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一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法

阅读:328发布:2021-04-14

专利汇可以提供一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法,所述粘片剂的成分为每100ml中含鸡蛋清3‑5 mL和糯米粉乳液5‑7 mL,余量为蒸馏 水 ;制备方法为,分别取3~5 mL鸡蛋清和5‑7 mL糯米粉乳液放于烧杯,用无菌水定容至100 mL,混匀,再用0.22µm规格的一次性针头 过滤器 过滤,滤液即为粘片剂;采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,包括收集菌体、固定、粘片、脱水、置换、 临界点 干燥、粘台和离子溅射的步骤;本 发明 解决了细菌扫描电镜观察实验中的脱片和混杂现象,针对细菌扫描电镜观察实验提供了一种行之有效的粘片剂及其制备方法和制片方法。,下面是一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法专利的具体信息内容。

1.一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂,其特征在于:其成分为,每100ml中含糯米粉乳液5-7 mL和鸡蛋清3-5 mL,余量为蒸馏
所述糯米粉乳液的制备:称取糯米粉5 g,130 ℃烘干1 h后,研钵充分研碎,放入50 mL离心管中,加40 mL蒸馏水,涡旋振荡器震荡20 min后,静置30 min,上清液即为糯米粉乳液。
2.如权利要求1所述粘片剂的制备方法,其特征在于:包括以下步骤:
分别取3-5 mL鸡蛋清和5-7 mL糯米粉乳液放于烧杯,用无菌水定容至100 mL,混匀,再用0.22 µm规格的一次性针头过滤器过滤,滤液即为粘片剂,于4 ℃保存,备用。
3.采用权利要求1所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,其特征在于:
包括以下步骤:
(1)收集菌体:将细菌材料经液体摇床培养24 -26h,获取旺盛生长的菌液;取培养好的菌液2 ml,移入10 ml无菌离心管,离心,弃上清,留沉淀菌体;在沉淀加入5 ml pH7.0、0.02 mol/L磷酸缓冲液悬浮漂洗5 min,离心,再用5 ml无菌水漂洗5 min,离心得菌体沉淀;
(2)固定:向菌体沉淀中加入1.5 ml 质量浓度2为.5%戊二水溶液,轻柔吹吸悬浮菌体,4 ℃固定6-12 h,离心,弃上清,留沉淀,加入2mL粘片剂悬浮菌体;
(3)粘片:将1片切割成5-7mm方载玻片小片投入步骤(2)的粘片剂菌体悬浮液中,轻轻晃动,使载玻片在菌悬液中翻转1-2次,之后静置5min,用镊子捞出载玻片小片,垂直放置,自然晾干;
(4)脱水:将步骤(3)中粘有菌体的载玻片小片依次用梯度叔丁醇,即从低体积浓度梯度叔丁醇到高体积浓度梯度叔丁醇,进行脱水,每个梯度10-15 min;
(5)置换:向步骤(4)中加入1.5ml乙酸异戊酯置换出菌体中所含的叔丁醇,连续进行两次,每次20-30 min;
(6)临界点干燥:将步骤(5)载玻片小片放入临界点干燥仪舱室中进行干燥2-2.5 h;
(7)粘台:将干燥后的载玻片小片直接粘于电镜样品台双面胶上;
(8)离子溅射:对粘有菌体材料的载玻片小片进行喷金膜后,即得到扫描电镜细菌超微形态观察片,置于扫描电镜中进行观察,拍照。
4.如权利要求3所述制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,其特征在于:步骤(1)和步骤(2)中所述离心,为6000-10000 r/min离心5 min。
5.如权利要求3所述制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,其特征在于:步骤(3)中所述自然晾干的时间为2min以内。
6.如权利要求3所述制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,其特征在于:步骤(4)所述梯度叔丁醇的体积分数分别为30%、50%、70%、85%、95%、100%,其中体积分数为100 %叔丁醇进行脱水2次。

说明书全文

一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种粘片剂,具体说是一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂及其制备方法。

