质粒通常用于重组蛋白的制备和用于基因治疗目的的DNA的制备。 质粒在宿主细胞中的稳定保持对于有效制备这些产物很重要。但是，宿 主细胞内携带的外源染色体DNA本身是不稳定的，因为与无质粒的细胞 相比，含有该质粒的细胞增加了代谢负担。为了保持质粒稳定性和减小 代谢负担，质粒经工程化以包含显性选择性标记物。
在培养细胞中保持质粒的常规方法为在质粒上包括抗生素抗性基 因，并在合适的抗生素存在下保持细胞。对于计划用于治疗用途的细胞 或质粒来说，这具有缺点，即包含抗生素抗性基因的质粒的使用可能会 促进抗生素抗性的传播。
一些质粒保持的方法曾试图利用由质粒携带基因控制的自然产生的 分离后杀灭机制(post segregational killing mechanism)。例如，hok/sok、srnB 和pnd系统涉及由稳定mRNA编码的杀伤蛋白，该杀伤蛋白由小的不稳 定反义RNA调节，其结合到杀伤RNA并使其失活。该杀伤RNA在反义 RNA降解后保留在无质粒的分离物中并翻译成致命蛋白。曾在减毒的活 载体疫苗菌株伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi))CDV 908htr-A中研究过利 用hok/sok系统的质粒保持(Galen et al，1999，Infect.Immunol，67： 6424-6433)。但是，这种分离后杀死机制不能在转化后进行质粒筛选，因 此依然依赖于质粒上的抗生素抗性基因的存在。
已开发一些无抗生素筛选的用于保持和筛选质粒的备选方法，其中 该质粒编码弥补宿主细胞营养缺陷的基因。例如，宿主细胞可以是突变 细胞，其不能合成必需氨基酸代谢物，只有在包含编码丢失的用于合成 此氨基酸的元件的质粒存在时才能在缺少此氨基酸的培养基中存活 (Wang M-D et al，1987，J.Bacteriol.，169：5610-5614)。但是，由于该氨基酸 必需去除，这种方法限制了生长培养基的组成。可用于复杂培养基的备 选方法采用具有热敏感tRNA合成酶基因的突变宿主细胞，仅在存在包 含野生型tRNA合成酶基因的质粒时，该宿主细胞才能在非许可温度下 存活(Skogman et al，1984，Gene 31：117-122)。另一筛选方法利用质粒携带 的tRNA基因弥补突变宿主细胞中必需染色体基因的无义突变(Zengel et al，1981，J.Bacteriol，145：459-465)。或者，增加细胞代谢负担的基因，如 pil操纵子可置于宿主染色体上，以便宿主细胞仅在编码相应阻遏蛋白的 质粒存在时才能存活(Ogden et al，1992，Biotech.Bioeng.，40：1027-1038)。
EP 0851932描述了通过操纵基因阻遏物滴定(titration)在体外培养细 胞中保持质粒的方法。该方法涉及对宿主细胞的工程化，以便它包含编 码阻遏物的第一染色体基因和细胞生长必需的第二染色体基因，该第二 染色体基因在其控制区具有用于该阻遏物的操纵基因序列。质粒不存在 时，第二染色体基因的表达由于阻遏物结合到操纵基因而被抑制，细胞 死亡。将需要保持在该宿主细胞中的质粒工程化以包含操纵基因序列， 以便在该质粒存在时，将阻遏物从生长必需基因滴定移除(titrated away)， 该基因被表达，细胞存活。这种机制也描述于Williams et al(Nucleic Acids Research，1999，26(9)：2120-2124)和Cranenburgh et al(Nucleic Acid Research，2001，29(5)：e26-e27)。
尽管一些不依赖于抗生素筛选的质粒保持和筛选机制已公知，考虑 到质粒在生产用于治疗应用的DNA和重组蛋白方面的日益增加的重要 性，人们仍然需要开发其它的方法。此外，到目前为止开发的质粒保持 和筛选系统需要使用为应用于这些系统而经特别修饰的质粒。人们依然 需要这样的质粒保持和筛选系统，即其不涉及抗生素抗性且采用本领域 普通的质粒而无需特别修饰。

本发明的第一方面，提供转化的宿主细胞，其包含
i)抑制细胞生长的染色体基因；以及
ii)编码反义序列的质粒，
其中由该质粒编码的所述反义序列抑制所述染色体基因的作用，由 此允许细胞生长。
优选地，由所述质粒编码的反义序列是由质粒的复制起点编码，但 它也可由该质粒的其它区域编码。
本发明使用的术语“反义序列”指基本上互补于其靶序列并能够特异 地与该靶序列杂交的核酸序列。优选地，由质粒编码的反义序列在严紧 条件下杂交到其靶序列。高严紧杂交条件定义为在包含50％甲酰胺、 5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml变性、剪切的鲑鱼精DNA 的溶液中42℃孵育过夜，随后在0.1X SSC中在约65℃清洗滤器。
本发明使用的“细胞生长”指培养基中的细胞数量随时间增加和指细 胞存活，其中活细胞的数量不随时间减少。“抑制细胞生长”的含义是指 染色体基因对细胞是致命的，以致培养基中活细胞的数量随时间减少， 或其阻止细胞生长，以致培养基中活细胞的数量不随时间增加。
根据本发明的该第一方面，转化宿主细胞的生长依赖于质粒的存在， 导致对保持质粒的细胞的筛选。如果质粒从宿主细胞丢失，则染色体基 因的作用将不再被质粒编码的反义序列阻止，细胞生长将被抑制。在一 些实施方案中，只需单拷贝的质粒就可抑制染色体基因的表达，从而允 许细胞生长。在其它实施方案中，可能需要多拷贝的质粒存在以抑制染 色体基因的表达。
染色体基因可直接抑制细胞生长。例如，染色体基因的转录和翻译 可产生对细胞致命的如毒素(toxin)的蛋白质。或者，染色体基因可间接抑 制细胞生长。例如，染色体基因的转录和翻译可产生阻遏蛋白，其抑制 第二染色体基因编码的对细胞生长必需的蛋白质的转录和翻译。染色体 基因的转录还可产生反义序列，其结合到第二染色体基因或结合到从该 第二染色体基因转录的mRNA而抑制对细胞生长必需的该第二染色体基 因的转录和/或翻译。
在一些实施方案中，染色体基因可通过更复杂的级联反应抑制细胞 生长。例如，染色体基因可编码活化蛋白，该活化蛋白激活第二染色体 基因的表达，该第二染色体基因接着编码阻遏蛋白，该阻遏蛋白抑制编 码对细胞生长必需的蛋白的第三染色体基因的表达。或者，第一染色体 基因可编码第二染色体基因的反义抑制物，该第二染色体基因接着编码 阻遏蛋白，该阻遏蛋白阻遏编码抑制细胞生长的蛋白的第三染色体基因 的表达。这类级联可包括超过三个染色体基因。例如，它们可包括4、5、 6、7或更多的染色体基因。在所有的这些级联中，缺少对第一染色体基 因抑制的质粒导致第一染色体基因引发级联反应，该级联反应最终导致 细胞生长的抑制。本发明提供适合的抑制细胞生长的染色体基因例子。
