酵母细胞壁组分及其检测
阅读：225发布：2021-05-14
专利汇可以提供酵母细胞壁组分及其检测专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及动物 饲料 添加剂及其在饲料产品中的检测。另外，本发明涉及 酵母 细胞壁组分、其分离方法、以及用于其免疫学检测的组合物和方法。，下面是酵母细胞壁组分及其检测专利的具体信息内容。
1.一种用于检测样品中酵母细胞壁的方法，包括：
-提供样品；
-将所述样品暴露于能够结合选自(1→4)-α-D-葡聚糖、(1→6)-β-D-葡聚糖和
(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的抗原的一级抗体，从而形成一级抗体-抗原复合物；
和
-使用二级抗体检测所述一级抗体和所述抗原之间的结合程度。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品衍生自选自以下的物质：牲畜饲料、伴侣动物饲料、饲料原料、全混合日粮(TMR)、草料、饲料颗粒、饲料浓缩物、饲料预混物副产品、谷物、酒糟、糖蜜、纤维、饲草、牧草、干草、籽粒、叶片、粗粉、可溶性饲料、饲料补充剂、以及其制备中间体。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述衍生通过提取所述物质以获得所述样品而实现。
4.根据权利要求3所述的方法，其中所述提取使用选自以下的步骤进行：酸提取、碱提取、有机提取、物理加工、及其组合。
5.根据权利要求4所述的方法，其中所述提取使用有机溶剂和酸进行。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述提取使用二甲基亚砜和盐酸进行。
7.根据权利要求4所述的方法，其中所述提取步骤还包括在高于室温的温度下孵育。
8.根据权利要求7所述的方法，其中所述孵育在75℃和85℃之间进行。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述一级抗体对所述抗原单特异的。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述一级抗体为多克隆抗体。
11.根据权利要求1所述的方法，其中检测所述抗体和所述抗原之间的所述结合程度在二级抗体的辅助下进行，所述二级抗体缀合至选自酶、荧光材料、生色材料、和放射性标记同位素的物质。
12.根据权利要求1所述的方法，其中所述二级抗体能够与所述一级抗体形成复合物。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述样品固定在刚性支撑物上。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述刚性支撑物包括多层板的孔。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述一级抗体和所述抗原之间的结合的所述检测通过确定与所述样品中结合所述一级抗体-抗原复合物的所述二级抗体的存在相对应的信号的水平而实现。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述信号选自生色信号、荧光信号、基于尺寸检测的分子、基于吸光度检测的分子、辐射、和同位素信号。
17.根据权利要求1所述的方法，其中所述检测使用ELISA免疫测定进行。
18.一种用于制备包含酵母细胞壁碳水化合物的免疫原性组合物的方法，包括：
-提供包含酵母细胞壁的样品；
-使用选自酸处理、碱处理和物理处理的动作从所述样品中提取所述酵母细胞壁碳水化合物；和
-从所述样品分离所述酵母细胞壁碳水化合物，其中所述酵母细胞壁碳水化合物为选自(1→4)-α-D-葡聚糖、(1→6)-β-D-葡聚糖和(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的碳水化合物。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述提取使用酸处理进行。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述酸为盐酸。
21.根据权利要求18所述的方法，还包括纯化所述分离的酵母细胞壁碳水化合物。
22.根据权利要求21所述的方法，其中所述纯化通过选自以下的步骤而实现：基于尺寸分离、基于电荷分离、基于疏水性分离、基于对结合分子的亲和力分离、以及基于分子构象分离。
23.根据权利要求18所述的方法，还包括混合氧化所述分离的酵母细胞壁碳水化合物。
24.根据权利要求23所述的方法，其中所述温和氧化通过使用氧化剂处理而实现。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述温和氧化通过使用二甲基亚砜和乙酸酸酐处理所述酵母细胞壁碳水化合物而实现。
26.根据权利要求24所述的方法，其中所述温和氧化导致活化所述酵母细胞壁碳水化合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述活化在所述酵母细胞壁碳水化合物的C6位进行。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述活化导致形成醛基。
29.根据权利要求26所述的方法，还包括将所述活化的酵母细胞壁碳水化合物暴露于选自以下的载体分子：牛血清白蛋白、匙孔戚血蓝蛋白、卵清蛋白、和牛甲状腺球蛋白。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述载体分子为牛血清白蛋白。
31.一种免疫原性组合物，包含与蛋白质共价连接的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖。
32.根据权利要求31所述的免疫原性组合物，其中所述组合物由酿酒酵母生物体产生。
33.根据权利要求31所述的免疫原性组合物，其中所述共价键合通过所述碳水化合物的C6原子发生。
34.一种组合物，包含能够结合选自(1→4)-α-D-葡聚糖、(1→6)-β-D-葡聚糖和(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的酵母细胞壁碳水化合物的抗体。
35.根据权利要求34所述的抗体，其中所述抗体为单克隆抗体。
36.根据权利要求34所述的抗体，其中所述抗体为多克隆抗体。
37.根据权利要求34所述的抗体，其中所述抗体能够结合(1→4)-α-D-葡聚糖。
38.根据权利要求34所述的抗体，其中所述抗体能够结合(1→6)-β-D-葡聚糖。
39.一种用于制备用来检测样品中酵母细胞壁的方法，包括使用根据权利要求31所述的免疫原性组合物免疫宿主动物。
40.一种用于检测样品中酵母细胞壁的试剂盒，包含：
-用于提取步骤的试剂，所述提取步骤导致释放选自(1→4)-α-D-葡聚糖、
(1→6)-β-D-葡聚糖和(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的酵母细胞壁碳水化合物；和-能够结合在所述提取步骤提取的所述酵母细胞壁碳水化合物从而形成一级抗体-抗原复合物的一级抗体；和
-能够附接到所述一级抗体-抗原复合物从而形成一级抗体-抗原-二价抗体复合物
的二级抗体。
41.根据权利要求40所述的试剂盒，由此所述二级抗体缀合到选自酶、荧光材料、生色材料和放射性标记同位素的物质。
42.一种用于确定样品中酵母细胞壁组分的存在的方法，所述方法包括：
-提供样品；
-对所述样品进行免疫学测定，其中所述测定检测选自(1→4)-α-D-葡聚糖、
(1→6)-β-D-葡聚糖和(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的化合物的所述存在；和-传递所述测定的结果。
43.根据权利要求42所述的方法，其中所述样品衍生自选自以下的物质：牲畜饲料、伴侣动物饲料、饲料原料、全混合日粮(TMR)、草料、饲料颗粒、饲料浓缩物、饲料预混物副产品、谷物、酒糟、糖蜜、纤维、饲草、牧草、干草、籽粒、叶片、粗粉、可溶性饲料、饲料补充剂、以及其制备中间体。
酵母细胞壁组分及其检测
[0002] 本发明涉及动物饲料添加剂及其在饲料产品中的检测。另外，本发明涉及酵母细胞壁组分、其分离方法、以及用于其免疫学检测的组合物和方法。
[0003] 发明背景
[0004] 在动物营养领域，已采用多种添加剂和补充剂来改善牲畜性能。在一些情况下，酵母细胞壁组分可用作动物饲料添加剂。一个实例是饲料添加剂MYCOSORB(由ALLTECH，Inc.制造)。MYCOSORB结合食品和饲料中的真菌毒素污染物，从而将真菌毒素以不能消化的状态隔离。这种真菌毒素污染物常常由于用作给料组分的谷物、谷物副产品以及玉米青贮饲料中田地和收割后的真菌生长而产生。虽然市售饲料原料和饲料产品组分必须经过真菌毒素监测，但没有监测系统是100％有效的。据估计，世界范围内所有作物的大约25％受到真菌毒素污染的影响(Council for Agricultural Science and Technology(1989)“Mycotoxins：Economics and Health Risks”，Task Force Report No.116，Ames，IA)，因此受污染的材料进入牲畜和伴侣动物饲料供应链的情况的发生几乎是不可避免的。牲畜消耗真菌毒素污染的饲料的后果包括食欲下降、生长减缓、生殖功能和乳产量降低、免疫系统受抑制、消化功能受损以及在严重情况下死亡。因此，真菌毒素隔离已被证明是用于降低不利地影响动物和人类健康的天然存在的毒素的危害的有用策略。
[0006] 发明概述
[0007] 本发明涉及动物饲料添加剂及其在饲料产品中的检测。另外，本发明涉及酵母细胞壁组分、其分离方法、以及用于其免疫学检测的组合物和方法。在一些实施方案中，提供检测样品(例如，饲料样品、食品样品、或其提取物)中酵母细胞壁组分和/或其片段的方法。这种方法可用于例如确定由酵母细胞壁组分(例如，酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、MYCOSORB饲料添加剂、BIOMOSS饲料添加剂、ACTIGEN饲料添加剂等)构成的食品和饲料添加剂在饲料产品(例如，牲畜饲料、伴侣动物饲料、或其制备中间体)中的存在。在一些实施方案中，本发明涉及用于从饲料产品(例如，牲畜饲料、伴侣动物饲料、或其制备中间体)中提取酵母细胞壁组分(例如，酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、MYCOSORB饲料添加剂等)的方法。在一些实施方案中，本发明提供可用于产生特定酵母细胞壁组分(例如，酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、和/或其缀合物)的抗体的抗原。在优选的实施方案中，这种抗原缀合至载体，例如蛋白质载体(如牛血清白蛋白(BSA))。在一些实施方案中，本发明提供用于在C6-OH位活化碳水化合物(例如，包含吡喃葡萄糖环的碳水化合物、葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)的方法。在一些实施方案中，这种活化包括温和氧化(例如，使用二甲基亚砜/乙酸酸酐)。在一些实施方案中，本发明提供能够识别酵母细胞壁抗原的抗体(例如，能够识别酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其缀合物的单克隆或多克隆抗体；针对(1→4)-α-D-葡聚糖/(1，6)-β-D-葡聚糖/BSA抗原产生的单克隆抗体513A161.1或513A431.1、针对(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖/BSA抗原产生的多克隆抗体；或其纯化、稀释、缀合、和/或单一特异性的形式)。在一些实施方案中，本发明提供包含用于检测样品(例如，饲料样品、食品样品、或其提取物)中酵母细胞壁组分(例如，酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、MYCOSORB饲料添加剂等)的试剂的试剂盒。
[0008] 本发明不受用于分析的样品的类型或性质限制。在一些优选的实施方案中，样品为食品或饲料产品或衍生自食品或饲料产品。食品或饲料产品包含任何被消耗(例如，被动物消耗)并为饮食贡献能量和/或营养的材料。饲料原料的实例包括但不限于全混合日粮(TMR)、草料、粒料、浓缩物、预混物副产品、谷物、酒糟、糖蜜、纤维、饲草、牧草、干草、籽粒(kernal)、叶片、粗粉、可溶物和补充剂。饲料和饲料原料不受其物理形式限制。饲料和饲料原料可加工成较小粒度(例如，切碎的、剁碎的、研碎的、磨碎的等)；制成液体形式(例如，提取的、烹煮的、浓缩的、转化成浆料或其他粘稠形式)；或加工成较大尺寸(例如，成捆的、固结的、压缩的、或成形为复合形状，例如粒状、块状、方形、薄片状等)。
[0009] 本发明不受用于获得分析样品的提取方法的类型或性质限制。在一些实施方案中，对待分析的初始材料(例如，食品或饲料产品；饲料原料)进行提取技术以获得分析样品。提取技术包括但不限于酸提取、碱提取、用有机溶剂提取、用缓冲液提取、用盐提取、用洗涤剂提取、物理提取(例如，烹煮、蒸汽提取、低温提取、研磨等)、或其组合。在一些实施方案中，使用有机溶剂和酸溶液的组合来提取待分析的材料(例如，食品或饲料产品；饲料原料)。在一些实施方案中，使用二甲基亚砜(DMSO)和盐酸(HCl)的溶液来提取待分析的材料(例如，食品或饲料产品；饲料原料)。
[0010] 本发明不受存在于初始样品中的分析物(例如，抗原、酵母细胞壁组分、酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、MYCOSORB饲料添加剂等)的量限制。分析物的量可小于0.005mg、0.005-0.05mg、0.05-0.5mg、0.5-1mg、1-5mg、5-10mg、10-25mg、25mg或更多。本发明不受存在于初始待测材料中的分析物(例如，抗原、酵母细胞壁组分、酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、MYCOSORB饲料添加剂等)的量限制。检测的分析物的量可小于0.05千克/吨、0.05-0.5千克/吨、0.5-1千克/吨、1.0-2.0千克/吨、2.0-3.0千克/吨、3.0-4.0千克/吨、4.0-5.0千克/吨、5.0-6.0千克/吨、6.0-10.0千克/吨、10千克/吨或更多。
[0011] 本发明不受用于检测分析物(例如，如抗原、酵母细胞壁组分、酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、MYCOSORB饲料添加剂等)的抗体的工作浓度限制。抗体(例如，能够识别酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其缀合物的单克隆或多克隆抗体；针对(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖/BSA抗原产生的单克隆抗体513A161.1或513A431.1、针对(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖/BSA抗原产生的多克隆抗体；或其纯化、稀释、缀合、和/或单一特异性的形式)的工作稀释度可为比1∶100,000稀；1∶50,000至1∶100,000；1∶20,000至1∶50,000；1∶10,000至1∶20,000；1∶5,000至1∶10,000；1∶1,000至1∶5,000；
1∶500至1∶1,000；1∶100至1∶500；1∶50至1∶100；1∶10-1∶50；1∶1至
1∶10；2∶1至1∶1；或比2∶1浓。
1∶500至1∶1,000；1∶100至1∶500；1∶50至1∶100；1∶10-1∶50；1∶1至
1∶10；2∶1至1∶1；或比2∶1浓。
[0012] 在一些实施方案中，本发明提供包含酵母细胞壁组分的免疫原性组合物。在一些实施方案中，酵母细胞壁组分包括酵母葡聚糖。在一些实施方案中，葡聚糖包括酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其缀合物或衍生物。在一些实施方案中，本发明提供缀合至载体(例如，蛋白质载体)的酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖。载体可有利于宿主动物的免疫原性和/或稳定性。载体的实例包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)、匙孔戚血蓝蛋白(KLH)、卵清蛋白(OVA)、牛甲状腺球蛋白(THY)和鸭乙型肝炎核心抗原(DHBcAg)(Gathuru等(2005)Vaccine 23：4727-4733)。本发明不受抗原和载体之间的连接位置限制。在一些优选的实施方案中，抗原(例如，碳水化合物抗原、葡聚糖、包含吡喃葡萄糖环的碳水化合物、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)在一个或多个相对于抗原的O-6位缀合至载体。在一些实施方案中，所述抗原为在C6位缀合至BSA的酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖。