背景技术

[0002] 生物因为个体微小肉眼无法直接观察,因而对菌体进行显微观测是微生物研究中最基本的一项技能,当运用普通光学显微镜进行形态观察无法达到目的时,还要借助于扫描电子显微镜(扫描电镜)来了解菌体的超微形态特征。细菌是微生物中最为典型的一类生物,传统的细菌扫描电镜观察实验中,尚未见有使用粘片剂的报道,经典的做法都是利用菌体对载玻片自然的黏附作用来完成实验,但这种处理方法菌体的脱片率较高,尤其是在二临界干燥环节,因为二氧化碳较长时间的反复冲击,更容易造成部分菌体从载玻片上脱落,从而使二氧化碳干燥仪舱室中不同样品间出现混杂,最终导致错误的观察结果。所以,探索更加有效的细菌扫描电镜观察制片方法,仍然具有广泛的现实意义,实际应用前景广阔。
[0003] 传统的细菌扫描电镜观察制片技术一般也能达到实验目的,但存在的问题也显而易见,这些不足集中体现在:(1)细菌在载玻片上的粘附仅仅依靠细菌细胞壁对载玻片的自然黏附作用,在制片的脱、置换和二氧化碳干燥环节出现明显的脱片现象;(2)在二氧化碳干燥环节出现脱片现象时,很容易形成不同样品间的混杂。虽然一次只干燥一个样品可以避免混杂情况的出现,但这样大大增加了实验耗时和成本,不利于多个样本实验的开展。

