本发明涉及白细胞介素18(IL-18)结合蛋白，特别涉及它们在急 性和慢性炎症疾病的预防和/或治疗中的用途。

最早在1989年白细胞介素-18(IL-18)被描述为γ-干扰素诱导因 子(IGIF)，并且是促炎症细胞因子，除了具有诱导γ-干扰素的能力 外，还具有多方面功能。这些生物学性能包括NF-κb的激活，Fas配 体表达，CC和CXC趋化因子的诱导，感受态人免疫缺陷病毒的增加的 产生。由于IL-18有诱导T细胞和巨噬细胞中γ-干扰素产生的功能， 它在Th1-型免疫应答中和参与先天和后天免疫性中起着重要作用。 IL-18就其结构和功能来说涉及IL-1家族。有关IL-18结构，功能和 生物学活性，参见，例如Dinarello，C.等(1998)J.Leukoc.Biol. 63：658-654；Dinarello，C.A.(1999)Methods 19：121-132；和 Dinarello，C.A.(1999)J.Allergy Clin.Immunol.103：11- 24；(McInnes，I.B.等(2000)Immunology Today 21：312-315； Nakanishi，K.等(2001)Ann.Rev.Immunol 19：423474。
细胞内IL-18-原在内毒素-刺激的细胞中经胱天蛋白酶1(Ghayur， T.等，(1997)Nature 386：619-623；Gu，Y.等，(1997)Science 275：206-209)，在Fas-L或细菌DNA刺激细胞中经胱天蛋白酶4，5 和6蛋白酶解加工成18kDa活性形式(Tsutsui，H.等， (1999)Immunity 11：359-67；Ghayur，T.，没有出版的 Observations)。IL-18-原还被其他蛋白酶解加工，例如嗜中性白细 胞蛋白酶3(Sugawara，S.等，(2001)J.Immunol.，167，6568- 6575)，胱天蛋白酶3(Akita，K.等，(1997)J.Biol.Chem. 272，26595-26603)，和丝氨酸蛋白酶弹性蛋白酶和组织蛋白酶 (Gracie J.A.，等，(2003)Journal of Leukocyte Biology 73，213-224)。人和鼠IL-18没有常规的前导序列，并且细胞成熟IL-18 释放的原理还不十分清楚。
IL-18的生物活性通过IL-18与由两个亚基构成的异二聚体IL- 18受体(IL-18R)结合而介导：α-亚基(IL-1R家族中的一员，也称作 IL-1R-相关蛋白-1或IL-1Rrp1)和β-亚基(也称作IL-18R辅助蛋白， IL-18AP或AcPL)。IL-18Rα亚基直接结合IL-18，但是不能信号传 导。β-亚基本身不结合IL-18，但是与α-亚基联合形成信号转导必 需的高亲和性受体(KD＝～0.3nM)(Sims，J.E.，(2002)Current Opin Immunol.14：117-122)。通过IL-18αβ复合体的IL-18信号传导 类似于IL-1R和Toll样受体(TLR)系统。IL-18R信号传导利用信号 传导分子，例如MyD88，IRAK，TRAF6，并且产生和IL-1产生的相似 的响应(例如，NIK，IkB激酶，NF-kB，JNK和p38 MAP激酶的激活)。 介导IL-18生物活性对IL-18Rα和信号传导分子的需要已经分别使用 IL-18Rα-亚基(Hoshino K.，等(1999)J.Immunol.162：5041- 5044；)，MyD88(AdachiO.，等(1998)Immunity 9：143-150)或IRAK (Kanakaraj P.，(1999)J.Exp.Med.189：1129-1138)敲除证实 了。
结合IL-18的抗体是本领域公知的。EP 0 974 600公开了能中和 IL-18的小鼠抗体。抗IL-18人抗体在PCT公开WO 0158956中公开， 这里引作参考。本发明提供了能以高亲合力结合IL-18，结合并中和 IL-18的结合蛋白质的新的家族，人抗体，及其片段。
发明概述
本发明提供IL-18结合蛋白，特别是人IL-18的抗体，以及制备 和使用这样的蛋白质的方法。本发明的一个方面是提供使用IL-18调 谐子调节基因表达的方法。
本发明的一个方面是提供包括能结合人IL-18的抗原结合结构域 的结合蛋白质。在一个实施方案中，抗原结合结构域包括至少一个包 括选自下面的氨基酸序列的CDR：
CDR-H1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：42)，其中：
X1是S，N，H，R，或Y；
X2是Y，G，R，S，或C；
X3是W，G，Y，D，S，V，或I；
X4是I，H，W，Y，M，L，或D；
X5是G，Y，S，N，或H；
X6是W，或者不存在；
和X7是T，S，G，或者不存在；
CDR-H2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO：43)，其中；
X1是F，Y，H，S，或V；
X2是I，或F；
X3是Y，S，或W；
X4是P，Y，或S；
X5是G，S，R，或D；
X6是D，或G；
X7是S，T，G，或R；
X8是E，T，I，或N；
X9是T，Y，N，I，K，或H；
X10是R，Y，或S；
X11是Y，N，或S；
X12是S，P，A，或V；
X13是P，S，或D；
X14是T，L，或S；
X15是F，K，或V；
X16是Q，S，或K；和
X17是G，或者不存在；
CDR-H3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16- X17-X18(SEQ ID NO：44)，其中；
X1是V，D，E，S，或C；
X2是G，R，D，S，K，L，Y，或A；
X3是S，G，Y，或R；
X4是G，S，Y，N，T，或D；
X5是W，S，A，G，Y，或T；
X6是Y，G，S，F，W，或N；
X7是P，S，F，Y，V，G，W，或V；
X8是Y，F，D，P，M，I，或N；
X9是T，W，D，L，Y，E，P，F，或G；
X10是F，D，Y，H，V，Y，或者不存在；
X11是D，Y，F，L，或者不存在；
X12是I，D，Y，或者不存在；
X13是Y，或者不存在；
X14是Y，或者不存在；
X15是G，或者不存在；
X16是M，或者不存在；
X17是D，或者不存在；和
X18是V，或者不存；
CDR-L1.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10-X11-X12-X13-X14-X15-X16-X17 (SEQ ID NO：45)，其中；
X1是R，或K；
X2是A，G，或S；
X3是S；
X4是E，R，Q，或H；
X5是S，I，T，或N；
X6是I，V，L，或F；
X7是S，G，L，N，或R；
X8和S，G，Y，R，N，H，或D；
X9是N，G，Y，R，或S；
X10是L，Y，S，或D；
X11是A，L，N，V，G，或D；
X12是A，N，E，K，G，或者不存在；
X13是K，T，N，或者不存在；
X14是N，Y，T，或者不存在；
X15是Y，L，或者不存在；
X16是L，C，Y，或者不存在；和
X17是A，D，或者不存在；
CDR-L2.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7(SEQ ID NO：46)，其中：
X1是T，G，S，W，或E；
X2是A，V，T，I，或L；
X3是S，或F；
X4是T，I，N，S，R，或Y；
X5是R，或L；
X6是A，Q，E，或F；和
X7是T，或S；
和
CDR-L3.X1-X2-X3-X4-X5-X6-X7-X8-X9-X10(SEQ ID NO：47)，其中：
X1是Q，或M；
X2是Q，H，或Y；
X3是Y，N，G，S，或R；
X4是N，H，Y，D，G，V，L，或I；
X5是N，G，I，Y，S，Q，F，或E；
X6是W，S，T，L，I，或F；
X7是P，L，T，D，或I；
X8是S，L，P，C，W，I，或F；
X9是I，T，S，或者不存在；和
X10是T，或者不存在。
优选地，抗原结合结构域包括至少一个包括选自由下面的残基构 成的组的氨基酸序列的CDR：SEQ ID NO.：6的残基31-35；SEQ ID NO.：6的残基50-66；SEQ ID NO.：6的残基99-110；SEQ ID NO.： 7的残基24-34；SEQ ID NO.：7的残基50-56；SEQ ID NO.：7的 残基89-98；SEQ ID NO.：8的残基31-37；SEQ ID NO.：8的残 基52-67；SEQ ID NO.：8的残基100-110；SEQ ID NO.：9的残 基24-35；SEQ ID NO.：9的残基21-27；SEQ ID NO.：9的残基 90-98；SEQ ID NO.：10的残基31-35；SEQ ID NO.：10的残基 50-65；SEQ ID NO.：10的残基98-107；SEQ ID NO.：11的残基 24-34；SEQ ID NO.：11的残基50-56；SEQ ED NO.：11的残基 89-97；SEQ ED NO.：12的残基31-37；SEQ ID NO.：12的残基 52-67；SEQ ID NO.：12的残基100-108；SEQ ID NO.：13的残 基24-35；SEQ ID NO.：13的残基51-57；SEQ ED NO.：13的残 基90-98；SEQ ID NO.：14的残基31-35；SEQ ID NO.：14的残 基50-66；SEQ ID NO.：14的残基99-111；SEQ ID NO.：15的残基 24-40；SEQ ID NO.：15的残基56-62；SEQ ID NO.：15的残基95- 103；SEQ ID NO.：16的残基31-37；SEQ ID NO.：16的残基52- 67；SEQ ID NO.：16的残基100-109；SEQ ID NO.：17的残基24-35； SEQ ID NO.：17的残基51-57；SEQ ID NO.：17的残基90-98；SEQ ID NO.：18的残基31-35；SEQ ID NO.：18的残基20-36；SEQ ID NO.：18的残基99-108；SEQ ID NO.：19的残基24-34；SEQ ID NO.：19的残基50-56；SEQ ID NO.：19的残基89-97；SEQ ID NO.：20的残基31-35；SEQ ID NO.：20的残基52-67；SEQ ID NO.： 20的残基100-108；SEQ ID NO.：21的残基24-35；SEQ ID NO.： 21的残基51-57；SEQ ID NO.：21的残基90-98；SEQ ID NO.：22 的残基31-35；SEQ ID NO.：22的残基50-66；SEQ ID NO.：22 的残基99-116；SEQ ID NO.：23的残基24-39；SEQ ID NO.：23 的残基55-61；SEQ ID NO.：23的残基94-102；SEQ ID NO.：24 的残基31-37；SEQ ID NO.：24的残基52-67；SEQ ID NO.：24 的残基100-109；SEQ ID NO.：25的残基24-35；SEQ ID NO.：25 的残基51-57；SEQ ID NO.：25的残基90-98；SEQ ID NO.：26 的残基31-37；SEQ ID NO.：26的残基52-67；SEQ ID NO.：26 的残基100-109；SEQ ID NO.：27的残基24-35；SEQ ID NO.：27 的残基51-57；SEQ ID NO.：27的残基90-98；SEQ ID NO.：28 的残基31-37；SEQ ID NO.：28的残基52-67；SEQ ID NO.：28 的残基100-108；SEQ ID NO.：29的残基24-35；SEQ ID NO.：29 的残基51-57；SEQ BD NO.：29的残基90-98；SEQ ID NO.：30 的残基31-37；SEQ ID NO.：30的残基52-67；SEQ ID NO.：30 的残基99-109；SEQ ID NO.：31的残基24-35；SEQ ID NO.：31 的残基51-57；SEQ ID NO.：31的残基90-98；SEQ ID NO.：32 的残基31-37；SEQ ID NO.：32的残基52-67；SEQ ID NO.：32 的残基100-109；SEQ ID NO.：33的残基24-35；SEQ ID NO.：33 的残基51-57；SEQ ID NO.：33的残基90-98；SEQ ID NO.：34 的残基31-37；SEQ ID NO.：34的残基52-67；SEQ ID NO.：34 的残基100-108；SEQ ID NO.：35的残基24-35；SEQ ID NO.：35 的残基51-57；SEQ ID NO.：35的残基90-98；SEQ ID NO.：36 的残基31-35；SEQ ID NO.：36的残基50-66；SEQ ID NO.：36 的残基99-116；SEQ ID NO.：37的残基24-39；SEQ ID NO.：37 的残基55-61；SEQ ID NO.：37的残基94-102；SEQ ID NO.：38 的残基31-35；SEQ ID NO.：38的残基50-66；SEQ ID NO.：38的 残基99-108；SEQ ID NO.：39的残基24-35；SEQ ID NO.：39的 残基51-57；SEQ ID NO.：39的残基90-98；SEQ ID NO.：40的残 基31-37；SEQ ID NO.：40的残基52-67；SEQ ID NO.：40的残 基97-109；SEQ ID NO.：41的残基24-40；SEQ ID NO.：41的残 基56-62；SEQ ID NO.：41的残基95-103。优选地，结合蛋白包括 至少3个CDRs。
在另一个优选实施方案中，结合蛋白包括一个VH结构域。优选地， VH结构域包括选自下面的氨基酸序列：SEQ ID NO：6；SEQ ID NO： 8；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：16； SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：38；和SEQ ID NO：40。在另 一个实施方案中，结合蛋白包括一个VL结构域。优选地，VL结构域包 括选自下面的氨基酸序列：SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO： 11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：27；SET M NO： 29；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：37； SEQ ID NO：39；和SEQ ID NO：41。
在一个优选的实施方案中，结合蛋白包括一个VH和一个VL结构 域。更优选地，结合蛋白包括包括选自下面的氨基酸序列的VH结构域： SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO：12；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：16；SEQ ID NO：18；SEQ ID NO：20；SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28；SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：38；和SEQ ID NO：40和包括选自下面的氨基酸序列的VL结构 域：SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13； SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO：29；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：37；SEQ ID NO： 39；和SEQ ID NO：41。最优选地，结合蛋白包括包括SEQ ID NO：7 的氨基酸序列的VL结构域和包括SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VH结 构域。
在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括选自人IgM恒定区；人 IgG1恒定区；人IgG2恒定区；人IgG3恒定区；人IgG4恒定区；人 IgE恒定区和人IgA恒定区的重链免疫球蛋白恒定区。优选地，重链 免疫球蛋白恒定区是人IgG1恒定区。优选地，重链恒定区中至少一个 氨基酸残基被置换，使得抗体的效应子功能被改变。更优选地，人IgG1 恒定区包括选自SEQ ID NO.：2，和SEQ ID NO.：3的氨基酸序列。
在另一个实施方案中，结合蛋白进一步包括选自人Igκ恒定区， 和人Igλ恒定区的轻链免疫球蛋白恒定区。优选地，人Igκ恒定区包 括氨基酸序列SEQ ID NO.：4，人Igλ恒定区包括氨基酸序列SEQ ID NO.：5。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO：2，和 SEQ ID NO：3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO： 4，和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO： 6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO：7的氨基酸序 列的Ig轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有SEQ ID NO：3的氨基 酸序列的Ig重链恒定区；具有SEQ ID NO：4的氨基酸序列的IG轻 链恒定区；具有SEQ ID NO：6的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具 有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合选自免疫球蛋白分子或者本领域公知 的其功能变体，所述变体保持结合蛋白的特征结合性质。具体免疫球蛋 白实施方案的例子包括但不限于scFv；单克隆抗体；人抗体；嵌合抗 体；人源化抗体；单结构域抗体；Fab片段；Fab′片段；F(ab′)2；Fv； 二硫键连接的Fv，和双特异性或双重特异性抗体。最优选地，结合蛋 白是人抗体。
