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一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用

阅读：853发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用，所述的捕获探针为Fe3O4/CuS，所述的Fe3O4/CuS包括首先制备Fe3O4微球，然后将Fe3O4微球加入CTAB溶液中，采用化学沉积法，加入CuSO4与Na2S溶液并搅拌洗涤制备Fe3O4/CuS。本发明只需将细菌与捕获探针孵育，免去了复杂的标记过程。解决了配对抗体的困难，更简单，方便，新颖。利用Fe3O4/CuS 纳米材料具有光热特性，在肉眼检测的基础上，光热检出方式将灵敏度检出限提高了10倍。用细菌鞭毛蛋白免疫制备出的单克隆抗体，只能高度特异性识别大肠杆菌O157:H7，对其他门类的细菌都无特异性。可以检测牛肉、鸡肉、牛奶以及蜂蜜等实际样品中的大肠杆菌O157:H7，具有很好的应用前景，可以作为通用检测方法检测所有的病原菌。，下面是一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种捕获探针，其特征在于，所述的捕获探针为Fe3O4/CuS，所述的Fe3O4/CuS包括首先制备Fe3O4微球，然后将Fe3O4微球加入CTAB溶液中，采用化学沉积法，加入CuSO4与Na2S溶液并搅拌洗涤制备Fe3O4/CuS。
2.如权利要求1所述的捕获探针，其特征在于，所述的Fe3O4微球的加入量为0.1～0.3g，粒径为220～280nm。
3.如权利要求1或2所述的捕获探针，其特征在于，所述的CuS的粒径为240～420nm。
4.一种大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法，其特征在于，包括用权利要求1～3任一权利要求所述的捕获探针将待检测样品中的大肠杆菌O157:H7捕获，进行孵育得到待检液，然后将待检液滴加至检测大肠杆菌O157:H7的试纸条上，然后采用近红外光照射试纸条，实现双通道检测。
5.如权利要求4所述的大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法，其特征在于，所述的捕获探针的浓度为0.8～1.2mg/mL，所述的孵育时间为10～900s，所述的近红外光波长为808nm。
6.如权利要求4所述的大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法，其特征在于，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理，所述的试纸条无质控线。
7.如权利要求6所述的大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法，其特征在于，所述的检测线包被有大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备方法包括：大肠杆菌O157:H7单克隆抗体溶于包被液配制成1mg/mL的抗体包被溶液，将抗体包被溶液以1μL/cm的速度包被于距硝酸纤维素膜的检测线上；
所述的包被液为：0.02g叠氮化钠、0.8g 氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL即得。
8.如权利要求6所述的大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法，其特征在于，所述的试纸条对大肠杆菌O157:H7的检测限为102CFU/mL。
9.权利要求1-4任一权利要求所述的捕获探针用于检测牛肉、鸡肉、牛奶和蜂蜜中的大肠杆菌O157:H7。
10.权利要求5-8任一权利要求所述的大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法用于检测牛肉、鸡肉、牛奶和蜂蜜中的大肠杆菌O157:H7。

说明书全文

一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用

技术领域

[0001] 本发明属生物检测领域，具体涉及一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用。

背景技术

[0002] 大肠杆菌O157:H7是从人肠出血性大肠杆菌感染中分离的常见血清型，其也是沙门氏菌和弯曲杆菌属之后第三种最常见的细菌食源性病原体。牛及其肉制品被认为是全球大肠杆菌O157的主要来源，另外，也从其他动物肉类产品中将其分离出来，如鸡肉、猪肉和羊肉。大肠杆菌O157:H7引起食物感染和食物中毒之后，会发生严重的痉挛性腹痛和反复发作的出血性腹泻，同时伴有发热、呕吐等表现，因此，快速、准确、灵敏、简便地检测出大肠杆菌，在医疗卫生、食品卫生、动物疫病监测等方面具有重要的意义，为了更早更灵敏地检测大肠杆菌O157:H7，实现易于操作，快速，便携和低成本的方法仍然是巨大的技术挑战。