本发明的转化宿主细胞优选用于保持治疗用途的质粒。由此，质粒 优选包括用于插入目的基因的克隆位点。优选地，质粒还包括目的基因。 所述目的基因优选可在哺乳动物细胞中、优选人细胞中表达。所述目的 基因可表达用于治疗用途的目的RNA或目的蛋白。本领域已知且本发明 提供可包括在质粒上的这类目的基因的例子。
通过结合到染色体基因自身并由此抑制该基因的转录，质粒编码的 反义序列可抑制染色体基因的作用。或者，质粒编码的反义序列可通过 结合到转录自染色体基因的mRNA而抑制该染色体基因的作用。取决于 染色体基因的性质，与转录自染色体基因的mRNA的结合可抑制染色体 基因的翻译，或阻止该染色体基因编码的反义序列结合到其靶点。
在本发明第一方面的优选实施方案中，调节序列可操作地连接到染 色体基因。“可操作地连接”指调节序列在读框内连接到染色体基因，以 便与染色体基因同时转录。优选地，调节序列可操作地连接染色体基因 的上游。但是，调节区可备选地可操作地连接该染色体基因的下游。当 调节序列可操作地连接染色体基因的上游，其优选插入在核糖体结合位 点。或者，调节序列可插入在核糖体结合位点的上游。染色体基因或可 操作地连接到调节基因的染色体基因可由组成型启动子或诱导型启动子 所控制。优选地，染色体基因或可操作地连接到调节基因的染色体基因 由组成型启动子控制。
质粒编码的反义序列可通过结合调节序列或通过结合从调节序列转 录的mRNA而抑制染色体基因的作用。在本发明的该实施方案中，由该 质粒编码的反义序列优选由质粒的复制起点编码。
所有的质粒复制起点都产生转录的RNA。在一些情况下，从质粒复 制起点转录的RNA直接用在复制的调节中(例如质粒R1、RK6、pT181、 pMV158和pIP501)。在另一些情况下，对转录的RNA进行翻译以提供 质粒复制所需的蛋白质(例如pSC101、pPS10、p15A、F、R100、R453、 P1、RK2、RA1、RSF10110、pColIV-K30、ColE2、ColE3、Rst1、pLS20 和pUB110)，参见Solar et al，1998，Microbiol and Molec.Biol.Rev.62： 434-363。
本发明包括转化的宿主细胞，其中所述质粒编码的反义序列为从这 些质粒中的任一种的复制起点转录的RNA。根据该实施方案，可操作地 连接到染色体基因的调节序列或从调节序列转录的mRNA反义于从所述 质粒复制起点转录的RNA。该质粒不存在时，转录和/或翻译可操作地连 接到染色体基因的调节序列，导致细胞生长的抑制。在质粒存在时，从 复制起点转录的RNA抑制染色体基因的作用，由此允许细胞生长。
根据本发明的这方面的优选实施方案，由所述质粒编码的反义序列 为RNAI，并且染色体基因上游的调节序列编码RNAII或其部分。可选 择地，由所述质粒编码的反义序列为RNAII，并且染色体基因上游的调 节序列编码RNAI或其部分。
RNAI和RNAII实际上为所有研究和商业用途的质粒的复制起点编 码的两个重叠的RNA转录本。RNAII引导质粒DNA合成的起始，使自 主质粒复制在E.coli中发生。RNAI为RNAII的反义抑制物，并阻止过量 的质粒复制以保证质粒拷贝数不超过宿主细胞可以支持的数目。现已发 现该反义机制可用于改进转化的宿主细胞中的质粒保持。
根据该实施方案，本发明提供了转化的宿主细胞，其包含，
i)可操作地连接到染色体基因的RNAII编码区或其部分，其中染色 体基因抑制细胞生长；以及
ii)包含RNAI编码区或其部分的质粒，
其中从所述RNAI编码区或其部分转录的RNAI结合到从所述RNAII 编码区或其部分转录的RNAII，抑制所述染色体基因的作用并由此允许 细胞生长。
可操作地连接到所述染色体基因的RNAII编码区或其部分转录成 RNAII-染色体基因mRNA。在编码RNAI的质粒不存在时，细胞生长被 抑制。可通过RNAII-染色体基因mRNA结合到细胞生长必需的第二染色 体基因或从这种第二染色体基因转录的mRNA而抑制细胞生长。可选择 地，可翻译RNAII-染色体基因，抑制细胞生长，其由染色体基因编码的 毒性蛋白质所引起或由该染色体基因编码的阻遏蛋白抑制细胞生长必需 的第二染色体基因所引起。当所述质粒存在时，从该质粒转录的RNAI 结合RNAII-染色体基因mRNA中的RNAII，阻止所述染色体基因对细胞 生长的抑制。
本发明还提供转化的宿主细胞，其包含，
i)可操作地连接到染色体基因的RNAI编码区或其部分，其中所述 染色体基因抑制细胞生长；以及
ii)包含RNAII编码区或其部分的质粒，
其中从所述RNAII编码区或其部分转录的RNAII结合到从所述 RNAI编码区或其部分转录的RNAI，抑制染色体基因的作用并由此允许 细胞生长。
可操作地连接到所述染色体基因的RNAI编码区或其部分转录成 RNAI-染色体基因mRNA。在编码RNAII的质粒不存在时，细胞生长被 抑制。可通过RNAI-染色体基因mRNA结合到细胞生长必需的第二染色 体基因或从这种第二染色体基因转录的mRNA而抑制细胞生长。可选择 地，可翻译所述的RNAI-染色体基因，抑制细胞生长，其由所述染色体 基因编码的毒性蛋白质所引起或由该染色体基因编码的阻遏蛋白抑制细 胞生长必需的第二染色体基因所引起。当所述质粒存在时，从给质粒转 录的RNAII结合RNAI-染色体基因mRNA中的RNAI，阻止染色体基因 对细胞生长的抑制。
所有的质粒都产生从复制起点转录的RNA，并且可购得的质粒的大 多数含有包含RNAI编码区和RNAII编码区的复制起点。不同于EP 0851932公开的系统，其中质粒保持依赖于将lac操纵基因系统克隆进所 用质粒中，而本发明能够在转化的宿主细胞中保持任何可购得的包含复 制起点的质粒，并筛选保持这些质粒的宿主细胞，无需将任何额外的克 隆进质粒。这具有以下优点，即质粒尺寸减小了，增加了DNA疫苗和基 因治疗应用中质粒的有效剂量。非必需细菌DNA的去除还减小了对CpG 二核苷酸免疫反应的风险。