[0013] 本发明的抗体不受其在其中产生的宿主物种限制。宿主物种可为大鼠、小鼠、豚鼠、仓鼠、兔子、山羊、绵羊、鸡、驴、马、牛科动物、犬科动物、猫科动物、猪科动物、类人猿、人类、或任何其他物种。本发明的抗体不受用于产生抗体的接种方案、抗原制备方法、或抗原递送方法限制。抗原可在存在或不存在免疫刺激剂(例如，佐剂)、缓冲液、盐、溶剂、增溶化合物等的情况下存在。可将宿主物种使用抗原免疫一次；两次；三次；四次；五次；5-10次；10-20次；或超过20次。本发明的抗体不受克隆性(例如，单克隆、多克隆)限制。抗体可以粗制或纯化形式使用。抗体可为多特异性或单特异性的。在优选的实施方案中，抗体能够特异性识别用于产生抗体的抗原。在一些优选的实施方案中，本发明的抗体能够特异性识别从酵母(例如，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))细胞壁提取的(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖。在一些优选的实施方案中，本发明的抗体包括多克隆抗体。在一些实施方案中，本发明提供能够识别酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物的单克隆或多克隆抗体。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物结合酵母细胞壁(1→4)-α-D-葡聚糖，但不结合除含酵母细胞壁(1→4)-α-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母细胞壁(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物)之外的物质中存在的含(1→4)-α-D-葡聚糖的部分。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物结合酵母细胞壁(1→6)-β-D-葡聚糖，但不结合除含酵母细胞壁(1→6)-β-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母细胞壁(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物)以外的物质中存在的含(1→6)-β-D-葡聚糖的部分。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物结合酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖，但不结合除酵母细胞壁(例如，酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物)以外的物质中存在的含(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的部分。
[0014] 本发明的一些抗原检测方法包括免疫检测方法。在一些优选的实施方案中，免疫检测方法包括ELISA。在一些实施例中，使用衍生自待分析的初始材料(例如，食品或饲料产品；饲料原料；其提取物)的样品和一级抗体(例如，能够识别酵母细胞壁组分的抗体；能够识别酵母葡聚糖的抗体；能够识别酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、和/或酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的抗体)进行ELISA。在一些实施方案中，抗体直接连接到能够产生可检测的信号的物质(例如，生色物质、荧光物质、放射性标记同位素等)。在一些实施方案中，抗体直接或间接与另一能够产生可检测的信号的试剂(例如，生色物质、荧光物质、放射性标记、同位素等)缔合。
[0015] 在一些实施方案中，本发明提供用于检测样品(例如，食品或饲料产品、饲料原料、其提取物)中分析物(例如，抗原、酵母细胞壁组分、酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、和/或酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)的试剂盒。试剂盒组分可包括但不限于试剂、提取缓冲液、溶剂、洗涤剂、封闭剂、管、抗体、标准物、说明书、及其任何组合。
[0016] 在一些实施方案中，本发明提供服务，其中对待分析的初始材料(例如，食品或饲料产品、饲料原料、其提取物)获得关于分析物(例如，抗原、酵母细胞壁组分、酵母葡聚糖、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、和/或酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)的浓度的信息。在一些实施方案中，由最终使用者(例如，农户、牲畜所有者、牲畜管理者、牲畜饲养者、伴侣动物所有者、伴侣动物管理者、伴侣动物饲养者、兽医、饲料或食物产品制造商、饲料或食物产品经销商、监管官员)进行所述分析。在一些实施方案中，由最终使用者(例如，农户、牲畜所有者、牲畜管理者、牲畜饲养者、伴侣动物所有者、伴侣动物管理者、伴侣动物饲养者、兽医、饲料或食物产品制造商、饲料或食物产品经销商、监管官员)将样品或初始材料递交给第三方，并且第三方进行所述分析。在一些实施方案中，第三方将有关分析结果的信息传递给最终使用者(例如，农户、牲畜所有者、牲畜管理者、牲畜饲养者、伴侣动物所有者、伴侣动物管理者、伴侣动物饲养者、兽医、饲料或食物产品制造商、饲料或食物产品经销商、监管官员)。在一些实施方案中，第三方将关于分析结果的信息传递给第四方。
[0018] 图1示出制备葡聚糖级分P1、P2、P3以及S1、S2和S3的示意图(参见例如实施例1)。
[0019] 图2示出初始兔抗血清以及亲和纯化的抗血清的四份上清的响应。亲和纯化的抗血清通过将对β-(1，6)-葡聚糖特异的(Gab 1-Gab4)抗体分离到涂覆有BSA的微孔板获得(参见例如实施例3)。
[0020] 图3示出使用纯化的抗-(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA多克隆兔抗体构建的校准曲线，所述抗体使用本文所述的方法产生(参见例如实施例2和3)。
[0021] 图4示出使用乳牛饲料材料中6个MYCOSORB包含水平进行5次测定所得的平均标准曲线。第二y-轴突出显示标准曲线的日内(％CV内)和日间(％CV间)重复性精密度。
[0022] 图5示出使用鸡饲料材料中6个MYCOSORB包含水平进行5次测定所得的平均标准曲线。第二y-轴突出显示标准曲线的日内(％CV内)和日间(％CV间)重复性精密度。
[0023] 图6示出使用猪饲料材料中6个MYCOSORB包含水平进行5次测定所得的平均标准曲线。第二y-轴突出显示标准曲线的日内(％CV内)和日间(％CV间)重复性精密度。
[0024] 图7示出对于多个微量滴定板分配从鸡饲料中获得的MYCOSORB产品信号扣除的干扰产品的平均光密度读数(ΔOD450)差值(实施例7)。除MYCOSORB产品(100％，1.0kg/T)之外，以50％、100％、200％(w/w)添加干扰产品。
[0025] 图8示出对于单个微量滴定板分配从鸡饲料中获得的MYCOSORB产品信号扣除的干扰产品的平均光密度读数(ΔOD450)差值(实施例7)。除MYCOSORB产品(100％，1.0kg/T)之外，以50％、100％、200％(w/w)添加干扰产品。
[0026] 图9示出指示浓度为1∶100(顶部)或1∶200(底部)的单克隆抗体513A161.1的交叉反应性的ELISA测定结果。
[0027] 图10示出指示浓度为1∶500(顶部)或1∶1000(底部)的单克隆抗体513A161.1的交叉反应性的ELISA测定结果。
[0028] 图11示出指示浓度为1∶1500(顶部)或1∶2000(底部)的单克隆抗体513A161.1的交叉反应性的ELISA测定结果。
[0029] 图12示出指示浓度为1∶100(顶部)或1∶200(底部)的单克隆抗体513A431.1的交叉反应性的ELISA测定结果。
[0030] 图13示出指示浓度为1∶500(顶部)或1∶1000(底部)的单克隆抗体513A431.1的交叉反应性的ELISA测定结果。
[0031] 图14示出指示浓度为1∶1500(顶部)或1∶2000(底部)的单克隆抗体513A431.1的交叉反应性的ELISA测定结果。
[0032] 图15示出以未稀释或按1∶1稀释于PBS或PBS+3％脱脂奶粉中的形式固定到板上的三种酵母细胞壁提取物标准品的平均ELISA测定吸光度读数和标准偏差(实施例6)。
[0033] 图16示出针对实施例6中所述的ELISA微板涂覆时间和孵育温度的饲料提取物标准曲线的图。
[0034] 定义
[0035] 为了方便理解本发明，多个术语和短语定义如下：
[0036] 如本文所用，术语“肽”、“多肽”和“蛋白质”均是指通过共价“肽键合”连接的氨基酸的一级序列。一般来讲，肽由数个氨基酸，通常2-50个氨基酸构成，并且比蛋白质短。术语“多肽”涵盖肽和蛋白质。在一些实施方案中，肽、多肽或蛋白质是合成的，而在其他实施方案中，肽、多肽或蛋白质是重组的或天然存在的。合成肽是由体外人工方法制备的肽(即不是在体内产生的)。
[0037] 术语“糖蛋白”或“糖肽”是指包含一个或多个与多肽链共价连接的碳水化合物残基的蛋白质或肽。术语“含硒蛋白”或“含硒肽”是指包含一个或多个硒原子的蛋白质或肽。通常，硒原子以在含硒氨基酸(包括硒代半胱氨酸和硒代甲硫氨酸)内的形式掺入到蛋白质中。
[0038] 术语“含硒糖蛋白”、“含硒糖肽”或“SGP”是指掺入一个或多个硒原子的糖蛋白或糖肽。通常，“含硒糖蛋白”包含一个或多个含硒氨基酸。“含硒糖蛋白”可包含多个呈任何数量的不同形式的碳水化合物。
[0039] 术语“样品”和“样本”以其最广泛的含义使用并且涵盖从任何来源获得的样品或样本。如本文所用，术语“样品”用来指从动物(包括人类)获得的生物样品，并且涵盖流体、固体、组织和气体。在本发明的一些实施方案中，样品包括包含植物来源的物质的样品(青贮饲料、谷物、经加工的牲畜饲料、在制造中间阶段的饲料产品)。然而，这些实例不应理解为限制可与本发明一起使用的样品的类型。
[0040] 如本文所用，术语“酵母”和“酵母细胞”是指分类在真菌界、具有细胞壁、细胞膜和细胞内组分的真核微生物。酵母并不形成特定的分类学或系统发育的分组。目前大约1,500个种是已知的；据估计，所有酵母种中仅有1％已进行描述。术语“酵母”经常被当作酿酒酵母的同义词，但是酵母在子囊菌门和担子菌门两个门中的位置显示了其系统发育多样性。术语“酵母”涵盖啤酒酵母、酿酒酵母和面包酵母。芽殖酵母(“真酵母”)被分类在酵母目。大多数酵母种通过出芽进行无性繁殖，但一些通过二分裂进行繁殖。酵母是单细胞的，但一些种通过形成连接的出芽细胞串而变为多细胞，所述连接的出芽细胞串称为伪菌丝(pseudohyphae)或假菌丝(false hyphae)。酵母大小可根据种的不同变化很大，直径通常测量为3-4μm，但一些酵母可达到超过40μm。如本文所用，术语“酵母细胞壁”也称为“YCW”，是指酵母生物体的围绕酵母的原生质膜和细胞内组分的细胞壁。酵母细胞壁包括酵母细胞壁的外层(主要是甘露聚糖)和内层(主要是葡聚糖和几丁质)。细胞壁的作用是提供结构和保护酵母内部(其代谢活性中心)。信号传导和识别通路位于酵母细胞壁中。酵母细胞壁的组成因菌株的不同而不同并根据酵母的生长条件变化。
[0041] 如本文所用，术语“酵母细胞壁提取物”是指已经过破裂或裂解(例如，在破裂和裂解阶段期间)并与酵母细胞的可溶性细胞内组分分离的酵母的酵母细胞壁。
[0042] 如本文所用，术语w/w(重量/重量)是指组合物中给定物质基于重量计的量。例如，包含0.02％w/w的本发明膳食饲料补充剂的动物饲料意指该膳食饲料补充剂的质量为动物饲料的总质量的0.02％(例如，907,200克的动物饲料中200克本发明膳食饲料补充剂组合物)。
[0043] 如本文所用，术语“纯化的”或“以纯化”是指从样品移除一些组分。例如，通过移除非酵母细胞壁组分(例如，细胞质膜和/或酵母细胞内组分)来纯化酵母细胞壁或酵母细胞壁提取物；还通过移除除酵母细胞壁之外的污染物或试剂来纯化它们。移除非酵母细胞壁组分和/或非酵母细胞壁的污染物导致酵母细胞壁或其组分在样品中的百分比增加。在分子水平上，术语“纯化的”是指从其天然环境移除、分离或分隔的分子(例如，碳水化合物、糖蛋白)。因此“分离的碳水化合物”可为纯化的碳水化合物。“基本上纯化的”分子至少60％、优选至少75％、还更优选至少90％不含有其他与其天然相关的组分。如本文所用，术语“纯化的”或“以纯化”还指从样品移除污染物。移除污染蛋白质导致所关注的多肽在样品中的百分比增加。此外，在植物、细菌、酵母或哺乳动物宿主细胞中表达并从其中纯化重组多肽(例如，糖蛋白)并通过移除宿主细胞蛋白质来纯化多肽；由此重组多肽在样品中的百分比增加。如本文所用，术语“动物”是指属于动物界的那些。这包括但不限于牲畜、农场动物、家养动物、伴侣动物或宠物、海洋和淡水动物、以及野生动物。
[0044] 如本文所用，术语“牲畜”也称为“牲畜种”，还称为“家养牲畜”，又称为“商业饲养动物”，是指有意在农业或水产业环境下培养以生产食物或纤维、或为了获得其劳动力或陪伴的驯养动物。
[0045] 如本文所用，术语“食物补充剂”“膳食补充剂”“膳食补充剂组合物”等是指配制成用作饮食的部分(例如，作为动物饲料的添加物)的膳食或营养补充剂的食物产品。本文描述了示例性膳食补充剂组合物。
[0046] 如本文所用，术语“试剂盒”用于指试剂和其他材料的组合。可以预想到试剂盒可包含诸如提取溶液、抗体和检测试剂的试剂。术语“试剂盒”并不旨在限于试剂和/或其他材料的特定组合。
[0047] 如本文所用，术语“毒性的”是指与在施用有毒物之前的相同细胞或组织相比对对象、细胞或组织的任何不利或有害效果。
[0048] 如本文所用，术语“冷冻干燥”和术语“冻干”以及术语“冷干”是指通过升华从呈冻结状态的物质移除溶剂。这通过将待干燥的材料冷冻到其共熔点以下然后提供升华潜热而实现。对热输入的精确控制允许从冻结状态干燥而不会使产物回熔。在实际应用中，在减压条件下加速并精确控制该过程。
[0049] 如本文所用，术语“自由流动干粉”是指自由流动的干粉，例如可从容器、包、器皿等倾倒而没有大块的阻碍的粉末。
[0050] 如本文所用，术语“研磨”是指通过冲击、剪切或摩擦减小粒度。
[0051] 如本文所用，术语“洗涤”是指(例如，使用任何类型的溶质(例如，蒸馏水、缓冲液或溶剂)或混合物)移除或洗清制备物的杂质或不需要的可溶性组分(例如，可洗涤酵母细胞壁提取物以从样品移除非酵母细胞壁组分；可洗涤微量滴定板的孔以移除非结合或非特异性结合的组分)。
[0052] 术语“抗体”或“免疫球蛋白”是指结合特异性抗原的蛋白质。免疫球蛋白包括但不限于多克隆、单克隆、嵌合和人源化抗体、Fab片段、F(ab’)2片段，并且包括如下类别的免疫球蛋白：IgG、IgA、IgM、IgD、IbE、以及分泌型免疫球蛋白(sIg)。免疫球蛋白通常具有两条相同的重链和两条轻链。然而，术语“抗体”和“免疫球蛋白”也涵盖单链抗体和双链抗体。可由任何已知的方法制备抗体(参见例如Current Protocols in Immunology(1998)John Wiley and Sons，Inc.，N.Y.)。
[0053] 术语“抗原”是指可与对抗原分子的一部分特异的抗体反应的碳水化合物、蛋白质、糖蛋白、脂蛋白、脂质或其他物质。
[0054] 如本文所用，术语“分析物”是指原子、分子、原子和/或分子的分组、物质或化学成分。分析物本身不能进行测量，相反分析物的方面或性质(物理、化学、生物等)可使用诸如HPLC或NMR分析程序进行测定。例如，不能测量“椅子”(分析物组分)本身，但椅子的高度、宽度等可以测量。同样，不能测量真菌毒素，但可以测量与其浓度相关的真菌毒素信号(例如，生色信号、荧光信号)。
[0055] 术语“免疫沉淀”、“免疫纯化”和“亲和纯化”以及诸如动词和形容词的语法变型形式，是指使用抗体将其抗原或其抗原的部分与其他分子的混合物分离。