本发明的另一方面提供了中和结合蛋白，其包括上文公开的结合 蛋白的任一种，其中中和结合蛋白能中和IL-18。优选地，中和结合蛋 白能结合中和人IL-18原；成熟-人IL-18或截短的-人IL-18中的任 何一种。在另一个实施方案中，中和结合蛋白减小了IL-18结合其受 体的能力。优选地，中和结合蛋白减小了人IL-18原；成熟-人IL- 18或截短的-人IL-18结合其受体的能力。
在另一个实施方案中，中和结合蛋白能抑制选自下面的IL-18生 物活性中的一种或几种：Th1调节；Th2调节(Nakanishi K.，等(2001) Cytokine and Growth Facto r Rev.12：53-72)；Nk调节；嗜中性 白细胞调节；单核细胞-巨噬细胞系调节；嗜中性白细胞调节；e嗜酸 性细胞调节；B-细胞调节；细胞因子调节；趋化因子调节；粘着分子 调节；和细胞募集调节。
在优选的实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的解离常数(KD)： 最大大约10-7M；最大大约10-8M；最大大约10-9M；最大大约10-10 M；最大大约10-11M；最大大约10-12M；最大大约10-13M。
在另一个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的生成速率： 至少大约102M-1s-1；至少大约103M-1s-1；至少大约104M-1s-1；至 少大约105M-1s-1；至少大约106M-1s-1。
在另一个实施方案中，中和结合蛋白具有选自下面的离解速率： 最大大约10-3s-1；最大大约10-4s-1；最大大约10-5s-1；最大大 约10-6s-1。
本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中任何一种的标 记结合蛋白，其中所述结合蛋白与可检测标记物结合。优选地，可检 测标记物选自放射性标记物，酶，荧光标记物，发光标记物，生物发光 标记物，磁性标记物和生物素。更优选地，放射性标记物是3H，14C，35S， 90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，或153Sm。
本发明的另一方面提供一种包括上面公开的结合蛋白中任何一种 的结合蛋白，其中所述结合蛋白与治疗性或细胞毒性物质结合。优选 地，所述治疗性或细胞毒性物质选自抗-代谢物；烷基化试剂；抗生素； 生长因子；细胞因子；抗-血管生成药物；抗-有丝分裂物质；蒽环霉 素A；毒素；编程性细胞死亡剂。
一个实施方案允许分离编码上述公开的结合蛋白中的任何一种的 核酸。另一个实施方案提供包括分离的上面公开的核酸的载体，其中 所述载体选自pcDNA；pTT(Durocher等，Nucleic Acids Research 2002，Vol 30，No.2)；pTT3(有另外多个克隆位点的pTT；pEFBOS (Mizushima，S.和Nagata，S.，(1990)Nucleicacids Research Vol 18，No.17)；pBV；pJV；和pBJ。
在另一个实施方案中，用载体转染宿主细胞。优选地，宿主细胞 是原核细胞。更优选地，宿主细胞是大肠杆菌。在相关实施方案中， 宿主细胞是真核细胞。优选地，所述真核细胞选自原生生物细胞，动 物细胞，植物细胞和真菌细胞。更优选地，宿主细胞是哺乳动物细胞， 包括但不限于，CHO和COS；或者真菌细胞，例如啤酒糖酵母；或昆虫 细胞，例如Sf9。
本发明的另一方面提供结合人IL-18的结合蛋白的制备方法，包括 在足以产生结合人IL-18的结合蛋白的条件下在培养基中培养上面公 开的宿主细胞中的任何一种。另一个实施方案提供根据上面公开的方 法制备的结合蛋白。
本发明的另一方面提供包括上面公开的结合蛋白中的任何一种的 结晶结合蛋白，其中所述结合蛋白以晶体存在。优选地，所述晶体是没 有载体的药学控制释放晶体。在一个实施方案中，作为晶体存在的结 合蛋白具有比结合蛋白可溶性配对物更大的体内半存留期。在另一个 实施方案中，结合蛋白在结晶之后保留其生物活性。
一个实施方案提供用于释放结合蛋白的成分，其中所述成分包括 含有上面公开的结晶结合蛋白和成分；和至少一种聚合物载体的组合 物。优选地，所述聚合物载体选自下面的一种或几种：聚(丙烯酸)，聚 (氰基丙烯酸酯)，聚(氨基酸)，聚(酸酐)，聚(缩肽)，聚(酯)，聚(乳 酸)，聚(乳酸-共-羟基乙酸)或PLGA，聚(b-羟基丁酸)，聚(γ-己内 酯)，聚(二氧六环酮)；聚(乙二醇)，聚((羟丙基)甲基丙烯酰胺，聚 [(有机)磷腈]，聚(原酯)，聚(乙烯醇)，聚(乙烯吡咯烷酮)，马来酸酐 -烷基乙烯基醚共聚物，多聚醇，白蛋白，藻酸盐，纤维素和纤维素衍 生物，胶原，纤维蛋白，明胶，透明质酸，低聚糖，glycaminoglycans， 硫酸多糖，它们的混合物和共聚物。优选地，所述成分选自白蛋白，蔗 糖，海藻糖，乳糖醇，明胶，羟丙基-β-环糊精，甲氧基聚乙二醇和聚 乙二醇。另一个实施方案提供对哺乳动物治疗的方法，包括对哺乳动 物施用有效量的上述组合物的步骤。
本发明的另一方面提供一种感兴趣的基因的基因表达的调节方 法，包括下面的步骤：提供IL-18多肽或IL-18调节剂；和多肽或调 节剂接触细胞，其中感兴趣的基因选自下面Genbank鉴定号确定的基 因：NM_000389，NM_002198，NM_002163，NM_006144，NM_006515， NM_007185，NM_002288，NM_003661，NM_021958，NM_001335，Hs. 382006，NM_020125，NM_007210，NM_021798，NM_013324，M11313， D88152，NM_001103，U37519，NM000697，J03600，NM_014578， S66793，U47054，L19871，M81181，NM～001188，U15460，NM014417， Z23115，NM_001713，U45878，U37546，U72649，U49187，J03507， U50360，XM_071866，NM_005623，Z32765，Z11697，XM071866， U51096，M83667，D87469，L07765，U66468，X14830，L29217， X15880，NM_001851，M27691，M37435，X13589，X16866， X59131，Nu004393，U73328，L19267，U53445，X68277，U48807， NM001950，U87269，M57730，X52541，J04076，X63741，L07077， M62831，M60830，U53786，NM_001988，NM_000141，M23668，U60062， NM_000141，U49973，U89995，U27326，A28102，M25667，L34357， U19523，L01406，U03486，X68285，Z18859，D49958，D43772， AC000099，M57731，X53800，M91036，D16583，X64877，X58431， M16937，NM014468，X92814，L19314，M26665，D10995，L41147， M24283，S81914，J03171，J00219，NM_000619，NM_000585，U31628， X04500，M27492，X01057，M26062，Y00081，Y00787，Z31695，X06256， X57206，U20734，NM014879，D31762，D42038，NM_005551，NM_014846， X06182，Nu005551，X07730，M13955，M57710，S83362，NM_002314， NM_005569，U49957，U89922，X14008，U59914，D14497，X59727， NM000429，U43944，X72755，NM021230，NM005951，X78710， X70991，M32011，S77763，M58603，S76638，M69043，U91616，D86425， L13740，U44848，U79251，M27288，AF000234，D50640，L20971， L10343，U77735，NM003579，U17034，AB000584，X63131， D11428，NM_032940，NM_005035，NM_003579，M18255，L01087， D38128，Y10375，D15049，M31166，U59877，NM_003579，U64675， S57153，NM_002903，NG_000013，X75042，M83221，NM_000537， U22314，S59049，U70426，U22377，U38480，L10338，M23178， M69203，NM_005409，D79206，NM_005065，NM_004186， J03764，NM_006802，D89077，NM_003037，M91463，D82326，L05568， U96094，X83301，D21267，L31529，M62800，NM_021014，Z35093， NM_005816，L25444，M95787，NM005421，L47345，M57732， NM_003205，M96956，U19878，M92357，M59465，X83490， U37518，NM_003294，U19261，U78798，S69790，U53476，L15309， U78722，X57809，U79249，AB000464，X77744，U79248，AI420129， HG2981-HT3127，HG3548-HT3749，HG870-HT870，HG4333-HT4603， HG3111-HT3287，HG4593-HT4998，HG961-HT961，HG1877-HT1917， HG3115-HT3291，HG4115-HT4385，和HG3925-HT4195。
优选地，调节剂是拮抗剂。更优选地，调节剂是结合蛋白或中和 结合蛋白。
本发明还提供含有上述结合蛋白或中和结合蛋白和药学可接受载 体的药物组合物。在另一个实施方案中，药物组合物含有至少一种用 于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的另外的治疗药物。优选地，所 述另外的药物选自：血管生成抑制剂(包括但不限于抗-VEGF抗体或 VEGF-诱捕剂)；激酶抑制剂(包括但不限于KDR和TIE-2抑制剂)； 共同-刺激分子阻断剂(包括但不限于抗-B7.1，抗-B7.2，CTLA4-Ig， 抗-CD20)；粘着分子阻断剂(包括但不限于抗-LFA-1Abs，抗-E/L选 择蛋白Abs，小分子抑制剂)；抗-细胞因子抗体或者其功能片段(包括 但不限于抗-IL-12，抗-TNF，抗-IL-6/细胞因子受体抗体)；甲氨喋 呤；皮质类固醇；环孢菌素；雷帕霉素；FK506；和非甾类抗炎药物。
另一方面，本发明提供一种抑制人IL-18活性的方法，包括使人 IL-18接触上述结合蛋白，使得人IL-18活性被抑制。在相关方面， 本发明提供对患有其中IL-18活性是有害的疾病的人患者抑制人IL- 18活性的方法，包括对人患者施用上述结合蛋白使得人患者中的人 IL-18活性被抑制，从而实现治疗。优选地，所述疾病选自：类风湿性 关节炎，骨关节炎，幼年型慢性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎， 反应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节病，全身红斑狼疮，局限 性回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿病，甲状腺炎， 哮喘，变态反应疾病，牛皮癣，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官 移植排异(包括但不限于骨髓和实体器官排异)，急性或慢性的与器 官移植相关的免疫疾病，肉状瘤病，动脉粥样硬化，传播性血管凝固， Kaw阿司匹林ki′s病，Grave′s病，肾病综合征，慢性疲劳综合征， Wegener′s肉芽肿病，Henoch-Schoenlein紫癜，肾微结节性脉管炎， 慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中毒休克综合征，脓毒症综 合征，恶病质，传染病，由寄生虫引起的疾病，后天免疫缺陷综合征， 急性横向骨髓炎，Huntington′s舞蹈病，帕金森病，早老性痴呆，中 风，原发肝功能障碍引起的肝硬化，溶血性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭， 心肌梗塞，Addison′s病，散发性，I型多腺缺乏和II型多腺缺乏， Schmidt′s综合征，成人(急性)呼吸抑制综合征，脱发，脱发斑，血 清反应阴性关节病，关节病，Reiter′s病，牛皮癣关节病，溃疡性结 肠关节病，肠滑膜炎，衣菌，鼠疫和沙门氏菌相关关节病，脊椎关节 病，动脉粥样化疾病/动脉硬化，特应性变态反应，自身免疫大疱病，寻 常性天疱疮，落叶性天疱疮，类天疱疮，线性IgA病，自身免疫溶血性 贫血，Coombs阳性溶血性贫血，后天性恶性贫血，少年恶性贫血，肌 痛性大脑炎/Royal Free病，慢性粘膜皮肤念珠菌病，巨细胞关节炎， 原发硬化肝炎，起因不明自身免疫肝炎，后天性免疫缺陷病综合征，后 天性免疫缺陷相关疾病，乙肝，丙肝，普通各式各样的免疫缺陷(普通各 式各样的血丙种球蛋白减少)，膨胀心肌病，女性不孕症，卵巢衰竭，早 产卵巢衰竭，纤维变性肺病，起因不明的纤维组织形成牙槽炎，炎后间 质肺病，间质局限性肺炎，与间质肺病相关的缔结组织疾病，与肺病相 关的混合缔结组织疾病，与间质肺病相关的全身硬化，与间质肺病相 关的类风湿性关节炎，与肺病相关的全身红斑狼疮，与肺病相关的皮 肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的Sjogren′s病，与肺病相关的僵硬脊椎 炎，结节性脉管炎弥散肺病，与肺病相关的含铁血黄素沉着病，药物引 起的间质肺病，辐射纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎， 淋巴细胞浸润性肺病，传染病后间质肺病，痛风关节炎，自身免疫肝 炎，1-型自身免疫肝炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2-型自身免疫 肝炎(抗-LKM抗体肝炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微 黑棘皮症，甲状旁腺机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾病，与器 官移植相关的慢性免疫疾病，骨关节炎，原发硬化胆管炎，1型牛皮癣， 2型牛皮癣，自发性白细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病NOS， 肾小球肾炎，肾microscopic vasulitis，莱姆病，盘形红斑狼疮，特 发性男性不孕症或NOS，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交 感神经眼炎，缔结组织疾病继发性高血压，Goodpasture′s综合征，结 节性多动脉炎肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，Still′s病， 全身硬化，Sjogren′s综合征，Takayasu′s病/动脉炎，自身免疫血小 板减少，特发性血小板减少，自身免疫甲状腺病，甲状腺机能亢进，甲 状腺肿自身免疫甲状腺机能亢进(Hashimoto′s病)，萎缩性自身免疫 甲状腺机能亢进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结 节性脉管炎，白癜风，急性肝病，慢性肝病，酒精性肝硬化，酒精引起的 肝损伤，choleosatatis，特应性肝病，药物引起的肝炎，非酒精性脂 肪性肝炎，变应性变态反应和哮喘，B族链球菌(GBS)感染，精神病(例 如，抑郁症和精神分裂症)，Th2型和Th1型介导的疾病，和癌症，例 如肺癌，乳房癌，胃癌，膀胱癌，结肠癌，胰腺癌，卵巢癌，前列腺 癌和直肠癌，和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴瘤)。
另一方面，本发明提供对患有其中IL-18活性是有害的疾病的患 者治疗的方法，包括在施用上述第二种药物之前，同时，或之后对患 者施用上述结合蛋白中的任何一种的步骤。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接 枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能结合成熟-人IL-18， 但是不特异性结合人IL-18原。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接 枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白能与125-2H抗体竞争 结合人IL-18。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接 枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与125-2H抗体竞 争结合人IL-18。
本发明另一方面提供选自人抗体；嵌合抗体；人源化抗体和CDR接 枝抗体的中和结合蛋白，其中所述中和结合蛋白不能与选自2.5(E) mg1抗体和IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
在优选的实施方案中，结合蛋白能结合成熟-人IL-18，但是不特 异性结合人IL-18原。在另一个实施方案中，结合蛋白能与125-2H抗 体竞争结合人IL-18。在另一个实施方案中，结合蛋白不能与125-2H 抗体竞争结合人IL-18。
在另一个实施方案中，结合蛋白不能与选自2.5(E)mg1抗体和 IL-18BP的结合蛋白竞争结合人IL-18。
在优选的实施方案中，结合蛋白包括包括SEQ ID NO：9的氨基酸 序列的VL，和包括SEQ ID NO：8的氨基酸序列的VH。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO：2，和 SEQ ID NO：3的氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO： 4，和SEQ ID NO：5的氨基酸序列的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO： 8的氨基酸序列的Ig重链可变区；和具有SEQ ID NO：9的氨基酸序 列的Ig轻链可变区。