[0003] 近年来，免疫层析试纸条，由于其制备和操作方便，成本低，检测时间短，结果直观可靠等优点，得到了广泛的关注，成为成熟的快速检测工具。纳米材料改良免疫层析试纸条方面，仍然存在三个障碍：(1)单读出检出形式易受外界干扰，限制了检测灵敏度和准确度；(2)传统材料虽有优势，但只限于材料与抗体之间复杂交联的限制；(3)抗体配对是一个非常大的障碍，在实际检测中很难获得识别抗原的抗体和成对抗体。

发明内容

[0004] 针对现有技术中的缺陷和不足，为解决上述技术问题，单读出检出形式易受外界干扰，灵敏度和准确度受限制，本发明采用了一种捕获探针、大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法及其应用。

[0005] 为达到上述目的，本发明采取的技术方案包括：

[0006] 一种捕获探针，所述的捕获探针为Fe3O4/CuS，所述的Fe3O4/CuS包括首先制备Fe3O4微球，然后将Fe3O4微球加入CTAB溶液中，采用化学沉积法，加入CuSO4与Na2S溶液并搅拌洗涤制备Fe3O4/CuS。

[0007] 进一步地，所述的Fe3O4微球的加入量为0.1～0.3g，粒径为220～280nm。

[0008] 进一步地，所述的CuS的粒径为240～420nm。

[0009] 优选的，将Fe3O4微球加入CTAB溶液中，搅拌，然后悬浮在Na2S水溶液中，然后滴加CuSO4水溶液并连续搅拌，后洗涤干燥即得。

[0010] 一种大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法，包括用本发明所述的捕获探针将待检测样品中的大肠杆菌O157:H7捕获，进行孵育得到待检液，然后将待检液滴加至检测大肠杆菌O157:H7的试纸条上，然后采用近红外光照射试纸条，实现双通道检测。

[0011] 进一步地，所述的捕获探针的浓度为0.8～1.2mg/mL，所述的孵育时间为10～900s，所述的近红外光波长为808nm。

[0012] 进一步地，所述的试纸条包括衬板，衬板上贴有硝酸纤维素膜，硝酸纤维素膜的一端覆盖吸水垫，硝酸纤维素膜的另一端依次覆盖样品垫和结合垫，硝酸纤维素膜的非覆盖面上沿横向设置检测线；检测线包被有大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，结合垫及样品垫分别经封闭液封闭处理，所述的试纸条无质控线。

[0013] 具体地，所述的检测线包被有大肠杆菌O157:H7单克隆抗体的制备方法包括：大肠杆菌O157:H7单克隆抗体溶于包被液配制成1mg/mL的抗体包被溶液，将抗体包被溶液以1μL/cm的速度包被于距硝酸纤维素膜的检测线上；

[0014] 所述的包被液为：0.02g叠氮化钠、0.8g 氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL即得。

[0015] 具体地，所述的试纸条对大肠杆菌O157:H7的检测限为102CFU/mL。

[0016] 本发明所述的捕获探针用于检测牛肉、鸡肉、牛奶和蜂蜜中的大肠杆菌O157:H7。

[0017] 本发明所述的大肠杆菌O157:H7的双通道检测方法用于检测牛肉、鸡肉、牛奶和蜂蜜中的大肠杆菌O157:H7。

[0018] 与现有技术相比，其优点与积极效果在于：

[0019] (1)免标记。只需将细菌与捕获探针孵育，免去了复杂的标记过程。

[0020] (2)打破传统的夹心检测方法。该发明只用一种抗体划在硝酸纤维素膜上直接进行检测，打破了传统同时采用两种抗体的夹心检测方法，大大节省了成本，解决了配对抗体的困难，更简单，方便，新颖。