[0056] 术语“免疫检测”以及语法变型形式是指使用抗体从其他分子的混合物中鉴别抗原或其部分的存在。
[0057] 术语“染色”是指本领域人员已知的用于更好地显现、辨别或鉴定材料(例如，样品、饲料样品、饲料样品的提取物、细胞、细胞)的特定组分和/或特征的很多方法。
[0058] 术语“免疫荧光”是指用于通过本领域实施人员已知的程序鉴定、标记、标示、显现或使易于看见的染色技术，其中配体(通常为抗体)与受体(通常为抗原)结合并且这种配体，如果为抗体，则缀合至荧光分子，或该配体然后被对该配体特异的抗体结合，并且所述抗体缀合至荧光分子，其中所述荧光分子可使用适当的仪器(例如，荧光显微镜)显现。
[0059] 术语“抗原决定簇”是指抗原的与特定抗体接触的那部分(例如，表位)。当蛋白质或蛋白质片段用于免疫宿主动物时，蛋白质的多个区域可引起产生与蛋白质上的给定区域或三维结构特异性结合的抗体；这些区域或结构称为抗原决定簇。抗原决定簇可与完整抗原(用于引起免疫应答的“免疫原”)竞争与抗体结合。
[0060] 如本文所用，术语“免疫测定”是指旨在允许检测样品中抗原的定性或定量测试。免疫测定通常利用抗原识别抗体。抗原识别抗体可直接或间接偶联到视觉化步骤，例如生色或荧光标记或酶。免疫测定的实例包括但不限于酶联免疫吸附测定(“ELISA”)、侧向层析测试、蛋白质印迹、基于微粒的测定(例如，Luminex 测定)、磁性免疫测定、斑点印迹、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、计数免疫测定(CIA)等。免疫测定可为竞争性或非竞争性的。
[0061] 如本文所用，术语“酶联免疫吸附测定”或“ELISA”，有时称为“夹心测定”，是指一种特定类型的免疫测定。通常，将未知量的抗原吸附或固定在固体表面上并暴露于能够识别它的抗体。通常通过直接或间接连接到荧光或生色酶来测定结合的抗体的数量。ELISA的类型包括但不限于直接ELISA、间接ELISA、夹心ELISA、竞争性ELISA和反向ELISA。如本文所用，术语“ELISA”是指酶联免疫吸附测定(或EIA)。多种ELISA方法和应用是本领域已知的，并且描述于很多参考文献中(参见例如Crowther，Molecular Biomethods Handbook中“Enzyme-Linked Immunosorbent Assay(ELISA)”，Rapley等(编辑)，第595-617页，Humana Press，Inc.，Totowa，N.J.(1998)；Harlow和 Lane(编 辑)，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press(1988)；Ausubel等(编辑)，Current Protocols in Molecular Biology，第11章，John Wiley & Sons，Inc.，New York(1994))。此外，存在多种市售ELISA测试体系。如本文所用，术语“食品”、“食料”、“饲料”、“饲料产品”、“饲料原料”等是指任何被消耗(例如，被动物消耗)并为饮食贡献能量和/或营养的材料。实例包括但不限于全混合日粮(TMR)、草料、粒料、浓缩物、预混物副产品、谷物、酒糟、糖蜜、纤维、饲草、牧草、干草、籽粒、叶片、粗粉、可溶物和补充剂。饲料原料不受其物理形式限制。饲料原料可加工成较小粒度(例如，切碎的、剁碎的、研碎的、磨碎的等)；制成液体形式(例如，提取的、烹煮的、浓缩的、转化成浆料或其他粘稠形式)；或加工成较大尺寸(例如，成捆的、固结的、压缩的、或成形为复合形状，例如粒状、块状、方形、薄片状等)。
[0062] 如本文所用，当用作名词时，“添加剂”或“补充剂”是指添加到或以其他方式包含到另一物质或事物中的物质或事物。另外，如本文所用，当用作名词时，词语“添加剂”或“补充剂”在提及在供应给动物之前混合到动物饲料中的“添加剂”或“补充剂”时可互换使用。
[0063] 如本文所用，术语“葡聚糖”是指任何含葡萄糖的碳水化合物聚合物。在一些实施方案中，葡聚糖为D-葡萄糖的聚合物，其聚合度没有限制、与其他聚合物共价或非共价连接、或确切的碳水化合物组合物。在葡聚糖聚合物的整个长度上，D-葡萄糖单元可参与α-键合、β-键合、或α-键合和β-键合两种。
[0064] 如本文所用，术语“碳水化合物”用于指具有通式Cm(H2O)n的有机化合物。碳水化合物仅由碳、氢和氧原子组成，从而氢原子和氧原子的原子比为2∶1。
[0065] 如本文所用，术语“信号”通常用于指任何可检测的指示反应已经进行(例如，抗体与抗原结合)的过程。可以设想到，呈放射性、荧光的或比色的产物/试剂形式的信号将都可与本发明一起使用。在本发明的多个实施方案中，对信号进行定性评估，而在替代实施方案中，对信号进行定量评估。
[0066] 如本文所用，术语“固相支撑物”用于指诸如抗体、抗原的试剂和其他测试组分附接的任何固体或固定材料。例如，在ELISA方法中，微量滴定板的孔提供固相支撑物。固相支撑物的其他实例包括显微镜载玻片、盖玻片、小珠、颗粒、细胞培养瓶、以及很多其他合适的物品。
[0067] 术语“特异结合”和“特异性结合”当用于指抗体和抗原之间的相互作用时，描述依赖于抗原上的特定结构(即抗原决定簇或表位)的存在的相互作用。换句话讲，抗体识别并结合抗原特有的蛋白质结构，而不是结合大体上所有蛋白质(即非特异结合)。
[0068] 发明详述
[0069] 酵母细胞壁(YCW)具有包含两种主要多糖组分的复杂结构：(1→2)(1→3)(1→6)-α-D-甘露聚糖和(1→3)(1→6)-β-D-葡聚糖。这些多糖通过O-糖苷键和N-糖苷键与YCW蛋白质连接，如最近出版的评论(Lesage等(2006)Microbiol.Mol.Biol.Rev.70：317-343；其全文以引用方式并入本文)中所讨论。在工业规模上，通常通过离心和洗涤从裂解的酵母生物体分离或提取YCW，如D.A.Howes和K.E.Newman所报道的(参见例如美国专利No.6,045,834；其全文以引用方式并入本文)。在这一阶段，YCW不溶于水。后续酶和化学处理初级YCW修饰多糖和蛋白质的结构，从而使得这些YCW组分至少部分地溶于水和二甲基亚砜“DMSO”中。产物的可溶性和不溶性部分的组成取决于处理条件。
[0070] 免疫测定包括可与这种复杂、非均一的混合物一起使用的灵敏分析技术。在本发明的一些方法实施方案中，来自已用包含酵母(1→6)-β-D-葡聚糖的抗原免疫的动物的抗体识别这种多糖，从而允许建立稳健且灵敏的免疫测定，所述酵母(1→6)-β-D-葡聚糖使细胞壁的所有主要结构组分相互连接(参见Kollár等(1997)J.Biol.Chem.272：17762-17775；其全文以引用方式并入本文)。在本发明的一些实施方案中，定量免疫测定(ELISA)允许分析动物饲料样品中的YCW衍生的营养添加剂MYCOSORB(ALLTECH，Inc.)。对来自YCW的(1→6)-β-D-葡聚糖的测定在定量YCW方面是非常特异的，因为(1→6)-β-D-葡聚糖在植物碳水化合物中是非常罕见的。因此，针对这种YCW多糖的抗体不与存在于动物饲料中的植物多糖进行显著相互作用，从而确保较低测定背景。
[0071] 另外，本发明的一些实施方案还提供用于以下的方法：1)从酵母细胞壁分离可溶性(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖(参见Kwiatkowski等(2009)J.Instit.Brew.115：1031和Arvindekar等(2002)Yeast 19：131-139，各自全文均以引用方式并入本文)，例如作为用于制备识别酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的抗体的抗原；使用Pfizner-Moffat试剂(参见Pfizner等(1963)J.Am.Chem.Soc.85：3027；其全文以引用方式并入本文)氧化这种多糖的吡喃葡萄糖环C-6位的羟基基团，以便将其转化成醛基(参见Zekovic等(2006)Chem.Papers60：243-248；其全文以引用方式并入本文)；以及将这种氧化形式的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖用于与牛血清白蛋白(BSA)的赖氨酸残基的还原胺化反应(参见Abdel-Magid等(1996)J.Org.Chem.61：3849-3862；其全文以引用方式并入本文)，从而产生多糖-蛋白质缀合物。在一些实施方案中，本发明提供用于分离和纯化(例如，使用离子交换、DEAE纤维素和不同离子强度的Na2HPO4缓冲液)(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA缀合物的方法，所述(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA缀合物被用作动物(例如兔)免疫中的可溶性免疫原(参见Howard等(2001)Basic Methods in AntibodyProduction and Characterization，CRC Press，第11-18以及31-50页)。在一些实施方案中，本发明提供BSA-涂覆的亲和相树脂的制备方法(参见Matejtschuk(1997)Affinity Separations：a Practical Approach，Oxford University Press)以及其在从包含对BSA特异的抗体和对(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖特异的抗体的兔血清中吸附对BSA特异的抗体的用途。在本发明的一些实施方案中，用于将多糖缀合至蛋白质的方法可用于制备人类和动物疫苗，因为这种方法保留了多糖的初始结构并且不像通常缀合方法那样修饰其还原端(参见美国专利No.6,596,861；其全文以引用方式并入本文)。
[0072] 酿酒酵母细胞壁葡聚糖
[0073] 葡聚糖在酿酒酵母细胞壁多糖中是普遍的(参见Kwiatkowski等(2009)J.Instit.Brew.115：151-158)。有文献记录了(1→3)-β-D-葡聚糖在保持酵母细胞壁形状和刚度中的作用(参见Klis等(2006)Yeast23：185-202；Lesage等(2006)Microbiol.Mol.Biol.Rev.70：317-343；各自全文均以引用方式并入本文)以及(1→6)-β-D-葡聚糖作为将所有细胞壁多糖连接在一起的多糖的作用(参见Aimaniada等(2009)J.Biol.Chem.284：13401-13412；Kollár等(1997)J.Biol.Chem.272：17762-1777；Klis等(2002)FEMS Microbiology Rev.26：239-256；各自全文均以引用方式并入本文)。在早期酵母文献(参见Gunja-Smith等(1974)Biochem.Biophys.Res.Com.56：588-592；Grba等(1975)Appl.Microbiol.Biotechnol.2：29-37；各自全文均以引用方式并入本文)中频繁提及有氧生长的酿酒酵母细胞中可溶性和不溶性糖原样(1→4)-α-D-葡萄糖的存在，并且已经鉴定两种形式的糖原合成酶(参见Gunja-Smith等(1977)J.Bacteriol.130：818-825；
Rothman-Denes等(1970)PNAS 66：967-974；各自全文均以引用方式并入本文)。糖原是由酿酒酵母累积的能量储备碳水化合物，其可在酵母饥饿阶段期间动用。其为α-D-葡萄糖
8
的聚合物，其分子量为～10 并且其支化结构具有通过1→4键合连接的10-14个α-D-葡萄糖的残基(参见Aklujkar等(2008)J.Instit.Brew.114：205-208；Boulton等(2001)The Biochemistry of Fermentation.In：Brewing Yeast and Fermentation，Blackwell Science，Iowa，第89-92页；各自全文均以引用方式并入本文)。
Rothman-Denes等(1970)PNAS 66：967-974；各自全文均以引用方式并入本文)。糖原是由酿酒酵母累积的能量储备碳水化合物，其可在酵母饥饿阶段期间动用。其为α-D-葡萄糖
8
的聚合物，其分子量为～10 并且其支化结构具有通过1→4键合连接的10-14个α-D-葡萄糖的残基(参见Aklujkar等(2008)J.Instit.Brew.114：205-208；Boulton等(2001)The Biochemistry of Fermentation.In：Brewing Yeast and Fermentation，Blackwell Science，Iowa，第89-92页；各自全文均以引用方式并入本文)。
[0074] 酵母细胞壁中(1→4)-α-D-葡聚糖含量可从少至干重的1％(参见Lille等(1980)J.Bacteriol.143：1384-1394)变化到多达干重的29％(参见Sedmak等，美国专利申请No.2006/0263415；其全文以引用方式并入本文)，取决于细胞的营养状态、分离方法、环境条件以及收获细胞的时间(参见Lille等(1980)J.Bacteriol.143：1384-1394)。工业上产生的啤酒酵母细胞(参见Sedmak等，美国专利申请No.2006/0263415；其全文以引用方式并入本文)包含28.9％干重(d.w.)浓度的葡聚糖，其包括12.4％d.w.的(1→4)-α-D-葡聚糖。当使用碱性蛋白酶处理这些细胞时，水不溶性的细胞壁组分包含
54.5％d.w.的葡聚糖和超过该重量一半的(1→4)-α-D-葡聚糖(29.2％d.w.)。
54.5％d.w.的葡聚糖和超过该重量一半的(1→4)-α-D-葡聚糖(29.2％d.w.)。
[0075] 在2002年，Arvindekar和Patil(参见Arvindekar等(2002)Yeast 19：131-139；其全文以引用方式并入本文)基于其如下发现：(1→4)-α-D-葡聚糖与(1→6)-β-D-葡聚糖共价连接，提出了关于酵母细胞壁内存在已被其他人定义为“难以洗涤掉的”酵母糖原(参见Fleet等(1976)J.Gen.Microbiol.94：180-192；其全文以引用方式并入本文)的不溶性部分的解释。然而，这与Kollar和合作者发表的1997论文(参见Kollár等(1997)J.Biol.Chem.272：17762-17775；其全文以引用方式并入本文)并且与Aimaniada和合作者发表的关于(1→6)-β-D-葡聚糖在酵母细胞壁内的作用和结构的工作(参见Aimaniada等(2009)J.Biol.Chem.184：13401-13412；其全文以引用方式并入本文)不一致。值得注意的是，Arvindekar和Patil的发现需要结构验证，因为作者使用来自酵母细胞壁的酶水解的微小片段进行研究，并且未使用NMR对其分离的产物进行定量或结构归属。
在开发本发明实施方案的过程中进行的实验中，开发了大规模分离方法以从酿酒酵母细胞壁分离混合(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖多糖，并且使用核磁共振(NMR)光谱法确定该产物的结构。
在开发本发明实施方案的过程中进行的实验中，开发了大规模分离方法以从酿酒酵母细胞壁分离混合(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖多糖，并且使用核磁共振(NMR)光谱法确定该产物的结构。
[0076] 动物食物和饲料
[0077] 动物饲料是特别地用于喂养驯养牲畜(例如，牛、山羊、绵羊、马、家禽、野牛、羊驼、美洲驼、驴、骡、兔、鸡、鹅、火鸡和猪)的任何食料。动物饲料通常包括干草、稻草、青贮饲料、压缩和颗粒饲料、油类和混合日粮、以及发芽谷物和豆类。2006年全世界的动物饲料行业消耗635百万吨饲料，年增长率为约2％。使用农用地来种植饲料而不是人类食物可为具有争议的；一些类型的饲料如玉米(corn)(玉米(maize))也可用作人类食物，而诸如牧草的其他饲料不能。除了给动物提供能量源，动物饲料还提供身体利用的营养素(例如，硒)。动物饲料通常在供给动物之前与补充剂和/或添加剂(例如，MYCOSORB)混合。
[0078] 免疫检测方法
[0079] 本发明提供用于检测样品中物质的方法，这种方法包括免疫检测测定或免疫测定。免疫测定(免疫检测测定、免疫检测方法)涉及使用用于检测(视觉化、定性鉴定、定量检测)与抗体结合的物质(例如，抗原)的抗体。被抗体识别的抗原可为大分子或其片段(例如，聚合物、碳水化合物、糖蛋白、蛋白质、其部分或单体)。例如，本发明的一些方法可用于检测酵母细胞壁葡聚糖(例如，(1→4)-α-D-葡聚糖、(1→6)-β-D-葡聚糖、和/或(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)。