在另一个实施方案中，结合蛋白包括具有选自SEQ ID NO：3的 氨基酸序列的Ig重链恒定区；具有选自SEQ ID NO：4的氨基酸序列 的IG轻链恒定区；具有SEQ ID NO：8的氨基酸序列的Ig重链可变 区；和具有SEQ ID NO：9的氨基酸序列的Ig轻链可变区。
本发明的详细描述
本发明提供IL-18结合蛋白，特别是抗-Il-18抗体，或者与其结 合的其抗原-结合部分。本发明的各方面涉及抗体和抗体片段，及其药 物组合物，以及制备这样的抗体和片段的核酸，重组表达载体和宿主 细胞。
本发明还包括使用本发明的抗体体外或体内检测人IL-18，抑制人 IL-18活性，和调节基因表达的方法。本发明还提供截短的IL-18。 在相关方面，本发明还提供用于制备截短的IL-18的核酸，重组表达 载体和宿主细胞。
除非在这里另有定义，与本发明相关使用的科学和技术定义应该 具有本领域技术人员通常理解的定义。此外，除非上下文必需说明，单 数应该包括复数，而复数应当包括单数。在本说明书中，除非另有说明 ″或″的意思是″和/或″。此外，术语″包括″，以及其他形式，例如，第 三人称的和过去式的″包括″的使用，是非限制性的。还有，除非另有说 明，术语，例如″元素″或″成分″包括包括一个成分的元素和成分以及 包括一个以上子单位的元素和成分。
一般情况下，与这里描述的细胞和组织培养，分子生物学，免疫 学，微生物学，遗传学和蛋白质和核酸化学和杂交技术相关使用的术语 是本领域公知的和通常使用的。本发明的方法和技术一般根据本领域 公知的常规方法和本说明书引述的和讨论的各种概述性的和更专业的 参考文献来进行，除非另有说明。根据厂商说明书进行酶促反应和纯 化技术，如本领域常规实现的或者如这里描述的。与这里描述的实验 步骤，分析化学，合成有机化学和药物化学技术相关的术语是本领域 公知的和通常使用的。化学合成，化学分析，药物制备，制剂和送药 和对患者的治疗是标准技术。
下面定义选择的术语，可以更容易理解本发明。
这里使用的术语″多肽″指任何氨基酸的聚合链。术语″肽″和″蛋白 质″与术语多肽互换使用，也指氨基酸的聚合链。术语″多肽″包括天然 或人造蛋白质，蛋白质片段和蛋白质序列的多肽类似物。多肽可以是 单体的或聚合的。
术语″分离的蛋白质″或″分离的多肽″是由于其来源或产生来源不 与其天然态下伴随它的天然相关成分相关；基本上没有来自相同物种 的其他蛋白质；由不同物种的细胞表达；或者在自然中不存在的蛋白质 或多肽。因此，化学合成或在不同于其天然起源细胞不同的细胞系中合 成的多肽是与其天然相关成分″分离的″。利用本领域公知的蛋白质纯 化技术，通过分离，可以使得蛋白质基本上没有天然相关成分。
这里使用的术语″回收″指，例如，利用本领域公知的蛋白质纯化 技术，通过分离，使得化学物质例如多肽基本上没有天然相关成分的 方法。
这里使用的术语″IL-18″，指也已知为干扰素-γ的细胞因子，包 括因子(IGIF)，那是一种促炎性细胞因子，除了诱导扰素-γ的能力 外还具有各种功能。与术语″hIL-18″互换使用的术语″人IL-18″包括 SEQ ID NO：1的多肽及其片段，包括但不限于，人IL-18原，成熟人 IL-18原，和保留这里描述的IL-18的生物活性的任何截短的人IL- 18。这里使用的术语″人IL-18原″指SEQ ID NO：1的多肽。这里使 用的术语″成熟人IL-18″，指SEQ ID NO：1的残基37-193，这里使 用的术语″截短的人″，指SEQ ID NO：1的残基59-193。优选地，IL- 18，及其片段是生物活性的。这里使用的术语″重组人IL-18″或 ″rhlL-18″指利用重组DNA技术体外制备的人IL-18。
这里使用的″IL-18的生物活性″指细胞因子IL-18的所有固有的 生物学性质。IL-18的生物学性质包括但不限于结合IL-18受体；促 进Th1和Tc1细胞的成熟和激活；通过几种细胞型促进细胞因子例如 TNF，IFNγ和IL-1β的产生；促进巨噬细胞释放细胞因子例如TNF和 IFNγ，产生NO；促进FasL表达，细胞毒性和细胞因子从NK细胞释放 (IFNγ)；促进细胞因子/趋化因子释放，突发性呼吸，颗粒释放，嗜 中性白细胞中粘着分子表达；促进内皮细胞迁移从而促血管生成；促进 GAG释放，软骨细胞中MMP和NO产生；促进某些细胞中COX2表达；和 在某些细胞中减少细胞增殖。
关于抗体，蛋白质，或肽与第二化学物质相互作用的这里使用的 术语″特异性结合″或″特异地结合″，意思是相互作用取决于化学物质 上特定结构(例如抗原决定簇或表位)的存在；例如，抗体识别和结合 特定蛋白质结构而不是一般的蛋白质。如果抗体对于表位″A″是特异性 的，含有标记的″A″和抗体的反应中，含有表位A(或者游离的，没有标 记的A)，的分子的存在，会减少与抗体结合的标记的A的量。
这里使用的术″抗体″，广义上指由四个多肽链构成的任何免疫球 蛋白(Ig)分子：两个重链(H)和两个轻链(L)，或者保留Ig分子的基本 表位结合特征的其任何功能片段，突变体，变体，或衍生物。这样的 突变体，变体，或衍生物抗体形式是本领域公知的。下面讨论非限制 性实施方案。
在全长抗体中，每条重链由一个重链可变区(这里缩写为HCVR或 VH)和一个重链恒定区构成。重链恒定区由三个结构域，CH1，CH2和CH3 构成。每条轻链由一个轻链可变区(这里缩写为LCVR或VL)和一条轻 链恒定区构成。轻链恒定区由一个结构域，CL构成。VH和VL区能进 一步分为高变区，称作互补性决定区(CDR)，期间散布着更保守的称作 构架区(FR)的区。每条VH和VL由三个CDRs和四个FRs构成，从氨 基末端至羧基末端以下面的顺序排列：FR1，CDR1，FR2，CDR2，FR3， CDR3，FR4。
这里使用的术语，抗体的″抗原-结合部分″(或者简单地″抗体部 分″)，指保留特异性结合抗原(例如，hIL-18)能力的抗体的一个或几 个片段。已经证明通过全长抗体的片段能完成抗体的抗原-结合功能。 这样的抗体实施方案还可以是双特异性的，双重特异性的，或多特异 性的形式；特异性结合两个或多个不同的抗原。术语抗体的″抗原-结合 部分″所包括的结合片段的实施例包括：(i)Fab片段，由VL，VH，CL 和CH1结构域构成的一价片段；(ii)F(ab′)2片段，包括在铰链区通过 二硫桥连接的两个Fab片段的二价片段；(iii)由VH和CH1结构域 构成的Fd片段；(iv)由抗体单臂的VL和VH结构域构成的Fv片段， (v)dAb片段(Ward等，(1989)Nature 341：544-546)，其包括一个 可变区；和(vi)分离的互补决定区(CDR)。此外，虽然Fv片段的两个结 构域，VL和VH，由不同的基因编码，利用重组方法，通过使它们制备 成其中VL和VH区对形成一价分子(已知是单链Fv(scFv)；参见，例 如，Bird等(1988)Science 242：423-426；和Huston等(1988) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：5879-5883)的蛋白质单链的合 成接头，能将它们连接。这样的单链抗体也包括在术语，抗体的″抗原 -结合部分″中。也包括其他形式的单链抗体，例如双抗体。双抗体是 二价，双特异性抗体，其中VH和VL结构域在单链多肽上表达，但是使 用太短不能在相同链上两个结构域之间配对的接头，从而使结构域与 另一个链的互补结构域配对，产生两个抗原结合位点(参见，例如， Holliger，P.，等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90： 6444-6448；Poljak，R.J.，等(1994)Structure 2：1121-1123)。 这样的抗体结合部分是本领域公知的(Kontermann和Dubel编著， Antibody Engineering(2001)Springer-Verlag.New York.790pp. (ISBN 3-540-41354-5)。
此外，抗体或其抗原-结合部分可以是更大的免疫粘着分子，是通 过抗体或抗体部分与一个或几个其他蛋白质或肽的共价或非共价结合 形成的。这样的免疫粘着分子的；例子包括使用链霉抗生物素蛋白核 心区形成四聚体scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等(1995)Human Antibodies and Hybridomas 6：93-101)，标记肽和C-末端多组氨酸 标签形成二价的和生物素化scFv分子(Kipriyanov，S.M.，等 (1994)Mol.Immunol.31：1047-1058)。抗体部分，例如Fab和F(ab′)2 片段，能应用常规技术，例如分别对全抗体进行木瓜蛋白酶或胃蛋白酶 消化而从全抗体制备。此外，应用这里描述的标准重组DNAa技术能获 得抗体，抗体部分和免疫粘着分子。
这里使用的术语″分离的抗体″，意指基本上没有具有不同抗原特 异性的其他抗体的抗体(例如，特异性结合hIL-18的分离的抗体基本 上没有特异性结合hIL-18以外抗原的抗体)。然而，特异性结合hIL-18 的分离的抗体具有与其他抗原例如来自其他物种的IL-18分子的交叉 反应性。此外，分离的抗体基本上没有其他细胞材料和/或化学品。
这里使用的术语″人抗体″意指包括具有来自人种系免疫球蛋白序 列的可变和恒定区的抗体。本发明的人抗体可以包括不是人种系免疫 球蛋白序列编码的氨基酸残基(例如体外随机或定点诱变或通过体内 体突变诱导的突变)，例如在CDRs中，特别是在CDR3中。然而，这里 使用的术语″人抗体″不包括其中CDR序列来自另一个哺乳动物种系例 如小鼠的种系的抗体接枝到人构架序列上。
这里使用的术语″重组人抗体″意在包括通过重组方法制备，表 达，产生或分离的所有的人抗体，例如利用转染到宿主细胞中的重组 表达载体表达的抗体(在下面Il C章节进一步描述)，从重组组合人抗 体库分离的抗体(Hoogenboom H.R.，(1997)TIB Tech.15：62-70； Azzazy H.，和Highsmith W.E.，(2002)Clin.Biochem.35： 425-445；Gavilondo J.V.，和Larrick J.W.(2002)BioTechniques 29：128-145；Hoogenboom H.，和Chames P.(2000)lmmunology Today 21：371-378)，从人免疫球蛋白基因转基因的动物(例如小鼠) 分离的抗体(参见，例如，Taylor，L.D.，等(1992)Nucl.Acids Res.20：6287-6295；Kellermann S-A.，和Green L.L.(2002) Current Opinion in Biotechnology 13：593-597；Little M.等 (2000)Immunology Today 21：364-370)或者通过涉及人免疫球蛋白 基因序列与其他DNA序列剪接的任何其他方法制备，表达，产生或分 离的抗体。这样的重组人抗体具有来自人种系免疫球蛋白序列的可变 和恒定区。但是在一些实施方案中，对这样的重组人抗体体外诱变(或 者，当体内体诱变使用人Ig序列的转基因动物时)，从而重组抗体的VH 和VL区的氨基酸序列是来自体内人抗体种系全部中天然并不存在的 人种系VH和VL序列或者与人种系VH和VL序列相关的序列。
术语″嵌合抗体″指包括来自一个物种的重链和轻链可变区序列和 来自另一个物种的恒定区序列的抗体，例如具有与人恒定区连接的鼠 重链和轻链可变区的抗体。
术语″CDR-接枝抗体″指包括来自一个物种的重链和轻链可变区， 但是其中序列中VH和/或VL中一个或几个CDR区被另一个物种的 CDR序列置换，例如具有其中一个或几个鼠CDRs(例如，CDR3)被人 CDR序列置换的鼠重链和轻链可变区的抗体。
术语″人源化抗体″指包含来自非人物种(例如小鼠)但是其中VH 和/或VL序列中至少一部分被变为更“人-样”，即人种系可变序列更 相似的重链和轻链可变区序列的抗体。人源化抗体的一种类型是CDR- 接枝抗体，其中人CDR序列导入非人VH和VL序列置换相应的非人CDR 序列。
如这里使用的，术语″hIL-18中和结合蛋白″指特异性结合hIL-18 并且中和hIL-18的生物活性的蛋白质。优选地，中和结合蛋白是其与 hIL-18的结合导致hIL-18的生物活性被抑制的中和抗体。优选地， 中和结合蛋白结合hIL-18并且将hIL-18的生物活性减小至少大约 20％，40％，60％，80％，85％或更多。中和结合蛋白对hIL-18的生物 活性的这种抑制作用能通过测定hIL-18生物活性的一个或几个指标 来评定。hIL-18生物活性的这些指标能通过本领域公知的体外或体内 分析的几种标准方法中的一种或几种来评定。
术语″表位″包括能特异性结合免疫球蛋白或T-细胞受体的任何多 肽决定簇。在一些实施方案中，表位决定簇包括象氨基酸，糖侧链，磷 酰基，或磺酰基这样的分子的化学活性表面基团，并且在一些实施方 案中，可以具有特定的三维结构特征和/或特定电荷特征。表位是抗 体结合的抗原的区。在一些实施方案中，当抗体优先识别蛋白质和/或 大分子复合混合物中其靶物抗原时，抗体特异性结合抗原。
如这里使用的术语″表面等离振子共振″指一种光学现象，它使得 通过检测生物传感器基体中蛋白质浓度的改变来分析实时生物特异性 相互作用，例如利用BIAcore系统(Pharmacia Biosensor AB， Uppsala，Sweden and Piscataway，NJ)。为了进一步描述，参见 Jonsson，U.，等(1993)Ann.Biol.Clin.51：19-26；Jonsson， U.，等(1991)Biotechniques 11：620-627；Johnsson，B.，等 (1995)J.Mol.Recognit.8：125-131；和Johnnson，B.，等(1991) Anal.Biochem.198：268-277。
如这里使用的术语″Kon″，意指本领域公知的抗体与抗原缔合生成 抗体/抗原复合体的生成速率常数。
如这里使用的术语″Koff″，意指本领域公知的抗体从抗体/抗原复 合体离解的离解速率常数。
如这里使用的术语″Kd″，意指本领域公知的特定抗体-抗原相互作 用的离解常数。
如这里使用的术语″标记的结合蛋白″，指带有插入的标记物提供 结合蛋白鉴定的蛋白质。优选地，标记物是可检测标记，例如插入放射 性标记的氨基酸或连接标记的抗生物素蛋白能检测的生物素基部分的 多肽(例如，包含荧光标记物或者光学或比色方法能检测的酶活性的 链霉抗生物素蛋白)。多肽的标记物的例子包括但不限于下面的：放射 性同位素或放射性核素(例如， 3H，14C，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，或153Sm)；荧光标记物 (例如，FITC，罗丹明，镧系磷光剂)，酶学标记(例如，辣根过氧化 物酶，荧光素酶，碱性磷酸酶)；化学发光标记物；生物素基团；预先确 定的第二报告基团识别的多肽表位(例如，亮氨酸拉链对序列，二次抗 体的结合位点，金属结合结构域，表位标签)；和有吸引力的试剂，例如 钆螯合剂。
术语″缀合结合蛋白″指与第二化学部分，例如治疗性药物或细胞 毒性试剂，化学连接的结合蛋白。术语″试剂″在这里用来指化合物， 化合物的混合物，生物大分子，或者从生物材料制备的提取物。优选 地，治疗性药物或细胞毒性试剂包括但不限于，百日咳毒素，紫杉酚， 细胞松弛素B，短杆菌肽D，溴化乙锭，吐根碱，丝裂霉素，依托泊苷， tenoposide，长春新碱，长春碱，秋水仙碱，阿霉素，柔红霉素，二羟 基炭疽菌素二酮，二羟蒽二酮，光辉霉素，放线菌素D，1-脱氢睾酮， 糖皮质激素，普鲁卡因，丁卡因，利多卡因，普萘洛尔，和嘌呤霉素， 和它们的类似物或同系物。
这里使用的术语″结晶结合蛋白″指以晶体形式存在的多肽。晶体 是一种固态形式，它与其他形式例如无定形固态或液晶态截然不同。晶 体由原子，离子，分子(例如蛋白质，象抗体)，或分子集合体(例 如抗原/抗体复合体)有序的重复的三维排列组成。这些三维排列根 据本领域公知的特殊数学关系排列。晶体中重复的基础单元，或者构件， 称作不对称单元。证实给出确定的结晶学对称性的排列中重复的不对 称单元提供晶体的″晶胞″。所有三个方向规则转换的晶胞的重复得到 晶体。参见Giege，R.和Ducruix，A.Barrett，Crystallization of Nucleic Acids and Proteins，a Practical Approach，2nd ea.， pp.201-16，Oxford University Press，New York，New York，(1999)″。
这里称作″多核苷酸″的术语在这里指两个或多个核苷酸，核糖核 酸或脱氧核糖核酸或任何类型核苷酸的修饰形式的聚合形式。该术语 包括单链和双链形式的DNA，但是优选双链DNA。
这里使用的术语″分离的多核苷酸″意思是多核苷酸(例如基因组 的，cDNA，或者合成来源，或者它们的组合)，其由于其来源，″分离的 多核苷酸″：与自然界发现″分离的多核苷酸″的多核苷酸的全部或 部分不相缔合；与自然界不连接的多核苷酸操作连接；或者在自然界不 作为更大序列的部分而存在。
这里使用的术语″载体″意指能将它所连接的另一个核酸转运的核 酸分子。载体的一种类型是″质粒″，它指其中可以连接另外的DNA片 段的环状双链DNA环。载体的另一种类型是病毒载体，其中另外的DNA 片段连接到病毒基因组中。一些载体能在导入它们的宿主细胞中自主 复制(例如，有细菌复制起点的细菌载体和游离基因哺乳动物载体)。 其他载体(例如，非游离型哺乳动物载体)在导入宿主细胞中时能被整 合到宿主细胞的基因组中，从而与宿主基因组一起复制。此外，一些载 体能指导它们操作连接的基因的表达。这样的载体在这里称作″重组表 达载体″(或者简单地，″表达载体″)。一般情况下，重组DNA技术中 使用的表达载体经常是质粒形式。本说明书中，″质粒″和″载体″可以 互换使用，因为质粒是最常使用的载体形式。然而，本发明意在包括这 样的表达载体的其他形式，例如病毒载体(例如，复制缺陷逆转录病毒， 腺病毒和腺-相关病毒，它们起着同等的功能。
术语″操作连接″指其中将描述的成分相关联使得它们以期望的方 式发挥功能的连接。与编码序列″操作连接″的调控序列以这样的方式 连接使得在与调控序列相匹配的条件下实现编码序列的表达。″操作连 接″序列包括与感兴趣的基因邻接的表达调控序列和以反式起作用或 者与感兴趣的调控基因有距离的表达调控序列。
这里使用的″表达调控序列″指进行表达和加工它们连接的编码序 列所必需的多核苷酸序列。表达调控序列包括合适的转录起始序列， 中止序列，启动子和增强子序列；有效RNA加工信号，例如剪接和多 腺苷酸酸化信号；稳定胞质mRNA的序列；提高翻译效率的序列(剂， Kozak共有序列)；提高蛋白质稳定性的序列；如果期望，增强蛋白质 分泌的序列。这样的调控序列的性质根据宿主生物而不同；在原核生物 中，这样的调控序列一般包括启动子，核糖体结合位点，和转录终止序 列；在真核生物中，一般情况下，这样的调控序列包括启动子和转录终 止序列。术语″调控序列″意在包括其存在对于表达和加工是必须的成 分，并且还包括其存在是有利的附加成分，例如前导序列和融合配对物 序列。