[0021] (3)双通道检测。该发明利用Fe3O4/CuS纳米材料具有光热特性，在肉眼检测的基础上，光热检出方式将灵敏度检出限提高了10倍。

[0022] (4)灵敏度高。本发明提供的试纸条对大肠杆菌O157:H7的最低检测限为102CFU/mL，其值低于很多其他文献报道的。

[0023] (5)特异性高。该发明用细菌鞭毛蛋白免疫制备出的单克隆抗体，只能高度特异性识别大肠杆菌O157:H7，对其他门类的细菌都无特异性。

[0024] (6)良好的实际应用。本发明可以检测牛肉、鸡肉、牛奶以及蜂蜜等实际样品中的大肠杆菌O157:H7，具有很好的应用前景，可以作为通用检测方法检测所有的病原菌。附图说明

[0025] 图1为本发明的检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条的试纸条组装示意图；

[0026] 图2为本发明的快速检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析的原理流程图；

[0027] 图3是本发明制备的免疫层析试纸条优化结果；

[0028] 图4是本发明制备的免疫层析试纸条检测灵敏度；

[0029] 图5是本发明制备的免疫层析试纸条检测特异性；

[0030] 图6是对本发明制备的免疫层析试纸条检测的实际应用；

[0031] 图7和图8是对本发明制备的新型探针验证；

[0032] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步的详细说明。

具体实施方式

[0033] 与单读数分析策略相比，双读出快速检测免疫色谱分析具有更高的准确性和更高的灵敏度，最近发现的光热效应已被用于增强免疫层析试纸条与光热材料的灵敏度，这些光热纳米材料的成果使得目前的研究提出光热免疫分析并构建了一些小规模组装的免疫生物传感器。

[0034] 本制备方法与传统的方法相比，提供了一种基于无标记和光热效应的双模式免疫层析试纸条检测方法，用于检测大肠杆菌O157:H7。本发明所述的“双通道检测方法”是指：一方面，Fe3O4/CuS可以有效捕获细菌并且不需要传统夹心模式中标记抗体的步骤，此新型无标记免疫层析试纸条检测策略仅使用一种抗体，细菌充当将材料与抗体连接到一起的中间物，节省了成本并实现高灵敏度检测。另一方面，基于材料的光热效应，用808nm近红外光激光笔，红外摄像头以及智能手机制作出一个简单的传感器设备，近红外光照射积聚在T线上的材料，记录每条试纸条T线照射前后的温差(ΔT)，进一步提高此生物传感器的准确性和灵敏度。样品中的大肠杆菌O157:H7首先被Fe3O4/CuS捕获，之后已经吸附细菌的材料将被固定在其上的单克隆抗体捕获，T线上，就会出现可见的明显的棕色。此外，由于在T线上具有光热性质的纳米材料的积聚，材料在激光照射下温度就会增高，因此，Fe3O4/CuS的棕色和光热信号在此免疫层析试纸条中作为定量读数，使用细菌与纳米材料直接结合作为强力探针检测多种食源性病原体提供了新途径。本发明的“Fe3O4/CuS”是指采用本发明的制备方法制备而成，菱形的簇状材料CuS与球状的磁性纳米材料Fe3O4复合而成。

[0035] 本发明的工作原理为：基于Fe3O4/CuS纳米材料可以直接吸附细菌的性能，在检测时，将Fe3O4/CuS直接添加到大肠杆菌O157:H7的细菌悬浮液中，其立即吸附在细菌表面上。之后，将新型探针复合物添加在样品垫上，通过毛细管力的牵引下其吸收垫，由于单克隆抗体和大肠杆菌O157:H7抗原之间可以特异性结合，T线上已经固定的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体将复合物捕获。此时，细菌表面富集了大量纳米材料探针，这些探针在T线上沉积起到肉眼检测的作用。另外，光热免疫传感器对大肠杆菌O157:H7的检测过程中，使用808nm的近红外光照射T线，并且通过光热转换器测定温度的变化，随着复合物浓度的增加，更多与细菌结合的纳米材料积聚在T线上，温度变化越明显，从而实现细菌的光热检测。