此外，在无抗生素选择的情况下可实现质粒保持。所述质粒因此无 需抗生素抗性基因的存在。该质粒上无抗生素抗性基因具有多个优点， 特别是在质粒或质粒编码的产物用于治疗用途的情况下。首先，所述质 粒上无抗生素抗性基因消除了抗生素抗性基因转移到环境中包括病原体 在内的有机体的危险。它还防止了从具有用于质粒筛选的残余抗生素的 细胞中分离的质粒的污染，从而无需对质粒测试残余抗生素的存在并消 除了抗生素抗性基因在患者细胞中引起损害作用的风险。选择不依赖于 抗生素抗性的事实避免了由于培养过程中抗生素降解而导致的缺少质粒 选择压力的问题。
用在本发明中的质粒包括其中从复制起点转录的RNA直接用在复制 调节中的质粒，例如质粒R1、RK6、pT181、pMV158和pIP501，以及 其中从复制起点转录的RNA被翻译以提供该质粒复制所需的蛋白质的质 粒，例如pSC101、pPS10、p15A、F、R100、R453、P1、RK2、RA1、 RSF10110、pColIV-K30、ColE2、ColE3、Rst1、pLS20和pUB110。优选 地，用于本发明的质粒包括包含RNAI编码区和RNAII编码区的复制起 点。包括包含RNAI编码区和RNAII编码区的复制起点的质粒包括包含 诸如colE1ori和pMB1ori的ColE1型ori的质粒。
可操作地连接到抑制细胞生长的染色体基因的RNAII编码区、RNAI 编码区或其部分可由组成型启动子或诱导型启动子控制。优选地，可操 作地连接到抑制细胞生长的染色体基因的RNAII编码区、RNAI编码区 或其部分可由组成型启动子控制。合适的组成型启动子在本领域为已知 的并包括例如包含E.coli启动子的-35和-10序列的启动子，如trc启动子。
根据本发明的第二方面，提供了包括抑制细胞生长的染色体基因的 细胞，所述染色体基因可操作地连接到位于该染色体基因上游的调节序 列，其中所述调节序列包括反义于从质粒复制起点转录的RNA的序列， 或其中调节序列编码反义于从质粒复制起点转录的RNA的序列的RNA 序列。该调节序列的性质将取决于计划用来转化宿主细胞的质粒的特性。 以上提供了适合的质粒复制起点的例子。如何设计反义于从这些复制起 点转录的RNA的调节序列对技术人员来说是显而易见的。
优选地，所述调节序列包括RNAI编码区或其部分，或RNAII编码 区或其部分。可操作地连接到抑制细胞生长的染色体基因的RNAII编码 区、RNAI编码区或其部分可由组成型启动子或诱导型启动子控制。优选 地，可操作地连接到抑制细胞生长的染色体基因的RNAII编码区、RNAI 编码区或其部分由组成型启动子控制。适合的组成型启动子在本领域为 已知的并包括例如包含E.coli启动子的-35和-10序列的启动子，如trc 启动子。
根据本发明的该第二方面的宿主细胞可用包括RNAI编码区和 RNAII编码区的质粒转化，以产生根据本发明第一方面的宿主细胞。
本发明的宿主细胞和转化的宿主细胞可位于体外培养基中。本发明 提供适合的宿主细胞的例子。
本发明的第三方面，提供在体外宿主细胞中保持质粒的方法，包括 在足以允许如上所述的宿主细胞生长的条件下培养所述细胞的步骤。该 方法能够在无抗生素抗性情况下进行质粒保持和选择，使其特别适用于 产生用于治疗用途的质粒DNA或重组蛋白质。根据本发明的第四方面， 提供了产生质粒DNA的方法，包括进行本发明第三方面的方法并分离所 述质粒DNA。根据本发明的第五方面，提供了产生重组蛋白质的方法， 包括根据本发明第三方面的方法培养包含编码目的蛋白的质粒的转化宿 主细胞并从细胞中分离蛋白质。
本发明转化的宿主细胞和宿主细胞自身可具有治疗用途。根据本发 明的第六方面，提供了根据本发明第一方面的转化宿主细胞在治疗中的 用途。
本发明的第七方面，提供药物组合物，其包括根据本发明第一方面 的转化宿主细胞，连同药学上可接受的赋形剂、稀释剂或缓冲剂，诸如 本领域技术人员所熟知的那些。根据这方面的一个实施方案，药物组合 物为疫苗组合物。除了赋形剂、稀释剂或缓冲剂以外，该疫苗组合物可 包括一种或多种佐剂。
本发明的第八方面，提供根据本发明第一方面的转化宿主细胞在制 备药物中的用途。优选地，所述转化的宿主细胞可用作基因递送系统。 例如，出于基因治疗的目的，转化的宿主细胞可用来递送所述质粒上的 目的基因。所述转化的宿主细胞还可用来递送所述质粒上的目的基因， 该目的基因的产物具有治疗作用，如反义寡核苷酸，或递送编码具有治 疗作用的蛋白质的目的基因。
可选择地，所述转化的宿主细胞可用来递送免疫原。根据该实施方 案，所述质粒上的目的基因可编码一种或多种引起免疫应答的抗原。技 术人员会理解编码引起免疫应答的抗原并且可包括在本发明的转化细胞 内质粒中的目的基因。
本发明的第九方面，提供治疗方法，该方法包括对患者给予上述的 转化宿主细胞或包括它们的组合物。具体地，提供了向患者递送目的基 因的方法，包括对患者给予上述的转化宿主细胞或包括它们的组合物。 如上所述，所述转化的宿主细胞中质粒上的目的基因自身可用于基因治 疗目的，或目的基因的转录或转录和翻译产物可具有治疗特性。
本发明的第十方面，提供针对病原体引起的疾病来免疫患者的方法， 包括对患者进行上述转化的宿主细胞或包括它们的组合物的给药，其中 所述细胞内所述质粒上的目的基因编码诱导针对病原体的免疫应答的抗 原。该抗原可在对患者进行细胞给药之前在细胞中表达，或者包含质粒 的细胞可给药到患者，让抗原在给药后在患者内表达，这取决于细胞和 控制目的基因表达的启动子的性质。优选地，所述细胞为细菌细胞，如 上所述，并且所述目的基因功能性地连接到细菌启动子或真核启动子。
本发明的第十一方面，提供保持活体内的宿主细胞中的质粒的方法， 包括对受体有机体提供本发明第一方面的转化宿主细胞。优选地，受体 有机体为哺乳动物，优选人。根据本发明的这个方面，染色体基因优选 抑制体内细胞生长，以便在受体有机体体内只有保持该质粒的宿主细胞 能够存活。例如，染色体基因可编码第二染色体基因的阻遏蛋白，而该 第二染色体基因为细胞完整性所必需。
以下提供用在本发明中的合适的质粒、目的borne基因、宿主细胞的 例子和抑制细胞生长的染色体基因的例子，以及本发明转化的宿主细胞 的医学应用的信息。
染色体基因
包括在本发明宿主细胞和转化的宿主细胞中的染色体基因可为抑制 生长的任何基因。
●直接抑制生长的染色体基因
优选的直接抑制生长的染色体基因包括编码毒素的基因。编码可用 在本发明中的毒素的基因的例子包括来自B.subtilis的sacB基因、E.coli F 质粒中ccdB编码的CcdB、质粒RK2中parD基因编码的Kid蛋白质、 限制性内切核酸酶基因和抗生素基因。
●通过抑制生长必需基因间接抑制生长的染色体基因