[0080] 多种免疫测定可用于定性或定量检测物质(例如，以低浓度存在的物质、存在于复杂混合物中的物质、碳水化合物物质、酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)。免疫测定的类型包括但不限于酶联免疫吸附测定(ELISA)、侧向层析测试、蛋白质印迹、基于微粒的测定(例如，Luminex 测定)、磁性免疫测定、斑点印迹、酶免疫测定(EIA)、放射性免疫测定(RIA)、化学发光免疫测定(CLIA)、计数免疫测定(CIA)等(参见例如Wild等(2005)“The Immunoassay Handbook，第3版”，Elsevier Ltd.，Oxford，UK)。免疫测定可为竞争性或非竞争性的。
[0081] 酶联免疫吸附测定(ELISA)
[0082] 酶联免疫吸附测定，“ELISA”已经用作医学和植物病理学、以及各行业中质量管理检验中的诊断工具。在一个实例中，典型的ELISA包括首先固定在聚苯乙烯微板或其他表面上的探针分子。然后施加诸如BSA的封闭剂并孵育。使包含未知浓度的特定目标分子(通常为蛋白质)的生物样品或其他样品与固定的探针分子接触。如果存在，目标分子被探针捕获，并与目标分子的浓度成比例。然后，通常使用温和洗涤剂溶液洗涤表面以移除任何不是特异性结合的分子。然后，施加诸如第二抗体的另外的分子，从而形成具有捕获探针、目标分子和标记的检测探针的“夹心”复合物。第二分子通常称为检测探针或检测抗体，并且一般与酶、半抗原或其他标记分子共价连接。
[0083] 在最终洗涤步骤之后，通过添加与标记的检测抗体结合并包含酶底物、荧光标记的检测试剂、或多种其他报告物的缀合物来使板显影。所述报告物产生与样品中目标抗原的量成比例的可检测信号。通常，使用比色或荧光读板仪读取ELISA读数，并且每个孔产生单个目标分析物测量结果。ELISA测定的其他变型形式包括但不限于间接、竞争性、或反向ELISA(参见例如Crowther等(2008)“The ELISA Guidebook，第2版”，Humana Press)。
[0084] 在很多情况下，在制成用于匹配使得可以通过自动化仪器实现处理的标准化格式的微板中进行ELISA。这些标准由生物分子科学学会(SBS)建立并被称为SBS标准。根据SBS标准，多孔板的“覆盖区”为大约85mm×125mm，其中孔以根据孔总数的特定位置格式设置。美国国家标准协会(ANSI)已公布微板的SBS标准为：“覆盖区域尺寸”(ANSI/SBS1-2004)、“高度尺寸”(ANSI/SBS 2-2004)、“底部外缘尺寸”(ANSI/SBS 3-2004)以及“孔尺寸”(ANSI/SBS 4-2004)。最常见地，ELISA使用者在单个板中采用96-孔。作为另外一种选择，当测定中需要少于96-孔，可采用最多12个8-孔“条”从而使得一次仅使用96-孔的一部分。
[0085] 测试服务
[0086] 在一些实施方案中，使用基于计算机的分析程序来将测定(例如，免疫测定、ELISA)产生的原始数据(例如，抗原的存在、不存在、或量)(例如，酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)转化成对最终使用者(例如，牲畜或伴侣动物饲养者或管理者、兽医、农户、消费者)而言具有预测价值的数据。最终使用者可使用任何合适的方式访问预测数据。因此，在一些实施方案中，本发明提供进一步的有益效果，即不大可能受过免疫测定分析训练的最终使用者不需要理解原始数据。数据直接以其最有用的形式呈现给最终使用者。然后最终使用者能够立即利用该信息以便优化对对象(例如，牲畜或伴侣动物)的护理。
[0087] 本发明设想到任何能够接收、处理和与进行测定的实验室来回传递有关样品的信息的方法。例如，在本发明的一些实施方案中，获得样品(例如，饲料样品、饲料样品的提取物)并递交给位于世界的任何地方(例如，在对象所在的国家或最终使用信息的国家相一致或不同的国家)的分析服务机构(例如，实验室等)以产生原始数据。最终使用者可让第三方获得样品(例如，饲料提取物)并递送至分析中心(profiling center)，或者对象可自行收集样品并直接将其递送至分析中心。当样品包含此前确定的信息时，最终使用者可将该信息直接递送至分析服务机构(例如，可通过计算机扫描包含所述信息的信息卡片并使用电子通信系统将数据传送至分析中心的计算机)。一旦被分析服务机构接收，就对样品进行处理并产生特定于最终使用者所需的诊断或预后信息的特征图(例如，抗原含量)。
[0088] 然后将特征图数据准备成适于最终使用者解读的格式。例如，与提供原始数据相反，准备的格式可向最终使用者体现风险评估(例如，抗原存在的可能性)，同时为特定牲畜护理选择提供建议。数据可通过任何合适的方法展示给最终使用者。例如，在一些实施方案中，分析服务机构产生可为最终使用者打印(例如，在接触的地点、在牲畜护理的地点)的报告或可在计算机显示器上展示给最终使用者的报告。
[0089] 在一些实施方案中，首先在牲畜护理的地点或在地区设施处分析信息。然后将原始数据递送至中央处理设施以进行进一步的分析和/或将原始数据转化成最终使用者或其他感兴趣的相关方可用的信息。中央处理设施提供隐私(所有数据均以统一的安全协议保存在中央设施中)、速度和数据分析的一致性的优点。然后中央处理设施在与最终使用者通信后可控制数据的命运。例如，使用电子通信系统，中央设施可将数据提供给最终使用者。
[0090] 在一些实施方案中，最终使用者能够使用电子通信系统直接访问数据。最终使用者可基于结果寻求进一步的建议。在一些实施方案中，数据用于研究用途。例如，数据可用于进一步优化牲畜或伴侣动物的营养方案。
[0091] 组合物和试剂盒
[0092] 用于(例如，足够用于、必要用于、或可用于)本发明的一些实施方案的方法中的组合物包含用于检测特定抗原(例如，酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)的存在与否的试剂。这些组合物中的任何者，单独或与本发明的其他组合物组合，可以试剂盒的形式提供。试剂盒可另外包含适当的对照和/或检测试剂。
[0093] 抗原-载体缀合
[0094] 在一些实施方案中，本发明提供可用于分析(例如，免疫学分析；用于抗体制备)酵母细胞壁物质的组合物(例如，抗原)。在一些实施方案中，本发明提供用于以下的方法：从酵母细胞壁分离可溶性(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖(参见Kwiatkowski等(2009)J.Instit.Brew.115：1031；Arvindekar等(2002)Yeast 19：131-139；各自全文均以引用方式并入本文)作为酵母(1→6)-β-D-葡聚糖的抗原；使用Pfizner-Moffat试剂(参见Pfizner等(1963)J.Am.Chem.Soc.85：3027；其全文以引用方式并入本文)氧化这种多糖的吡喃葡萄糖环C-6位的羟基基团，以便将其转化成醛基(参见Zekovic等(2006)Chem.Papers 60：243-248；其全文以引用方式并入本文)；以及将这种氧化形式的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖用于与载体(例如，载体蛋白质如BSA)的赖氨酸残基的还原胺化(参见Abdel-Magid等(1996)J.Org.Chem.61：3849-3862；其全文以引用方式并入本文)反应，从而产生多糖-载体缀合物。在一些实施方案中，本发明涉及应用分离技术(例如，离子交换、DEAE纤维素和不同离子强度的Na2HPO4缓冲液)分离纯抗原(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA缀合物)，该纯抗原被用作免疫动物(例如，免疫兔)的可溶性免疫原(参见Howard等(2001)“Basic Methods in Antibody Production and Characterization”，CRC Press，第11-18以及31-50页)。在一些实施方案中，本发明还涉及制备BSA涂覆的亲和相(参见Matejtschuk(1997)“AffinitySeparations：A Practical Approach”，Oxford University Press)以及其在从包含载体(例如，BSA)抗体和抗原(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)抗体的抗血清(例如，兔抗血清)中吸附对载体特异的(例如，对BSA特异的)抗体从而有利于所得抗体制品的特异性的用途。在本发明的一些实施方案中，用于将多糖缀合至载体(例如，蛋白质载体如BSA)的方法可用于制备人类和动物疫苗，因为这种方法保留多糖结构，而不是如典型缀合方法那样引起还原端修饰(参见Moreau等，美国专利No.6,596,861；其全文以引用方式并入本文)。
[0095] 在多糖或寡糖用作抗原之前，其弱抗原性通常需要改性。在本发明的一些实施方案中，开发出合成方法，其中将多糖抗原(包含(1→6)-β-D-葡聚糖)缀合至源于或来源于与用于免疫的物种不同的动物物种的载体(例如，蛋白质载体如BSA)(参见Howard等(2001)“Basic Methods in Antibody Production and Characterization”，CRCPress，第 11-18 页 及 31-50 页；Matejtschuk(1997)“Affinity Separations：A Practical Approach”，Oxford University Press)。虽然本发明不受所用载体的性质或类型限制，但BSA因为其商业可得性和存在五个赖氨酸残基而是有利的，所述五个赖氨酸残基中的每一个均具有可通过多种化学方法与多糖或寡糖缀合的单个游离氨基基团(参见Abdel-Magid等(1996)J.Org.Chem.61：3849-3862；Lees等(1996)Vaccine 14：190-198；Pawlowski等(1999)Vaccine 17：1474-1483；各自全文均以引用方式并入本文)。在一些优选实施方案中，抗原的碳水化合物部分和将用于缀合的载体均为水溶性的。在一些实施方案中，抗原(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖多糖)的碳水化合物部分的还原端醛基并不用于直接缀合至载体(例如，BSA)，因为那样做将显著改变多糖抗原的结构和结合容量。在一些实施方案中，本发明通过应用乙酸酸酐/二甲基亚砜(Ac2O/DMSO)体系(参见Zekovic等(2006)Chem.Papers 60：243-248；其全文以引用方式并入本文)在除C3之外的位置氧化使得最大程度地保留碳水化合物部分的结构。
[0096] 在一些实施方案中，本发明提供使用酵母细胞壁组分(例如，来自酿酒酵母细胞壁的可溶性(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)合成将用于制备抗体(例如，多克隆抗体)的抗原(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA(牛血清白蛋白))缀合物的方法。在一些实施方案中，本发明提供免疫原性组合物，该组合物包含(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖和/或包含(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的缀合物(例如，蛋白质或糖缀合物)。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物可用于检测所关注样品(例如，动物饲料样品或其衍生物、部分或提取物)中酵母细胞壁产物。在一些实施方案中，本发明的组合物是通过例如酸性提取(参见Kwiatkowsk等(2009)J.Instit.Brew.115：1031；
其全文以引用方式并入本文)从富含葡聚糖的材料或富含葡聚糖的产品(GEM，ALLTECH，Inc.，Nicholasville，KY，USA)提取的。在一些实施方案中，使用二甲基亚砜(DMSO)/乙酸酸酐(Ac2O)混合物(参见Pfizner等(1963)J.Am.Chem.Soc.85：3027；其全文以引用方式并入本文)在吡喃葡萄糖环的C-6位温和氧化多糖(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)将C-6羟基亚甲基(-CH2OH)基团转化成醛(-CH＝O)基(参见Zekovic等(20060 Chem.Papers 60：243-248；其全文以引用方式并入本文)，并使得氧化形式的抗原(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)能够进入与载体(例如，BSA)的还原胺化(参见
Moreau等，美国专利No.6,596,861；Abdel-Magid等(1996)J.Org.Chem.61：3849-3862；各自全文均以引用方式并入本文)。
其全文以引用方式并入本文)从富含葡聚糖的材料或富含葡聚糖的产品(GEM，ALLTECH，Inc.，Nicholasville，KY，USA)提取的。在一些实施方案中，使用二甲基亚砜(DMSO)/乙酸酸酐(Ac2O)混合物(参见Pfizner等(1963)J.Am.Chem.Soc.85：3027；其全文以引用方式并入本文)在吡喃葡萄糖环的C-6位温和氧化多糖(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)将C-6羟基亚甲基(-CH2OH)基团转化成醛(-CH＝O)基(参见Zekovic等(20060 Chem.Papers 60：243-248；其全文以引用方式并入本文)，并使得氧化形式的抗原(例如，(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)能够进入与载体(例如，BSA)的还原胺化(参见
Moreau等，美国专利No.6,596,861；Abdel-Magid等(1996)J.Org.Chem.61：3849-3862；各自全文均以引用方式并入本文)。
[0097] 本发明的缀合方法(例如，包括在C6-OH的多糖活化)提供完全保守的多糖部分初始结构，并且因而有利于抗原制备。包括但不限于高碘酸盐氧化(参见Hay等(1973)Methods Carb.Chem.5：357-370；其全文以引用方式并入本文)或CDAP活化(参见Lees等(1996)Vaccine 14：190-198)的多糖或寡糖活化替代方法产生显著改性的多糖，从而损害其作为抗原的实用性。
[0098] 抗体
[0099] 本发明的另一个方面是制备用于检测酵母细胞壁组分(例如，酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖)的测定中的免疫球蛋白的方法，所述方法包括以下步骤：用酵母细胞壁组分(例如，酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA、或其其他片段、变体或缀合物)免疫对象和从接受者分离免疫球蛋白。通过这种方法制备的免疫球蛋白是本发明的另一个方面。
[0100] 用于多克隆抗体制备的接种物通常通过以下方式来制备：将抗原组合物分散于诸如盐水或其他佐剂的生理上可耐受的稀释剂中以形成水性组合物。将免疫刺激量的接种物施用给对象，然后使接种的对象保持足以使抗原组合物引起保护性抗体的时间。
[0101] 抗体可以诸如亲和色谱法(参见例如Harlow和Lane，Antibodies；a Laboratory Manual(1988)Cold Springs Harbor Laboratory Press)的熟知技术所需的程度进行分离。
[0102] 抗体包括来自多种常用动物(例如，山羊、灵长类、兔、驴、猪、马、豚鼠、大鼠或人)的抗血清制剂。从动物取血并回收血清。
[0103] 根据本发明制备的免疫球蛋白可包括完整抗体、抗体片段或亚片段。抗体可为任何类别的完整免疫球蛋白例如IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、嵌合抗体或对本发明的两种或更多种抗原具有双特异性的杂合抗体。它们也可为片段，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv等，包括杂合片段。
[0104] 或者，可以使用本领域已知的方法改变描述用于制备单链抗体的技术以适合制备特异性结合特定抗原的单链抗体。具有相关特异性但具有不同个体基因型组成的抗体可通过从随机组合免疫球蛋白文库进行链改组而产生(参见例如Burton，Proc.Natl.Acad.Sci.88，1112023，1991)。