[0036] 通过该构建，大肠杆菌O157:H7能够被T线上的抗体有效捕获，其打破了传统同时采用测试抗体和捕获抗体的夹心试纸条的形式，只使用一种抗体，大大降低了成本并实现高度灵敏的检测。此外，光热效应试纸条的开发为解决了现如今灵敏度检出限低的困扰，此试纸条检测方法具有很高的灵敏度和很强的特异性，结构简单，成本效益高，快速的分析时间和便携性，具有极大的应用潜力来满足即时诊断测定的要求。该方法已成功应用于牛肉、鸡肉、牛奶以及蜂蜜中沙门氏菌的检测，验证了其实用性和适用性。因此只需一种抗体，该方法就可以作为通用检测平台去检测所有病原菌。

[0037] 本发明所用试剂均为市售所得，仪器均为常规仪器。化学沉积法是利用一种合适的还原剂使镀液中的金属离子还原并沉积在基体表面上的化学还原过程。

[0038] 所述的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体可以是现有的方法制备得到或者市场上能买到的单克隆抗体，最好是按照Zhang Daohong等人在刊物《Analytical Chimica Acta》第635卷第63-69页题目为“Production of ultrasensitive generic monoclonal antibodies against major aflatoxins using a modified two-step screening procedure”一文中记载的方法制备得到的：将大肠杆菌O157:H7免疫小鼠以诱导抗大肠杆菌的抗血清产生，然后取小鼠的脾细胞与SP2/0骨髓瘤细胞进行半固体细胞融合，再通过间接ELISA和夹心ELISA筛选能够产生目的抗体的杂交瘤细胞，得到5株高灵敏度特异性的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，且其中两株抗体能配对形成夹心。再将效价最好杂交瘤细胞注射入小鼠腹腔，大量产生抗体，采用辛酸硫酸铵法纯化抗体。

[0039] 实施例1：

[0040] (1)利用水热合成方法，将FeCl3·6H2O(1.35g)和柠檬酸三钠(0.45g)在乙二醇(40mL)中混合并持续搅拌60分钟，将NaAc(2.4g)加入混合物中，并搅拌0.5小时，然后将混合物密封在特氟隆衬里的不锈钢高压釜中并在200℃下加热10小时，冷却至室温后，产物用水和乙醇洗涤三次，在60℃的干燥箱中干燥，得到Fe3O4微球。

[0041] (2)采用化学沉积法，将步骤一得到的Fe3O4(0.2g)微球加入CTAB溶液(0.5g/L 25mL十六烷基三甲基溴化铵)中，搅拌0.5小时，将溶液洗涤三次，在室温下搅拌3小时，悬浮在Na2S水溶液(0.04M，25mL)中，然后滴加CuSO4水溶液(0.04M，25mL)并连续搅拌3小时，混合溶液变暗，用水和乙醇洗涤数次，然后在60℃下干燥。

[0042] 将制备好的Fe3O4/CuS配制成1mg/mL的水溶液，与大肠杆菌O157:H7溶液(100μL)混合孵育四分钟，即得该待检液，可用于试纸条检测。

[0043] 下述实施例3-5使用的待检液为实施例1制备得。

[0044] 实施例2：

[0045] 大肠杆菌O157:H7通用单克隆抗体的制备方法，包括以下步骤：

[0046] 步骤一：动物免疫

[0047] 购买6周龄BALB/c小鼠，购买大肠杆菌O157:H7，提取鞭毛蛋白进行免疫。第一次免疫用0.8mg/mL的大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白溶液与等量福氏完全佐剂混合乳化，小鼠腹腔注射乳化后的抗原；于4周后进行第二次免疫，采用0.8mg/mL的大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白与等量福氏不完全佐剂混合乳化，小鼠腹腔注射乳化后的抗原。于4周后进行第三次免疫，免疫方式与第二次相同；再于三周后进行第四次免疫，免疫方式同样与第二次相同。4次免疫剂量相同，均为每鼠100μg大肠杆菌O157:H7；这4次免疫后一周，尾静脉采血，分离血清，采用间接ELISA法监测小鼠血清效价；选择效价相对较高的血清对应的小鼠再进行最后一次加强免疫，免疫剂量为之前的2倍，免疫方式为腹腔注射。