这里定义的″转化″指外源DNA进入宿主细胞的任何过程。利用本 领域公知的各种各样的方法在天然或人为条件下可以发生转化。转化 可以依赖公知的方法将外来核酸序列插入原核或真核宿主细胞。根据 转化的宿主细胞选择方法并且包括但不限于，病毒感染，电穿孔，脂 质转染，和粒子轰击。这样的″转化″细胞包括稳定转化的细胞，其中 插入的DNA能作为自身复制质粒或者作为宿主染色体的部分复制。它 们还可以包括瞬时表达插入的DNA或RNA有限时间的细胞。
这里使用的″重组宿主细胞″(或者简单地″宿主细胞″)意指其中已 经导入外源DNA的细胞。应该理解这样的术语意在不仅指特定受体细 胞，而且还有这样的细胞的后代。因为由于突变或环境影响，在后代 中可能发生一些改变，这样的后代事实上可能与母本细胞不同，但是它 仍然包括在这里使用的术语″宿主细胞″的范围内。优选地，宿主细胞 包括选自生命界任何原核和真核细胞。优选的真核细胞包括原生生 物，真菌，植物和动物细胞。最优选地，宿主细胞包括但不限于原核细 胞系大肠杆菌；哺乳动物细胞系CHO和COS；昆虫细胞系Sf9；和真菌 细胞啤酒糖酵母。
标准技术可以用于重组DNA，寡核苷酸合成，和组织培养和转化(例 如，电穿孔，脂质转染)。酶促反应和纯化技术可以根据厂商说明书进 行或者以本领域常规做法或者根据这里的描述进行。上述技术和方法 一般根据本领域公知的常规方法和各种概述和更具体说明的参考文献 的描述进行，这些参考文献在本说明书中引述并讨论。参见，例如， Sambrook等Molecular Cloning：A Laboratory Manual(第二版， 冷泉港出版社，冷泉港，纽约(1989))，这里为了所有的目的引作参 考。
正如本领域公知的和这里使用的，″转基因生物″，指有包含转基 因的细胞的生物，其中导入生物体中的转基因(生物体的祖先)表达在 生物体中天然并不表达的多肽。″转基因″是DNA构建体，其稳定操作 整合导产生转基因生物体的细胞的基因组中，在转基因生物的一种或 几种细胞类型或组织中指导编码基因产物的表达。
术语″调控″和″调节″互换使用，如这里使用的，指感兴趣的分子活 性(例如，hIL-18的生物活性)的变化或改变。调控可以是感兴趣的分 子的某些活性或功能大小的增加或减小。举例的分子的活性和功能包 括但不限于，结合特征，酶活性，细胞受体激活，和信号转导。
相应地，这里使用的术语″调节剂″是能改变或变化感兴趣的分子 的活性或功能(例如，hIL-18的生物活性)的化合物。例如，调节剂可 以引起分子的某些活性或功能的大小与不存在调节剂所发现的活性或 功能的大小相比有所增大或降低。在一些实施方案中，调节剂是抑制剂， 其降低分子的至少一种活性或功能大小。举例的抑制剂包括但不限于 蛋白质，肽，抗体，，peptibodies，碳水化合物或小有机分子。 Peptibodies描述于，例如，WO01/83525。
这里使用的术语″激动剂″指一种调节剂，其当与感兴趣的分子接 触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在激动剂所发现的活 性或功能的大小相比有所增大。特别感兴趣的激动剂包括但不限于， IL-18多肽，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18的任何其他分子。
这里使用的术语″拮抗剂″或″抑制剂″指一种调节剂，其当与感兴 趣的分子接触时，引起分子的某些活性或功能的大小与不存在拮抗剂 所发现的活性或功能的大小相比有所增大。特别感兴趣的拮抗剂包括 阻断或调节hIL-18的生物学或免疫学活性的那些。hIL-18的拮抗剂 和抑制剂包括但不限于，蛋白质，核酸，碳水化合物，或结合hIL-18 的任何其他分子。
这里使用的术语″样品″以其广义使用。这里使用的″生物样品″包 括但不限于，来自活体或活体前的一定量物质。这样的活体包括但不限 于，人，小鼠，大鼠，猴，狗，兔和其他动物。这样的物质包括但不限 于，血液，血清，尿液，滑液，细胞，器官，组织，骨髓，淋巴结和脾。
这里使用的，一般公知的，本领域技术人员使用的，术语″竞争″， 指一种蛋白质与第二种结合蛋白结合这两种结合蛋白共同的配体(例 如，IL-18)的相互干扰或者阻碍的能力。用于测定结合蛋白的竞争 特征的试验是本领域公知的。这里描述优选的竞争试验。
I.结合人IL-18的人抗体
本发明的一个方面提供以高亲合力，低解离速率和高中和能力， 结合I L-18分离的人抗体，其抗原结合部分。优选地，抗体，或者其 部分是分离的抗体。优选地，本发明的人抗体是中和人抗-IL-18抗 体。
A.抗IL-18抗体的制备方法
通过本领域公知的多种技术可以制备本发明的抗体。制备本发明 的抗-IL-18抗体的特别优选的方法包括使用XENOMOUSE转基因小鼠， 并且使用本领域公知的用于制备抗体的杂交瘤和SLAM细胞操作技术 (Abgenix，Inc.，Fremont，CA)，并且使用包括实施例3.2描述的 IL-18肽的抗原，即，包括SEQ ID NO.1的氨基酸序列和其片段的人 IL-18。
在本发明的一个实施方案中，通过用IL-18抗原免疫包括人免疫球 蛋白基因座全部或部分的非人动物制备人抗体。在优选的实施方案中， 非人动物是XENOMOUSE转基因小鼠，包括人免疫球蛋白基因座的大片 段并且在小鼠抗体产生中缺乏的基因工程小鼠品系。参见，例如， Green等Nature Genetics 7：13-21(1994)和美国专利5,916, 771，5,939,598，5,985,615，5,998,209，6,075,181，6,091, 001，6,114,598和6,130,364。还参见1991年7月25日公开的WO 91/10741，1994年2月3日公开的WO 94/02602，1996年10月31 日公开的WO 96/34096和WO 96/33735，1998年4月23日公开的 WO98/16654，1998年6月11日公开的WO 98/24893，1998年11月 12日公开的WO 98/50433，1999年9月10日公开的WO 99/45031，1999 年10月21日公开的WO 99/53049，2000年2月24日公开的WO 00 09560，和2000年6月29日公开的WO 00/037504。XENOMOUSE转基 因小鼠产生全人抗体的成人-样人抗体库，并且产生抗原-特异性人 Mabs。XENOMOUSE转基因小鼠通过导入兆碱基大小的，人重链基因座 和x轻链基因座的种系构型YA片段而包含大约80％人抗体库。参见 Mendez等，Nature Genetics 15：146-156(1997)，Green和 Jakobovits J.Exp.Med.188：483-495(1998)，其公开内容引作 参考。
本发明还提供了通过免疫包括人免疫球蛋白基因座的非人转基因 动物从非人非小鼠动物制备抗-IL-18抗体的方法。人们可以利用上面 刚描述的方法制备这样的动物。这些专利文献中公开的方法可以根据 美国专利5,994,619的描述改进。在优选实施方案中，非人动物可以 是大鼠，绵羊，猪，山羊，牛或马。
在另一个实施方案中，包括人免疫球蛋白基因座的非人动物是人 免疫球蛋白“小基因座”的动物。在小基因座研究中，通过从Ig基因 座包含各个基因来模拟外源Ig基因座。这样，一个或几个VH基因， 一个或几个DH基因，一个或几个JH基因，一个μ恒定区，和一个第 二恒定区(优选γ恒定区)形成用于插入动物中的构建体。这项研究具 体描述于美国专利No.5,545,807，5,545,806，5,625,825， 5,625,126，5,633,425，5,661,016，5,770,429，5,789,650， 5,814,318，5,591,669，5,612,205，5,721,367，5,789,215， 和5,643,763，这里引作参考。
小基因座研究的好处是快捷，能产生包括Ig基因座的部分的构建 体并且导入动物中。然而，小基因座研究的潜在的缺点是可能没有足 够的免疫球蛋白多样性来支持全B-细胞发育，使得抗体产生较少。
为了制备人抗-IL-18抗体，用IL-18抗原免疫包括人免疫球蛋白 基因座的一些或全部的非人动物，并且从动物分离抗体或产生抗体的 细胞。IL-18抗原可以是分离的和/或纯化的IL-18，并且优选是人 IL-18。在另一个实施方案中，IL-18抗原是IL-18的片段，优选成熟 IL-18。在另一个实施方案中，IL-18抗原是包括至少一个IL-18的表 位的片段。
对动物的免疫可以通过本领域公知的任何方法来进行。参见，例如， Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，纽约：冷泉港 出版社，1990。对非人动物例如小鼠，大鼠，绵羊，山羊，猪，牛和 马进行免疫的方法是本领域公知的。参见，例如，Harlow和Lane， 美国专利5,994,619。在优选的实施方案中，IL-18抗原与辅助剂一 起施用刺激免疫应答。这样的辅助剂包括完全或不完全福氏佐剂， RIBI(胞壁酰二肽)或ISCOM(免疫刺激复合体)。这样的辅助剂通过局 部沉积分离它而可以保护多肽不快速散播，或者它们可以含有刺激宿 主分泌对巨噬细胞和免疫系统的其他成分有趋化性的物质。优选地，如 果施用多肽，免疫程序包括施用两次或多次多肽，延续几周。
实施例2.2.A提供用磷酸盐缓冲盐水中人IL-18免疫XENOMOUSE 转基因小鼠的方案。
B.抗体和产生抗体的细胞系的产生
用IL-18抗原免疫动物之后，可以从动物获得抗体和/或产生抗 体的细胞。通过从动物取血或杀死动物而从动物获得含有抗-IL-18抗 体的血清。可以使用从动物获得的血清，从血清获得的免疫球蛋白级 分，或者从血清纯化的抗-IL-18抗体。以这种方式获得的血清或免疫 球蛋白是多克隆的，因此带有一系列异源性质。
在另一个实施方案中，可以从受免疫动物制备产生抗体的无限繁 殖杂交瘤。免疫之后杀死动物，并且根结本领域公知的，将B脾细胞 与无限繁殖骨髓瘤细胞融合。参见，例如，Harlow和Lane，上文。 在优选实施方案中，骨髓瘤细胞不分泌免疫球蛋白多肽(非分泌细胞 系)。融合抗生素选择之后，使用IL-18，或者其部分，或表达IL-18 的细胞筛选杂交瘤。在优选实施方案中，利用酶联免疫分析(ELISA)或 者放射免疫分析(RIA)进行最初的筛选，优选ELISA。WO 00/37504 中提供了ELISA筛选的实施例，这里引作参考。
选择产生抗-IL-18抗体的杂交瘤，克隆，并且进一步筛选期望的 特征，包括强健杂交瘤生长，高抗体产生和期望的抗体特征，下面进一 步讨论。培养杂交瘤并且在同源动物体内，在没有免疫系统的动物，例 如，裸鼠，中展开，或者在培养基中体外培养。筛选，克隆和扩展杂交 瘤的方法是本领域技术人员公知的。
优选地，免疫动物是表达人免疫球蛋白基因并且B脾细胞与来自和 非人动物相同物种的骨髓瘤融合的非人动物。更优选地，免疫动物是 XENOMOUSE转基因小鼠，骨髓瘤细胞系是非-分泌小鼠骨髓瘤，例如骨 髓瘤细胞系是P3X63Ag8.653(参见，例如，实施例2.2.B)。
一方面，本发明提供产生人抗-IL-18抗体的杂交瘤。在优选的实 施方案中，杂交瘤是小鼠杂交瘤，如上所述。在另一个优选的实施方案 中，杂交瘤是在非人非小鼠物种中产生的，例如大鼠，绵羊，猪，山羊， 牛或马。在另一个实施方案中，杂交瘤是人杂交瘤，其中人非分泌骨髓 瘤与表达抗-IL-18抗体的人细胞融合。
在本发明的另一个方面，利用本领域称作筛选淋巴细胞抗体方法 (SLAM)的方法从单一的分离的淋巴细胞制备重组抗体，如美国专利No. 5,627,052，PCT公开WO 92/02551，和Babcock，J.S.等(1996) Proc.Natl.Acad.Sci.USA 93：7843-7848所述。在该方法中， 应用抗原特异性溶血血小板测试来筛选I(A)章节中描述的任何一种 免疫动物得到的分泌感兴趣的抗体的单一细胞，例如淋巴细胞，在抗原 特异性溶血血小板测试中，抗原IL-18，或者其片段，利用接头，例 如生物素，与绵羊红细胞偶联，并且用来鉴定分泌对IL-18有特异性的 抗体的单一细胞。鉴定感兴趣的分泌抗体的细胞之后，通过逆转录酶 -PCR从细胞获得重链和轻链可变区cDNAs，然后在哺乳动物细胞例如 COS或CHO细胞中，在合适的免疫球蛋白恒定区(例如，人恒定区)的 上下游表达这些可变区。用来自体内筛选的淋巴细胞的扩增的免疫球 蛋白序列转染宿主细胞，然后进一步分析并体外筛选，例如通过使转染 细胞分离表达抗IL-18抗体的细胞。进一步体外操作扩增的免疫球蛋 白序列，例如通过体外亲和性成熟方法，例如PCT公开WO 97/29131 和PCT公开WO 00/56772中描述的那些。
也可以利用体外方法来制备本发明的抗体，其中筛选抗体库来鉴 定具有期望的结合特异性的抗体。这样筛选重组抗体库的方法是本领 域公知的并且包括例如下面文献中描述的方法：Ladner等，美国专利 No.5,223,409；Kang等，PCT公开No.WO92/18619；Dower等， PCT公开No.WO 91/17271；Winter等，PCT公开No.WO 92/20791； Markland等，PCT公开No.WO 92/15679；Breitling等，PCT公 开No.WO 93/01288；McCafferty等，PCT公开No.WO 92/01047； Garrard等，PCT公开No.WO 92/09690；Fuchs等(1991)Biol Technology 9：1370-1372；Hay等(1992)Hum Antibod Hybridomas 3：81-85；Huse等(1989)Science 246：1275-1281；McCafferty 等，Nature(1990)348：552-554；Griffiths等，(1993)EMBO J 12：725-734；Hawkins等(1992)J Mol Biol 226：889-896； Clackson等(1991)Nature 352：624-628；Gram等(1992)PNAS 89：3576-3580；Garrad等(1991)Bio/Technology 9：1373-1377； Hoogenboom等(1991)Nucl Acid Res 19：4133-4137；和Barbas 等(1991)PNAS 88：7978-7982，美国专利申请公开20030186374，和 PCT公开No.WO 97/29131，这些文献的内容在此引作参考。
重组抗体库可以来自用IL-18，或IL-18的部分免疫的受试者。或 者，重组抗体库可以来自裸受试者，即，没有用IL-18免疫的受试者， 例如从没有用人IL-18免疫的人受试者获得的人抗体库。通过用包括 人IL-18的肽(例如，相应于hIL-18的部分的肽)筛选重组抗体库来筛 选本发明的抗体，从而筛选识别IL-18的那些抗体。实施这样的筛选 和选择的方法是本领域公知的，例如上一段中的参考文献中描述的 的。为了筛选对hIL-18具有特定的结合亲和性的本发明的抗体，例如 以特定解离速率常数从人IL-18离解的那些，能利用本领域公知的表 面等离振子共振的方法来筛选具有期望的解离速率常数的抗体。为了 筛选对hIL-18具有特定中和活性的本发明的抗体，例如具有特殊IC50 的那些，可以利用本领域公知的评价hIL-18活性的抑制作用的本领域 公知的标准方法。
一方面，本发明提供分离的抗体，或者结合人IL-18的其抗原结合 部分。优选地，抗体是中和抗体。优选地，抗体是人抗体。在很多实施 方案中，抗体是重组抗体或单克隆抗体。本发明最优选的中和抗体在这 里称作2.5(E)，并且具有SEQ ID NO：7的氨基酸序列的VL和SEQ ID NO：6的氨基酸序列的VH。最优选地，2.5(E)抗体结合人IL-18， Kd小于5×1010M(参见实施例2.2.F)。
优选地，本发明的抗-IL-18抗体，例如2.5(E)抗体和相关抗体， 具有减小或中和IL-18活性的能力，例如，根据本领域公知的几种体 外和体内测试所测定的(例如，参见实施例3.2.F)。例如，这些抗体中 和KG-1细胞中人γ干扰素的IL-18-诱导的产生，IC50值的范围至少大 约10-8M，大约10-9M，或者大约10-10M。此外，这些抗体还中和全血 细胞中人γ干扰素的IL-18-诱导的产生，IC50值的范围至少大约10-8M， 大约10-9M，或者大约10-10M。
在特别优选的实施方案中，抗-IL-18抗体2.5(E)结合各种形式 的人IL-18，包括IL-18原，成熟IL-18和截短的IL-18。抗体2.5(E) 不特异性结合其他细胞因子，例如IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6， IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16， IL-17，IL-21，TNF，LT(淋巴毒素)，LTα1β2，和LTα2β1。但是， 抗体2.5(E)与来自其他物种的IL-18没有交叉反应性。例如，抗体 中和来自cynomolgus猴的IL-18的活性(IC50 for cyno IL-18＝9.E ×10-11；参见实施例2.2.J1)。
一方面，本发明提供2.5(E)抗体和功能抗体部分，2.5(E)-相关 抗体和功能抗体部分，与2.5(E)等同性质的其他人抗体和功能抗体 部分，例如以低离解动力学和高中和能力结合IL-18的高亲和性。在 优选的实施方案中，分离的抗体，或者其抗原-结合部分，结合人IL-18， 根据表面等离振子共振所测定的，其中抗体，或者其抗原-结合部分，其 中抗体，或者其抗原-结合部分，以大约0.1s-1或更小的Koff速率常数从 人IL-18离解，或者其以大约1×10-6M或更小的IC50抑制人IL-18活 性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合 部分，可以以大约1×10-2s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解， 或者其以大约1×10-7M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据 表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约 1×10-3s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1× 10-8M或更小的IC50抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振 所测定的，抗体，或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-4s-1或更小 的Koff速率常数从人IL-18离解，或者其以大约1×10-9M或更小的IC50 抑制人IL-18活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体， 或者其抗原-结合部分，可以以大约1×10-5s-1或更小的Koff速率常数从 人IL-18离解，或者其以大约1×10-10M或更小的IC50抑制人IL-18 活性。或者，根据表面等离振子共振所测定的，抗体，或者其抗原-结 合部分，可以以大约1×10-5s-1或更小的Koff速率常数从人IL-18离解， 或者其以大约1×10-11M或更小的IC50抑制人IL-18活性。