[0105] 单链抗体也可使用杂交瘤cDNA作为模板、使用诸如PCR的DNA扩增方法来构建(参见例如Thirion等，1996，Eur.J.Cancer Prev.5，507-11)。单链抗体可为单特异性或双特异性的，并且可为二价或四价的。四价、双特异性单链抗体的构建在例如Coloma&Morrison，1997，Nat.Biotechnol.15，159-63中提出。二价、双特异性单链抗体的构建在例如Mallender & Voss，1994，J.Biol.Chem.269，199-206中提出。
[0106] 可使用人工或自动化核苷酸合成构建编码单链抗体的核苷酸序列，使用标准重组DNA方法克隆到表达构建体中，并导入细胞中以表达所述编码序列，如下所述。或者，单链抗体可使用例如丝状噬菌体技术(参见例如Verhaar等，1995，Int.J.Cancer 61，497-501；Nicholls等，1993，J.Immunol.Meth.165，81-91)直接制备。
[0107] 特异性结合特定抗原的抗体也可以通过以下方式来制备：诱导淋巴细胞群中的体内产生或筛选免疫球蛋白文库或高度特异性结合反应物的组，如文献(参见例如Orlandi等，Proc.Natl.Acad.Sci.86，38333837，1989；Winter等，Nature 349，293 299，1991)中所公开的。
[0108] 嵌合抗体可如WO 93/03151中所公开的来构建。还可以制备衍生自免疫球蛋白并且为多价和多特异性的结合蛋白，诸如WO94/13804中所述的“双抗体”。可通过本领域熟知的方法纯化抗体。例如，可通过使抗体通过结合有相关抗原的柱来亲和纯化所述抗体。然后可使用具有高盐浓度的缓冲液从柱上洗脱结合的抗体。
[0109] 可将本发明的免疫原性组合物施用给对象，该对象然后充当免疫球蛋白源，所述免疫球蛋白响应于特定免疫原性组合物的激发而产生。如此处理的对象将提供血浆，通过常规血浆分级分离方法将从该血浆中获得超免疫球蛋白。
[0110] 本发明的组合物包括但不限于可为任何类别的完整免疫球蛋白(例如，IgG、IgM、IgA、IgD或IgE、嵌合抗体)的抗体(例如，单克隆和/或多克隆抗体)或对本发明的两种或更多种抗原具有特异性的杂合抗体。它们也可为片段，例如F(ab’)2、Fab’、Fab、Fv等，包括杂合片段。
[0111] 制备单克隆抗体的方法是本领域熟知的并且可包括融合脾细胞与骨髓瘤细胞(参见例如Kohler和Milstein 1975 Nature 256；495；Harlow和Lane，Antibodies；a Laboratory Manual(1988)Cold Springs Harbor Laboratory Press)。或者，可通过筛选合适的噬菌体展示文库而获得单克隆Fv片段(参见例如Vaughan TJ等1998 Nature Biotechnology 16；535)。单克隆抗体可通过已知方法进行人源化或部分人源化。
[0112] 在本发明的一些实施方案中，抗体组合物能够识别酵母细胞壁抗原(例如，能够识别酵母(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物的单克隆或多克隆抗体)。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物结合酵母细胞壁(1→4)-α-D-葡聚糖，但不结合除含酵母细胞壁(1→4)-α-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母细胞壁(1→4)-α-D-葡聚糖、酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物)之外的物质中存在的含(1→4)-α-D-葡聚糖的部分。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物结合酵母细胞壁(1→6)-β-D-葡聚糖，但不结合除含酵母细胞壁(1→6)-β-D-葡聚糖的聚合物(例如，酵母细胞壁(1→6)-β-D-葡聚糖、酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物)以外的物质中存在的含(1→6)-β-D-葡聚糖的部分。在一些实施方案中，本发明的抗体组合物结合酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖，但不结合除酵母细胞壁(例如，酵母细胞壁(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖、或其片段、变体或缀合物)以外的物质中存在的含(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖的部分。
实施例
实施例
[0113] 提供以下实施例是为了展示和进一步说明本发明的某些优选实施方案和方面，而不应理解为限制本发明的范围。
[0114] 实施例1
[0115] 从食品级酿酒酵母酵母细胞壁β-葡聚糖中提取(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖
[0116] 酵母细胞壁葡聚糖制备
[0117] 使用去离子水将通过酶/碱性/热处理由酿酒酵母制备的工业级(1→6)-β-D-葡聚糖(ALL-BGY，ALLTECH，Inc.，Nicholasville，KY，USA)洗涤四次以移除任何可溶性残余物。在冷冻干燥之后，获得“富含葡聚糖的材料”(“GEM”)。
[0118] 酵母细胞壁葡聚糖的酸性消化
[0119] 图1示出各种级分的制备。如Kwiatkowski等(2009)J.Instit.Brew.115：151-158(其全文以引用方式并入本文)中所述进行酵母细胞壁葡聚糖的酸性消化。在80℃下将“富含葡聚糖的材料”(“GEM”)(70g)用700mL的100mM HCl(pH 2.2)进行水解6h。
这之后，将混合物以13,500×g/10℃/10min离心并收集上清液。将沉淀物用150ml去离子水提取两次并冻干，获得57.9g的白色无定形产物(P1)。
这之后，将混合物以13,500×g/10℃/10min离心并收集上清液。将沉淀物用150ml去离子水提取两次并冻干，获得57.9g的白色无定形产物(P1)。
[0120] 将两次洗涤物与初始上清液合并并用2N NaOH中和至pH 7.0。通过离心收集形成的沉淀(沉淀物P1/7)(冻干后1.82g)并且在低于37℃的温度下使用Buchi真空旋转蒸发器将上清液浓缩至450ml体积。使用5kDa AMICON 15超滤离心装置(Millipore Corporation，Delaware USA)将该溶液进一步浓缩。通过使用两份等体积的去离子水并使用相同的超滤装置离心两次来洗涤浓缩物(～150mL)，以移除盐和酸水解所产生的低分子量组分。将经洗涤的浓缩物(S1)冻干，获得7.5g的白色无定形产物。使用与第一次0.1N HCl提取中相同比率的试剂和条件对沉淀物P1的一部分进行第二次提取。将这些产物冻干从而获得P2和S2。使用0.1N HCl的第二次提取在对上清液进行中和之后并未产生沉淀。
使用与第一次0.1N HCl提取中相同比率的试剂和条件对沉淀物P2的一部分进行第三次提取，并且将产物冻干从而获得P3和S3。使用0.1N HCl的第三次提取在对上清液进行中和
1
之后并未产生沉淀。通过使用 H NMR光谱学确定来自0.1N HCl提取的可溶性和不可溶性级分的碳水化合物组成和多糖结构。使用H2SO4-HPLC组成分析(参见Dallies等(1998)Yeast 14：1297-1306；其全文以引用方式并入本文)分析样品中的甘露糖和葡萄糖含量。
使用LECO燃烧分析并通过将氮含量乘以因子6.25来计算蛋白质含量的估计量。
使用与第一次0.1N HCl提取中相同比率的试剂和条件对沉淀物P2的一部分进行第三次提取，并且将产物冻干从而获得P3和S3。使用0.1N HCl的第三次提取在对上清液进行中和
1
之后并未产生沉淀。通过使用 H NMR光谱学确定来自0.1N HCl提取的可溶性和不可溶性级分的碳水化合物组成和多糖结构。使用H2SO4-HPLC组成分析(参见Dallies等(1998)Yeast 14：1297-1306；其全文以引用方式并入本文)分析样品中的甘露糖和葡萄糖含量。
使用LECO燃烧分析并通过将氮含量乘以因子6.25来计算蛋白质含量的估计量。
[0121] 实施例2
[0122] 抗原制备
[0123] (1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖制剂的Ac2O/DMSO氧化
[0124] 将580毫克‘可溶性’葡聚糖放置在配备有磁力搅拌棒并用橡胶隔片密封的22ml玻璃小瓶中。在室温下并在搅拌下，使用玻璃注射器向该小瓶中添加10ml无水DMSO和110μl乙酸酸酐。在20℃下，葡聚糖悬浮液在4h搅拌内完全溶解。继续搅拌混合物24h，在这之后，用40ml水稀释反应混合物。使用30kDa Amicon 15超滤离心装置浓缩所得澄清溶液，并将过滤器上的残余物洗涤五次，每次使用12ml去离子水，从而从溶剂和反应物中分离和纯化氧化产物。所有离心均以4,750×g/30min/10℃进行。收集过滤器上的最终残余物并冷冻干燥，从而获得502mg 白色粉末形式的氧化的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖。该产物部分溶于水中并完全溶于DMSO中。
[0125] 元素分析
[0126] 氧化的葡聚糖的实测值：C-40.05％；H-6.61％。C6H8O5x H2O的计算值：C-40.48％；H-5.66％
[0127] 氧化的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖与BSA的还原胺化
[0128] 将412mg氧化的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖样品溶解于20ml去离子水中，然后在磁力搅拌下与256mg BSA于2ml去离子水中的溶液混合。然后使用60mg氰基硼氢化钠固体处理该混合物。将反应小瓶用橡胶隔片密封，并将混合物在20℃下搅拌24h。这之后，添加100mg硼氢化钠并将混合物再搅拌22h。然后通过30kDaAmicon 15超滤离心装置以4,750×g/30min/10℃过滤该澄清溶液。在过滤器上洗涤残余物四次，每次使用12ml水，并将最终浓缩物冻干，从而获得573mg白色粉末。
[0129] 元素分析
[0130] C 45.01％、H 6.40％、N 2.11％。
[0131] (1→4)-α-/(1→6)-βD-葡聚糖-BSA缀合物的DEAE纤维素离子交换色谱分离[0132] 将400mg粗制缀合物于5ml的5mM Na2HPO4中的溶液引入至2×55cm玻璃色谱柱顶部，该色谱柱包含于5mM Na2HPO4中的50gDEAE纤维素。使用不同浓度的Na2HPO4洗脱以下物质：40.1mg(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖(220ml，5mM)；132.3mg纯(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA缀合物(280ml，55mM)；和96.7mgBSA(80ml，100mM)。使用30kDa AMICON15超滤离心装置将纯(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA缀合物溶液浓缩至2ml体积，使用去离子水洗涤并冻干，从而获得132.3mg(24.4％的总产率)白色粉末样产物。凝胶电泳产生通过使用考马斯蓝和PAS染色揭示的宽带，其中央位于～170kDa处。在电泳图中未检测到游离BSA或任何其他杂质。
[0133] 元素分析
[0134] C 40.11％、H 6.23％、N 3.06％、(20.44w％BSA)。计算的β-葡聚糖：BSA的比率为4∶1。
[0135] 实施例3
[0136] 多克隆抗体制备和纯化
[0137] 抗原制备和兔免疫
[0138] 将10mg如实施例2中所述制备的BSA-缀合的抗原冻干，保存在4℃下，并用于免疫三只兔(每次免疫200μg抗原)。免疫方案如表1中所列。
[0139] 表1.用于在兔中产生抗-(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA多克隆抗体的免疫方案。
[0140]天数 动作
0 设置、预取血，初始免疫
21 推进
35 推进
44-45 取血
49 推进
58-59 取血
63 取血
0 设置、预取血，初始免疫
21 推进
35 推进
44-45 取血
49 推进
58-59 取血
63 取血
[0141] 多克隆抗体的亲和相纯化
[0142] 将1克环氧活化琼脂糖(Sigma E 6632)悬浮于2.68g BSA(SIGMAA2153)于27ml 10mM Na2HPO4中的溶液中，并将该混合物在4℃下于冰水浴中搅拌4小时。这之后，将该混合物以2500×g/5min/10℃离心，并将沉淀物洗涤并再离心四次，每次使用30ml
100mMNa2HPO4/0.05w％NaN3。
100mMNa2HPO4/0.05w％NaN3。
[0143] 将来自BSA涂覆的亲和相(上述)的最后一次离心的沉淀物悬浮于750μl血清(从已用‘可溶性’葡聚糖-BSA缀合物免疫的兔收集)于20ml 10mM Na2HPO4/0.05w％NaN3中的溶液中，并在室温下翻滚2h，然后以1500×g/5min/10℃离心。收集上清液并将沉淀物使用20ml相同缓冲液再洗涤三次，这导致再收集三份上清液。对上清液检查其对BSA和‘可溶性’葡聚糖的特异性，如图2中所示出的。将包含显著量的抗体的第一和第二上清液集中在一起，并通过使用10kDaAMICON Ultra-15离心过滤装置以5000×g/5min/10℃离心浓缩至2.5ml体积。使用10mM Na2HPO4/0.05w％NaN3在过滤器上洗涤浓缩物并使用相同缓冲液将其稀释至6ml体积(6g)。将该‘亲和纯化的抗体’溶液的1∶800稀释液用于对动物饲料中的MYCOSORB进行ELISA测定。获得的校准曲线示于图3中。
[0144] 实施例4
[0145] 通过ELISA检测酵母细胞壁的(1→4)-α-/(1→6)-β-D-葡聚糖
[0146] 材料和方法
[0147] 试剂
[0148] 除非另外指明，否则仅适用公认分析级的试剂，并且去离子水或去矿物水或水纯度相当(在25℃下18,2MΩ/cm)。
[0149] 试剂以及试剂溶液的制备如下：
[0150] ·盐酸，12.1N；HCl
[0151] ·稀盐酸，1N；HCl：将41.3ml HCl 121N缓慢添加到400ml去离子水中并在搅拌盘上使用搅拌棒混合直至冷却。将该溶液转移到500ml容量瓶中并使用去离子水定容，然后在室温下保存。
[0152] ·二甲基亚砜：所用DMSO为高纯度，适用于分光光度法、液相色谱法和气相色谱法。
[0153] ·提取试剂：为了制备提取试剂，将900ml DMSO与98.75ml去离子水和1.25ml HCl12，1N混合。在室温下于搅拌盘上使用搅拌棒以中等速度混合该溶液，然后在20℃下或以上保存。
[0154] ·氯化钠(“NaCl”)
[0155] ·氯化钾(“KCl”)
[0156] ·磷酸氢二钠(“Na2HPO4”)
[0157] ·磷酸二氢钾(“KH2PO4”)
[0158] ·磷酸盐缓冲液(“PBS”)10X：为了制备10X PBS，将80.0g氯化钠[NaCl]、2.0g氯化钾[KCl]、14.2g磷酸氢二钠[Na2HPO4]和2.4g磷酸二氢钾[KH2PO4]与大约800ml去离子水混合。在搅拌盘上使用搅拌棒搅拌该溶液直至固体完全溶解。将该溶液转移到1000ml容量瓶中并使用去离子水定容，然后在室温下或2-8℃下保存。作为未稀释的溶液在2-8℃下的最大储存时间为6个月。在使用之前将该溶液升至室温。
[0159] ·稀PBS，1X：为了制备1X PBS，将1体积的PBS，10X用9体积的去离子水稀释。在室温下于搅拌盘上使用搅拌棒以中等速度混合该稀释液。最大储存时间为一天。
[0160] ·聚山梨醇酯20
[0161] ·含有0.05％聚山梨醇酯20的0.01M磷酸盐缓冲液，pH 7.4：为了制备，将一小袋的内容物溶解于1000ml去离子水中。在搅拌盘上搅拌该溶液直至完全溶解，然后在室温下或2-8℃下保存。作为未稀释的溶液在2-8℃下的最大储存时间为6个月。在使用之前将该溶液升至室温。
[0162] ·脱脂奶粉
[0163] ·3％(w/v)的于PBS中的脱脂奶粉，1X封闭剂：为了制备1X封闭剂，在使用前将干奶粉完全溶解于1X PBS中。每个板需要10ml体积来封闭。最大储存时间为一天。