[0048] 所述的0.8mg/mL的大肠杆菌O157:H7鞭毛蛋白溶液为将提取的鞭毛蛋白0.8mg溶于0.01mol/L磷酸缓冲盐溶液，磷酸缓冲盐溶液为0.02g叠氮化钠、0.8g氯化钠、0.29g十二水磷酸氢二钠、0.02g氯化钾和磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL即得。

[0049] 步骤二：细胞融合

[0050] 对经过加强免疫后的小鼠，于加强免疫3天后，采用50％聚乙二醇(分子量为1450g/mol)作融合剂，按常规方法进行细胞融合。具体方法：

[0051] (1)取1～2×107个SP2/0骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合，800rpm离心7min，洗细胞两次；

[0052] (2)于超净工作台内取出灭菌的吸水纸，将装有骨髓瘤细胞与免疫脾细胞混合细胞的50mL离心管上清倒尽后，倒扣在吸水纸上去除明显水滴；

[0053] (3)从CO2培养箱中取出温育至37℃的50％PEG，用1mL的吸管吸取0.8mL，手持装有混合细胞的50mL离心管，置于37℃水浴中，将PEG缓缓加到混合细胞上，边加边轻轻搅拌，持续90s加完，静置1min，挪走水浴锅，取出温育至37℃的50mL RPMI-1640基础培养液，用吸管吸取10mL缓缓加到融合细胞上，边加边轻轻搅拌，使细胞团块分散，先加1mL，再加2mL，再加3mL，最后加完剩下的4mL，加完第一个10mL后，接着沿管壁加完剩下的40mL，加完后，拧紧盖，轻轻颠倒几次，使细胞混匀；

[0054] (4)10000rpm离心7min，弃上清，用重悬有饲养细胞的20mL HAT完全培养液将融合细胞重悬；

[0055] (5)将重悬起来的细胞加入到80mL已温育至37℃的半固体培养基中，轻轻摇晃使细胞混合均匀，之后用20mL注射器将悬有融合细胞的半固体培养基吸起，均匀分配到8～9个六孔细胞培养板中，1.5～2mL/孔，置37℃CO2培养箱培养；

[0056] (6)融合后2～3周左右进行观察，可以看到半固体培养基上出现白色细胞集落，用无菌枪头逐个吸取单集落并转移至96孔培养板中，每孔一个克隆。用HT液体培养基继续培养。当克隆长满孔底1/2～2/3时，培养液变黄，即可进行杂交瘤细胞的筛选。

[0057] 步骤三：细胞株的筛选

[0058] 先采用间接ELISA法筛选出抗大肠杆菌O157:H7的阳性孔；再采用夹心ELISA法对筛选出的阳性孔进行配对检测，用大肠杆菌O157:H7作为抗原，选择吸光值和灵敏度均较高的孔。获得能配对的单克隆细胞株。

[0059] 步骤四：单克隆抗体的纯化

[0060] 在筛选到的细胞株中2B4细胞株产生的抗体对大肠杆菌O157:H7具有最好的灵敏度，所以选择2B4细胞株注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，采用辛酸-硫酸铵法纯化抗体，具体操作为：腹水用双层滤纸过滤，4℃，12000r/min离心15min，吸取上清。所得腹水上清与2倍体积的醋酸盐缓冲液混合，搅拌下缓慢加入正辛酸33μL/mL腹水，室温混合30min，4℃静置2h。4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀。上清用0.22μm滤膜过滤后，加入1/10滤液体积的0.1mol/L pH值7.4的磷酸盐缓冲液，用2mol/L氢氧化钠溶液调混合液pH值至7.4。上清4℃预冷，缓慢加入等体积的饱和硫酸铵溶液，4℃静置2h。4℃，12000r/min离心30min，弃上清。所得沉淀用1/10原腹水体积的0.02mol/L磷酸盐缓冲液重悬，装入透析袋，先用0.01mol/L磷酸盐缓冲液透析6-8h，再用纯水透析。透析完后取出液体4℃，12000r/min离心30min，弃沉淀。将充分透析好的蛋白溶液置-80℃冰箱冷冻，之后用冷冻干燥机冻干，收集冻干粉，即得纯化好的大肠杆菌O157:H7单克隆抗体，将抗体置-20℃冰箱中备用。