在另一个实施方案中，本发明提供分离的人抗体，或其抗原结合部 分，具有包括SEQ ID NO：7；SEQ ID NO：9；SEQ ID NO：11；SEQ ID NO：13；SEQ ID NO：15；SEQ ID NO：17；SEQ ID NO：19；SEQ ID NO：21；SEQ ID NO：23；SEQ ID NO：25；SEQ ID NO：27；SEQ ID NO： 29；SEQ ID NO：31；SEQ ID NO：33；SEQ ID NO：35；SEQ ID NO：37； SEQ ID NO：39；或SEQ ID NO：41的氨基酸序列的轻链可变区(VL)， 和包括SEQ ID NO：6；SEQ ID NO：8；SEQ ID NO：10；SEQ ID NO： 12；SEQ ID NO：14；SEQ ID NO：16；SEQ BD NO：18；SEQ ID NO：20； SEQ ID NO：22；SEQ ID NO：24；SEQ ID NO：26；SEQ ID NO：28； SEQ ID NO：30；SEQ ID NO：32；SEQ ID NO：34；SEQ ID NO：36；SEQ ID NO：38；或SEQ ID NO：40的氨基酸序列的重链可变区(VH)。
在一些实施方案中，抗体包括重链恒定区，例如IgG1，IgG2，IgG3， IgG4，IgA，IgE，IgM或IgD恒定区。优选地，重链恒定区是IgG1重 链恒定区或IgG4重链恒定区。此外，抗体包括轻链恒定区，κ轻链恒 定区或λ轻链恒定区。优选地，抗体包括κ轻链恒定区。或者，抗体部 分可以是，例如，Fab片段或单链Fv片段。
Fc部分中氨基酸残基的置换改变抗体效应子功能是本领域公知的 (Winter，等，美国专利No.5,648,260；5624821)。抗体的Fc部 分介导几种重要效应子功能，例如细胞因子诱导，ADCC，吞噬作用，补 体依赖性细胞毒性(CDC)和抗体和抗原-抗体复合体的半衰期/清除 率。在一些情况下，对于治疗性抗体，这些效应子功能是所期望的， 但是在另一些情况下可能是不需要的甚至是有害的，取决于治疗目 标。一些人IgG同位型，特别是IgG1和IgG3，分别通过与FcγRs和 补体C1q结合而介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是决定抗体的 循环半衰期的关键成分。在另一个实施方案中，抗体的恒定区例如抗 体的Fc区中至少一个氨基酸残基被置换，使得抗体的效应子功能被改 变。
一个实施方案提供了标记的结合蛋白，其中本发明的抗体或抗体 部分被衍生化或者连接另一个功能分子(例如，另一个肽或蛋白质)。例 如，通过将本发明的抗体或抗体部分(通过化学偶联，基因融合，非 共价结合或者其他)与一个或几个其他分子部分功能连接，能衍生本 发明的标记的结合蛋白，所述其他分子部分例如另一种抗体(例如， 双特异性抗体或二联抗体)，可检测试剂，细胞毒性试剂，药物物质，和 /或能介导抗体或抗体部分与另一种分子(例如链霉抗生物素蛋白核 心区或多组氨酸标签)结合的蛋白质或肽。
本发明的抗体或抗体部分可以被衍生化的有用可检测试剂包括荧 光化合物。举例的荧光可检测试剂包括荧光素，荧光素异硫氰酸酯，罗 丹明，5-二甲基胺-1-萘磺酰基氯，藻红蛋白等等。还可以用可检测酶 将抗体衍生化，例如用碱性磷酸酶，辣根过氧化物酶，葡萄糖氧化酶等 等能够。当用可检测酶将抗体衍生化时，通过加入另外的试剂检测它， 酶用来产生可检测反应产物。例如，当存在可检测试剂辣根过氧化物 酶时，加入过氧化氢和二氨基联苯胺产生有色反应产物，其是可检测 的。也可以用生物素将抗体衍生物化，并且通过间接测定抗生物素蛋 白或链酶抗生物素蛋白结合来测定。
本发明的另一个实施方案提供结晶结合蛋白。优选地，本发明涉 及这里公开的全抗-IL-18抗体及其片段的结晶，含有这样的结晶的制 剂和组合物。在一个实施方案中，结晶的结合蛋白具有比结合蛋白的 可溶配对物更长的体内半存留期。在另一个实施方案中，结合蛋白在 结晶之后保留了生物活性。
根据本领域公知的方法和根据中公开的，可以制备本发明的结晶 结合蛋白，WO 02072636在此引作参考(也参见例如2.2.M)。
本发明另一个实施方案提供糖基化结合蛋白，其中抗体或抗原-结 合部分包括一个或几个糖残基。最初的体内蛋白质的产生可以进一步 加工，这是翻译后修饰。特别地，糖(乙二醇)残基可以酶促加上，这 个过程是糖基化作用。得到的带有共价连接的寡糖侧链的蛋白质已知 是糖基化蛋白质或糖蛋白。蛋白质糖基化作用取决于感兴趣的蛋白质 的氨基酸序列，以及其中表达蛋白质的宿主细胞。不同的生物体可以产 生不同的糖基化作用酶(例如，糖基转移酶和糖苷酶)，并且具有不同 的底物(核苷酸糖类)。由于这样的因素，蛋白质糖基化模式，糖基残基 的成分可以根据其中表达特定蛋白质的宿主系统而不同。本发明中使 用的糖基残基可以包括但不限于，葡萄糖，半乳糖，甘露糖，岩藻糖，n- 乙酰氨基葡萄糖和唾液酸。优选地，糖基化结合蛋白包括糖基化残 基，使得糖基化模式是人的。
本领域技术人员公知不同的蛋白质糖基化作用可以产生不同的蛋 白质特征。例如，与哺乳动物例如CHO细胞系中表达的相同蛋白质相 比，微生物宿主例如使用酵母内源途径的酵母中产生的糖基化的治疗 性蛋白质的功效可能被减小。这样的糖蛋白在人体中也可以是免疫原 性的并且具有给药后减小的体内半存留期。人和其他动物中的特异受 体可以识别特异糖基残基并且促进蛋白质在血液中的快速清除。其他 副作用包括蛋白质折叠，可溶性，对蛋白酶的灵敏性，运输，转运，区 室化，分泌，被其他蛋白质或因子识别，抗原性，或变应原性的改变。 因此，医师可能优选具有特定糖基化作用成分和模式的治疗性蛋白质， 例如与人细胞中或关注的受试者动物的物种-特异性细胞中产生的相 同或至少相似的糖基化成分和模式。
通过基因修饰宿主细胞来表达异源糖基化酶，可以实现与宿主细 胞不同的糖基化蛋白质的表达。应用本领域公知的技术，医师可以获 得具有人蛋白质糖基化作用的抗体或其抗原-结合部分。例如，对酵母 菌株进行基因修饰来表达非天然存在的糖基化酶，使得这些酵母菌株 中产生的糖基化蛋白质(糖蛋白)具有与动物细胞特别是人细胞产生的 相同的蛋白质糖基化作用(美国专利申请20040018590和 20020137134)。
此外，本领域技术人员明白，使用经基因工程处理的表达各种糖基 化酶的宿主细胞库，可以表达感兴趣的蛋白质，使得库中成员宿主细胞 产生具有不同糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。医师可以选择并分 离具有特定糖基化作用模式的感兴趣的蛋白质。优选地，具有特定的选 择的新的糖基化作用模式的蛋白质具有改善的或改变的生物性质。
C.重组IL-18抗体的产生
通过本领域公知的各种技术可以制备本发明的抗体。例如，从宿主 细胞表达，其中编码重链和轻链的表达载体通过标准技术被转染导宿 主细胞中。各种形式的术语″转染″意在包括通常用于将外源DNA导入 原核或真核细胞中的各种技术，例如，电穿孔，磷酸钙沉淀，DEAE- 葡聚糖转染等。虽然有可能在原核或真核宿主细胞中表达本发明的抗 体，但是在真核细胞中表达是优选的，最优选在哺乳动物宿主细胞中表 达抗体，因为这样的真核细胞(特别是哺乳动物细胞)比原核细胞更有 可能装配和分泌适当地折叠并具有免疫活性的抗体。
用于表达本发明的重组抗体的优选的哺乳动物宿主细胞包括中国 仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)(包括dhfr-CHO细胞，描述于Urlaub和 Chasin，(1980)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216-4220，与 DHFR选择标记物一起使用，例如，如R.J.Kaufman和P.A.Sharp (1982)Mol.Biol.159：601-621)所述，NSO骨髓瘤细胞，COS细 胞和SP2细胞。当将编码抗体基因的重组表达载体导入哺乳动物宿主 细胞中时，通过将宿主细胞培养足以使抗体在宿主细胞中表达的时间 来制备抗体，或者，更优选地，抗体分泌到宿主细胞在其中生长的培养 基中。
利用标准蛋白质纯化技术从培养基中回收抗体。宿主细胞还可以 用来制备功能抗体片段，例如Fab片段或scFv分子。理解上述方法中 的变化在本发明的范围内。例如，可以预期用编码本发明的抗体的轻链 和/或重链的功能片段的来转染宿主细胞。还可以利用重组DNA技术 来去除对于与感兴趣的抗原结合不是必需的编码轻链和重链之一的 DNA的一些或部分。这样截短的DNA分子表达的分子也包括在本发明 的抗体内。另外，可以制备双功能抗体，其中一个重链和一个轻链是本 发明的抗体，而另一个重链和轻链对于感兴趣的抗原之外的抗原是特 异性的，通过标准化学交联方法使本发明的抗体与第二抗体交联。
在本发明抗体或抗原-结合部分的重组表达的优选系统中，通过磷 酸钙介导的转染，将编码抗体重链和抗体轻链的重组表达载体导入 dhfr-CHO细胞。在重组表达载体中，抗体重链和轻链基因各自操作连 接于CMV增强子/AdMLP启动子调控元件，驱动高水平基因转录。重组 表达载体还带有DHFR基因，其用于使用甲氨喋呤筛选/扩增用载体转 染的CHO细胞的筛选。培养选择的转化子宿主细胞让它表达抗体重链 和轻链，并且从培养基回收完整抗体。利用标准分子生物技术来制备 重组表达载体，转染宿主细胞，选择转化子，培养宿主细胞，并且从培养 基回收抗体。本发明还提供通过在合适的培养基中培养本发明的宿主 细胞直到合成本发明的重组抗体来合成本发明的重组抗体的方法。该 方法进一步包括从培养基分离重组抗体。
表1是本发明优选的抗-hIL-18抗体的VH和VL区的氨基酸序列 的表。在VH区中，氨基末端(N-末端)的位置1中天然存在的氨基酸 是谷氨酸(E)或谷氨酰(Q)。但是，为了在包括VH区的蛋白质的大规 模生产中产生带有同源N-末端的重组蛋白质，N-末端的位置1优选谷 氨酸(E)。
表1  VH和VL区的氨基酸序列列表   蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VH 2.5(E)               SEQ ID NO.：6         EVQLVQSGTEVKKPGESLKI   SCKGSGYTVTSYWIGWVRQM   PGKGLEWMGFIYPGDSETRY   SPTFQGQVTISADKSFNTAF   LQWSSLKASDTAMYYCARVG   SGWYPYTFDIWGQGTMVTVS   S   VH 2.5 CDR-H1   SEQ ID NO.：6的残基31-35   SYWIG   VH 2.5 CDR-H2   SEQ ID NO.：6的残基50-66   FIYPGDSETRYSPTFQG   VH 2.5 CDR-H3   SEQ ID NO.：6的残基99-110   VGSGWYPYTFDI           VL 2.5(E)               SEQ ID NO.：7       EIVMTQSPATLSVSPGERAT   LSCRASESISSNLAWYQQKP   GQAPRLFIYTASTRATDIPA   RFSGSGSGTEFTLTISSLQS     EDFAVYYCQQYNNWPSITFG   QGTRLEIKR
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区   VL 2.5 CDR-L1   SEQ ID NO.：7的残基24-34   RASESISSNLA   VL 2.5 CDR-L2   SEQ ID NO.：7的残基50-56   TASTRAT   VL 2.5 CDR-L3   SEQ ID NO.：7的残基89-98   QQYNNWPSIT         VH 2.13               SEQ ID NO.：8         QVQLQESGPGLVTPSQTLSL   TCTVSGGSISSGGHYWTWIR   QHPGKGLEWIGYIYYSGSTY   YNPSLKSRLTISVDTSKNQF   SLKLSSVAAADTAVYYCARD   RGGSGSYWDYWGQGTLVTVS   S   VH 2.13 CDR-H1   SEQ ID NO.：8的残基31-37   SGGHYWT   VH 2.13 CDR-H2   SEQ ID NO.：8的残基52-67   YIYYSGSTYYNPSLKS   VH 2.13 CDR-H3   SEQ ID NO.：8的残基100-110   DRGGSGSYWDY         VL 2.13             SEQ ID NO.：9       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRGSRSVSSGYLAWYQQK   PGQAPRLLIYGVSIRATGIP   DRFSGSGSGTDFTLTISRLE   PEDFAVYYCQQYHGSPLTFG   GGTKVEIKR   VL 2.13 CDR-L1   SEQ ID NO.：9的残基24-35   RGSRSVSSGYLA   VL 2.13 CDR-L2   SEQ ID NO.：9的残基21-27   GVSIRAT   VL 2.13 CDR-L3   SEQ ID NO.：9的残基90-98   QQYHGSPLT           VH 2.3         SEQ ID NO.：10       QVQLQESGPGLVKPSETLSL   TCTVSGGSIRNYYWSWIRQP   PGKGLEWVGYIYSSGSTNYN   PSLKSRVTISVDTSKNQFSL   KLSSVTAADTAVYYCARDRG   GASFFDYWGQGTLVTVSS   VH 2.3 CDR-H1   SEQ ID NO.：10的残基31-35   NYYWS   VH 2.3 CDR-H2   SEQ ID NO.：10的残基50-65   YIYSSGSTNYNPSLKS   VH 2.3 CDR-H3   SEQ ID NO.：10的残基98-107   DRGGASFFDY         VL 2.3             SEQ ID NO.：11       DIQMTQSPSSLSASIGDRVT   ITCRASQIIGGYLNWYQQRP   GKAPKFLIYSTSILQSGVPS   RFSGSGSGTDFTLTISSLQP   EDFATYYCQQTYITPPTFGP   GTKVDIKR   VL 2.3 CDR-L1   SEQ ID NO.：11的残基24-34   RASQIIGGYLN   VL 2.3 CDR-L2   SEQ ID NO.：11的残基50-56   STSILQS   VL 2.3 CDR-L3   SEQ ID NO.：11的残基89-97   QQTYITPPT         VH 215             SEQ ID NO.：12       QVQLQESGPGLVKPSQTLSL   TCTVSGGSINSGDYYWSWIR   QHPGKGLEWIGHISYRGTTY   YNPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAVYCCARD   RGGGFFDLWGRGTLVTVSS   VH 215 CDR-H1   SEQ ID NO.：12的残基31-37   SGDYYWS   VH 215 CDR-H2   SEQ ID NO.：12的残基52-67   HISYRGTTYYNPSLKS   VH 215 CDR-H3   SEQ ID NO.：12的残基100-108   DRGGGFFDL
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VL 215             SEQ ID NO.：13       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASRSLSSGYLAWYQQK   PGQAPRLLIYGASIRATGIP   DRFSGSGSATDFTLTISRLE   PEDFAVYYCQQYNYSPLTFG   GGTRVEINR   VL 215 CDR-L1   SEQ ID NO.：13的残基24-35   RASRSLSSGYLA   VL 215 CDR-L2   SEQ ID NO.：13的残基51-57   GASIRAT   VL 215 CDR-L3   SEQ ID NO.：13的残基90-98   QQYNYSPLT         VH 231               SEQ ID NO.：14         EVQLVESGGGSVQPRGSLRL   SCAASGFTFSSYSMNWVRQA   PGKGLEWVSYFSSSGGIIYY   ADSVKGRFTISRDNAKNSLY   LQMNSLRDEDTAVYYCARDD   SSGYYPYFFDYWGQGTLVTV   SS   VH 231 CDR-H1   SEQ ID NO.：14的残基31-35   SYSMN   VH 231 CDR-H2   SEQ ID NO.：14的残基50-66   YFSSSGGIIYYADSVKG   VH 231 CDR-H3   SEQ ID NO.：14的残基99-111   DDSSGYYPYFFDY         VL 231             SEQ ID NO.：15       DIVMTQSPDSLAVSLGERAT   INCKSSQTVLYRSNNKNYLA   WYQQKSGQPPKLLIYWASTR   ESGVPDRFSGSGSGTDFTLT   ISSLQAEDVAVYYCQQYYST   PLTFGGGTKVEIKR   VL 231 CDR-L1   SEQ ID NO.：15的残基24-40   KSSQTVLYRSNNKNYLA   VL 231 CDR-L2   SEQ ID NO.：15的残基56-62   WASTRES   VL 231 CDR-L3   SEQ ID NO.：15的残基95-103   QQYYSTPLT         VH 251             SEQ ID NO.：16       QLQLQESGPGLVKPSETLSL   TCTVSGGSISSRVYYWGWIR   QPPGKGLEWIGSIYYSGSTY   YNPSLKSRVTISVDASKNQF   SLKLSSVTAADTAIYYCARE   DSSAWVFEHWGQGTLVTVSS   VH 251 CDR-H1   SEQ ID NO.：16的残基31-37   SRVYYWG   VH 251 CDR-H2   SEQ ID NO.：16的残基52-67   SIYYSGSTYYNPSLKS   VH 251 CDR-H3   SEQ ID NO.：16的残基100-109   EDSSAWVFEH           VL 251               SEQ ID NO.：17       EIVLTQSPDTLSLSPGERAT   LSCRASHILSRNYLAWYQQK   PGQAPRLLMYGISIRATGIP   DRFSGSGSGADFTLTINRLE     PEDFAVYYCQHYDNSLCSFG   QGTKLEVKR   VL 251 CDR-L1   SEQ ID NO.：17的残基24-35   RASHILSRNYLA   VL 251 CDR-L2   SEQ ID NO.：17的残基51-57   GISIRAT   VL 251 CDR-L3   SEQ ID NO.：17的残基90-98   QHYDNSLCS