[0164] ·兔多克隆抗体；一级抗体(抗体溶液#1)：如本文所述制备的亲和纯化的抗体。在-80℃下保持备用。
[0165] ·稀释的兔多克隆抗体溶液：通过将1μl抗体溶液#1加入到XiμlPBS，1X中而在PBS中稀释至1∶Xi。每个微量滴定板需要10ml体积的溶液。在使用前将稀释的抗体溶液混合均匀，并弃去多余的稀释的抗体。最大储存时间为一天。
[0166] · 过 氧 化 物 酶 缀 合 的 亲 和 纯 化 羊 抗 兔IgG(H+L)；HRP二 级 抗 体，Ref.#111-035-045(Jackson ImmunoResearch，PA，USA-抗体溶液#2)：使用1.5ml去离子水水化并离心直至获得完全澄清的溶液。以10μl等分试样在-80℃下保存备用。作为未稀释的溶液在2-8℃下的最大储存时间为6周。
[0167] ·稀释的羊抗兔抗体：通过将1μl抗体溶液#2加入到Yiμl PBS，1X中而在PBS中稀释至1∶Yi。在使用前将稀释的抗体溶液混合均匀，并弃去多余的稀释的抗体。最大储存时间为一天。
[0168] ·SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物：仅将所需体积重新分配在琥珀色的Nalgene HDPE和LDPE瓶中。在使用之前将底物升至室温。将封盖保持紧闭，避光。弃去多余的底物，并将该试剂在2-8℃下保存。当在8℃下保存时，最大储存时间从制造之日起为24个月。
[0169] ·MYCOSORB储备样品；批参考号285965(ALLTECH，Inc.，KY，USA)：使用均匀的MYCOSORB样品。
[0170] ·MYCOSORB在饲料原料中的稀释：在250ml离心瓶中将20g饲料材料与递增量的MYCOSORB产品(0.01；0.02；0.08；0.10；0.12g)混合(重复三次)以生成标准曲线。将瓶在轨道式震荡器上以400rpm摇振1h。称量饲料材料的精度等于±0.025g，而对于MYCOSORB产品，精度为±0.005g。
[0171] ·大批量的在饲料材料中稀释的MYCOSORB：在1000ml容器中使用1.2g产品和300g饲料材料制备大量的在饲料中稀释的MYCOSORB产品的样品。将瓶在轨道式震荡器上以400rpm摇振1h。MYCOSORB产品在饲料材料中的最终浓度为4.0kg/T。将均质化的300.0g大批量的饲料-产品混合物中的20.0g转移到250ml离心瓶中。再重复该转移9次以获得
10个平行测定样品。在每制备3个等分试样之间间歇地摇振该混合物以避免产品沉降到瓶底部。称量饲料材料的精度等于±0.025g，而MYCOSORB产品精度为±0.005g。
10个平行测定样品。在每制备3个等分试样之间间歇地摇振该混合物以避免产品沉降到瓶底部。称量饲料材料的精度等于±0.025g，而MYCOSORB产品精度为±0.005g。
[0172] ·未知量的MYCOSORB在饲料原料中的稀释：通过将未知量的MYCOSORB产品和20.0g(±0,025g)的饲料材料转移到五个250ml离心瓶的每一个中来制备未知样品。将瓶在轨道式震荡器上以400rpm摇振1h。同时完成样品的标准曲线的样品制备。
[0173] 样品配方
[0174] 三种饲料材料(参见表4、表5和表6)用于验证所述测定。根据本领域已存在的组成选择饲料材料配方。样品量为总共15kg饲料材料，该饲料材料在递送至实验室之前经过仔细匀质化。在整个研究期间，将样品保存在2-8℃下。
[0175] 样品匀质性验证
[0176] 通过以产品在饲料中的中间浓度即4.0kg/T制备大批量的稀释在饲料中的MYCOSORB产品，来验证MYCOSORB产品在饲料材料中的稀释的匀质性。将样品分成10个子样品，并进一步根据提取程序提取，然后通过对10个样品中的每一个进行四次ELISA测定而确定产品检测的变异系数。
[0177] 样品制备
[0178] 标准样品的制备如本文所述进行并且示于表2中，其中以MYCOSORB产品进行测试。在这种情况下，参考如本文所述的初始储备产品。未知样品根据如上所述制备。在进行提取程序之前不需要研磨饲料样品，(如果饲料材料以粒化形式提供，也不需要研磨)。据发现，研磨饲料材料可影响测定的最终可靠性。
[0179] 表2.用于标准曲线的MYCOSORB产品的稀释步骤。
[0180]
[0181] a以每吨饲料材料中MYCOSORB产品的千克数表示的稀释因子
[0182] b饲料范围＝±0,025g，
[0183] cMYCOSORB产品范围＝±0,005g
[0184] d其中C为饲料原料中未知的MYCOSORB量
[0185] 提取程序
[0186] 将整组的瓶在轨道式震荡器上以400rpm摇振1h。每次取出三个瓶并使用瓶口体积分配器向每个瓶添加80ml体积的提取试剂。将瓶封盖。手动摇振所有样品以确保与提取试剂完全混合。将瓶在保持80℃恒温的水浴中放置1h，保证饲料溶液完全浸没在水中。在孵育之后，将瓶从水浴中取出并使用高扭矩实验室搅拌器以搅拌棒(NALGENE品牌)混合瓶的内容物。混合物完全匀质化。对每个MYCOSORB包含水平和每个未知样品均使用干净的搅拌棒。将瓶重新在保持80℃恒温的水浴中放置1h。在孵育之后，将瓶从水浴中取出并使用瓶口体积分配器向每个瓶添加80ml去离子水，然后将瓶封盖。手动摇振瓶直至完全混合；必要时使用伴随高扭矩实验室搅拌器的NALGENE品牌搅拌棒。将瓶以8,000g离心10min。
使用玻璃吸管，将大约10ml上清液转移到15ml无菌离心管中。将管以4,000g离心10min并通过倾析转移到新的适当标记的15ml无菌离心管中。将管在-20℃下保存过夜直至用于ELISA测定。
使用玻璃吸管，将大约10ml上清液转移到15ml无菌离心管中。将管以4,000g离心10min并通过倾析转移到新的适当标记的15ml无菌离心管中。将管在-20℃下保存过夜直至用于ELISA测定。
[0187] ELISA程序
[0188] SureBlue Reserve TMB Microwell过氧化物酶底物用于通过与稀释的HRP二级抗体反应，进一步与稀释的一级抗体反应而触发比色反应，该一级抗体自身与从稀释的MYCOSORB产品提取的所关注底物特异性反应，所述稀释的MYCOSORB产品固定在微量滴定板上。20min之后使用HCl，1N最终终止该比色反应，并在读板仪上以450nm波长进行吸光度读取。因此，对仅由饲料材料制成的空白进行测定，以解释来自饲料基质的可能的比色变化，所述饲料基质在分光光度计上产生背景信号。为了计算，从对每个样品获得的吸光度值中扣除空白值。
[0189] 将保存过夜的此前提取的样品解冻并升至室温。在用于ELISA中涂覆微量滴定板的孔之前，将样品涡旋以确保样品均匀。
[0190] 对于每个样品重复，将100μl上清液转移到96孔微量滴定板上的3个孔的每一个中，如表3中所示。在配备有程序化自动微量滴定孔分配器的实验室中可进行样品在板上的随机化分配。将标准曲线样品和样品重复全部分配在一个独特的板上(即，所有0kg/T样品重复固定在板上E1至F10的整个行/列)。将未知MYCOSORB平行测定样品分配在相同板上(即，固定在板上A11至C12的整个行/列)。将微量滴定板用微板粘合剂膜密封并在37℃下孵育1h。孵育之后，移除微量滴定板的每个孔中的溶液并以250μl PBS，1X置换以进行单次洗涤。再重复该操作总共2次。将微量滴定板的每个孔用100μl的脱脂奶粉于PBS中的稀释溶液封闭并在室温下孵育1h。孵育之后，移除每个孔中的溶液并以250μl PBS，1X置换以进行单次洗涤，然后以250μl包含0.05％聚山梨醇酯20的PBS洗涤2次。
[0191] 将100μl体积的稀释的一级抗体添加到每个孔中。将微量滴定板在室温下孵育1h。孵育之后，移除微量滴定板的每个孔中的溶液并以250μl的包含0.05％聚山梨醇酯
20的PBS，1X置换以进行3次洗涤。
20的PBS，1X置换以进行3次洗涤。
[0192] 将100μl体积的稀释的二级抗体添加到每个孔中。将微量滴定板在室温下孵育1h。孵育之后，移除微量滴定板的每个孔中的溶液并以250μl的包含0.05％聚山梨醇酯
20的PBS，1X置换以进行3次洗涤。
20的PBS，1X置换以进行3次洗涤。
[0193] 将100μl体积的预热至室温的TMB底物添加到每个孔中并将微量滴定板在室温下孵育20min。在与TMB底物孵育正好20min之后，将100μl体积的HCl，1N立即添加到每个孔中以终止比色显影。在微量滴定板阅读仪上以450nm读取每个微量滴定板。
[0194] 表3.微量滴定板上的样品组分配。
[0195]
[0196] *其中C为饲料原料中未知MYCOSORB产品的包含水平
[0197] **样品组标识参见表2
[0198] 从平行测定排除数据
[0199] 需要统计数据分析以确保所有平行测定为类似的，从而排除未通过Dixon’s Q检验并因此根据如下定义被认定为异常值的那些：Qn＝|xa-xb|/R，其中R为所有数据点的范围；xa为疑似异常值；xb为最接近xa的数据点。如果Q计算＞Q表，则在95％置信区间拒绝有问题的点。
[0200] 标准曲线制作
[0201] 使用标准曲线进行定量。使用产品的工作范围内的至少五个水平(包括零)来对每种饲料基质构建标准曲线，如理事会指令(CouncilDirective)96/23中所述。计算每个样品组在OD450下的孔吸光度的三个平行测定的平均值。计算空白饲料样品在OD450下的孔吸光度的十个平行测定的平均值。然后以获得的差值ΔOD450(OD450样品组-OD450空白饲料)为纵坐标并以不同MYCOSORB产品浓度范围0.5、1.0、4.0、5.0、6.0kg/T为横坐标制作标准曲线或校准曲线。
[0202] 在以平均空白值对所测值进行校正之后，根据线性回归使用最佳拟合线ΔOD450＝Ax(MYCOSORB)计算所绘制的包含水平对OD450吸收的图线的回归系数和方程式。校准曲线2
的可接受性范围和线性度通过高于0.95的相关系数(r)值来验证。然后使用所述曲线的对应方程式来通过解该对应方程式确定未知样品中MYCOSORB产品的包含水平。
的可接受性范围和线性度通过高于0.95的相关系数(r)值来验证。然后使用所述曲线的对应方程式来通过解该对应方程式确定未知样品中MYCOSORB产品的包含水平。
[0203] 内推法
[0204] 如果发现标准曲线的相关系数高于r2＞0.95，则然后使用经校正曲线的对应方程式F(x)＝Ax，(已扣除背景信号且截取零)来确定未知样品中MYCOSORB产品的包含水平。计算未知包含水平(C)的MYCOSORB产品在OD450下的十个平行测定的平均值。将获得的平均值扣除此前计算的空白饲料样品在OD450下的孔吸光度的十个平行测定的平均值。然后-1
使用OD450平均值来解经校正曲线F (yC)的方程式，其中yC＝AxC：
使用OD450平均值来解经校正曲线F (yC)的方程式，其中yC＝AxC：
[0205] xC＝yC/A，其中yC等于获得的未知样品(C)的平均OD450减去空白的OD450，xC为对应的MYCOSORB包含水平，并且A为标准曲线的斜率，单位是kg/T OD450。
[0206] 检测限和定量限
[0207] 根据IUPAC命名法测定检测限(LD＝3σ空白)和定量限(LQ＝10σ空白)并给定为ΔOD450。
[0208] 通过基质空白分析确定检测限(LD)和定量限(LQ)，并使用标准曲线F(x)＝Ax计算成来自由平均背景OD450值校正的线性回归的浓度，所述标准曲线根据以下解析如下：
[0209] LD＝3σ空白/A和LQ＝3σ空白/A，其中LD为可检测的最小产品浓度或检测限；LQ为可定量的最小产品浓度或定量限。
[0210] 匀质性
[0211] 匀质性变异系数(RSDH＝CVH)定义为在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从相同样品获得的10个独立平行测定的平均变异系数。
[0212] 精密度：重复性
[0213] 测试批内重复性精密度(RSD内＝CV内)定义为在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从同一批测试的相同样品获得的重复的平均变异系数。
[0214] 测试批间重复性精密度(RSD间＝CV间)为在不同天由相同技术人员使用相同设备和方法从不同批测试的相同样品获得独立结果的平均变异系数。
[0215] 精密度：总体精密度
[0216] 精密度评价相同量的连续测定结果之间的一致性的分散度(或接近度)。一组测定结果的分散性通常以标准偏差表示。因此精密度由在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从相同样品获得的单个包含水平的单个单独实验的标准偏差；比较由相同技术人员使用相同设备和方法进行的每个单独测试批的标准偏差，根据下式计算：其中σ总为全部组的实验的标准偏差，σ内为单个单独实验的
标准偏差，σ间为多个实验之间的标准偏差，并且n为平行测定数。
标准偏差，σ间为多个实验之间的标准偏差，并且n为平行测定数。
[0217] 标准偏差的比较通过使用组平均数的方差和组内方差的平均数之间的F检验(p值≤0.05)由方差分析(单因素ANOVA)实现。
[0218] 准确度
[0219] 准确度是可见于被测量的产品的测试结果和接受参考值之间的一致性的接近度。因此通过测量表示为百分位数的回收率来评价准确度。在这方面，回收率表示分析物中存在或掺和分析物的量的比例，所述分析物经过提取并可用于测量。偏差是测试结果和接受参考值(分析物的加标浓度)之间的差值。根据下式进行计算：
[0220]
[0221] 其中Xc为加标样品中测量的浓度；Xb为未加标样品(空白)中测量的浓度；XTH为理论浓度。
[0222] 用于验证测试的饲料材料
[0223] 在ALLTECH，Inc.，KY，USA的动物营养基因组学和应用动物营养学中心(Center for Animal Nutrigenomics and Applied AnimalNutrition)对饲料材料与不同包含水平的MYCOSORB产品混合而成的乳牛饲料制剂、鸡饲料制剂和猪饲料制剂进行测试。饲料制剂的完整说明列于下文。
[0224] 乳牛饲料材料
[0225] 该饲料材料由Coralis Vern(Vern sur Seiche，France，Ref.#111605)配制，其配方名称为“Spirit Lait 2L5”(表4)。样品量为总共15kg饲料材料，该饲料材料在递送至实验室之前经过仔细匀质化。在整个研究期间，将样品保存在2-8℃下。该乳牛饲料材料以粒化形式提供。在进行提取程序之前不需要研磨饲料样品。
[0226] 表4.用于验证所述方法的乳牛饲料配方。
[0227]
[0228]
[0229]
[0230] *用于限定饲料的蛋白质含量和动物蛋白质需求，二者均以小肠中可真实消化的真蛋白质(“PDI”)表示。饮食的PDI含量是(i)PDIA部分，即在瘤胃中不降解但在小肠中可真实消化的膳食蛋白质；(ii)PDIM部分，即在小肠中可真实消化的微生物真蛋白质的总和。每种饲料均通过可降解的氮(PDIMN)和其为瘤胃微生物提供的可用的能量(PDIME)而为微生物蛋白质合成作贡献。考虑到以下两个公式：(1)PDIN＝PDIA+PDIMN和(2)PDIE＝PDIA+PDIME，每种饲料的价值直接通过PDIA和PDIM的总和给出。
[0231] 鸡饲料材料
[0232] 该饲料材料在University of Kentucky和ALLTECH，Inc.，KY，USA之间的联合研究小组Coldstream University of Kentucky处配制(表5)。根据本领域存在并可推广至常见于欧洲联盟、北美洲、拉丁美洲等的配方的组成进行制备。样品量为总共15kg饲料材料，该饲料材料在递送至实验室之前经过仔细匀质化。在整个研究期间，将样品保存在2-8℃下。
[0233] 表5.用于验证所述方法的鸡饲料配方。
[0234]a
[0235] 每kg饮食提供的维生素：2200IU维生素A；720ICU维生素D3；27IU维生素E；0,91mg维生素K3(2-甲基-1，4-萘醌)；2mg硫胺；8mg核黄素；55mg烟酸；18mg泛酸钙；5mg维生素B6(吡哆醇)；0,221mg生物素；1mg叶酸；478mg胆碱；28μg维生素B12(氰钴胺)。
[0236] 猪饲料材料
[0237] 该饲料材料在University of Kentucky和ALLTECH，Inc.，KY，USA之间的联合研究小组Coldstream University of Kentucky处配制(表6)。根据本领域存在并可推广至常见于欧洲联盟、北美洲、拉丁美洲等的配方的组成进行制备。样品量为总共15kg饲料材料，该饲料材料在递送至实验室之前经过仔细匀质化。在整个研究期间，将样品保存在2-8℃下。
[0238] 表6.用于验证所述方法的猪饲料配方。
[0239]
[0240]