[0061] 所述的醋酸盐缓冲液为0.29g醋酸钠，0.141mL醋酸加水定容至100mL所得。

[0062] 所述的0.01mol/L的磷酸盐缓冲液为0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL所得。所述的用2mol/L氢氧化钠溶液为80g氢氧化钠加水定容至1000mL所得。

[0063] 下述实施例3-5使用的大肠杆菌O157:H7通用单克隆抗体为实施例2制备得到的。

[0064] 实施例3：本实施例给出了关于快速检测大肠杆菌O157:H7的试纸条的各条件优化实验。

[0065] (1)硝酸纤维素膜的制备

[0066] 检测线的包被：将大肠杆菌O157:H7单克隆抗体溶于包被液配制成1mg/mL的溶液；用划线方式将包被液以1μL/cm的速度横向包被于距硝酸纤维素膜上沿30mm的位置(即检测线上)，然后于37℃条件下干燥30分钟。所述的包被液为：0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，
0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL所得。

[0067] (2)样品垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长15mm宽3mm的规格，放入封闭液中浸湿，于37℃条件下干燥10-16小时，得样品垫，然后置干燥器中室温保存。所述的封闭液为2g牛血清白蛋白，0.02g叠氮化钠，0.8g氯化钠，0.29g十二水磷酸氢二钠，0.02g氯化钾，磷酸二氢钾0.02g加水定容至100mL所得。

[0068] (3)结合垫的制备：将玻璃纤维膜剪裁成长8mm宽3mm的规格，放入封闭液中浸湿，取出，于37℃条件下干燥10-16小时，置干燥器中室温保存。

[0069] (4)吸水垫的制备

[0070] 将吸水纸剪裁成长18mm宽3mm的规格，即得吸水垫。

[0071] (5)微生物培养为：大肠杆菌O157:H7活化后分别接种于LB培养基，静置37℃培养24小时；挑取单菌落接种于250mL LB肉汤培养基中，150r/min摇床37℃培养24小时；将菌液以4000r/min离心15min，收集菌体；分别用pH7.4浓度为0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤菌体3次，以10mL0.01 mol/L的磷酸盐缓冲溶液重悬；加0.5％福尔马林溶液，室温下放置24小时灭活；灭活结束后，分别用0.01mol/L的磷酸盐缓冲溶液洗涤3次后，用0.01mol/L的PBS调节成合适浓度，调整抗原浓度为108CFU/mL，于-20℃保存备用。

[0072] (6)试纸条的组装：首先将硝酸纤维素膜贴附于衬板上，然后样品垫压结合垫1-3mm，结合垫压硝酸纤维素膜1-3mm，吸水垫压硝酸纤维素膜1-3mm依次贴附于衬板上，即得快速检测大肠杆菌O157:H7的免疫层析试纸条。

[0073] (7)Fe3O4/CuS溶液浓度的优化

[0074] Fe3O4/CuS的浓度对细菌的着色效果有显着影响。在固定细菌浓度108CFU/mL的下，研究了不同Fe3O4/CuS的浓度分别为0.5，1.0，1.5和2.0mg/mL。

[0075] (8)Fe3O4/CuS溶液体积的优化

[0076] Fe3O4/CuS的体积对于该方法的检测能力起着重要作用，体积量影响着检测的灵敏度。在该步骤中，不同染料体积10至80μL分别与100μL 106CFU/mL细菌溶液混合孵育并测试。

[0077] (9)免疫反应时间

[0078] 影响检测线强度的另一个重要参数是免疫反应时间。将被染色的细菌加入样品垫后5～15分钟内每5分钟测量一次结果。

[0079] (10)Fe3O4/CuS溶液与细菌溶液孵育的时间的优化

[0080] 孵育的时间也可能影响检测线上的信号强度。将Fe3O4/CuS和细菌混合物孵育不同时间，时间范围为10，60，120，180，240，360，600，900s。