优选的间接抑制生长的染色体基因包括编码蛋白阻遏物的染色体基 因，该蛋白阻遏物抑制细胞生长必需的第二染色体基因，以及编码反义 序列的染色体基因，该反义序列抑制细胞生长必需的第二染色体基因。 在本发明的一个实施方案中，所述第二染色体基因对细胞生长为条件型 必需的。
当所述染色体基因编码蛋白质阻遏物时，所述第二染色体基因优选 可操作地连接到由该阻遏物方便地抑制的操纵基因和启动子。
例如，如果所述染色体基因编码蛋白质阻遏物LacI，细胞生长必需 的所述第二染色体基因优选可操作地连接到lac操纵基因和启动子。E. coli lac阻遏物如“The Lactose Operon(乳糖操纵子)”，J.Beckwith，in Escherichia coli and Salmonella typhimurium，Eds.，J.L.Ingraham et al.， 1987 Amer.Soc.Micro.，pp.1444-1452，和Dickson et al.，1975，Science 187：27-35所述。采用如下方式调节lac操纵子。在非诱导条件下(如在葡 萄糖上生长)，LacI结合到lac操纵子的操纵基因，阻止b-半乳糖苷酶 (LacZ)、乳糖通透酶(LacY)和转乙酰酶(LacA)的转录。在诱导条件下(诸如 在乳糖上生长或添加不可代谢的类似物IPTG)，阻遏物不再结合到操纵基 因，并发生转录。该操纵子的表达可通过对b-半乳糖苷酶的分析容易地 检测。
本发明其它有用的阻遏物系统包括用在真核细胞中调节基因活性的 tet阻遏物系统(Gossen et al.，(1994)Current Opinions in Biotechnology， 5，516-520)。tet阻遏物系统已用在酵母、网柱菌属(dictiostelium)、植物细 胞和烟草植物中。本发明另一有用的阻遏物系统为ArgRNV阻遏物系统 (Burke et al.，(1994)Mol.Microbiol.13，609-618)。ArgR阻遏物通常只在精 氨酸存在时结合到其操纵基因。但是，突变的ArgRNV阻遏物在无精氨 酸存在时结合到操纵基因并在精氨酸存在时仍保持结合，具有反式显性 (transdominant)作用。具有两个对称Arg盒的理想化的ArgR结合位点(操 纵基因)可经工程化进入目的质粒，以将ArgRNV从其表达由ArgR结合 位点控制的必需基因中滴定出。
E.coli trp阻遏物也可用在本发明中(参见“The tryptophan Operon(色 氨酸操纵子)”，Yanof sky and Crawford，in Escherichia coli and Salmonella typhimurium，mEds.，J.L.Ingraham et al.，1987，Amer.Soc.Micro.，pp. 1453-1472)。trp阻遏物以50拷贝/细胞存在，需要在发酵培养基中存在作 为阻遏物结合的诱导物的色氨酸。
E.coli galR阻遏物可用在本发明中(参见“The Galactose Operon(半乳 糖操纵子)”，S.Adhya，inEscherichia coli and Salmonella typhimurium，Eds.， J.L.Ingraham et al.，1987，Amer.Soc.Micro.，pp.1503-1512)。
E.coli araC阻遏物也可用在本发明中(参见“The L-Arabinose Operon(阿拉伯糖操纵子)”，R.Schlief，In Escherichia coli and Salmonella typhimurium，Eds.，J.L.Ingraham et al.，1987，Amer.Soc.Micro.，pp. 1473-1481；Dunn et al.，1984，Proc.Nat.Aca.Sci.81；5017-5020)。araC阻遏 物在阿拉伯糖存在时增加结合亲和力。
最后，A阻遏物可用在本发明中(Introduction to Lambda Phages，in Current Protocols in Molecular Biology(分子生物学现代实验操作中的λ噬 菌体导论)，Eds.Ausubel，et al.，1994，Section III，Unit 1.9；Hochschild et al.，1986，Cell 47(5)；807-816)。
对细胞生长必需的第二染色体基因可以是编码与细胞代谢物的生物 合成有关的产物的基因、其产物涉及碳代谢的基因或编码大分子的生物 合成和调节的基因，例如对宿主细胞的DNA和/或RNA合成和复制功能 必需的基因。
某些编码涉及细胞组分供给，特别是细胞壁前体供给的酶的基因为 宿主细胞生长所必需，并可用在本发明中。例如，细菌细胞壁含有内消 旋二氨基庚二酸(DAP)，不能合成此组分将导致细胞裂解。因此DAP生 物合成途径中的基因，即dapA、dapB、dapC、dapD和dapE基因可用作 细胞生长必需的第二染色体基因，其由第一染色体基因所抑制。dapA和 dapB已被克隆和测序，并且dapB可作为单顺反子得到(Richaud et al.，J. Bacteriol.166：297-300，1986；Bouvier et al.，J.Biol.Chem. 259：14829-14834，1984)。
涉及其它细胞壁组分生物合成，如D-丙氨酸生物合成的基因，也可 用在本发明中(Walsh，1989，J.Biol.Chem.264(5)：2393-2396)。
涉及脂肪酸生物合成的基因也可用在本发明中。一个例子为fabA， 其编码3-羟基癸酰基-ACP脱水酶，负责在不饱和和饱和脂肪酸生物合成 的分歧点向生长的脂肪酸链引入双键(Cronan Jr.J.E.and Rock.C.O. (1987))。Biosynthesis of membrane lipids.In‘Escherichia coli and Salmonella typhimurium：cellular and molecular biology(膜脂的生物合成， 大肠杆菌和鼠伤寒沙门氏菌：细胞和分子生物学)’.Neidhardt.F.C.(ed.) American Society of Microbiology，Washington D.C.)。除非提供不饱和脂 肪酸，该酶以高浓度存在，且fabA突变体裂解。