[0241] 使用乳牛饲料材料验证
[0242] 在ALLTECH，Inc.，KY，USA的动物营养基因组学和应用动物营养学中心(Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal Nutrition)对混合有五个不同浓度的MYCOSORB产品的欧洲类型固体乳牛饲料配方进行测试。
[0243] 对分别与0.0；0.5；1.0；4.0；5.0；6.0kg/T的MYCOSORB产品混合的乳牛饲料材料以及分配在相同微量滴定板上的与未知水平的MYCOSORB产品混合的相同乳牛饲料材料的样品进行分析。
[0244] 适用性
[0245] 进行该验证是为了确定开发用于特异性分析MYCOSORB产品和替代物的ELISA测定作为一种旨在追踪复杂饲料原料中所述产品的溯源性终点程序的特性。
[0246] 使用六个MYCOSORB产品水平进行验证，该六个水平对应于混合到饲料样品中的包含水平工作范围(0.0；0.5；1.0；4.0；5.0；6.0kg/T)。
[0247] 稀释的兔多克隆抗体溶液：根据背景水平调整一级抗体稀释度。因此通过将1μl抗体溶液#1加入到1.2ml PBS，1X中而将抗体在PBS中稀释至1∶2,500。每个微量滴定板需要10ml体积的溶液。
[0248] 稀释的羊抗兔抗体：根据背景水平调整二级抗体稀释度。因此通过将1μl抗体溶液#2加入到20.0ml PBS，1X中而将抗体在PBS中稀释至1∶20,000。
[0249] 匀质性
[0250] 在实验计划中，对中值包含水平的MYCOSORB产品(4.0kg/T)获得样品的匀质性验证。将对该特定水平的测定在10个单独样品上重复5次，每个样品使用4个重复。
[0251] 根据详细见于表7中的计算值，CVH为4.53％。
[0252] 表7.对混合到欧洲类型乳牛饮食中的单个浓度即4.0kg/T的MYCOSORB产品的匀质性评价，其通过ELISA程序对10个重复分析4次的单独样品制备进行5批测试而评价。
[0253]
[0254] 校正
[0255] 对混合有如本文所述并在0.0至6.0kg/T范围内的已知标准样品浓度的MYCOSORB产品的饲料进行测定校正。线性曲线拟合y＝Ax用于限定浓度和响应(OD450)之间的关系。来自5批测试的平均值标准曲线示于图4中。
[0256] 线性度
[0257] 通过根据扣除空白之后使用最佳拟合线(截距在零处)ΔOD450＝Ax(MYCOSORB)所绘制的包含水平对OD450吸收的图线的方程式计算回归系数来评价标准曲线的线性度，由于2
发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度，表8。
发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度，表8。
[0258] 表8.标准曲线的线性度。
[0259]
[0260]*
[0261] 均方误差在线性回归模型中定义为： 其中 yi为实验测定的y值； 为MYCOSORB产品的期望xi浓度的理论值。
[0262] 重复性
[0263] 重复性是通过评估重复性标准偏差的内部变异的量度。已通过在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从同一批测试的相同样品获得同一批测试的重复内的重复性评价，以代表同一批测试内的检测变异CV内(表9)。已通过在不同天由相同技术人员使用相同设备和方法从不同批测试的相同样品获得不同批测试之间的重复性评价，以代表不同批测试之间的检测变异CV间(表10)。
[0264] 结果显示在同一天和在不同天获得的标准曲线均具有较小的变异性，并且当应用于0.0和6.0kg/T之间的标准曲线工作范围时平均日内精密度为5.70％且日间精密度为7.86％。总体精密度为8.28％(表11)。
[0265] 表9.标准曲线构建的测试批内重复性精密度。
[0266]
[0267]
[0268] 表10.标准曲线构建的测试批间重复性精密度。
[0269]
[0270]
[0271] 表11.标准曲线构建的总体精密度。
[0272]
[0273] LD和LQ(灵敏度)
[0274] LD和LQ值记录于表12中。发现LQ值低于MYCOSORB产品的推荐最小包含率即2kg/T，从而使得能够对饲料材料中的该产品进行定量。
[0275] 检测限 LD＝0.501±0.103kg/T
[0276] 定量限 LQ＝1.800±0.389kg/T
[0277] 表12.LD和LQ测定。
[0278]
[0279]
[0280] 准确度
[0281] 通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)对混合到饲料材料中的4.0-kg/T浓度的MYCOSORB产品测量准确度。根据以上表述的公式使用获得的用于匀质性计算的测定值计算每个样品的最终浓度(表13)。然后由对所有测试获得的平均准确度计算平均精密度，并与混合到饲料材料中的MYCOSORB产品的加标浓度量4.0-kg/T进行比较。根据上文给出的公式进行该计算。
[0282] 结果显示回收率评估导致对饲料材料的真实含量即MYCOSORB产品的加标浓度高估21％(表14)。
[0283] 表13.通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)对混合到饲料材料中的4.0-kg/T浓度的MYCOSORB产品测量的准确度和精密度。
[0284]
[0285]
[0286] 表14.通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)的平均对混合到饲料材料中的4.0-kg/T浓度的MYCOSORB产品测量的总体回收率。
[0287]
[0288] 使用鸡饲料材料验证
[0289] 在ALLTECH，Inc.，KY，USA的动物营养基因组学和应用动物营养学中心(Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal Nutrition)对混合有五个不同浓度的MYCOSORB产品的固体鸡饲料配方进行测试。
[0290] 对分别与0.0；0.5；1.0；4.0；5.0；6.0kg/T的MYCOSORB产品混合的鸡饲料材料以及分配在相同微量滴定板上的与未知水平的MYCOSORB产品混合的相同鸡饲料材料的样品进行分析。
[0291] 适用性
[0292] 进行该验证是为了确定开发用于分析MYCOSORB产品和替代物的ELISA测定作为一种旨在追踪复杂饲料原料中前面提及的产品的溯源性终点程序的特性。
[0293] 使用六个MYCOSORB产品(Ref.#285965)水平进行验证，该六个水平对应于混合到饲料样品中的包含水平工作范围(0.0；0.5；1.0；4.0；5.0；6.0kg/T)。
[0294] 稀释的兔多克隆抗体溶液：根据背景水平调整一级抗体稀释度。因此通过将1μl抗体溶液#1(4.15)加入到7.5ml PBS，1X中而将抗体在PBS中稀释至1∶7,500。每个微量滴定板需要10ml体积的溶液。
[0295] 稀释的羊抗兔抗体：根据背景水平调整二级抗体稀释度。因此通过将1μl抗体溶液#2加入到30.0ml PBS，1X中而将抗体在PBS中稀释至1∶30,000。
[0296] 匀质性
[0297] 在实验计划中，对中值包含水平的MYCOSORB产品(4.0kg/T)获得样品的匀质性验证。将对该特定水平的测定在10个单独样品上重复5次，每个样品使用4个平行测定(表15)。
[0298] 表15.对混合到鸡饲料材料中的单个浓度即4.0kg/T的MYCOSORB产品的匀质性评价，其通过ELISA程序对10个重复分析4次的单独样品制备进行5批测试而评价。
[0299]
[0300] 校正
[0301] 对混合有已知标准样品浓度并在0.0至6.0kg/T范围内的MYCOSORB产品的饲料进行测定校正，使用线性曲线拟合y＝Ax限定浓度和响应(OD450)之间的关系，来自5批测试的平均标准曲线示于图5中。
[0302] 线性度
[0303] 通过根据扣除空白之后使用最佳拟合线(截距在零处)ΔOD450＝Ax(MYCOSORB)所绘制的包含水平对OD450吸收的图线的方程式计算回归系数来评价标准曲线的线性度，由于2
发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度。对每个标准测试曲线和平均标准测试曲线计算的回归系数记录于表16中。
发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度。对每个标准测试曲线和平均标准测试曲线计算的回归系数记录于表16中。
[0304] 表16.鸡饲料材料中标准曲线的线性度。
[0305]
[0306] *均方误差在线性回归模型中定义为： 其中 yi为实验测定的y值； 为MYCOSORB产品的期望xi浓度的理论值。
[0307] 重复性
[0308] 重复性是通过评估重复性标准偏差的内部变异的量度。通过在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从同一批测试的相同样品获得同一批测试的重复内的重复性评价，以代表同一批测试内的检测变异CV内(表17)。已通过在不同天由相同技术人员使用相同设备和方法从不同批测试的相同样品获得不同批测试之间的重复性评价，以代表不同批测试之间的检测变异CV间(表18)。
[0309] 结果显示在同一天和在不同天获得的标准曲线均具有较小的变异性，平均日内精密度为6.00％。然而，当应用于0.0和6.0kg/T之间的标准曲线工作范围时，样品间的差异较明显，日间精密度为21.52％且总体精密度为21.75％(表19)。
[0310] 表17.标准曲线构建的测试批内重复性精密度。
[0311]
[0312]
[0313] 表18.标准曲线构建的测试批间重复性精密度。
[0314]
[0315] 表19.标准曲线构建的总体精密度。
[0316]
[0317] LD和LQ(灵敏度)
[0318] LD和LQ值记录于表20中。发现LQ值低于MYCOSORB产品的推荐包含率，从而使得能够对饲料材料中的该产品进行定量。
[0319] 检测限 LD＝0.547±0.237kg/T。
[0320] 定量限 LQ＝1.864±0.806kg/T。
[0321] 表20.鸡饲料材料中的LD和LQ测定。
[0322]
[0323] 准确度
[0324] 通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)对混合到饲料材料中的4.0-kg/T浓度的MYCOSORB产品测量准确度。如本文所述使用获得的用于匀质性计算的测定值计算每个样品的最终浓度(表21)。然后由对所有测试批获得的平均准确度计算平均精密度，并与混合到饲料材料中的MYCOSORB产品的加标浓度量4.0-kg/T进行比较。根据本文给出的公式进行该计算。
[0325] 结果显示回收率导致对饲料材料的真实含量即MYCOSORB产品的加标浓度高估18％(表22)。
[0326] 表21.通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量的准确度和精密度。
[0327]
[0328] 表22.通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)的平均对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量的总体回收率。
[0329]
[0330] 使用猪饲料材料验证
[0331] 在ALLTECH，Inc.，KY，USA的动物营养基因组学和应用动物营养学中心(Center for Animal Nutrigenomics and Applied Animal pig Nutrition)对混合有五个不同浓度的MYCOSORB产品的固体猪饲料配方进行测试。
[0332] 对分别与0.0；0.5；1.0；4.0；5.0；6.0kg/T的MYCOSORB产品混合的猪饲料材料以及分配在相同微量滴定板上的与未知水平的MYCOSORB产品混合的相同猪饲料材料的样品进行分析。
[0333] 适用性
[0334] 进行该验证是为了确定开发用于分析MYCOSORB产品和替代物的ELISA测定作为一种旨在追踪复杂饲料原料中所述产品的溯源性终点程序的特性。
[0335] 使用六个MYCOSORB产品水平进行验证，该六个水平对应于混合到饲料样品中的包含水平工作范围(0.0；0.5；1.0；4.0；5.0；6.0kg/T)。
[0336] 稀释的兔多克隆抗体溶液：根据背景水平调整一级抗体稀释度。因此通过将1μl抗体溶液#1加入到3.5ml PBS，1X中而将抗体在PBS中稀释至1∶3,500。每个微量滴定板需要10ml体积的溶液。
[0337] 稀释的羊抗兔抗体：根据背景水平调整二级抗体稀释度。因此通过将1μl抗体溶液#2加入到30.0ml PBS，1X中而将抗体在PBS中稀释至1∶30,000。
[0338] 匀质性
[0339] 在实验计划中，对中值包含水平的MYCOSORB产品(4.0kg/T)获得样品的匀质性验证。将对该特定水平的测定在10个单独样品上重复5次，每个样品使用4个重复(表23)。
[0340] 表23.对混合到猪饲料材料中的单个浓度即4.0kg/T的MYCOSORB产品的匀质性评价，其通过ELISA程序对10个重复分析4次的单独样品制备进行5批测试而评价。
[0341]
[0342] 校正
[0343] 对混合有已知标准样品浓度并在0.0至6.0kg/T范围内的MYCOSORB产品的饲料进行测定校正，使用线性曲线拟合y＝Ax(其截距设置在零处)限定浓度和响应(OD450)之间的关系，来自5批测试的平均标准曲线示于图6中。
[0344] 线性度
[0345] 通过根据扣除空白之后使用最佳拟合线(最佳拟合线截距在零处)ΔOD450＝Ax(MYCOSORB)所绘制的包含水平对OD450吸收的图线的方程式计算回归系数来评价标准曲2
线的线性度。由于发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度，对每个标准测试曲线和平均标准测试曲线计算的回归系数记录于表24中。
线的线性度。由于发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度，对每个标准测试曲线和平均标准测试曲线计算的回归系数记录于表24中。
[0346] 表24.猪饲料材料中标准曲线的线性度。
[0347]
[0348] 均方误差在线性回归模型中定义为： 其中 yi为实验测定的y值；为MYCOSORB产品的期望xi浓度的理论值。
[0349] 重复性
[0350] 重复性是通过评估重复性标准偏差的内部变异的量度。已通过在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从同一批测试的相同样品获得同一批测试的重复内的重复性评价，以代表同一批测试内的检测变异C内(表25)。已通过在不同天由相同技术人员使用相同设备和方法从不同批测试的相同样品获得不同批测试之间的重复性评价，以代表不同批测试之间的检测变异CV间(表26)。
[0351] 结果显示在同一天和在不同天获得的标准曲线均具有较小的变异性，并且当应用于0.0和6.0kg/T之间的标准曲线工作范围时平均日内精密度为7％且日间精密度为20％。
[0352] 表25.标准曲线构建的测试批内重复性精密度。
[0353]
[0354]
[0355] 表26.标准曲线构建的测试批间重复性精密度。
[0356]
[0357]
[0358] 表27.标准曲线构建的总体精密度。
[0359]
[0360] LD和LQ(灵敏度)
[0361] LD和LQ值记录于表28中。发现LQ值低于MYCOSORB产品的推荐包含率，从而使得能够对饲料材料中的该产品进行定量。
[0362] 检测限 LD＝0.403±0.150kg/T
[0363] 定量限 LQ＝1.363±0.498kg/T
[0364] 表28.猪饲料材料的LD和LQ测定。
[0365]
[0366]
[0367] 准确度
[0368] 通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量准确度。如本文所述使用获得的用于匀质性计算的测定值计算每个样品的最终浓度(表29)。然后由对所有测试获得的平均准确度计算平均精密度，并与混合到饲料材料中的MYCOSORB产品的加标浓度量4.0kg/T进行比较。根据本文所述的公式进行该计算。
[0369] 结果显示回收率评估导致对饲料材料的真实含量即MYCOSORB产品的加标浓度高估20％(表30)。
[0370] 表29.通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量的准确度和精密度。
