
[0132] 提供以下实施例,以显示和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面,并不应理解为限制本发明的范围。
[0133] 实施例1
[0134] 材料和方法
[0135] 酵母培养。以下方案用于每个Bioflow发酵罐(BioFlow III,New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,New Jersey,U.S.A.)以使酿酒酵母(来自Fermin,Alltech10
Inc.,批次#689的活性干酵母(ADY),酵母细胞数:2.38x10 个细胞/克,生存力:92.6%)生长。通过将28g新鲜的ADY Fermin转移到250ml无菌去离子水的预热瓶中,来制备酵母接种物。然后,在30℃下(水浴中)孵育溶液20分钟并搅拌几次。BioFlow培养基由66g酵母提取物、10g蛋白胨、4g右旋糖、4g酵母氮碱和1750ml去离子水组成。通过使酵母单独生长制备对照批,这需要向反应器容积中额外添加250mL去离子水。通过向反应器中添加
8g、16g和32g制备含有酵母和膨润土K10(Fluka)的三个批次。将Bioflow反应器培养基加热到30℃,并在接种前在10分钟期间以1L/min的流速注入空气。设定搅拌速度为300rpm,在整个生长过程监测培养基并维持最低pH值为5.0。添加消泡剂(根据需要添加消泡剂AES,1∶10)。然后无菌条件下注射磷酸氢二铵(DAP)(4g溶于10mL中,pH 4.0)。将之前重悬的酵母添加到发酵罐中。在生长期间,用糖尿病条(OneTouch,UltraMini,LifeScan,Inc.,Milpitas,California,U.S.A.)测定葡萄糖水平,且当葡糖糖水平低于0.8mg/mL时,添加补充的葡萄糖。在接种2小时内,搅拌速率逐渐增加到500rpm,同时加大气流(在3小时内高达4L/min)。当补充的葡萄糖底物消耗一半时,向反应器中另外添加膨润土(8g、16g和32g在250ml去离子水中)以使粘土在最终培养基中的终浓度分别达到0.5%、1.0%和
2.0%。
[0136] 当所有的糖被利用完后,收集酵母培养物。将BioFlow的内含物收集到无菌瓶中,在4000g下离心20分钟。弃上清,用0.125%NaCl水溶液清洗沉淀。根据离心后形成的2个不同层,将沉淀分离成两个部分:(i)含有粘土的层和(ii)含有酵母和粘土的层。然后用0.125%NaCl溶液清洗酵母3次。
[0137] 粘土交织的酵母细胞壁提取方法。使用两个单独的方法从如上述产生的酵母中分离酵母细胞壁部分。
[0138] 在第一种方法中,使用采用玻璃珠和微型珠磨式研磨器(Bead-Beater,Model#1107900,Biospec Products,Inc.,Hamilton Beach/Proctor-Silex,Inc.,Southern Pines,North Carolina,U.S.A.)的“微量法(micro-method)”。用2体积的含有苯甲基磺酰氟(PMSF)的10mM Tris-Cl(pH 7.4)将沉淀重悬,在5mL的总体积中用玻璃珠(50∶50,酵母浆液∶珠粒)拍击30秒,停顿1分钟,始终在上进行。重复拍击10次或直到95%细胞破裂。重新收集珠粒并清洗。将组分合并,在4000g下离心20分钟。然后收集沉淀,将其冻干并研磨。
[0139] 在第二种方法中,用无菌去离子水重悬酵母沉淀,以达到干物质的13%至15%浓度。在60℃下搅拌酵母浆。使用10%NaOH将pH值调成8.0,然后添加0.3mL/L的酶。在8小时内维持温度和搅拌条件。在最初的2小时内,每15分钟(使用10%NaOH)监测并调节pH值,然后在接下来的6小时内,每1小时监测并调节pH值。将浆液转移到无菌离心瓶中,在4000g下离心20分钟。弃上清,用3体积的冷无菌水清洗沉淀,然后再次在4000g下离心20分钟。重复清洗步骤两次,然后将沉淀冷冻、冻干和研磨。