可选择地，对细胞生长必需的所述第二染色体基因可以是涉及碳源 利用的基因。特别是，该第二染色体基因可包括乳糖操纵子基因，以便 在乳糖作为唯一碳源的情况下，只有保持质粒并且乳糖操纵子基因在其 中表达的细胞才能存活。其它的改变对本领域人员来说是显而易见的。
谷氨酸合成酶是诸如NSO骨髓瘤细胞系的真核细胞的必需基因 (Bebbington et al.，(1992)Bio/Technology 10，169-175)并且当宿主细胞为真 核细胞时被优选为所述第二染色体基因。
所述第二染色体基因还可以是宿主细胞的编码DNA和/或RNA合成 或复制蛋白的必需基因。McMacken等提供了在诸如E.coli和Salmonella 细菌中与这些必需功能有关的这类基因的例子(in Escherichia coli and Salmonella typhimurium，Cellular and Molecular Biology，Ed.Neidhardt et al.，Amer.Soc.Micro.，Wash.D.C.，1987，pp.564-612)，包括但不限于以下 基因：dnaA、dnaB、dnaC、ssb、dnaG、polC(dnaE)、dnaQ(mutD)dnaN、 dnaZX、gyrA、gyrB、polA、lig、dnaT、rpoA、rpoB、rpoC和rpoD。
尽管并非优选，所述第二染色体基因可为抗生素抗性基因，以便用 质粒转化菌株，能够在抗生素存在时生长。
对于用在医学用途中的转化宿主细胞来说，取决于给药途径，局部 环境的多种因子可施加选择性压力。当抵抗这种压力的能力连接至已鉴 定的基因，则这可用作可选择的标记物。举例而言，对于口服给药的细 胞，特别是细菌细胞而言，对胃内容物的低pH的抗性构成了显著的选择 性优势。在表现出与此有关的基因中有链球菌突变体(streptococcus mutants)的uvrA基因(Hanna et al，2001 J Bacteriol 183：5964)、E.coli的 gadA、B和C基因(Castanie-Cornet and Foster，2001，Microbiology 147： 709)、鼠伤寒沙门氏菌的rpoS、fur、atp和atbR基因(Baik et al，1996 Microbiology 142：3195)、幽门螺杆菌(Helicobacter pylori)的lepA、Frasel、 czcA、uvrA、atpF’和醛-酮还原酶基因(Bijlsma et al，2000，J Infect Dis 182：1566)以及编码单核细胞增多性利斯特菌(Listeria monocytogene)的 F0F1ATP酶的基因(Cotter et al 2000 Int J Food Microbiol 60：137)。
赋予细胞内存活性能(例如单核细胞增多性利斯特菌中的SvpA， Borezee et al，2001，Microbiology 147：2913)或对诸如溶酶体的特定细胞部 位的抗性的基因也可用在适合的宿主细胞中。
优选的间接抑制细胞生长的基因还包括编码反义序列的染色体基 因，该反义序列通过结合到第二染色体基因或结合到从该第二染色体基 因转录的mRNA而抑制细胞生长必需的所述第二染色体基因。
反义序列为基本互补于其靶序列并能特异地与该靶序列杂交的序 列。既然反义序列可通过直接结合到细胞生长必需的第二染色体基因或 结合到从该第二染色体基因转录的mRNA而起作用，则所述靶序列可以 为该第二染色体基因的编码序列或非编码序列或其部分。本领域普通技 术人员会知道制备能与靶序列特异地杂交的反义序列的方法(参见，例如 Cohen，J.S.，Trends in Pharm.Sci.，10，435(1989)，Okano，J.Neurochem. 56，560(1991)；O′Connor，J.Neurochem 56，560(1991)；Lee et al.，Nucleic Acids Res 6，3073(1979)；Cooney et al.，Science 241，456(1988)；Dervan et al.，Science 251，1360(1991))。
优选地，所述反义序列在严紧条件下杂交到所述靶序列。高严紧杂 交条件定义为在包含50％甲酰胺、5XSSC(150mM NaCl，15mM柠檬酸三 钠)、50mM磷酸钠(pH7.6)、5x Denhardts溶液、10％硫酸葡聚糖和20mg/ml 变性、剪切的鲑鱼精DNA的溶液中42℃孵育过夜，随后在0.1X SSC中 在约65℃清洗滤器。
如上所述，通过引发最终导致细胞生长必需基因的抑制或抑制细胞 生长基因的活化的涉及多个基因的级联反应，第一染色体基因可抑制细 胞生长。例如，所述第一染色体基因可编码阻遏蛋白，该阻遏蛋白抑制 编码活化物的第二染色体基因，该活化物则会活化细胞生长必需的第三 染色体基因。可选择地，所述第一染色体基因可编码抑制所述第二染色 体基因的阻遏蛋白，该第二染色体基因编码反义序列，该反义序列另外 抑制抑制细胞生长的第三染色体基因。这些仅仅是满度本发明要求的很 多基因级联中的例子，这对于本领域技术人员来说是显而易见的。
修饰的宿主细胞的产生
抑制细胞生长的所述染色体基因可以是自然存在于宿主细胞基因组 中的基因或可以是外源基因。
当所述质粒编码的反义序列通过结合到可操作地连接到所述染色体 基因的调节序列而抑制该染色体基因时，该染色体基因可以是可操作地 连接到外源调节基因的自然产生的基因。例如，可移除通常控制自然产 生的毒素基因的表达的序列，而将该毒素基因可操作地连接到由组成型 启动子控制的外源RNAI编码序列上。类似地，可移除通常控制自然产 生的阻遏蛋白表达的序列，而将该阻遏蛋白基因可操作地连接到由组成 型或诱导型启动子控制的外源RNAII编码序列上。因此，在本文的实施 例2中，自然产生的阻遏物基因lacI可操作地连接到RNAII编码区。
可选择地，所述调节序列和染色体基因可以都是外源的，当该调节 序列为RNAI或RNAII编码序列且该染色体基因编码抑制细胞生长必需 的第二染色体基因的反义序列时，就是这种情况。
如果存在细胞生长必需的第二染色体基因，它也可以是自然产生的 基因或外源基因。
抑制细胞生长的染色体基因可以多拷贝存在于基因组中，尤其是当 宿主细胞为真核宿主细胞时。
如何操作细胞以产生适用于本发明的宿主细胞对本领域人员来说是 显而易见的。
宿主细胞
本发明适用于所有的细胞类型，包括如哺乳动物的动物细胞以及昆 虫细胞、植物细胞、真菌(如酵母)、细菌和古细菌。