发明内容

[0004] 本发明目的是解决细菌扫描电镜观察实验中的脱片和混杂现象,针对细菌扫描电镜观察实验的提供一种行之有效的粘片剂及其制备方法和制片方法。
[0005] 一种用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂,其成分为每100 ml中含糯米粉乳液5-7 mL和鸡蛋清3-5 mL,余量为蒸馏水;
所述糯米粉乳液的制备:称取糯米粉5 g,130 ℃烘干1 h后,研钵充分研碎,放入50 mL离心管中,加40 mL蒸馏水,涡旋振荡器震荡20 min后,静置30 min,上清液即为糯米粉乳液。
[0006] 用于制作细菌扫描电镜观察片的粘片剂的制备方法,包括以下步骤:分别取3-5 mL鸡蛋清和5-7 mL糯米粉乳液放于烧杯,用无菌水定容至100 mL,混匀,再用0.22 µm规格的一次性针头过滤器过滤,滤液即为粘片剂,于4 ℃保存,备用。
[0007] 采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,包括以下步骤:(1)收集菌体:将细菌材料经液体摇床培养24 -26h,获取旺盛生长的菌液;取培养好的菌液2 ml,移入10 ml无菌离心管,离心,弃上清,留沉淀菌体;在沉淀加入5 ml pH7.0、0.02 mol/L磷酸缓冲液悬浮漂洗5 min,离心,再用5 ml无菌水漂洗5 min,离心得菌体沉淀;
(2)固定:向菌体沉淀中加入1.5 ml 质量浓度2为.5%戊二水溶液,轻柔吹吸悬浮菌体,4 ℃固定6-12 h,离心,弃上清,留沉淀,加入2mL粘片剂悬浮菌体;
(3)粘片:将1片切割成5-7mm方的载玻片小片投入步骤(2)的粘片剂菌体悬浮液中,轻轻晃动,使载玻片在菌悬液中翻转1-2次,之后静置5min,用镊子捞出载玻片小片,垂直放置,自然晾干;
(4)脱水:将步骤(3)中粘有菌体的载玻片小片依次用梯度叔丁醇,即从低体积浓度梯度叔丁醇到高体积浓度梯度叔丁醇,进行脱水,每个梯度10-15 min;
(5)置换:向步骤(4)中加入1.5ml乙酸异戊酯置换出菌体中所含的叔丁醇,连续进行两次,每次20-30 min。
[0008] (6)临界点干燥:将步骤(5)载玻片小片放入临界点干燥仪舱室中进行干燥2-2.5 h;(7)粘台:将干燥后的载玻片小片直接粘于电镜样品台双面胶上;
(8)离子溅射:对粘有菌体材料的载玻片小片进行喷金膜后,即得到扫描电镜细菌超微形态观察片,置于扫描电镜中进行观察,拍照。
[0009] 所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,步骤(1)和步骤(2)中所述离心,为6000-10000 r/min离心5 min。
[0010] 采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,步骤(3)中所述自然晾干的时间为2min以内。
[0011] 采用所述粘片剂制作扫描电镜细菌超微形态观察片的方法,步骤(4)所述梯度叔丁醇的体积分数分别为30%、50%、70%、85%、95%、100%,其中体积分数为100 %叔丁醇进行脱水2次。
[0012] 有益效果是:1、运用扫描电子显微镜对细菌进行显微观测是掌握和了解未知类群必不可少的研究内容之一,微观形态特征是细菌多相分类的重要依据之一,然而细菌扫描电镜观察实验中,脱片和混杂情况非常普遍。本发明提供了一种细菌扫描电镜观察制片方法,丰富了微生物显微观察制片技术途径,在微生物的形态观察实验中具有很强的实用性。
[0013] 2、本发明粘片剂不但可以使菌体在载玻片粘附更牢固,也可以使接触的菌体之间黏合的更牢固,这样一来,即便是菌体相互重叠,一些菌体没有与载玻片有效粘连,也不会在二氧化碳临界干燥环节被冲散,使不同样品之间形成混杂,所以,尤其适合多个样品同时进行干燥的情况,也使对菌体浓度的要求更加的宽泛。粘片剂制备质量的好坏,是影响其发挥作用的关键。在制备过程中,几个关键点是:糯米粉烘干温度必须达到130 ℃、持续时间不超过2 h才能有较好的糊化效果;对鸡蛋清的选择最好是选用土鸡蛋的蛋清;过滤除菌要遵循微生物实验无菌操作的一般技术要求。
[0014] 3、本发明技术方案目的明确,效果可靠,制备过程通俗易懂,便于操作,既可用作细菌扫描电镜观察制片时的粘片剂,也可以推广到酵母菌、放线菌、真菌孢子等微生物个体的扫面电镜观察实验。粘片剂在具体使用时也可根据实验材料的大小、细胞形态特征等情况适当调整成分用量,以达到最佳的使用效果。
[0015] 4、在本发明技术方案原理是,粘片剂中糯米粉主要含有支链淀粉蛋白质和少量脂肪等天然高分子化合物成分,这些成分干热后发生糊化,高分子之间的相互作用增强,使得淀粉成分和蛋白成分嵌合更加牢固,形成新的更加致密的网络结构,其胶凝性和稳定性也有较大提高,有利于对微小菌体的黏附固定。鸡蛋清作为粘片剂成分主要是因为其含有纤维状粘蛋白,在粘片剂中,蛋清的纤维状粘蛋白补充糯米粉乳液中的蛋白种类,二者相互配合,可起到更好的胶连作用,提高对菌体的黏附效果。糯米粉乳液和鸡蛋清的混合过程中,必须在室温下进行,因为在高温下,鸡蛋清会提前形成絮状沉淀,失去黏附效果。附图说明
[0016] 图1是本发明的实施例1中的长杆型细菌扫描电镜观察效果图;图2是本发明的实施例1中的球型细菌扫描电镜观察效果图;
图3是本发明的实施例1中的鞭毛细菌扫描电镜观察效果图;
图4是本发明的实施例1中的混杂污染菌扫描电镜观察效果图;
其中,图中箭头所指为两种细菌;
图5是本发明的实施例2中的100000倍扫描电镜下的观察效果图;
图6是本发明的实施例2中的15000倍扫描电镜下的观察效果图。