[0081] 结果见图3A，随着Fe3O4/CuS浓度的增加，检测线颜色强度呈上升趋势。当Fe3O4/CuS浓度高达1.0mg/mL时，T线的强度最高，是实验所需要的最佳浓度。

[0082] 见图3B，随着Fe3O4/CuS体积的增加，体积升高至40μL，达到最高。因此，Fe3O4/CuS最佳体积为40μL。

[0083] 见图3C，随着免疫时间的延长，检测线强度在10min时最大。因此，反应时间设定为10分钟，以节省测定时间，提高可视化效果的可读性和准确性。

[0084] 见图3D所示，随着孵育时间的增加检测线上的颜色强度在4min时T线强度最大。因此，在随后的实验中，Fe3O4/CuS和细菌孵育4分钟后再加入到样品垫上。

[0085] 实施例4：

[0086] 快速检测大肠杆菌O157:H7的试纸条的灵敏度测定

[0087] 试纸条制备及细菌培养过程步骤与实施例3中的(1)～(6)步骤相同。

[0088] 具体的检测过程：将Fe3O4/CuS溶于水配成浓度为1.0mg/mL的溶液，再将菌液用0.01M磷酸盐缓冲液稀释成80～108CFU/mL的浓度，各浓度分别取100μL溶液作为检测液，与
40μL Fe3O4/CuS混合孵育4分钟，再逐滴加入试纸条的样品垫，同时取100μL0.01M磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，操作与上述相同，逐滴加入另一试纸条的样品垫，10分钟后读取结果。

[0089] 肉眼检测结果：(1)阳性：当检测试纸条的检测线显示出棕色线条时，判为阳性，表明待测样品中的大肠杆菌O157:H7的浓度高于或等于103CFU/mL。(2)阴性：当检测试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果，表明待测样品中的大肠杆菌O157:H7低于103CFU/mL。

[0090] 见图4A，随着大肠杆菌O157:H7浓度的降低，试纸条T线的棕色越来越浅，肉眼可见3 3
的浓度为10CFU/mL，因此，本发明肉眼可以检测到大肠杆菌O157:H7最低浓度为10CFU/mL。

[0091] 见图4B，随着大肠杆菌O157:H7浓度的降低，检测到的光热温度越来越低，光热试纸条所检测到的浓度为102CFU/mL，相比于肉眼检测灵敏度提升了10倍。

[0092] 实施例5：快速检测肠炎沙门氏菌的试纸条的特异性测定

[0093] 试纸条制备及细菌培养过程步骤与实施例2中的(1)～(6)相同。

[0094] 具体的检测过程：将Fe3O4/CuS溶于水配成浓度为1.0mg/mL的溶液，分别将大肠杆菌O157:H7，鼠伤寒沙门氏菌，哈达尔沙门氏菌，伦敦沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲杆菌，单增李斯特氏菌和肠炎沙门氏菌的菌液用0.01M磷酸盐缓冲液稀释成108CFU/mL的浓度，各浓度分别取100μL溶液作为检测液，与40μL Fe3O4/CuS混合孵育4分钟，再逐滴加入试纸条的样品垫，同时取100μL0.01M磷酸盐缓冲液作为阴性对照液，操作与上述相同，逐滴加入另一试纸条的样品垫，10分钟后读取结果。

[0095] 肉眼检测结果：(1)阳性：当检测试纸条的检测线显示出棕色线条时，判为阳性。(2)阴性：当检测试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果。

[0096] 见图5，数字1-9分别表示108CFU/mL的不同的菌种，依次为大肠杆菌O157:H7，鼠伤寒沙门氏菌，哈达尔沙门氏菌，伦敦沙门氏菌，金黄色葡萄球菌，空肠弯曲杆菌，单增李斯特氏菌和肠炎沙门氏菌。除了检测大肠杆菌O157:H7的试纸条T线有肉眼可见的明亮的棕色外，检测其他细菌的试纸条T线都没有颜色，说明该发明能高度特异性识别大肠杆菌O157:H7，有特别高的特异性。