[0140] 实施例2
[0141] 利用玻璃珠和微型珠磨式研磨器,从不存在和存在粘土的条件下培养的酵母细胞中分离的酵母细胞壁提取物的表征
[0142] 如所述(参见实施例1)使用用的珠磨式研磨器和玻璃珠的微量法,在细胞重悬于具有PMSF的pH值为7.4的Tris-HCl缓冲液之后,使酵母细胞破裂。然后分析酵母细胞壁裂解物,以表征酵母细胞壁及其在对所考虑的每种单独真菌毒素的生理pH条件下吸附真菌毒素的能力(表示为相比于存在的总真菌毒素的效能百分数)。从动力学上评估整体的吸附/结合活性。测试样品包括最少5个水平至最高10个水平的真菌毒素浓度,用分散在水性培养基中以浓度为0.25-4g/L使用的不同酵母细胞壁制剂测试,该水性培养基具有固定的pH值4,其代表动物消化道内的pH的消化条件。使用耦合有荧光和二极管阵列检测器(例如,以检测真菌毒素及吸附的/螯合的真菌毒素的量)的高效液相色谱计算吸附评价值。
[0143] 数据如图3所示。从存在粘土条件下培养的酵母细胞(粘土交织的酵母细胞)中获得的酵母细胞壁提取物,显示显著的、意外的螯合及吸附玉米赤霉烯酮的能力(例如,与从不存在粘土条件下培养的酵母细胞中提取的酵母细胞壁仅6.91%的效能相比,从存在2%粘土条件下培养的酵母细胞中提取的酵母细胞壁显示79.33%的效能)。从存在2%粘土条件下培养的酵母细胞中提取的酵母细胞壁组合物的79.33%的效率,也显著高于之前的文献中报道的传统组合物仅44.7%的效率,所述传统组合物包含其中在干混合基础上稍后添加粘土的酵母细胞壁提取物的混合物。在反应介质中包含对AFBI和ZEA的螯合剂产物的水平分别为0.1和0.4%,所述反应介质维持在恒定pH值4.0。在37℃下在90分钟期间定轨搅拌下进行试验,并且使用装备有荧光检测器的高效液相色谱评估结合的毒素的量。
[0144] 此外,存在粘土条件下生长/培养的酵母显示细胞壁成分/结构的明显改变。例如,随着粘土量增加,甘露聚糖∶葡聚糖比增加(例如,随着粘土从0、0.5%、1.0%增加至2.0%,甘露聚糖∶葡聚糖比分别从1.01增加至1.2、1.35和1.45)。随着添加到细胞培养基中粘土的量增加,蛋白质的总量也增加。
[0145] 实施例3
[0146] 利用蛋白酶切,从在不存在和存在粘土条件下生长/培养的酵母细胞中分离的酵母细胞壁提取物的表征
[0147] 如实施例1中所述,用蛋白酶处理酵母细胞。然后分析酵母细胞壁裂解物以表征酵母细胞壁及其在对所考虑的每种单独真菌毒素的生理pH条件下吸附真菌毒素的能力(表示为相比于存在的总真菌毒素的效能百分数)。从动力学上评估整体的吸附活性。测试样品包括最少5个水平至最高10个水平的真菌毒素浓度,用分散在水性培养基中以浓度为0.25-4g/L使用的不同酵母细胞壁制剂测试,该水性培养基具有固定的pH值4,其代表动物消化道内的pH的消化条件。使用耦合有荧光和二极管阵列检测器(例如,以检测真菌毒素及吸附的/螯合的真菌毒素的量)的高效液相色谱计算吸附评价值。
[0148] 数据如图4所示。从存在粘土条件下培养的酵母细胞中获得的粘土交织的酵母细胞壁提取物,显示显著的、意外的螯合和/或吸附玉米赤霉烯酮和黄曲霉毒素B1的能力。例如,从存在2.0%粘土条件下生长的酵母中获得的酵母细胞壁提取物显示对玉米赤霉烯酮85.89%的效能,而来自不存在粘土条件下培养的酵母的酵母细胞壁提取物,仅显示69%的吸附效率。从存在2.0%粘土条件下生长的酵母中获得的粘土交织的酵母细胞壁提取物显示对黄曲霉毒素B1 53.7%的效能,而来自不存在粘土条件下培养的酵母的酵母细胞壁提取物仅显示2.65%的吸附效率。此外,存在粘土条件下生长/培养的粘土交织的酵母显示细胞壁成分/结构的明显改变。在反应介质中包含对AFBI和ZEA的螯合剂产物的水平分别为0.1和0.4%,所述反应介质维持在恒定的pH 4.0。在37℃下在90分钟期间于定轨振荡下进行试验,并且使用装备有荧光检测器的高效液相色谱评估结合的毒素的量。