具体实施方式

[0017] 实施例1采用本发明技术示范和验证对不同形态类型细菌的制片观察效果,具体操作如下:
(1)粘片剂的制备
粘片剂配方(100 mL计):糯米粉乳液6 mL,鸡蛋清4 mL,蒸馏水定容至100 mL。
[0018] 粘片剂制备方法(100 mL计):A.糯米粉乳液的制备:称取糯米粉5 g,130 ℃烘干1 h后,研钵充分研碎,放入50 mL离心管中,加40 mL蒸馏水,涡旋振荡器震荡20 min后,静置30 min,上清液即为糯米粉乳液。
[0019] B.粘片剂的制备过程:分别取3-5 mL鸡蛋清和5-7 mL糯米粉乳液放于烧杯,用无菌水定容至100 mL,从分混匀,再用0.22 µm规格的一次性针头过滤器过滤,滤液即为制得的粘片剂。于4 ℃保存备用。
[0020] (2)细菌扫描电镜观察制片过程将细菌材料经液体摇床培养24 h左右,获取旺盛生长的菌体材料。
[0021] (1)收集菌体:取培养好的菌液2 ml,移入10 ml无菌离心管,6000-10000 r/min离心5 min,弃上清,留沉淀菌体。在沉淀加入5 ml pH7.0、0.02 mol/L磷酸缓冲液悬浮漂洗5 min,离心(条件同前文,下同),再用5 ml无菌水漂洗5 min,离心得菌体沉淀。
[0022] (2)固定:向离心管中加入1.5 ml 2.5%戊二醛溶液,轻柔吹吸悬浮菌体,4 ℃固定6-12 h,离心,弃上清,留沉淀,加入2mL粘片剂悬浮菌体。
[0023] (3)粘片:将切割成5-7mm方块的载玻片小片(1片)投入步骤(2)的粘片剂菌体悬浮液中,轻轻晃动,使载玻片在菌悬液中翻转1-2次,之后静置5min,用镊子捞出载玻片小片,垂直放置,自然晾干(一般控制在2min以内)。
[0024] (4)脱水:将步骤(3)中粘有菌体的载玻片小片用梯度叔丁醇(体积分数分别为30%、50%、70%、85%、95%、100%)溶液依次脱水,每个梯度10-15 min,其中100 %叔丁醇进行2次。
[0025] (5)置换:向步骤(4)中加入1.5ml乙酸异戊酯置换出菌体中所含的叔丁醇,连续进行两次,每次20-30 min。
[0026] (6)临界点干燥:将步骤(5)载玻片小片放入临界点干燥仪舱室中进行干燥2-2.5 h。
[0027] (7)粘台:将干燥后的载玻片小片直接粘于电镜样品台双面胶上。
[0028] (8)离子溅射:对粘有菌体材料的载玻片小片进行喷金镀膜。
[0029] (9)观察:将喷金镀膜后的样品台置于扫描电镜中进行观察,拍照。
[0030] 以制片过程中不使用粘片剂为作为对照,对三种不同类型的细菌同时制样,在同一干燥仪舱室干燥,实验重复3次,每种材料做3片,统一观察20个视野。实验结果表明:使用本发明粘片剂制片,对长杆型细菌、球形细菌和具有鞭毛的细菌,均达到了较好的观察效果,在观察过程中未发现不同类型菌株之间的混杂,如图1-3所示;而未使用粘片剂的对照,则出现了混杂情况,如图4所示,说明使用粘片剂确实加固了菌体在载玻片上的牢固程度。
[0031] 实施例2采用本发明技术示范和验证不同放大倍数情况下两种类型细菌的观察效果,以制片过程中不使用粘片剂为对照,操作同案例一。
[0032] 结果表明:当对菌体进行高倍观察时,使用粘片剂的处理在高倍镜下(如10万倍)观察时,未出现漂移、放电、无法聚焦等情况(图5);未使用粘片剂的处理在高倍镜下(如1.6万倍)观察时,即出现漂移、难以聚焦、放电等情况,如图6所示,说明使用粘片剂在细菌的扫描电镜观察时,尤其是在高倍镜下观察时具有明显优势。
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