[0097] 实施例6：快速检测大肠杆菌O157:H7的试纸条的应用

[0098] 试纸条制备及细菌培养过程步骤与实施例2中的(1)～(6)相同。

[0099] 具体的检测过程：将Fe3O4/CuS溶于水配成浓度为1.0mg/mL的溶液，将已知浓度的8
菌液加入到饮用水中形成80–10CFU/mL的浓度，各浓度分别取100μL溶液作为检测液，与40μL Fe3O4/CuS混合孵育4分钟，再逐滴加入试纸条的样品垫，同时取100μL饮用水作为阴性对照液，操作与上述相同，逐滴加入另一试纸条的样品垫，10分钟后读取结果，再利用808nm近红外光照射T线得到温度差值。

[0100] 肉眼检测结果：(1)阳性：当检测试纸条的检测线显示出棕色线条时，判为阳性。(2)阴性：当检测试纸条的检测线不显示颜色时，判为阴性结果。

[0101] 见图6，随着菌浓度降低，试纸条上棕色越来越浅，实际样品牛肉，鸡肉，牛奶和蜂蜜肉眼可见的检出限浓度可分别达到104，103，104，103CFU/mL，光热检出限浓度为103，102，103，102CFU/mL，反映了其良好的实际应用价值。

[0102] 实施例7、Fe3O4/CuS材料表征

[0103] 为了证明本发明使用的Fe3O4/CuS很好的合成，本发明人还做了以下实验：

[0104] (1)扫描电镜：图7A为Fe3O4扫面电镜图，为球状，粒径为220～280nm；图7B为Fe3O4/CuS复合纳米材料的电镜图，菱形的簇状材料CuS(240～420nm)与球状的磁性纳米材料Fe3O4构成了此复合材料；图7C为Fe3O4/CuS捕获菌的图，从图中可以看出，菌表面附着了很多复合纳米材料，且菌破碎，不完整，说明Fe3O4/CuS复合纳米材料既可以捕获菌又可以杀死菌，此外，图7D插图a、b表明，a图为在没有任何外部磁场的情况下，OD600＝1的细菌溶液，b图为OD600＝1的细菌溶液与Fe3O4/CuS的混合液，旁边为磁铁，在没有任何外部磁场的情况下，将OD600＝1.0细菌溶液与Fe3O4/CuS混合后，在施加磁铁后30分钟内，混合物几乎透明。

[0105] (2)抑菌图：7E图为Fe3O4/CuS与三种细菌的抑菌试验，将肠炎沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7和李斯特菌用于试验检测中，观察到实验组(a、b、c)的细菌数量明显少于对照组(d、e、f)，表明此捕获探针都具有较强的抗菌能力。

[0106] (3)紫外表征：从图7F可以看出，与原来的Fe3O4相比，纳米复合Fe3O4/CuS(虚线)的特征峰呈深红移570nm。

[0107] (4)红外表征：从图8A可知，Fe3O4/CuS纳米复合材料不仅具有CuS的特征Cu-S峰(1110cm-1)以及Fe3O4的Fe-O峰(594cm-1)，1637cm-1和1401cm-1处的谱带可归因于的COOH的拉伸振动。

[0108] (5)X射线光电子能谱：从图8B可知，在934.16、530.41、168.79、284.94和711.34eV下，曲线上分别有五个不同的Cu 2p、O 1s、S 2p、C 1s和Fe 2p峰，表明材料合成成功。

[0109] (6)X射线衍射：从图8C可以看出，Fe3O4/CuS纳米复合材料既有CuS的特征峰29.08°(102),31.54°(103),34.57°(006),49.56°(110)和57.98°(116)，又具有Fe3O4的特征峰32.40°(220),36.57°(331)，43.20°(400)，54.87°(422),56.30°(511)和62.17°(440)，证明复合材料合成成功。

[0110] (7)光热表征：从图8D得到，随着Fe3O4/CuS辐照时间和浓度的增加，材料的温度迅速上升，约3分钟后保持不变，然而，1毫升纯水样品在辐照后没有显示出任何明显的温度变化，结果表明，此纳米材料光热效应良好，能够有效地将光能转化为热能。

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