当所述宿主细胞为细菌细胞时，它可以是革兰氏阴性细菌细胞或革 兰氏阳性细菌细胞。当所述细胞为革兰氏阴性细菌细胞，它优选为E. coli(大肠杆菌)细胞或Salmonella(沙门氏菌)细胞。当所述细胞为革兰氏阳 性细菌细胞，它优选为Bacillus(杆菌)，Streptomyces(链球菌)， Lactobacillus(乳杆菌)或Lactococcus(乳球菌)细胞。
特别有用的是减毒的宿主细胞，它们经减毒以便可接受地无副作用 从而在受体有机体中自由地用于治疗用途。依赖于细胞的特殊性，它可 适用于兽医或人的治疗用途。
可得到的减毒细菌中有以下：
鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)包括菌株SL3261(aroA突 变体，Titball et al，1997，Infection and Immunity 65：1926，Titball et al，1995， Infection and Immunity 63：563)、VNP20009(purl和msbB突变体，Toso et al，2002，J Clin Oncol 20：142)；
伤寒沙门氏菌(Salmonella typhi)包括菌株CVD 908-htrA、x4073、 x4632、Ty800、CVD 909和CVD 915(Galen et al，1999，Infect.Immun. 67：6424-6433；Morona et al，1991，Gene 107：139-144；Tacket et al，1997， Infect.Immun.65：3381-3385；Garmory et al，2002，FEMS Microbiology Reviews 26：339-353)；
Salmonela gallinarum包括菌株9R(用于禽类接种，Feberwee et al， 2001，Avian Dis 45：1024)；
大肠杆菌(Escherichia coli)包括aroA、cnfl和OPM突变体 (Rippere-Lampe et al，2001，Infect Immunol 69：3954)；
弗氏志贺菌(Shigella flexneri)包括菌株S.flexneri 2a guaBA(Altboum et al，2001，Infect Immunol 69：3150)；
霍乱弧菌(Vibrio cholerae)包括菌株Peru2(Ryan et al，2000，Infect. Immun.68：221-226)；
单核细胞增多性利斯特菌(Listeria monocytogenes)包括PrfA和SvpA 突变体(Sheehan et al，1996，Mol Microbiol 20：785；Borezee et al，2001， Microbiology 747：2913)；
流产布鲁杆菌(Brucella abortus)包括菌株RB51(Vemulapalli et al， 2000，Infect Immunol 68：3290)；
牛结核分枝杆菌(Mycobacterium bovis)包括菌株Calmette-Guerin (BCG)；以及
结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)。
本发明有用的质粒携带基因
本发明转化的宿主细胞内质粒上携带的目的基因可以是任何基因。 该基因可以是递送到受体有机体时产生治疗作用的基因。例如，可能是 基因治疗目的所需的递送基因到受体有机体。
可选择地，可能需要递送基因到受体有机体，是因为该基因的转录 产物或转录和翻译产物具有治疗作用。例如，目的基因的转录产物可以 是反义寡核苷酸，或者该目的基因可编码具有治疗作用的抗原。具体地， 目的基因可编码在受体有机体中引起免疫应答的一种或多种抗原。在受 体有机体中诱导免疫应答的可包括在质粒中的目的基因的例子为caf操 纵子的cafl、caflA和caflM基因。
如果需要目的基因被转录或转录和翻译，优选将它功能性地结合到 启动子。优选地，该启动子为真核启动子或细菌启动子。在给药到受体 有机体之前或者仅在给药到受体有机体之后的宿主细胞中，所述功能性 地结合到目的基因的启动子的选择和宿主细胞的选择决定了目的基因是 转录还是转录和翻译。
在一些情况下，可能需要递送已经表达了目的基因的宿主细胞，这 时，可选择功能性地结合到目的基因的启动子以便它在宿主细胞中起作 用并促进宿主细胞中所述目的基因的转录和翻译。例如，当所述宿主细 胞为细菌细胞，则这种情况下功能性地结合到目的基因的启动子可为细 菌启动子。
在其它情况下，可能需要递送包括包含目的基因的质粒的宿主细胞 到受体有机体，但延迟目的基因的表达，直到将细胞递送到受体有机体。 例如，当所述宿主细胞为细菌细胞，则这种情况下所述功能性地结合到 目的基因的启动子可为真核启动子，其不会在宿主细胞中促进目的基因 的转录和翻译，而是在递送到受体有机体后进行。
本发明有用的疫苗接种方法
应理解，采用本发明的转化宿主细胞的疫苗接种可通过多种给药途 径中的任何一种进行。对于Mycobacterium，例如通常的途径为真皮内或 皮下注射。对于肠道细菌如Salmonella、Shigella或E.coli，优选口服给 药(尤其是抗酸突变体)或经直肠给药。在一些情况下，经粘膜、静脉内或 腹膜内给药可以为优选的。
其它体内应用的给药
应理解，可以采用多种方法用于非疫苗接种用途的给药。
除了用于疫苗接种的经肠和肠道外给药途径，非疫苗接种用途可能 需要其它的程序。其中有采用可植入的渗透性容器，在该容器中包含本 发明的细胞。
附图简述
图1：pUC18 ori图谱，显示RNAI和RNAII转录本的位置。RNAII引 导DNA合成的起始，RNAI为RNAII的反义抑制物。
图2：用在阻遏物oriSELECT中的宿主细胞基因组的例子。该宿主 细胞基因组包含连接到阻遏物基因顺反子的RNAII编码区，二者由组成 型RNAII启动子控制。该基因组还包括由可诱导启动子控制的必需基因。 在质粒不存在时，表达该阻遏蛋白并阻遏必需基因，抑制细胞生长。质 粒产生的RNAI结合到RANII-阻遏物mRNA融合的RNAII转录本阻断 所述阻遏蛋白的翻译，允许必需基因的表达和细胞生长。