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VH 268             SEQ ID NO.：18       QVQLVESGGGVVQPGRSLRL   SCAASGFTFRNYGLHWVRQA   PGKGLEWVAVIWYDGSNKYY   ADSVKGRFTISRDNSKNTLY   LQMNSLRAEDTAVYYCARES   YYYYGMDVWGQGTTVTVSS   VH 268 CDR-H1   SEQ ID NO.：18的残基31-35   NYGLH   VH 268 CDR-H2   SEQ ID NO.：18的残基20-26   VIWYDGSNKYYADSVKG   VH 268 CDR-H3   SEQ ID NO.：18的残基99-108   ESYYYYGMDV           VL 268               SEQ ID NO.：19       EIVMTQSPATLSVSPGERAT   LSCRASQSFNSNLVWYQQKP   GQAPRLLIYGASTRATGIPA   RFSGSGSGTEFTLTISSLQS     EDFAVYYCQQYNNWTWTFGQ   GTKVEIKR   VL 268 CDR-L1   SEQ ID NO.：19的残基24-34   RASQSFNSNLV   VL 268 CDR-L2   SEQ ID NO.：19的残基50-56   GASTRAT   VL 268 CDR-L3   SEQ ID NO.：19的残基89-97   QQYNNWTWT         VH 336             SEQ ID NO.：20       QVQLQESGPGLVKPSQTLSL   TCTVSGGSINSGDYYWSWIR   QHPGKGLEWIGHISYRGTTY   YNPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAVYCCARD   RGGGFFDLWGRGTLVTVSS   VH 336 CDR-H1   SEQ ID NO.：20的残基31-35   SGDYYWS   VH 336 CDR-H2   SEQ ID NO.：20的残基52-67   HISYRGTTYYNPSLKS   VH 336 CDR-H3   SEQ ID NO.：20的残基100-108   DRGGGFFDL           VL 336               SEQ ID NO.：21       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQSVSSGYLAWYQQK   PGQAPRLLIYGASIRATGIP   DRFSGSGSATDFTLTISRLE     PEDFAVYYCQQYGYSPLTFG   GGTRVEINR   VL 336 CDR-L1   SEQ ID NO.：21的残基24-35   RASQSVSSGYLA   VL 336 CDR-L2   SEQ ID NO.：21的残基51-57   GASIRAT   VL 336 CDR-L3   SEQ ID NO.：21的残基90-98   QQYGYSPLT           VH 351                 SEQ ID NO.：22         QVQLVESGGGVVQPGRSLRL   SCAASGFTFSHYGMHWVRQA   PGKGLEWVAVISYDGRNKYY   VDSVKGRFTISRDNSKNTLY     LQMNSLRAEDTAVFYCAREK   GGSGWPPFYYYYGMDVWGQG   TTVTVSS   VH 351 CDR-H1   SEQ ID NO.：22的残基31-35   HYGMH   VH 351 CDR-H2   SEQ ID NO.：22的残基50-66   VISYDGRNKYYVDSVKG   VH 351 CDR-H3   SEQ ID NO.：22的残基99-116   EKGGSGWPPFYYYYGMDV
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VL 351             SEQ ID NO.：23       DIVMTQTPLSLSVTPGQPAS   ISCKSSQNLLYSDGETYLCW   YLQKPGQPPQLLIYEVSNRF   SGVPERFSGSGSGTDFTLKI   SRVEAEDVGIYYCMQNVQLP   LTFGGGTRVEIKR   VL 351 CDR-L1   SEQ ID NO.：23的残基24-39   KSSQNLLYSDGETYLC   VL 351 CDR-L2   SEQ ID NO.：23的残基55-61   EVSNRFS   VL 351 CDR-L3   SEQ ID NO.：23的残基94-102   MQNVQLPLT         VH 413             SEQ ID NO.：24       QTQLQESGPGLVKPSETLSL   TCTVSGGSISSRVYYWGWIR   QPPGKGLEWIGSIYYSGSTY   YSPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAIYYCARE   DSSAWVFEHWGQGTLVTVSS   VH 413 CDR-H1   SEQ ID NO.：24的残基31-37   SRVYYWG   VH 413 CDR-H2   SEQ ID NO.：24的残基52-67   SIYYSGSTYYSPSLKS   VH 413 CDR-H3   SEQ ID NO.：24的残基100-109   EDSSAWVFEH           VL 413               SEQ ID NO.：25       EIVLTQSPDTLSLSPGERAT   LSCRASQILSRNYLAWYQQK   PGQAPRLLIYGISIRATGIP   DRFSGSGSGADFTLTINRLE     PEDFAVYYCQHYDNSLCSFG   QGTKLEVKR   VL 413 CDR-L1   SEQ ID NO.：25的残基24-35   RASQILSRNYLA   VL 413 CDR-L2   SEQ ID NO.：25的残基51-57   GISIRAT   VL 413 CDR-L3   SEQ ID NO.：25的残基90-98   QHYDNSLCS         VH 435             SEQ ID NO.：26       QLQLQESGPGLVKPSETLSL   TCTVSGGSIDSRIYYWGWIR   QPPGKGLEWIGSIYYRGSTY   YNPSLKSRVTISVDTPKNQF   SLKLNSVTAADTAVYYCARE   DSSAWVFDYWGQGTLATVSS   VH 435 CDR-H1   SEQ ID NO.：26的残基31-37   SRIYYWG   VH 435 CDR-H2   SEQ ID NO.：26的残基51-67   SIYYRGSTYYNPSLKS   VH 435 CDR-H3   SEQ ID NO.：26的残基100-109   EDSSAWVFDY         VL 435             SEQ ID NO.：27       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQSVRNNYLNWYQQK   PGQAPRLLIYGAFSRATGIP   DRFSGSGSGTDFTLTISSLE   PEDFVVYYCQQYGNSIDSFG   QGTKLEINR   VL 435 CDR-L1   SEQ ID NO.：27的残基24-35   RASQSVRNNYLN   VL 435 CDR-L2   SEQ ID NO.：27的残基51-57   GAFSRAT   VL 435 CDR-L3   SEQ ID NO.：27的残基90-98   QYGNSIDS
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VH 444             SEQ ID NO.：28       QVQLQESGPGLVKPSQTLSL   TCTVSGGSINSGDYYWSYIR   QHPGKGLEWIGHISYRGTTY   YNPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAVYCCARD   RGGGFFDLWGRGTLVTVSS   VH 444 CDR-H1   SEQ ID NO.：28的残基31-37   SGDYYWS   VH 444 CDR-H2   SEQ ID NO.：28的残基52-67   HISYRGTTYYNPSLKS   VH 444 CDR-H3   SEQ ID NO.：28的残基100-108   DRGGGFFDL           VL 444               SEQ ID NO.：29       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQSVSSGYLAWYQRK   PGQAPRLLIYGTSIRATGIP   DRFSGSGSATDFTLSISRLG     PEDFAVYYCQQYGYSPLTFG   GGTRVEINR   VL 444 CDR-L1   SEQ ID NO.：29的残基24-35   RASQSVSSGYLA   VL 444 CDR-L2   SEQ ID NO.：29的残基51-57   GTSIRAT   VL 444 CDR-L3   SEQ ID NO.：29的残基90-98   QQYGYSPLT         VH 478             SEQ ID NO.：30       QVQLQESGPGLVKPSQTLSL   TCTVSGGSISSGGHYWSWIR   QHPGKGLEWIGYIYYSGSTH   YNPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLRSVSAADTAGYYCASL   YNGNGYFDLWGRGTLVTVSS   VH 478 CDR-H1   SEQ ID NO.：30的残基31-37   SGGHYWS   VH 478 CDR-H2   SEQ ID NO.：30的残基52-67   YIYYSGSTHYNPSLKS   VH 478 CDR-H3   SEQ ID NO.：30的残基99-109   SLYNGNGYFDL           VL 478               SEQ ID NO.：31       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQSISSGYLAWYQQK   PGQAPRLIIYGVSRRATGIP   DRFSGSGSGADFTLTISRLD     PEDFVVYYCQQYGFSPLTFG   GGTKVEIKR   VL 478 CDR-L1   SEQ ID NO.：31的残基24-35   RASQSISSGYLA   VL 478 CDR-L2   SEQ ID NO.：31的残基51-57   GVSRRAT   VL 478 CDR-L3   SEQ ID NO.：31的残基90-98   QQYGFSPLT         VH 521             SEQ ID NO.：32       QLQLQESGPGLVKPSETLSL   TCTVSGGSISRSYDYWGWIR   QPPGKGLEWIGSIYYRGSTY   YNPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAVYYCARE   YSTTWSIDYWGQGTLVTVSS   VH 521 CDR-H1   SEQ ID NO.：32的残基31-37   RSYDYWG   VH 521 CDR-H2   SEQ ID NO.：32的残基52-67   SIYYRGSTYYNPSLKS   VH 521 CDR-H3   SEQ ID NO.：32的残基100-109   EYSTTWSIDY
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VL 521             SEQ ID NO.：33       ENVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQSIRNNYLAWYQQK   PGQAPRLLIHGASSRATGIP   DRFGGSGSGTDFTLTISRLE   PEDFAVYFCQQYGNSIITFG   PGTKVDVNR   VL 521 CDR-L1   SEQ ID NO.：33的残基24-35   RASQSIRNNYLA   VL 521 CDR-L2   SEQ ID NO.：33的残基51-57   GASSRAT   VL 521 CDR-L3   SEQ ID NO.：33的残基90-98   QQYGNSIIT         VH 550             SEQ ID NO.：34       QVQLQESGPGLVKPSQTLSL   TCTVSGGSINSGGYYWSWIR   QHPGKGLEWIGHISYRGTTY   SNPSLKSRVTISVDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAVYYCARD   RGGGFFDLWGRGTLVTVSS   VH 550 CDR-H1   SEQ ID NO.：34的残基31-37   SGGYYWS   VH 550 CDR-H2   SEQ ID NO.：34的残基52-67   HISYRGTTYSNPSLKS   VH 550 CDR-H3   SEQ ID NO.：34的残基100-108   DRGGGFFDL           VL 550               SEQ ID NO.：35       EIVLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQSVNSGYLAWYQQK   PGQAPRLLIYGVSIRATDIP   DRFSGSGSATDFTLTISRLE     PEDFAVYYCQQYGFSPLTFG   GGTRVEINR   VL 550 CDR-L1   SEQ ID NO.：35的残基24-35   RASQSVNSGYLA   VL 550 CDR-L2   SEQ ID NO.：35的残基51-57   GVSIRAT   VL 550 CDR-L3   SEQ ID NO.：35的残基90-98   QQYGFSPLT         VH 581               SEQ ID NO.：36         QVQLVESGGGVVQPGRSLRL   SCAASGFTFSHCGMHWVRQA   PGKGLEWVAVISYDGSNKYY   ADSVKGRFTISRDNSKNTLY   LQMNSLRAEDTAVYYCAKDH   GGSGSPPFYYYYGMDVWGQG   TTVTVSS   VH 581 CDR-H1   SEQ ID NO.：36的残基31-35   HCGMH   VH 581 CDR-H2   SEQ ID NO.：36的残基50-66   VISYDGSNKYYADSVKG   VH 581 CDR-H3   SEQ ID NO.：36的残基99-116   DHGGSGSPPFYYYYGMDV           VL 581               SEQ ID NO.：37       DILMTQTPLSLSVTPGQPAS   ISCKSSQSLLHGDGKTYLYW   YLQKPGQPPQFLIQELSNRF   SGVPDRFSGSGSGTDFTLKI       SRXEAEDVGVYYCMQSLQLP   LTFGGGTKVQIKR   VL 581 CDR-L1   SEQ ID NO.：37的残基24-39   KSSQSLLHGDGKTYLY   VL 581 CDR-L2   SEQ ID NO.：37的残基55-61   ELSNRFS   VL 581 CDR-L3   SEQ ID NO.：37的残基94-102   MQSLQLPLT