[0149] 将实施例1的方法与酵母的备选来源一起使用,以评估以1.0%添加至生长培养基中的蒙皂石粘土(American Colloid Company,Arlighton Height,IL,USA)对粘土交织的酵母细胞壁材料的组成的影响。研究了属于酿酒酵母的三种酵母类型:ADY Fermin(08-032/460-89)、来自Levapan的面包酵母(批次#7169281,Levapan S.A.,Bogota,Columbia)以及来自DCL的活性干酵母(批号#1390,DCL Yeast Ltd.,Alloa,Great Britain)。
[0150] 水解之前,ADY Fermin、Levapan、DCL CIYCW的酵母细胞壁中分别存在19.9、17.0和10.3%的葡聚糖水平;10.6、10.4和8.4%的甘露聚糖水平;1.5、1.4和0.9%的几丁质(N-乙酰葡糖胺)水平(参照总细胞表示),在此条件下观察粘土交织的酵母细胞壁之间的变化。
[0151] 根据选择的酵母细胞类型,所产生的材料的螯合效能也存在差异(参见图9)。在效能方面观察到的变化也与所考虑的真菌毒素类型有关。
[0152] 实施例4
[0153] 来自不存在和存在粘土条件下生长/培养的酵母细胞中的酵母细胞壁提取物的电子显微镜成像
[0154] 在本发明的实施方案研发期间进行实验,以表征并观察几种酵母样品(参见,例如图2)。通过过滤酵母在含2.5%戊二醛(GTA)的0.85%NaCl溶液中的再水化溶液制备样品。然后通过直径为13mm,孔径为0.1μm用0.85%NaCl预湿的尼龙核孔过滤溶液。然后将过滤物转移到培养皿中,并在室温下,90分钟内用GTA/二甲胂酸盐(Cac)固定剂的液滴覆盖。然后用pH值为7.2的0.1M Na Cac漂洗过滤物。通过将过滤物置于管中,在60分钟期间用100μL含2%四氧化饿的0.1M Na Cac pH 7.2进行二次固定。接着用pH值为7.2的0.1M Na Cac漂洗样品并用去离子水漂洗3次。使用乙醇系列(25%至100%)完成样品的脱水。然后,冻干样品,将其固定短柱(stub)上,该短柱用针对电导率目的的碳带制备,并涂覆有Au/P合金。在3.0keV下在S-4300 FESEM(Hitachi,Japan)上进行观察。为了去除酵母和粘土之间的任何非特异性相互作用,在用Au/P涂覆之前,在每个固定的样品上施加高压氮气流。
[0155] 实施例5
[0156] 用粘土培养的酵母细胞壁的生产的半工业放大
[0157] 放大的酵母培养。使用150L发酵罐(ML-4100,New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,New Jersey,U.S.A.)使酿酒酵母(来自Fermin,Alltech Inc.的活性干酵10
母(ADY),批次#609,酵母细胞数:2.38x10 个细胞/克,生存力:92.6%)生长。通过向预先高压灭菌(121℃,40分钟)的19L的大玻璃瓶中转移0.84kg的新鲜的ADY Fermin来制备酵母接种物,该大玻璃瓶具有配管且覆盖有含有7.5L水的生物保护层,并在高压灭菌后维持在30℃的恒温箱中过夜。通过添加9L水,6kg右旋糖和搅拌棒制备2个19L的覆盖有生物保护层的食物大玻璃瓶。将碳源混合并溶解后,高压灭菌食物基质(121℃,40分钟)。