图3：用在毒素基因oriSELECT中的宿主细胞基因组的例子。该基 因组包含置于RNAII下游的编码枯草杆菌(bacillus subtilis)果聚糖生成酶 的sacB基因(Link et al，1997 J.Bacteriol.179：6228-6237)。在蔗糖存在时， sacB合成毒性产物，该细胞在蔗糖存在时被杀灭，除非存在表达阻断毒 性基因mRNA翻译的RNAI的质粒。
图4：用在反义oriSELECT中的宿主细胞基因组的例子。宿主细胞 基因组包含细胞生长必需的基因和连接到反义于该细胞生长必需基因的 基因的RNAII编码区。质粒不存在时，该反义RNA将结合到必须基因 mRNA，由此阻止必需基因的翻译和细胞生长。当细胞用提供RNAI的质 粒转化，RNAI将结合到所述的RNAII-反义RNA，阻止其结合到必须基 因mRNA，允许细胞生长。
图5：通过PCR从pUC18扩增RNAII的5’端。显示了RNAI和RNAII 的转录本的位置，以及在RNAII 5’端插入编码阻遏物lacI的基因的上游 之前，用于扩增RNAII 5’端引物的位置，来将该基因用于插进用在阻遏 物oriSELECT中的宿主细胞基因组中。
图6：利用PCR从DH1 ORT菌株的基因组DNA扩增lacI的5’端。 显示了用于该扩增的引物5lacI和3lacI的位置。
图7：通过结合利用图5中的引物产生的RNAII扩增产物和利用图6 中的引物产生的lacI扩增产物而形成的产物。显示了用在扩增组合产物 中的引物位置。
图8：用在阻遏物oriSELECT中的宿主细胞基因组的另一例子。该 宿主细胞的基因组含有连接到阻遏物基因顺反子(lacI)的RNAII编码区， 二者由基于E.coli trc启动子中发现的-10和-35序列和间隔(spacing)的组 成型启动子控制。该基因组还包含由诱导型启动子控制的必需基因(未示 出)。无质粒时，该阻遏蛋白被表达并阻遏必需基因，抑制细胞生长。质 粒产生的RNAI结合到RANII-阻遏物mRNA融合的RANII转录本而阻 断所述阻遏蛋白的翻译，允许必需基因的表达和细胞生长。
现在将通过与采用质粒复制起点作为选择标记物的质粒保持系统有 关的实施例对本发明做更加详细地说明。应理解的是，可对实施例描述 的系统作出修改。
实施例
本发明仅采用复制起点(pMB1或ColEI ori)作为选择性标记物而使质 粒的选择和保持成为可能，该选择性标记本文记为oriSELECT。如图1 所示，这些ColEI相容oris编码两重叠的RNA转录本，RNAII引导质粒 DNA合成的起始，RNAI为RNAII的反义抑制物(Scott et al，1984， Microbiol.Rev.48：1-23；Chan et al，1985 J.Biol.Chem.260：8925-8935)。 实际上所有的研究或商用质粒都依赖于这些oris在E.coli中自主复制。
本发明可包括构建遗传上修饰的E.coli菌株，其中该基因组被修饰 以含有连接到操纵子(operon)中的抑制性元件的编码RNAII的区。质粒产 生的RNAI结合到RANII-mRNA融合阻止抑制性基因mRNA的翻译， 由此允许细胞存活和生长。这种质粒保持系统的三种建议的机制描述如 下：
实施例1：阻遏物oriSELECT
如图2所示，用在阻遏物oriSELECT中的宿主细胞基因组包含连接 到阻遏物基因顺反子的RNAII编码区，二者由组成型RNAII启动子控制。 连接到阻遏物顺反子的RNAII编码区也可由备选的组成型启动子控制， 例如基于Trc启动子中发现的E.coli-10和-35序列以及间隔的启动子， 如图8所示。该宿主细胞还可包含由可诱导型启动子控制的细胞生长必 需基因(图8中未示出)。
无质粒时，该阻遏蛋白被表达并通过结合到控制必需基因的操纵基 因/启动子而阻遏必需基因，抑制细胞生长。质粒产生的RNAI结合到 RANII-阻遏物mRNA融合的RANII转录本而阻断该阻遏物的翻译，允许 必需基因的表达，从而允许细胞生长。
为了构建用在Repressor oriSELECT的这种宿主细胞，从细菌菌株的 染色体删除必需基因，例如dapD(Richaud et al，1984，J.Biol.Chem.259： 14824-14828)或fabA(Cronan et al，1987，Biosynthesis of membrane lipids(膜脂的生物合成).In′Escherichia coli and Salmonella typhimurium： cellular and molecular biology′，Neidhardt，F.C.(ed.).American Society of Microbiology，Washington D.C.)，将它们置于诱导型启动子(例如Plac)的 控制下并插回到该染色体中。从该染色体中删除编码与诱导型启动子有 关的阻遏物的基因，这种情况下为lacI。这种阻遏物基因置于操纵子中 RNAII部分的编码区的下游，让组成型RNAII启动子(或任何其它组成型 启动子，例如基于Trc启动子中发现的E.coli-10和-35序列以及间隔的 启动子)驱动二者的转录。RNAII编码区的3’端被修饰以结合入阻遏物的 核糖体结合位点，以便它是重叠的并被RNAI所阻断。有时，可通过增 加RNAII编码区的3’端和lac核糖体结合位点的距离来增强LacI阻遏蛋 白的表达。将该构建体插入到染色体中。
现在该细胞将组成型地产生阻遏物。该阻遏蛋白会结合到控制必需 基因的染色体操纵基因，由此阻止细胞生长。当细胞用包含ColEI-相容 ori的质粒转化，RNAI将结合RNAII并阻止下游阻遏物基因的翻译，允 许细胞生长。
如果染色体必需基因具有其自身相关的阻遏物，该阻遏物(减弱启动 子(minus its promoter))可被工程化进入RNAII下游操纵子中，并将该操纵 子插进细菌染色体以置换野生型阻遏物。
必需基因可以为条件型必需外源基因(例如抗生素抗性基因)。
如果必需外源基因为诱导型并具有其自身相关的外源阻遏物，该阻 遏物基因可被工程化进入RNAII下游操纵子中并将该操纵子插进细菌染 色体。
实施例2：毒素基因oriSELECT
如图3所示，用在毒素基因oriSELECT的宿主细胞的基因组包含置 于RNAII下游的编码枯草杆菌果聚糖生成酶的sacB基因(Link et al，1997 J.Bacteriol.179：6228-6237)。在蔗糖存在时，sacB合成毒性产物，细胞 被杀灭，除非介入表达RNAI的质粒。另一由诱导型启动子调节的毒性 基因可融合到RNAII编码区替代sacB。