  蛋白质   序列标识   序列   12345678901234567890   蛋白质区         VH 7.5             SEQ ID NO.：38       QVQLVESGGGVVQPGRSLRL   SCAASGFTFSYYGMHWVRQA   PGKGLEWVAVIWYDGRNKYY   ADSVKGRVTISRDNSKKTLY   LQMNSLRAEDTAVYYCAREG   GYYYGMDVWGQGTTVTVSS   VH 7.5 CDR-H1   SEQ ID NO.：38的残基31-35   YYGMH   VH 7.5 CDR-H2   SEQ ID NO.：38的残基50-66   VIWYDGRNKYYADSVKG   VH 7.5 CDR-H3   SEQ ID NO.：38的残基99-108   EGGYYYGMDV         VL 7.5             SEQ ID NO.：39       EILLTQSPGTLSLSPGERAT   LSCRASQNVSSSYLAWYQQN   PGQAPRLLIYGASSRATGIP   DRFSGSGSGTDFTLTISRLE   PEDFEVYYCQQSGSSLFTFG   PGTKVDIKR   VL 7.5 CDR-L1   SEQ ID NO.：39的残基24-35   RASQNVSSSYLA   VL 7.5 CDR-L2   SEQ ID NO.：39的残基51-57   GASSRAT   VL 7.5 CDR-L3   SEQ ID NO.：39的残基90-98   QQSGSSLFT         VH 2.11             SEQ ID NO.：40       QVQLQESGPGLVKPSQTLSL   TCTVSGGSIRSGDHYWTWIR   QHPGKGLEWIGHIYYSGSTY   YNPSLKSRLTISIDTSKNQF   SLKLSSVTAADTAVYYCARD   YGGNGYFDYWGQGTLVTVSS   VH 2.11 CDR-H1   SEQ ID NO.：40的残基31-37   SGDHYWT   VH 2.11 CDR-H2   SEQ ID NO.：40的残基52-67   HIYYSGSTYYNPSLKS   VH 2.11 CDR-H3   SEQ ID NO.：40的残基97-109   CARDYGGNGYFDY           VL 2.11               SEQ ID NO.：41       DIVMTQTPLSLPVTPGEPAS   ISCRSSQSLLDSDDGNTYLD   WYLQKPGQSPQLLIYTLSYR   ASGVPDRFSGSGSGTDFTLN     ISRVEAEDVGVYYCMQRIEF   PITFGQGTRLEIKR   VL 2.11 CDR-L1   SEQ ID NO.：41的残基24-40   RSSQSLLDSDDGNTYLD   VL 2.11 CDR-L2   SEQ ID NO.：41的残基56-62   TLSYRAS   VL 2.11 CDR-L3   SEQ ID NO.：41的残基95-103   MQRIEFPIT
上面分离的抗-IL-18抗体CDR序列确立了根据本发明分离的并且 包括下面表2列出的CDR序列的多肽的IL-18结合蛋白的新家族。为 了制备和选择具有优选IL-18结合和/或中和活性的本发明的CDR，可 以使用本领域公知的标准方法来制备本发明的结合蛋白并且评价那些 结合蛋白的IL-18结合和/或中和特征，包括但不限于这里具体描述 的那些。
表2：共有IL-18 CDR亲和配体(下面列出每个氨基酸位置可供选 择的残基；-表示残基可以不存在)。   CDR   区   序列   标识   共有序列     CDR-H1                 SEQ ID   NO.：42               X1X2X3X4X5X6X7   S  Y   W  I  G   -  -   N  G   G  H  Y   W  T   H  R   Y  W  S      S   R  S   D  Y  N      G   Y  C   S  M  H      V   L      I   D   CDR-H2               SEQ ID   NO.：43             X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17   F  I   Y  P  G   D  S   E  T  R   Y   S   P   T   F   Q   -   Y  F   S  Y  S   G  T   T  Y  Y   N   P   S   L   K   S   G   H      W  S  R      G   I  N  S   S   A   D   S   V   K   S            D      R   N  I          V   V                          K                              H   CDR-H3                     SEQ ID   NO.：44                   X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17X18   V  G   S  G   W  Y  P  Y   T  -   -   -   -   -   -   -   -   -   D  R   G  S   S  G  S  F   W  F   D   I   Y   Y   G   M   D   V   E  D   Y  Y   A  S  F  D   D  D   Y   D   S  S   R  N   G  F  Y  P   L  Y   F   Y   C  K      T   Y  W  V  M   Y  H   L      L      D   T  N  G  I   E  V      Y                W  N   P  Y      A                V      F                              G   CDR-L1                 SEQ ID   NO.：45               X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10X11X12X13X14X15X16X17   R  A   S  E   S  I  S   S  N  L   A   -   -   -   -   -   -   K  G      R   I  V  G   G  G  Y   L   A   K   N   Y   L   A      S      Q   T  L  L   Y  Y  S   N   N   T   Y   L   C   D             H   N  F  N   R  R  D   V   E   N   T       Y                       R   N  S      G   K                           H         D   G                           D   CDR-L2               SEQ ID   NO.：46             X1X2X3X4X5X6X7   T  A   S  T  R   A  T   G  V   F  I  L   Q  S   S  T      N      E   W  I      S      F   E  L      R             Y   CDR-L3                   SEQ ID   NO.：47                 X1X2X3X4X5X6X7X8X9X10   Q  Q   Y  N   N  W  P   S  -  -   M  H   N  H   G  S  L   L  I  T      Y   G  Y   I  T  T   P  T          S  D   Y  L  D   C  S          R  G   S  I  I   W             V   Q  F      I             L   F         F             I   E
D.抗-IL-18抗体的应用
由于它们与人IL-18结合的能力，本发明的抗-人IL-18抗体，或者 其部分能用来检测人IL-18(例如，生物样品中的，例如血清或血浆)， 利用常规的免疫分析，例如常用的酶联免疫吸着测定法(ELISA)，放射 免疫测定法(RIA)或组织免疫组织化学法。本发明提供检测生物样品中 人IL-18的方法，包括使生物样品接触本发明的抗体或抗体部分，并 且检测与IL-18结合的抗体(或抗体部分)或没有结合的抗体(或抗 体部分)，从而检测生物样品中的人IL-18。用可检测物质直接或间 接标记抗体有利于结合或没有结合的抗体的检测。合适的可检测物质 包括各种酶，非朊基基团，荧光材料，发光材料和放射性材料。合适 的酶的例子包括辣根过氧化物酶，碱性磷酸酶，β-半乳糖苷酶或乙酰 胆碱酯酶；合适的非朊基基团复合体的例子包括链霉抗生物素蛋白/生 物素和抗生物素蛋白/生物素；合适的荧光材料的例子包括7-羟基香 豆素，荧光素，荧光素异硫代氰酸酯，罗丹明，二氯三嗪基胺荧光素，丹 磺酰氯或藻红蛋白；发光材料的例子包括鲁米诺；合适的放射性材料的 例子包括3H，14C，35S，90Y，99Tc，111In，125I，131I，177Lu，166Ho，或153Sm。
供标记抗体可选择的，通过使用用可检测物质标记的hIL-18标准 物和没有标记的抗-人IL-18抗体的竞争免疫测定能测定生物液体中 的人IL-18。在该项分析中，生物样品，标记的rhIL-18标准物和抗- 人IL-18抗体合并，并且测定与没有标记的抗体结合的标记的rhIL- 18标准物的量。样品中，人IL-18的量与和抗-人IL-18抗体结合的 标记的rhIL-18标准物的量成反比。
本发明的抗体和抗体部分优选能体外和体内中和人IL-18活性。 因此，例如，在含有hIL-18的细胞培养物中，在IL-18与本发明的抗 体有交叉反应的人受治疗者中或者其他哺乳动物受治疗者中，这样的 本发明的抗体和抗体部分能用来抑制hIL-18活性。在一个实施方案中， 本发明提供抑制IL-18活性的方法，包括使IL-18接触本发明的抗体 或抗体部分，使得IL-18活性被抑制。优选地，IL-18是人IL-18。例 如，在含有或怀疑含有hIL-18的细胞培养物中，向培养基加入本发明 的抗体或抗体部分，抑制培养物中的hIL-18活性。
在另一个实施方案中，本发明提供减小受治疗者IL-18活性的方法， 有利地对患有其中IL-18活性是有害的疾病或病症的患者减小IL-18 活性。本发明提供对患有这样的疾病或病症的患者减小IL-18活性的 方法，该方法包括对受治疗者施用本发明的抗体或抗体部分，使得患者 体内IL-18活性被减小。
优选地，IL-18是人IL-18并且受治疗者是人受治疗者。或者， 受试者可以是表达能结合本发明的抗体的IL-18的哺乳动物。还有， 受治疗者还可以是导入了hIL-18的哺乳动物(例如，通过施用hIL-18 或者通过hIL-18转基因的表达)。为了治疗目的，可以对人受治疗者 施用本发明的抗体。此外，为了兽医的目的或者作为人疾病的动物模 型，能对表达IL-18的非人哺乳动物施用本发明的抗体，其中抗体能 结合。关于后一种情况，这样的动物模型对于评价本发明的抗体的治疗 功效是有用的(例如，剂量试验和给药持续时间)。
如这里使用的，术语″其中IL-18活性是有害的疾病″意在包括其 中已经确诊患有疾病的患者体内存在IL-18是或者怀疑是疾病病理原 因或者使疾病恶化原因的因素的疾病或其他病症。因此，其中IL-18 活性是有害的疾病是其中预期IL-18活性的减小减轻疾病的症状和/ 或进展的疾病。患有疾病的患者的生物液体中IL-18浓度的增加可以 证实这种疾病(例如，患者的血清，血浆，滑液等中IL-18浓度的增加)， 利用例如上述抗-IL-18抗体能检测。能使用本发明的抗体治疗的疾病 的非限制性例子包括下面涉及本发明的抗体的药物组合物的章节中讨 论的那些疾病。
D.药物组合物
本发明还提供含有本发明的抗体或其抗原-结合部分和药学可接 受载体的药物组合物。在一个实施方案中，药物组合物进一步含有至 少一种用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病另外的治疗药物。
本发明的抗体和抗体部分能被掺入适合对患者给药的药物组合物 中。典型地，药物组合物含有本发明的抗体或抗体部分和药学可接受 载体。这里使用的，″药学可接受载体″包括生理相容的任何和所有溶 剂，分散介质，抗细菌剂和抗真菌剂，等张剂和吸收延迟剂等。药学可 接受载体的例子包括下面的一种或几种：水，盐水，磷酸盐缓冲盐水， 葡萄糖，甘油，乙醇等，以及它们的组合。很多情况下，组合物中优 选含有等张剂，例如糖，多元醇，例如甘露糖醇，山梨醇或氯化钠。 药学可接受载体还包括少量辅助物质，例如湿润剂或乳化剂，防腐剂 或缓冲液，它们提高抗体或抗体部分的贮存期或效率。
本发明的抗体和抗体部分能被掺入适合肠胃外给药的药物组合物 中。优选地，抗体或抗体-部分制备成含有0.1-250毫克/毫升抗体 的注射液。注射液包括硬质或琥珀小瓶，安瓿或预先装填的注射器中 的液体或冻干剂型。缓冲剂可以是L-组氨酸(1-50mM)，最佳5-10mM， pH 5.0质7.0(最佳pH 6.0)。合适的缓冲剂包括但不限于，琥珀酸钠， 柠檬酸钠，磷酸钠或磷酸钾。可以用氯化钠来改变0-300mM(对于液 体剂型最佳150mM)浓度的溶液的毒性。冻干剂型可以含有抗冻剂， 主要是0-10％蔗糖(最佳0.5-1.0％)。其他合适的抗冻剂包括海藻糖和 乳糖。冻干剂型可以含有膨胀剂，主要是1-10％甘露糖醇(最佳2- 4％)。液体和冻干剂型可以含有稳定剂，主要是1-50mM L-甲硫氨酸(最 佳5-10mM)。其他合适的膨胀剂包括甘氨酸，精氨酸，可以含有0-0.05％ 吐温-80(最佳0.005-0.01％)。另外的表面活性剂包括但不限于吐温 20和BRIJ表面活性剂。
本发明的组合物可以是各种各样的剂型。这些包括，例如，液体， 半固体和固体剂型，例如溶液(例如，注射液和灌注液)，分散剂或悬浮 剂，片剂，丸剂，粉末剂，脂质体和栓剂。优选剂型取决于想要的给药 方式和治疗应用。典型优选组合物是注射液或灌注液，例如与用其他 抗体对人被动免疫使用的那些相似的组合物。优选的给药方式是肠胃 外(例如，静脉内，皮下，腹膜内，肌内)。在优选的实施方案中，通过 静脉内灌注或注射施用抗体。在另一个优选的实施方案中，通过肌内或 皮下施用抗体。
治疗性组合物一般必须是灭菌的并且在制备和贮存条件下是稳定 的。组合物可以配制成溶液，微乳剂，分散剂，脂质体，或者适合高药 物浓度的其他有序结构。通过将活性化合物(即抗体或抗体部分)与 上面例举的成分的一种或组合一起掺入需要量的合适的溶剂，如果需 要，接着无菌过滤，能制备灭菌注射液。一般情况下，通过将活性成分 掺入到含有基本分散基质和上面例举的那些的其他成分的无菌赋形剂 中来制备分散剂。在无菌情况下，无菌注射液制剂的冻干粉末剂，制剂 的优选方法是真空干燥和喷雾干燥，得到活性成分加预先灭菌过滤的 溶液的任何附加期望的成分的粉末剂。例如，通过使用包衣例如卵磷 脂，通过在分散剂情况下保持要求的粒度和通过使用表面活性剂，能 保持溶液的合适的流动性。通过组合物中含有延迟吸收的物质，例如 一硬脂酸盐和明胶，能使可注射组合物延续吸收。
通过本领域公知的各种方法能施用本发明的抗体和抗体-部分，但 是对于很多治疗性应用，优选的给药途径/方式是皮下注射，静脉内注 射或输液。如本领域技术人员明白的，给药途径/方式根据预期结果 而不同。在一些实施方案中，使用保护化合物抗快速释放的载体可以制 备活性化合物制剂，例如控制释放制剂，包括植入物，透皮贴，和微胶 囊送药系统。可以使用可生物降解生物匹配聚合物，例如乙烯醋酸乙 烯酯，聚酐类，聚乙二醇酸，胶原，聚原酯，和聚乳酸。这样的制剂的 很多制备方法申请了专利或者一般为本领域技术人员公知的。参见， 例如，Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems， J.R.Robinson，编著，Marcel Dekker，Inc.，New York，1978。
在一些实施方案中，本发明的抗体或抗体部分可以例如和惰性稀 释剂或可同化可食用载体一起口服给药。化合物(如果期望，和其他 成分)还可以在硬或软外壳明胶胶囊中封闭，压制成片，或者直接掺到 患者的食物中。对于口服治疗给药，化合物可以与赋形剂混合并且以摄 食片剂，口腔片剂，锭剂，胶囊，酏剂，悬浮剂，糖浆，糯米纸囊剂 等剂型使用。对于通过肠胃外给药之外的本发明化合物的施用，必需用 防止它失活的材料将化合物包衣，或者与化合物共同给药。
还可以向组合物中掺入补充活性化合物。在一些实施方案中，本发 明的抗体或抗体部分与用于治疗其中IL-18活性是有害的疾病的一种 或几种另外的治疗药物共同配制和/或共同给药。例如，本发明的抗- hIL-18抗体或抗体部分可以与结合其他靶物的一种或几种另外的抗体 (例如，结合其他细胞因子或结合细胞表面分子的抗体)共同配制和/ 或共同给药。此外，本发明的一种或几种抗体可以与上述治疗药物的一 种或几种联合使用。这样的联合治疗可以有利地使用较低剂量的施用 的治疗药物，从而避免与各种单一治疗相关的可能的毒性或并发症。
在一些实施方案中，抗IL-18抗体或者其片段与本领域公知的半存 留期伸长赋形剂连接。这样的赋形剂包括但不限于，Fc结构域，聚乙二 醇，和葡萄糖。这样的赋形剂描述于，例如，美国申请顺序号No. 09/428,082和公开的PCT申请No.WO 99/25044，它们为了任何目 的在此引作参考。