使用1L含有250ml去离子水,120g磷酸氢二铵(用浓盐酸调节成pH 4.0-4.1)的灭菌的有盖的瓶子制备氮溶液。通过添加700mL去离子水,192g磷酸氢二铵(用浓盐酸调节成pH
4.0-4.1)制备两个1L无菌的有盖的食物氮瓶。在19L的大玻璃瓶中制备碱溶液,该大玻璃瓶具有配管、覆盖有生物保护层并含有13.5L水、1.5L KOH。然后将该配管连接到蠕动泵
在19L的大玻璃瓶中制备消泡剂(Antifoam AES,1∶10)溶液,该大玻璃瓶具有配管并覆盖有生物保护层,且含有12L水、3L消泡剂(Antifoam AES,3kg);然后混合。然后将该配管连接到蠕动泵。由1.98kg琥珀、0.3kg蛋白胨、0.12kg右旋糖、0.12kg酵母氮源、0.516g蒙皂石粘土(American Colloid Company,Arlighton Height,IL,USA)和60L水组成150L发酵培养基,将其在121℃,15psi下搅拌1小时。将该培养基冷却到30℃并在整个繁殖过程中保持该温度。
[0158] 在接种前和整个发酵过程中,温度维持在30℃下,轻微搅动(70%的功率)和注入空气(5psi)下,在150L发酵罐中进行繁殖。接种前,在150L的发酵罐中将含有0.84kg ADY(溶于7.5L水中)的接种物搅拌20至30分钟。在搅拌条件下,向每个食物大玻璃瓶添加一瓶食物氮。将氮溶液泵入150L发酵罐中,并在接种前混合至少10分钟。根据需要将消泡大玻璃瓶连接到150L发酵罐并通过配管将消泡剂泵入发酵罐中。在发酵罐内设置泡沫探测器以监测泡沫,并恰当地补充消泡剂。根据需要将碱溶液连接到150L发酵罐并通过配管泵入其中。监测150L发酵罐基质的pH演变,在整个生长过程中维持pH值为5.0的最低值。通过将接种物大玻璃瓶与端口连接并将内含物泵入150L发酵罐中进行接种。在第一次取样前,将发酵罐中的接种物混合20至30分钟。在整个繁殖过程中监测泡沫,每小时调节空气和进行搅动。内部和外部监测pH值且必要时调节pH值,以保持pH值为5.0或更高。用糖尿病条(OneTouch,UltraMini,LifeScan,Inc.,Milpitas,California,U.S.A.)测定葡萄糖水平,当葡糖糖水平低于0.8mg/mL时,通过缓慢抽入食物溶液或随着时间逐渐加快,来添加补充的葡萄糖。如果糖水平上升到0.8mg/mL以上,则减慢加料速度或必要时停止。
[0159] 当所有的糖被利用完后,收集酵母培养物。将150L发酵罐的内含物收集到无菌瓶中,在4000g下离心20分钟。弃上清,并测定洗涤的酵母的干物质的百分率。然后将材料转移回150L发酵罐,并添加水使得浆浓度从干物质的9-11%到13-15%。在任何时期都维持搅拌。
[0160] 通过酶水解的粘土交织的酵母细胞壁提取。在60℃下搅拌13-15%的干物质酵母浆。在添加0.3mL/L的酶之前,使用10%NaOH将pH值调成8.0。在8小时内维持温度和搅拌条件。在最初的2小时内,每15分钟(使用10%NaOH)监测和调节一次pH值,然后在接下来的6小时内,每1小时监测和调节一次pH值。将浆液转移到无菌离心瓶中,在4000g下离心20分钟。弃上清,用3体积的冷无菌水清洗沉淀,然后再次在4000g下离心20分钟。重复清洗步骤两次,然后将沉淀冷冻、冻干和研磨。在喷雾干燥阶段温度的增加导致产量稍微较高并且在喷雾干燥器中产品的积累变少。