[0371]
[0372]
[0373] 表30.通过5次独立实验(每次实验包含10个独立样品且每个样品重复测试4次)的平均对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量的总体回收率。
[0374]
[0375] 使用鸡和猪饲料材料验证
[0376] 在鸡和猪基质中进行用于MYCOSORB检测的饲料ELISA测定，并在独立实验室中验证并与验证结果相比较。在Alimetrics，Ltd.，Koskelontie 19B，Espoo，Finland验证所述测定。
[0377] 在不同的2天对混合有在0.0至6.0kg/T范围内的已知标准样品浓度的MYCOSORB产品的饲料进行测定校正。使用线性曲线拟合y＝Ax(截距设置在零处)限定猪饲料原料和鸡饲料原料中浓度和响应(OD450)之间的关系。吸光度和所得校正在不同测试批之间显著不同；然而，已知样品和盲样品的绝对浓度保持相同。
[0378] 线性度
[0379] 通过根据扣除空白之后使用最佳拟合线(最佳拟合线截距在零处)ΔOD450＝Ax(MYCOSORB)所绘制的包含水平对OD450吸收的图线的方程式计算回归系数来评价标准曲2
线的线性度。由于发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度，相关系数范围为0.991至0.994(表31)。
线的线性度。由于发现相关系数值高于r ＞0.95而证明标准曲线的线性度，相关系数范围为0.991至0.994(表31)。
[0380] 表31.鸡和猪饲料材料中标准曲线的线性度。
[0381]
[0382] 均方误差在线性回归模型中定义为： 其中 yi为实验测定的y值；为MYCOSORB产品的期望xi浓度的理论值。
[0383] LD和LQ(灵敏度)
[0384] LD和LQ值在40％盐酸基质中进行测定。各自LD和LQ值的估计分别为混合到鸡饲料原料中的0.35kg/T和1.20kg/T MYCOSORB以及混合到猪饲料原料中的0.27kg/T和0.91kg/T MYCOSORB(分别表32和表33)。
[0385] 表32.在间隔一天时间进行并由验证实验室对鸡饲料原料执行的两个单独测试批中获得的空白样品的结果。
[0386]
[0387]
[0388] 表33.在间隔一天时间进行并由验证实验室对猪饲料原料执行的两个单独测试批中获得的空白样品的结果。
[0389]
[0390] “已知”样品的准确度和精密度
[0391] 通过2次独立实验(每次包含6个平行测定)对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量准确度。由对所有测试获得的平均准确度计算平均精密度，并与混合到饲料材料中的MYCOSORB产品的加标浓度量4.0kg/T进行比较。
[0392] 获得的值达到准确度和精密度两方面的标准，如下。
[0393] 已通过在同一天由相同技术人员使用相同设备和方法从同一批测试的相同样品获得同一批测试的重复内的重复性评价，以代表同一批测试内的检测变异CV内。已通过在不同天由相同技术人员使用相同设备和方法从不同批测试的相同样品获得不同批测试之间的重复性评价，以代表不同批测试之间的检测变异CV间。
[0394] 如下针对鸡和猪基质，获得的值达到准确度和精密度两方面的标准(表34和表35)。
[0395] 表34.通过使用混合到鸡饲料材料中的MYCOSORB产品的已知样品(4.0kg/T)在不同的2天进行的6个重复测试测定的准确度和精密度。
[0396]
[0397] 表35.通过使用混合到猪饲料材料中的MYCOSORB产品的已知样品(4.0kg/T)在不同的2天进行的6个重复测试测定的准确度和精密度。
[0398]
[0399] “未知”样品的准确度和精密度
[0400] 在盲测中通过2次独立实验(每次包含3个平行测定)对混合到饲料材料中的4.0kg/T浓度的MYCOSORB产品测量准确度。获得的值达到准确度和精密度两方面的标准，如下(表36和表37)。
[0401] 表36.通过对混合到鸡饲料材料中的MYCOSORB产品的未知样品(4.0kg/T)进行的3个重复测试测定的准确度和精密度。
[0402]
[0403]
[0404] 表37.通过对混合到猪饲料材料中的MYCOSORB产品的未知样品(4.0kg/T)进行的3个重复测试测定的准确度和精密度。
[0405]
[0406] 耐变性
[0407] 耐变性分析评价在经受环境和程序变量的微小变化时测量方法抵抗结果变化的能力。
[0408] 通过改变一级抗体和二级抗体稀释度、一级抗体的稳定性、通过改变不同待测样品在微量滴定板上的分配(包含所有待测定样品并包含空白、标准品和未知样品的单个板vs.包含每个分析样品更多重复但空白、标准品和未知样品在不同微量滴定板上的多个微量滴定板)来研究ELISA测定的稳定性。表38记录了变化，并显示甚至在进行变化的情况下结果也是一致的，这表明该测试具有较强的耐变性，尤其是对抗体稀释度的变化。
[0409] 表38.耐变性测试。标准条件以粗体示出。如果存在，10％的改变也突出显示。
[0410]
[0411]
[0412] 实施例5
[0413] 单克隆抗体特异性测试
[0414] 方法
[0415] 以针对酵母(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA缀合物产生的单克隆抗体测试十七种在PBS中浓度为50μg/ml的化合物以确定交叉反应性。
[0416] 测试的化合物为：可溶性马铃薯淀粉、米淀粉、小麦淀粉、玉米淀粉、BSA、糖原(来自兔)、糖原(来自牡蛎)、糖原(牛)、甘露聚糖、昆布多糖、Zymosin A、Maltrin QD、来自面包酵母的葡聚糖、来自纤细裸藻(Eug.gracilis)的(1→3)-β-D-葡聚糖、圆酵母(Torulayeast)、珠磨器制备的Ycw-02(酵母细胞壁部分-珠磨器制备)、来自大麦的β葡聚糖。
[0417] 还测试了浓度为1μg/ml、2μg/ml和5μg/ml的酵母细胞壁提取物(MYCOSORB批号08FS001)和用于产生单克隆抗体的(1→4)-α-D-葡聚糖/(1→6)-β-D-葡聚糖-BSA抗原。两种单克隆抗体(513A161.1和513A431.1)均以如下范围的稀释度进行测定：1∶100、1∶200、1∶500、1∶1000、1∶1500和1∶2000。使用批号0702013的96孔Nunc微量滴定板。将板每个孔覆以100μl化合物并通过使用指尖轻叩8-10次摇动。将板用密封带覆盖并在37℃下孵育1h。使用多道移液器移除溶液并将板洗涤3次，每次洗涤使用200μl PBS。在每次移除洗涤溶液之前使用指尖轻叩板8-10次。洗涤之间，通过将板在纸巾上轻叩而移除多余液体。为了封闭，每个孔添加100μl的3％牛奶(未离心)。将板在室温下孵育1h。移除封闭溶液并使用1x 200μl PBS、2x 200μlPBS+0.05％聚山梨醇酯20洗涤各孔。在每次移除洗涤溶液之前通过使用指尖轻叩8-10次摇动板。洗涤之间，通过将板在纸巾上轻叩而移除多余液体。
[0418] 每个孔添加100μl的每种稀释度的适当血清。PBS(100μl/孔)用于空白孔。将板覆盖、在室温下孵育1h。移除溶液并将各孔洗涤3次，每次使用200μl PBS+0.05％聚山梨醇酯20。在每次移除洗涤溶液之前使用指尖轻叩板8-10次以进行摇动。洗涤之间，通过将板在纸巾上轻叩而移除多余液体。每个孔添加100μl二级抗体(1∶10,000羊抗鼠，IgG-过氧化物酶缀合的)。将板覆盖、在室温下孵育1h。移除溶液并将各孔洗涤3次，每次洗涤使用200μl PBS+0.05％聚山梨醇酯20。在每次移除洗涤溶液之前使用指尖轻叩板8-10次以进行摇动。洗涤之间，通过将板在纸巾上轻叩而移除多余液体。
[0419] 每个孔添加100μl室温TMB底物。5分钟之后，每个孔使用100μl 1N HCl终止反应。将板底部指纹擦净，并在10秒摇振之后，使用微量滴定板阅读仪读取450nm下的吸光度。
[0420] 结果
[0421] ELISA数据的柱状图示于图9-14中。513A161.1和513A431.1与浓度低至1μg/ml的抗原499-73-3均非常强烈地反应，并与2μg/ml抗原反应产生最强的吸光度读数。抗体也能识别浓度在1μg/ml至5μg/ml范围内的08FS001，且在5ug/ml下具有最强吸光度读数。然而，08FS001的吸光度显著低于抗原499-73-3。抗体513A161.1识别昆布多糖并与其显著反应，而513A431.1则不然。对于Zymosin A，两种抗体均具有非常强的吸光度读数，该吸光度读数类似于且有时强于见于抗原499-73-3的吸光度。令人惊奇的是，所述抗体显示与ZymosinA、Maltrin QD、来自面包酵母的葡聚糖、来自纤细裸藻的(1→3)-β-D-葡聚糖、圆酵母和ycw-02珠磨器沉淀物的显著交叉反应，从而限制了其用于定量ELISA测定的用途。
[0422] 实施例6
[0423] 优化单克隆抗体ELISA测定条件以检测从饲料提取的抗原的尝试
[0424] 在PBS中稀释对比在PBS+3％脱脂奶粉中稀释
[0425] 在定量ELISA测定中尝试使用单克隆抗体513A161.1(实施例5)以检测从饲料提取的抗原导致低吸光度读数。为了确定将抗体稀释于3％牛奶(相对于稀释于PBS中)是否影响吸光度读数(例如，通过在与饲料提取物组分结合时引起过度封闭)，进行以下方案：
[0426] 如实施例4中所述使用包含0.5％HCl的溶液对酵母细胞壁提取物(MYCOSORB批号08FS001)进行化学提取方法。如实施例5中所述进行ELISA测定，使用稀释度为1∶400的单克隆抗体513A161作为一级抗体并使用稀释于PBS或3％牛奶中的羊抗鼠IgG-HRP抗体(1∶10,000)作为二级抗体。将微量滴定板每个孔覆以100μl酵母细胞壁提取物或每个孔覆以200μl按1∶1稀释于PBS中的提取物。
[0427] 示于图15中的结果证实观察到抗体稀释剂的轻微但统计学上不显著的影响。另外，尝试使用单克隆抗体检测饲料标准品中的抗原(所述抗原用0.5％HCl提取)所进行的三个重复测定导致平行测定之间的读数的较大波动、较大标准偏差和抬高的吸光度读数。
[0428] 抗原涂覆步骤-温度和时间
[0429] 在定量ELISA测定中尝试使用单克隆抗体513A161.1(实施例5)以检测从饲料提取的抗原导致低吸光度读数。为了提高使用鼠单克隆抗体513A161.1的ELISA的吸光度读数，进行以下实验以确定改变抗原涂覆孵育步骤的时间和温度是否会改善从饲料提取的抗原的检测而不增加背景/非特异性结合。
[0430] 方案包括如上所述进行饲料提取以产生分析样品。将样品等分试样立即涂覆到板上或在-25℃下保存过夜。重复样品制备3次以产生三个平行提取物。使用鸡饲料制剂中的抗原制备六点标准曲线样品(0，0.4，0.8，1.2，1.8，2.4kg/T)。将板用饲料提取物标准曲线样品涂覆并使其在如下条件下孵育：4℃下过夜(静止)、4℃下过夜(摇动)或37℃下1小时(静止)。如实施例5中所述进行ELISA测定，使用按1∶400的稀释度在3％牛奶中制备的单克隆抗体513A161.1作为一级抗体并使用稀释于3％牛奶中的羊抗鼠IgG-HRP抗体(1∶10,000)作为二级抗体。底物孵育进行30分钟，并测定450nm下的吸光度。
[0431] 示于图16中的结果表明：改变抗原涂覆到板上的时间和温度并不会将吸光度增加至最佳范围并且也不会影响标准曲线的线性度。此外，背景增加与孵育时间无关。
[0432] 实施例7
[0433] 多克隆抗体选择性(干扰)测试
[0434] 为了确定干扰程度，使用本文所述的鸡饲料材料进行一组测定，所述鸡饲料材料不含或含有存在量为1kg/T的MYCOSORB产品(参考号285965)，该含有MYCOSORB产品的鸡饲料材料不含或含有若干比例的属于饲料制剂中存在的碳水化合物或副产品的可能干扰产品(相比于MYCOSORB产品包含水平为50％、100％、200％，w/w)。在这方面，已对以下产品进行研究并测试以评价其对通过本文的确切方法检测MYCOSORB产品的影响：
[0435] ·直链淀粉(马铃薯淀粉)：(1→4)∶(1→6)-α-D-葡聚糖的比率为30∶1。
[0436] ·麦芽糊精和玉米糖浆固体：由天然玉米淀粉、右旋糖的聚合物制成的容易消化的碳水化合物。
[0437] ·糖原(来自牛肝脏，IX类型)：(1→4)∶(1→6)-α-D-葡聚糖的比率为10∶1。
[0438] · 昆 布 多 糖 ( 来 自 掌 状 海 带 ( L am in ar iadigitata))∶(1→3)∶β(1→6)-β-D-葡聚糖的比率为3∶1。
[0440] ·Red Star Pasteur香槟活性干酒酵母(来自贝酵母(Saccharomycesbayanus))：酵母和酵母细胞壁(由(1→3)∶β(1→6)-β-D-葡聚糖、与蛋白质连接的(1→4)∶(1→6)-α-D-聚甘露糖、(1→2)∶(1→4)-β-N-乙酰葡萄糖胺制成的复合碳水化合物)。
[0441] 如图7和图8中所示，使用MYCOSORB产品和混合有50％、100％、200％(w/w)的干扰物质的MYCOSORB产品获得的信号之间的差值总计为大约0的OD450值。该结果说明了不存在干扰并且因此所述测定用于检测包含不同碳水化合物干扰物质的复杂饲料基质中MYCOSORB产品的特异性。
[0442] 每种单独干扰物质的详细结果和单因素方差分析检验在95％置信区间的极限值在表39至表44中给出，其中计算了光密度(450nm)平均值和样品间的差值以及标准偏差和变异系数。使用Levene’s、O′Brien′s、以及Brow和Forsythe检验评价了每种干扰物质内的方差齐性。在非恒定方差的情况下，使用非参数Kruskal-Willis单因素方差分析方法，其中秩转换产生对非正态性更加稳健且抗异常值的检验。对于测试的每种干扰物质浓度，在不同板上或在单个独立板上进行分析。两种板制备获得相同的结果。
[0443] 表39.对鸡饲料中混合有0、50％、100％、200％(w/w)的直链淀粉的MYCOSORB产品获得的OD450平均值。值之间的差异通过置信区间为95％的单因素方差分析和均值比较统计检验进行分析。
[0444]
[0445]
[0446] 表40.对鸡饲料中混合有0、50％、100％、200％(w/w)的麦芽糊精的MYCOSORB产品获得的OD450平均值。值之间的差异通过置信区间为95％的单因素方差分析和均值比较统计检验进行分析。
[0447]
[0448]
[0449] 表41.对鸡饲料中混合有0、50％、100％、200％(w/w)的糖原的MYCOSORB产品获得的OD450平均值。值之间的差异通过置信区间为95％的单因素方差分析和均值比较统计检验进行分析。
[0450]
[0451]
[0452] 表42.对鸡饲料中混合有0、50％、100％、200％(w/w)的昆布多糖的MYCOSORB产品获得的OD450平均值。值之间的差异通过置信区间为95％的单因素方差分析和均值比较统计检验进行分析。
[0453]
[0454]
[0455] 表43.对鸡饲料中混合有0、50％、100％、200％(w/w)的REDSTAR酒酵母的MYCOSORB产品获得的OD450平均值。值之间的差异通过置信区间为95％的单因素方差分析和均值比较统计检验进行分析。
[0456]
[0457]
[0458] 表44.对鸡饲料中混合有0、50％、100％、200％(w/w)的干酒糟的MYCOSORB产品获得的OD450平均值。值之间的差异通过置信区间为95％的单因素方差分析和均值比较统计检验进行分析。
[0459]
[0460]
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 非火焙干燥黑毛茶的制备方法及其制备的黑毛茶 | 2020-05-14 | 95 |
| 一种利用酒糟生产白酒的方法 | 2020-05-14 | 75 |
| 一种龙蛇酒及其制作方法 | 2020-05-12 | 409 |
| 一种苹果柚富含微量元素高产栽培技术 | 2020-05-13 | 415 |
| 一种有机凉粉草的种植方法 | 2020-05-13 | 483 |
| 一种优质青贮构树饲料的制备方法 | 2020-05-13 | 715 |
| 低压法双粗双精蒸馏生产燃料乙醇的系统及工艺 | 2020-05-08 | 1045 |
| 一种稻蛙生态共养方法 | 2020-05-12 | 359 |
| 具有在同一颗粒内分开的尿素酶抑制剂和硝化抑制剂的增效肥料 | 2020-05-13 | 719 |
| 一种利用葡萄牙棒孢酵母酿造日本清酒的方法 | 2020-05-08 | 573 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
全酒糟热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