利用由RNAII编码区和编码sacB的下游基因组成的操纵子来工程化 构建体。RNAII编码区的3’端被修饰以并入sacB的核糖体结合位点。组 成型RNAII启动子驱动基因表达。当将其被插进细菌染色体，细胞可在 物无蔗糖时生长，但当添加蔗糖时，产生毒素，细胞死亡。当细胞用包 含ColEI-相容ori的质粒转化，RNAI将结合RNAII-毒素基因mRNA并 阻断翻译，允许细胞在蔗糖存在时生长。
温度敏感或化学诱导的启动子可用于驱动该RNAII-毒素基因融合的 表达。在允许温度或在诱导物存在时，细胞被杀灭，除非引进表达RNAI 的质粒。
实施例3：双反义oriSELECT
如图4所示，在双反义oriSELECT中，宿主细胞基因组包含细胞生 长必需的基因和连接到反义于细胞生长必需基因的基因的RNAII编码 区。
将必需基因(例如dapD或fabA)的反义版本置于编码RNAII区的操纵 子下游，让组成型RNAII启动子驱动二者的转录。RNAI编码区的3’端 被修饰以结合入必需基因反义转录本部分，以便它被RNAII部分交叠。 将该构建体插进细菌染色体。
现在该细胞将组成型地产生RNAII和反义RNA。该反义RNA将结 合到所述必需基因mRNA。由此阻止必需基因的翻译和细胞生长。
当细胞用包含ColEI-相容ori的质粒转化，RNAI将结合RNAII-反义 RNA并阻止其结合到必需基因mRNA，允许细胞生长。
实施例4：阻遏物oriSELECT菌株的产生
可通过将RNAII-lacI操纵子整合进(并由此置换)染色体lacI阻遏物 基因而将ORT菌株DH1lackan(Willians et al，1998)、DH1lacdapD和 DH1lacP2dapD(Cranenburgh et al，2001，Nucleic Acid Res.29：e26)转变成 oriSELECT菌株。基于pKO3整合系统的单质粒结构(Link et al，1997 J. Bacteriol.179：6228-6237)用于在所有ORT菌株中用RNAII-lacI置换野生 型lacI，描述如下。
1.通过PCR和克隆扩增围绕lacI的染色体lac操纵子部分；
2.由插入lacI阻遏物基因上游的RNAII编码区构成的工程化的操纵 子，置换其天然启动子。应定位该LacI核糖体结合位点，以便在mRNA 上，它被反义RNAII的结合所阻断。
3.将RNAII-lacI操纵子基因座克隆进整合质粒pKO3。
4.将RNAII-lacI操纵子基因座整合进DH1lackan、DH1lacdapD和 DH1lacP2dap D的野生型lac操纵子基因座以产生oriSELECT菌株。
5.利用具有ColEI/pMB1ori和无lacO序列(以避免ORT选择)的质粒 测试质粒在这些菌株中的选择性和保持。
以下更加详细地描述构建该oriSELECT菌株所需的克隆步骤：
剪接PCR产生RNAII-lacI融合
1.采用下列引物通过PCR从pUC18扩增RNAII5’端的部分(产物＝ 176bp)，如图5所示。
5RNAII：GAATGCATCAAAGGATCTTCTTGAGA(26nt)
3RNAII：ACATTCACCACCGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAA GCCA(42nt)
2.采用下列引物通过PCR从DH1 gDNA扩增lacI5’端部分(产物＝ 597bp)，如图6所示
5lacI：GATACCAAATACGGTGGTGAATGTGAAACCAGTAACGT TATA(42nt)
3lacI：ACAGAACTTAATGGGCCCGCTAACA(25nt)
3.在单一PCR中组合两PCR产物并采用5RNAII和3lacI引物扩增 以产生749bp RNAII-lacI基因融合PCR产物(5RNAII和3lacI引物之间的 区域)，如图7所示。
4.利用NsiI和ApaI剪切剪接的PCR产物以产生用于克隆进乳糖操 纵子替换lacI启动子和5’端的片段。
克隆乳糖操纵子部分并插入RNAII-lacI
1.利用以下引物从DH1 gDNA扩增lac操纵子。
5LO：CTCTTGCGCCGG GTCGACATACCCC(25nt)
3LO：TAA GTCGACCACGGGTTGCCGTTTT(25nt)
引物5LO掺入天然SalI位点(带下划线的)，而3LO引入一个单核苷 酸改变(黑体)。总PCR产物大小＝5803bp。
2.利用SalI剪切PCR产物并克隆进同样用SalI剪切的pUC18。
3.利用NsiI和ApaI剪切该质粒并克隆进步骤4的片段中，用 RNAII-lacI基因融合置换lacI的启动子和5’端。
4.用NsiI剪切插入物并连接进同样用NsiI剪切的pKO3recA。
5.整合进DH1lacdapD、DH1lacP2dapD和DH1lackan以产生 oriSELECT菌株。
6.利用具有pMB1复制起点的质粒测试质粒选择和保持。
当RNAII组成型启动子用于驱动RNAII-基因融合的表达时，如果需 要的话，其它任何组成型启动子可被替换。RNAII启动子用在这些实施 例中，因它已经存在。备选地优选组成型启动子为基于Trc启动子中发 现的E.coli-10和-35序列以及间隔的启动子。这种E.coli启动子比RNAII 启动子更陌生，因此可在希望产生增加量的lacI阻遏蛋白时采用，由此 保证在无质粒时阻止生长。
可通过增加RNAII编码区的3’端和lacI核糖体结合位点的距离来增 强lacI阻遏蛋白的表达。
还应理解的是插入基因盒的备选方法可用于代替上述的pKO3方法。 例如，λRed重组系统可用于以线性PCR产物来整合基因盒(Murphy，1998， J.Bacteriol.，180：2063-2071)。
这些实施例基于RNAII-基因融合表达盒，用RNAI起反义抑制物的 功能。这是因为在含有质粒的细胞中，存在的RNAI 5倍过量于 RNAII(Liang et al，1999，292：19-37)。由于可得到摩尔数过量的RNAI，由 此RNAI可作为更加有效的抑制物。但是，可能有这样的情况，即采用 RNAI构建基因融合更加有利，而不是RNAII。这时，来自质粒的RNAII 转录本将起反义抑制物的作用。
在oriSELECT菌株中，表达来自ColEI/pMB1ori的Rom蛋白的基因 的染色体整合可能是必需的，因为这将增强RNAI与RNAII的结合亲和 力(Chan et al，1984 J.Biol.Chem.260：8925-8935)。