[0161] 粘土材料的内含可后接样品灰分浓度的变化,灰分浓度对于粘土交织的酵母细胞壁达到约为20%的值,相比于不含任何粘土材料的酵母细胞壁提取物中的5%浓度(参见图6)。前述在Bioflow发酵罐中产生的ADY Fermin酵母细胞系与在150L发酵罐中所产生的之间在组成方面亦发现有显著区别,其中在大规模生产中,葡聚糖和甘露聚糖组成下降,但同时酵母细胞壁中的几丁质含量增加(1.5%至3%),这说明酵母细胞壁对干扰剂和涉及细胞壁信号转导途径的应答。
[0162] 评估半工业规模CIYCW产品对真菌毒素的螯合效率(参见例如图7),结果证明,CIYCW的真菌毒素吸附能力增加。
[0163] 实施例6
[0164] 利用工业源糖生产粘土交织的酵母细胞壁
[0165] 酵母培养。使酿酒酵母(来自Fermin,Alltech Inc.的活性干酵母(ADY),酵母10
细胞数:2.38x10 个细胞/克,生存力:92.6%)在Bioflow发酵罐(BioFlow III,New Brunswick Scientific Co.,Inc.,Edison,New Jersey,U.S.A.)中生长。通过将29g新鲜的ADY Fermin转移到预热的87ml无菌去离子水的瓶中,从而制备酵母接种物。然后,
30℃下(水浴)孵育该溶液20分钟,并搅拌几次。BioFlow基质由0.048g次氯酸钙、0.24g硫酸镁、0.168g硫酸锌、0.24g氯化镁、2.4g(2.5毫升制备的食物)甘蔗汁、7.5蒙皂石粘土(0.5%在最终的基质中,(American Colloid Company,Arlighton Height,IL,USA))和
1440mL去离子水组成。甘蔗汁是用水稀释的糖蜜的30%总还原糖(TRS)溶液。用669g糖蜜(62.8%TRS)和731mL去离子水制备甘蔗汁。将54.5g尿素溶于163.5mL的去离子水制备氮源。
[0166] 将Bioflow反应器基质在30℃下加热,并在接种前以1L/min的流速注入空气10分钟。设定搅拌速度为300rpm,并在整个生长过程中对培养基进行监测和使用85%磷酸维持pH5.0的最低值。添加消泡剂(Antifoam AES,1∶10,根据需要)。将之前重悬的酵母添加到发酵罐中。在生长期间,用糖尿病条(OneTouch,UltraMini,LifeScan,Inc.,Milpitas,California,U.S.A.)测定葡萄糖水平,当葡糖糖水平低于0.8mg/mL时,添加补充的食物(来自甘蔗汁)。在接种2小时内,将搅拌逐渐增加到500rpm,同时加大空气流速(在3小时内高达4L/min)。在最终基质中,反应器的粘土的终浓度为0.5%。
[0167] 待添加到发酵罐中的糖蜜的量取决于酵母利用糖的效率,其包括在400g至600g之间。糖蜜的过量加料遇到导致不能通过发酵产生任何酵母生物量的生产问题。当观察到没有进一步的生长时收获酵母培养物。将BioFlow内含物收集到无菌瓶中,并在4000g下离心20分钟。弃上清,用含0.125%NaCl的水溶液清洗沉淀。当用糖蜜进行酵母繁殖时没有发现有组分分离。然后用0.125%NaCl溶液清洗酵母3次。
[0168] 粘土交织的酵母细胞壁的提取方法。用无菌去离子水重悬酵母沉淀至13%至15%的干物质浓度。在60℃下搅拌酵母浆。在添加0.3mL/L的酶之前,使用10%NaOH将pH值调成8.0。在8小时内维持温度和搅拌条件。在最初的2小时内,每15分钟监测和(使用10%NaOH)调节一次pH值,然后在接下来的6小时内,每1小时监测和调节一次pH值。将浆液转移到无菌离心瓶中,在4000g下离心20分钟。弃上清,用3体积的冷无菌水清洗沉淀,然后再次在4000g下离心20分钟。重复清洗步骤两次,然后将沉淀冷冻、冻干和研磨。
[0169] 根据用于繁殖酵母的碳源不同,制备的材料亦显示出不同的螯合效率(参见图8)。观察到的在效率方面的变化同样与考虑的真菌毒素类型有关。材料的组成亦与前述使用右旋糖作为唯一碳源制备的材料组成不同。发现在酵母细胞壁(参照总细胞表示)中存在13.4%的葡聚糖、17.8%的甘露聚糖和2.7%的几丁质(N-乙酰葡糖胺)水平。
[0170] 实施例7
[0171] 针对镰刀菌属真菌毒素(Fusarium Mycotoxicoses)的体内效能
[0172] 在圭尔夫大学(the University of Guelph)的Arkell家禽研究站将一日龄的杂种火鸡幼禽(Hybrid Turkeys,Kitchener,ON,Canada)单独称重,标上翅号并随机分配到各组中。将幼禽随机分配到5种饮食的每一种。最初将幼禽维持在32℃,按每周3℃将温度逐渐降低,在第4周末达到21℃温度。在实验期间保持该温度。给火鸡幼禽喂食的起始阶段(0-3周)的饮食为玉米、小麦和大豆,生长阶段(4-6周)的饮食用对照谷物,对照+0.2%粘土交织的酵母细胞壁、被污染的谷物和被污染的谷物+0.2%粘土交织的酵母细胞壁配制。根据NRC(1994)配制符合或超过火鸡的最低限度的营养需求的对照饮食。在起始阶段和生长阶段期间,分别通过用镰刀菌属真菌毒素天然污染的污染玉米和小麦替代25和10%及26和5%的对照玉米和小麦,来制备真菌毒素污染的饮食。计算用污染的谷物替代对照谷物的水平,以在起始和生长阶段期间获得大约4mg DON/kg饮食的真菌毒素攻击。通过用0.2%的粘土交织的酵母细胞壁(CIYCW)取代饮食中的对照玉米,来制备聚合物葡甘露聚糖吸附剂补充的饮食。随意地提供食物和水。在每个阶段的开始,对代表性饲料样品取样,用于近似分析和真菌毒素分析。按照公职分析化学工作者协会(Association of Official Analytical Chemists)(1980),进行饮食的蛋白质、干物质和灰分含量的测定。
表1中示出了饮食配方和营养物含量。圭尔夫大学动物保护委员会根据加拿大动物保护委员会的指导方针批准实验过程。
[0173] 表1 实验饮食的组成(%)。
[0174]
[0175]
[0176] 1每千克饮食中提供的维生素矿物质混合物:维生索A(全反式棕榈酸视黄酯),8800IU;胆钙化醇,3300IU;维生素E(全消旋-α-醋酸维生素E),40IU;甲萘醌,3.3mg;硫胺素,4.0mg;核黄素,8.0mg;泛酸,15.0mg;烟酸,50mg;吡哆醇,3.3mg;胆碱,600mg;叶酸,
1.0mg;生物素,220μg;维生素B12,12μg;乙氧喹,120mg;锰,70mg;锌,70mg;,60mg;
10mg;碘,1.0mg;硒,0.3mg。
[0177] 2莫能星钠,10%。
[0178] 3粘土交织的酵母细胞壁。
[0179] 表2示出了DON、15-乙酰基-DON、ZEN、烟曲霉毒素和赭曲毒素A的饮食浓度。其他真菌毒素在该方法的检出限以下,该方法检出限为瓜萎镰菌醇0.12mg/kg、3-乙酰基-DON 0.05mg/kg、新腐皮镰孢醇0.07mg/kg、二乙酰氧基蔍草镰刀菌醇0.06mg/kg、T-2毒素0.06mg/kg、HT-2毒素0.04mg/kg和黄曲毒素0.001mg/kg。DON、15-乙酰基-DON、ZEN、烟曲霉毒素和赭曲毒素A的检出限分别为0.06、0.05、0.025、0.05和0.0003mg/kg。
[0180] 表2.实验饮食中的真菌毒素浓度(μg/g)
[0181]
[0182] 1同样在实验饮食中测定了其他真菌毒素,但是并未检出,所述毒素包括二乙酰氧基蔍草镰刀菌醇、T2毒素、瓜萎镰菌醇、3-乙酰基-DON、新腐皮镰孢醇、HT-2毒素以及黄曲霉毒素。
[0183] 2粘土交织的酵母细胞壁。
[0184] 4低于检测限
[0185] 在起始阶段末,喂食受污染的谷粒不会明显地影响体重增加、饲料消耗和饲料利用率(表3)。与对照组相比,在生长阶段末,喂食受污染的饮食明显地增加体重增加并改善饲料转化效率。在生长阶段期间,饮食对采食量没有影响(表3)。在生长阶段末期,与对照组相比,向受污染的饮食补充粘土交织的酵母细胞壁增加体重增加、增强饲料消耗并改善饲料利用率。在喂食受污染饮食和补充有粘土交织的酵母细胞壁的受污染饮食的禽类中,体重增加和饲料转化效率在6周实验期间显著较高。
[0186] 表3.饮食性镰刀菌属真菌毒素对火鸡行为的影响1
[0187]
[0188] vs:对比
[0189] 1值为最小均方;对于体重增加n=4畜圈(pens),采食量和饲料转化效率(7-8禽/畜圈/阶段)
[0190] 2对照;
[0191] 3新的聚合物葡甘露聚糖真菌毒素吸附剂;
[0192] 4受污染的饮食;
[0193] 5旧的聚合物葡甘露聚糖真菌毒素吸附剂;6P>0.05
[0194] 在第6周,喂食受污染的谷粒增加了(P<0.05)嗜酸性粒细胞数(表4)。补充具有粘土交织的酵母细胞壁的受污染饮食阻止这种现象产生。与未补充的对照相比,向对照饮食补充粘土交织的酵母细胞壁明显地增加了血细胞比容。与对照相比,在第3周,喂食受污染饮食的禽类中葡萄糖的浓度和γ-谷氨酰转移酶的活性明显降低(表5)。补充粘土交织的酵母细胞壁则阻止这种现象产生。与对照相比,在第3周和第6周时,向受污染饮食补充粘土交织的酵母细胞壁明显地增加了尿酸浓度。与对照相比,在第3周时,喂食受污染的饮食和粘土交织的酵母细胞壁的禽类中,乳酸脱氢酶的活性明显降低。
[0195] 4.饮食性镰刀菌属真菌毒素在血液学上的影响1
[0196]
[0197]
[0198]
[0199] vs:对比
[0200] 1值为最小均方;对于每种饮食和每个阶段n=4畜圈,且2禽/畜圈
[0201] 2对照;3粘土交织的酵母细胞壁;4受污染的饮食;6P>0.05
[0202] 表5.饮食性镰刀菌属真菌毒素在血浆化学上的影响1
[0203]
[0204]
[0205]
[0206]
[0207]
[0208]
[0209] vs:对比
[0210] 1值为最小均方;对于每种饮食和每个阶段n=4畜圈,且2禽/畜圈
[0211] 2对照;3粘土交织的酵母细胞壁;4受污染的饮食;6P>0.05
[0212] 与对照相比,在第6周时,喂食受污染的谷粒明显降低了乳酸脱氢酶的活性(表5)。补充粘土交织的酵母细胞壁阻止这种现象产生。与对照相比,在第6周时,喂食受污染的和粘土交织的酵母细胞壁的饮食的禽类中,钙和磷的浓度明显升高。与对照相比,第6周时,相同的饮食也明显地降低了γ-谷氨酰转移酶的活性。在喂食补充有粘土交织的酵母细胞壁的受污染饮食的禽类中,观察到总蛋白和球蛋白的浓度明显增加,而胆固醇水平降低。
[0213] 对火鸡喂食受镰刀菌属真菌毒素自然污染的谷粒引起关于体重增加和饲料转化效率的本能反应。与对照相比,载有镰刀菌属真菌毒素的饲料对血液参数产生一些影响,包括在第6周时嗜酸性粒细胞数增加和乳酸脱氢酶的活性降低,以及在第3周时葡萄糖浓度降低和γ-谷氨酰转移酶的活性降低。喂食粘土交织的酵母细胞壁阻止所有这些影响产生。与喂食未补充的受污染谷粒相比,喂食粘土交织的酵母细胞壁引起在生长方面的数值增加(P>0.05)。
[0214] 以上说明书中提到的所有公开文献和专利通过引用并入本文中。本发明描述的组合物和方法的各种修饰和变化对本领域技术人员是显而易见的,并未背离本发明的范围和精神。尽管本发明是结合具体优选的实施方案进行描述的,但应该理解的是,要求保护的本发明,不应该过度受限于这些具体的实施方案。实际上,对相关领域技术人员显而易见的用于实施本发明的所述模式的各种修饰,意图纳入本发明的范围内。
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