在与各种涉及免疫和炎症元素的疾病相关的病理中，白介素18起 着关键作用。这些疾病包括但不限于：类风湿性关节炎，骨关节炎， 幼年型慢性关节炎，脓毒性关节炎，莱姆关节炎，银屑病关节炎，反 应性关节炎，和脓毒性关节炎，脊椎关节病，全身红斑狼疮，局限性 回肠炎，溃疡性结肠炎，肠炎，胰岛素依赖性糖尿病，甲状腺炎，哮 喘，变态反应疾病，牛皮癣，皮炎硬皮病，移植物抗宿主病，器官移 植排异，急性或慢性的与器官移植相关的免疫疾病，肉状瘤病，动脉粥 样硬化，传播性血管凝固，Kawapapki′s病，Grave′s病，肾病综合 征，慢性疲劳综合征，Wegener′s肉芽肿病，Henoch-Schoenlein紫 癜，肾微结节性脉管炎，慢性活性肝炎，眼色素层炎，脓毒性休克，中 毒休克综合征，脓毒症综合征，恶病质，传染病，由寄生虫引起的疾 病，后天免疫缺陷综合征，急性横向骨髓炎，Huntington′s舞蹈病， 帕金森病，早老性痴呆，中风，原发肝功能障碍引起的肝硬化，溶血 性贫血，恶性肿瘤，心脏衰竭，心肌梗塞，Addison′s病，散发性，I 型多腺缺乏和II型多腺缺乏，Schmidt′s综合征，成人(急性)呼吸抑 制综合征，脱发，脱发斑，血清反应阴性关节病，关节病，Reiter′s 病，牛皮癣关节病，溃疡性结肠关节病，肠滑膜炎，衣菌，鼠疫和沙 门氏菌相关关节病，脊椎关节病，动脉粥样化疾病/动脉硬化，特应性 变态反应，自身免疫大疱病，寻常性天疱疮，落叶性天疱疮，类天疱疮， 线性IgA病，自身免疫溶血性贫血，Coombs阳性溶血性贫血，后天性 恶性贫血，少年恶性贫血，肌痛性大脑炎/Royal Free病，慢性粘膜 皮肤念珠菌病，巨细胞关节炎，原发硬化肝炎，起因不明自身免疫肝 炎，后天性免疫缺陷病综合征，后天性免疫缺陷相关疾病，乙肝，丙肝， 普通各式各样的免疫缺陷(普通各式各样的血丙种球蛋白减少)，膨胀 心肌病，女性不孕症，卵巢衰竭，早产卵巢衰竭，纤维变性肺病，起因 不明的纤维组织形成牙槽炎，炎后间质肺病，间质局限性肺炎，与间质 肺病相关的缔结组织疾病，与肺病相关的混合缔结组织疾病，与间质 肺病相关的全身硬化，与间质肺病相关的类风湿性关节炎，与肺病相 关的全身红斑狼疮，与肺病相关的皮肤肌炎/多肌炎，与肺病相关的 Sjogren′s病，与肺病相关的僵硬脊椎炎，结节性脉管炎弥散肺病，与 肺病相关的含铁血黄素沉着病，药物引起的间质肺病，纤维化，辐射 纤维化，闭塞性毛细支气管炎，慢性嗜酸性肺炎，淋巴细胞浸润性肺 病，传染病后间质肺病，痛风关节炎，自身免疫肝炎，1-型自身免疫肝 炎(典型自身免疫或狼疮样肝炎)，2-型自身免疫肝炎(抗-LKM抗体肝 炎)，自身免疫介导的低血糖，B型胰岛素抗性微黑棘皮症，甲状旁腺 机能减退，与器官移植相关的急性免疫疾病，与器官移植相关的慢性免 疫疾病，骨关节炎，原发硬化胆管炎，1型牛皮癣，2型牛皮癣，自发性白 细胞减少，自身免疫中性白细胞减少，肾病NOS，肾小球肾炎，肾 microscopic vasulitis，莱姆病，盘形红斑狼疮，特发性男性不孕症 或NOS，精液自身免疫性，多发性硬化(所有亚型)，交感神经眼炎，缔 结组织疾病继发性高血压，Goodpasture′s综合征，结节性多动脉炎 肺动，急性风湿性发烧，类风湿性脊椎炎，Still′s病，全身硬 化，Sjogren′s综合征，Takayasu′s病/动脉炎，自身免疫血小板减少， 特发性血小板减少，自身免疫甲状腺病，甲状腺机能亢进，甲状腺肿自 身免疫甲状腺机能亢进(Hashimoto′s病)，萎缩性自身免疫甲状腺机 能亢进，原发性粘液水肿，晶体抗原性葡萄膜炎，原发性结节性脉管 炎，白癜风，急性肝病，慢性肝病，酒精性肝硬化，酒精引起的肝损伤， choleosatatis，特应性肝病，药物引起的肝炎，非酒精性脂肪性肝炎， 变应性变态反应和哮喘，B族链球菌(GBS)感染，精神病(例如，抑郁 症和精神分裂症)，Th2型和Th1型介导的疾病，急性和慢性疼痛(不 同疼痛类型)，和癌症，例如肺癌，乳房癌，胃癌，膀胱癌，结肠癌， 胰腺癌，卵巢癌，前列腺癌和直肠癌，和造血恶性肿瘤(白血病和淋巴 瘤)。本发明的人抗体和抗体部分能用来治疗患有自身免疫疾病的患 者，特别是与炎症相关的那些，包括类风湿性脊椎炎，变态反应，自 身免疫糖尿病，自身免疫葡萄膜炎。
优选地，本发明的抗体或者其抗原-结合部分被用来治疗类风湿性 关节炎，Crohn′s病，多发性硬化，胰岛素依赖型糖尿病，糖尿病和牛 皮癣。
本发明的抗体，或抗体部分还可以与用于治疗自身免疫和炎症疾 病的一种或几种治疗性药物一起给药。
本发明的抗体或者其抗原-结合部分可以单独使用或联合治疗这 样的疾病。应该明白本发明的抗体或者其抗原-结合部分可以单独使用 或与附加的药物例如治疗性药物联合，所述附加的药物由技术人员为 了想要的目的来选择。例如，附加的药物可以是本领域认为用于本发 明的抗体治疗的疾病或症状的治疗药物。附加药物也可以是对治疗组 合物有有益贡献的药物，例如，影响组合物粘度的药物。
还应该明白本发明所包括的联合是用于它们想要的目的的那些联 合。下面列出的药物是为了详细说明的目的而不是为了限制。作为本 发明一部分的联合治疗是本发明的抗体和至少一种选自下面列出的附 加药物。联合给药还可以包括一种以上的附加药物，例如两种或三种 附加药物，如果如此联合，则形成的组合物能实现它想要的功能。
优选的联合给药是非甾类抗炎药，也称作NSAIDS，包括象布洛芬 的药物。其他优选的联合给药是皮质类固醇，包括氢化泼尼松；当与本 发明的抗-IL-18抗体联合治疗患者时，通过减小甾类剂量能减小甚至 消除使用甾类的公知的副作用。本发明的抗体，或抗体部分可以与之 联合的用于类风湿性关节炎的治疗药物的非限制性例子包括下面的： 细胞因子抑制抗炎药物(CSAIDs)；其他细胞因子或生长因子的抗体 或拮抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6，IL-7， IL-8，IL-12，IL-15，IL-16，IL-21，IL-23，干扰素，EMAP-II，GM-CSF， FGF，和PDGF。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与细胞表面分子 的抗体联合，细胞表面分子例如CD2，CD3，CD4，CD8，CD25，CD28，CD30， CD40，CD45，CD69，CD80(B7.1)，CD86(B7.2)，CD90，CTLA或它 们的配体，包括CD154(gp39或CD40L)。
在自身免疫和接着的炎症级联中不同点，治疗药物优选的联合可 能干涉；优选的例子包括TNF拮抗剂，象嵌合，人源化或人TNF抗体， D2E7，(PCT公开No.WO97/29131)，CA2(RemicadeTM)，CDP 571，和 可溶性p55或p75TNF受体，其衍生物，(p75TNFRIgG(EnbrelTM)或 p55TNFRIgG(Lenercept)，还有TNFα转化酶(TACE)抑制剂；类似地， IL-1抑制剂(白介素-1-转化酶抑制剂，IL-1RA等)对于相同原因是 有效的。其他优选联合包括白介素。还有另一个优选联合是自身免疫 应答的其他关键起作用者，其作用平行于，依赖于或与IL-18功能一 致；特别优选的是IL-12拮抗剂包括IL-12抗体或可溶性IL-12受体， 或IL-12结合蛋白。已经证明IL-12和IL-18重叠但是功能不同，两 者的拮抗剂的联合可能最有效。还有另一个优选的联合是非耗尽抗- CD4抑制剂。还有其他优选的联合包括共同刺激途径CD80(B7.1)或 CD86(B7.2)的拮抗剂，包括抗体，可溶性受体或拮抗剂配体。
本发明的抗体，或其抗原结合部分还可以与下面的药物联合，例 如甲氨喋呤，6-MP，硫唑嘌呤，柳氮磺胺吡啶，美沙拉秦，奥沙拉秦， 氯化喹啉/羟氯喹，pencillamine，金硫丁二钠(肌内和口服)，硫唑嘌 呤，cochicine，皮质类固醇(口服，吸入和局部注射)，β-2腺受体激 动剂(沙丁胺醇，特布他林，沙美特洛)，黄嘌呤(茶叶碱，氨茶碱)， 色甘酸盐，萘多罗米，酮替芬，阿托品和溴乙东碱，环孢菌素，FK506， 瑞帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛米，NSAIDs，例如，布洛芬皮质类固醇， 例如，氢化泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓形成剂， 补体抑制剂，肾上腺素能剂，干扰通过促炎症细胞因子例如TNFα或 IL-1传导信号的药物(例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制 剂)，IL-1β转化酶抑制剂，TNFα转化酶(TACE)抑制剂，T-细胞信号传 导抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑 嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张肽转化酶抑制剂，可溶性细胞因子受体 和其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体和衍生物p75TNFRIgG (EnbrelTM H p55TNFRIgG(Lenercept))，sIL-1RI，sIL-1RII， sIL-6R)，抗炎细胞因子(例如，IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGF β)，塞来昔布，叶酸，羟氯喹硫酸盐，罗非克西，etanercept，英 夫单抗，萘普生，valdecoxib，柳氮磺胺吡啶，甲泼尼龙，美洛昔康， 甲泼尼龙乙酸盐，金硫丁二钠，阿司匹林，去炎松，待所利德，丙氧 芬，二硫硫胺/扑热息痛，叶酸盐，萘普酮，二氯酚酸钠，吡罗昔康，依 托度酸，双氯芬酸钠，丙嗪，氧可酮盐酸盐，氢可酮二酒石酸盐/ 扑热息痛，双氯芬酸钠/米索普特，芬太尼，anakinra，人重组体，曲 马朵盐酸盐，双水杨酯，舒林酸，维生素B12/脂肪酸/维生素B6，扑 热息痛，阿仑特罗钠，氢化泼尼松，硫酸吗啡，利多卡因盐酸盐，消 炎痛，硫酸葡萄糖胺/软骨素，盐酸阿米替林，磺胺嘧啶，盐酸氧可酮/ 扑热息痛，盐酸奥洛他定，米索普特，萘普生钠，奥美拉唑，环磷酰 胺，利妥希玛，IL-1 TRAP，MRA，CTLA4-IG，IL-18 BP，抗-IL-12，抗- IL15，BIRB-796，SCIO-469，VX-702，AMG-548，VX-740， Roflumilast，IC-485，CDC-801，和甲基氢化泼尼松。优选的联合包 括甲氨喋呤或来氟洛米，在中等或严重类风湿性关节炎情况下，环孢菌 素。
本发明的抗体，或抗体部分能与之联合一起治疗肠炎的治疗药物 的非限制性例子包括下面的：budenoside；表皮生长因子；环孢菌素， 柳氮磺胺吡啶；氨基水杨酸盐；6-巯基嘌呤；硫唑嘌呤；甲硝哒唑；脂 氧合酶抑制剂；美沙拉嗪；奥沙拉嗪；巴柳氮；抗氧化剂；血栓烷抑 制剂；IL-1受体拮抗剂；抗-IL-1β单克隆抗体；抗-IL-6单克隆抗体； 生长因子；弹性蛋白酶抑制剂；吡啶-咪唑化合物；其他人细胞因子或 生长因子的抗体或拮抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，L-2，IL-6，L-7，IL- 8，IL-12，IL-15，IL-16，EMAP-II，GM-CSF，FGF，和PDGF。本发明的 抗体或者其抗原结合部分能与细胞表面分子的抗体联合，例如CD2，CD3， CD4，CD8，CD25，CD28，CD 30，CD40，CD45，CD69，CD90或者它们 的配基。本发明的抗体或者其抗原结合部分还可以与药物联合，例如 与甲氨喋呤，环孢菌素，FK506，瑞帕霉素，霉酚酸酯，来氟洛 米，，NSAIDs，例如，布洛芬，皮质类固醇，例如氢化泼尼松，磷酸二酯 酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体抑制剂，肾上腺素能剂，干扰 促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导信号的药物(例如IRAK，NIK， IKK，p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β转化酶抑制剂，TNFα转化酶抑制 剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白酶抑制剂，柳 氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张肽转化酶抑制剂，可 溶性细胞因子受体和其衍生物(例如可溶性p55或p75TNF受体， sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)，抗炎细胞因子(例如，IL-4，IL- 10，IL-11，IL-13和TGFβ)。
本发明的抗体，或抗原结合部分能与之联合一起治疗Crohn′s病 的治疗药物的优选例子包括下面的：TNF拮抗剂，例如，抗-TNF抗体， D2E7(PCT公开No.WO97/29131；HUMIRA)，CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG(ENBREL)和p55TNFRIgG (LENERCEPT))抑制剂和PDE4抑制剂。本发明的抗体，或其抗原结合 部分能与皮质类固醇联合，例如budenoside和地塞米松。本发明的抗 体，或其抗原结合部分还可以与药物例如柳氮磺胺吡啶，5-氨基水杨 酸和奥沙拉嗪，和干扰炎性细胞因子例如IL-1的合成或作用的药物， 例如IL-1β转化酶抑制剂和IL-1ra联合。本发明的抗体，或其抗原 结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂使用，例如，酪氨酸激酶抑制 剂6-巯基嘌呤。本发明的抗体，或其抗原结合部分能与IL-11联合。 本发明的抗体，或其抗原结合部分能与下面的药物联合：美沙拉嗪，泼 尼松，硫唑嘌呤，巯基嘌呤，英夫单抗，甲泼尼龙，琥珀酸钠，地芬诺 酯/硫酸阿托品，盐酸洛派丁胺，甲氨喋呤，奥美拉唑，叶酸盐，环丙 沙星/葡萄糖-水，重酒石酸二氢可待因酮/扑热息痛，盐酸四环素，氟 轻松醋酸酯，甲硝哒唑，硫贡撒/硼酸，消胆胺/蔗糖，盐酸环丙沙星， 硫酸天仙子胺，盐酸杜冷丁，盐酸咪达唑仑，盐酸氧可酮/扑热息痛，盐 酸异丙嗪，磷酸钠，新诺明/甲氧苄定，塞来昔布，聚丙烯酸树脂，萘 磺酸丙氧芬，氢化可的松，多种维他命，巴柳氮二钠，磷酸可卡因/ 扑热息痛，colesevelam盐酸盐，维生素B12，叶酸，左氟沙星，甲泼 尼龙，natalizumab和干扰素-γ。
本发明的抗体，或抗体部分能与之联合治疗多发性硬化的治疗药 物的非限制性例子包括下面的：皮质类固醇；氢化泼尼松；甲泼尼龙； 硫唑嘌呤；环磷酰胺；环孢菌素；甲氨喋呤；4-氨基吡啶；替扎尼定； 干扰素-β1a(AVONEX；Biogen)；干扰素-β1b(BETASERON； Chiron/Berlex)；干扰素α-n3)(Interferon Sciences/Fujimoto)， 干扰素-α(Alfa Wassermann/J&J)，干扰素-β1A-IF (Serono/Inhale Therapeutics)，Peginterferon α2b (Enzon/Scher ing-Plough)，共聚物1(Cop-1；格拉太咪尔；Teva Pharmaceutical Industries，Inc.)；高压纯氧；静脉内免疫球蛋 白；克拉利平；其他人细胞因子或生长因子和它们的受体的抗体或拮 抗剂，例如，TNF，LT，IL-1，IL-2，IL-6，IL-7，IL-8，IL-12，IL-23， IL-15，IL-16，EMAP-II，GM-CSF，FGF，和PDGF。本发明的抗体或者 其抗原结合部分能与细胞表面分子的抗体联合，例如CD2，CD3， CD4，CD8，CD19，CD20，CD25，CD28，CD30，CD40，CD45，CD69， CD80，CD86，CD90或者它们的配基。本发明的抗体或者其抗原结合部分 还可以与药物联合，例如与甲氨喋呤，环孢菌素，FK506，瑞帕霉素，霉 酚酸酯，来氟洛米，，NSAIDs，例如，布洛芬，皮质类固醇，例如氢化 泼尼松，磷酸二酯酶抑制剂，腺苷激动剂，抗血栓剂，补体抑制剂，肾 上腺素能剂，干扰促炎症细胞因子例如TNFα或IL-1传导信号的药物 (例如IRAK，NIK，IKK，p38或MAP激酶抑制剂)，IL-1β转化酶抑制 剂，TACE抑制剂，T-细胞信号传导抑制剂，例如激酶抑制剂，金属蛋白 酶抑制剂，柳氮磺胺吡啶，硫唑嘌呤，6-巯基嘌呤，血管紧张肽转化 酶抑制剂，可溶性细胞因子受体和其衍生物(例如可溶性p55或p75 TNF受体，sIL-1RI，sIL-1RII，sIL-6R)，抗炎细胞因子(例如， IL-4，IL-10，IL-11，IL-13和TGFβ)。
本发明的抗体或者其抗原结合部分能与之联合治疗多发性硬化的 治疗药物优选例子包括干扰素-β，例如，IFNβ1a和IFNβ1b；格拉 太咪尔，皮质类固醇，胱天蛋白酶抑制剂，例如胱天蛋白酶-1的抑制 剂，IL-1抑制剂，TNF抑制剂，和CD40配体和CD80的抗体。
本发明的抗体或者其抗原结合部分还可以与药物联合，例如 alemtuzumab，四氢大麻酚，Unimed，daclizumab，米托蒽醌， xaliproden hydrochloride，4-氨基吡啶，乙酸格拉太咪尔， natalizumab，sinnabidol，a-immunokine  NNSO3，ABR-215062， AnergiX.MS，趋化因子受体拮抗剂，BBR-2778，calagualine，CPI- 1189，LEM(脂质体胶囊米托蒽醌)，THC.CBD(类大麻素激动剂) MBP-8298，甲基氢化泼尼松(PDE4抑制剂)，MNA-715，抗-IL-6受体 抗体，neurovax，派非尼酮，allotrap 1258(RDP-1258)，sTNF-R1， talampanel，teriflunomide，TGF-β2，tiplimotide，VLA-4拮抗 剂(例如，TR-14035，VLA4 Ultrahaler，Antegran-ELAN/Biogen)，γ 干扰素拮抗剂，IL-4激动剂。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗咽痛的治疗药物的非限 制性例子包括下面的：阿司匹林，硝酸甘油，单硝酸异山梨酯，琥珀酸 美托洛尔，阿替洛尔，酒石酸美托洛尔，阿罗地平磺酸盐，硫氮翁酮 盐酸盐，硝酸异山梨酯，氯吡格雷硫酸氢盐，心痛定，阿托伐他汀钙， 氯化钾，呋塞米，辛伐他汀，盐酸维拉帕米，地高辛，盐酸心得安，卡 维地洛，萘诺普利，螺内酯，二氢氯噻，依那普利马来酸盐，纳多洛 尔，雷米普利，依诺肝素钠，肝素钠，缬沙坦，盐酸甲磺胺心定，降 脂异丙酯，ezetimibe，布美他尼，氯沙坦钾，萘诺普利/二氢氯噻，非 洛地平，卡托普利，比索洛尔富马酸盐。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗关节强硬脊椎炎的治疗 药物的非限制性例子包括下面的：布洛芬，二氯酚酸钠和米索普特，萘 普生，美洛昔康，消炎痛，二氯酚酸钠，塞来昔布，罗非克西，柳氮 磺胺吡啶，甲氨喋呤，硫唑嘌呤，米诺环素，泼尼松，etanercept，英 夫单抗。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗哮喘的治疗药物的非限 制性例子包括下面的：沙丁胺醇，沙美特罗/氟地松，孟鲁司特钠，氟 地松丙酸盐，步地奈德，泼尼松，沙美特罗xinafoate， levalbuterol盐酸盐，硫酸沙丁胺醇/异丙托品，泼尼松龙磷酸钠，曲 安柰德，倍氯米松二丙酸盐，溴化异丙托品，阿奇霉素，乙酸吡布特 罗，氢化泼尼松，无水茶叶碱，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，克拉霉素，扎 鲁司特，福莫特罗富马酸盐，流感病毒疫苗，甲泼尼龙，阿莫西林三 水合物，氟尼缩松，变应性变态反应注射液，色氨酸钠，盐酸甲美芳 铵，氟尼缩松/薄荷醇，阿莫西林/克拉维酸钾，左氟沙星，吸入器辅助 装置，愈创甘油醚，地塞米松钠磷酸盐，莫西沙星盐酸盐，盐酸多西 环素，愈创甘油醚/d-消旋啡烷，p-麻黄素/cod/扑尔敏，加替沙星，西 替利嗪盐酸盐，糠酸毛他松，沙美特罗xinafoate，退嗽，头孢氨苄， pe/氢可酮/扑尔敏，西替利嗪盐酸盐/伪麻黄碱，苯福林/cod/异丙嗪， 可卡因/异丙嗪，头孢罗齐，地塞米松，愈创甘油醚/假麻黄碱，扑尔敏 /氢可酮，奈多罗米钠，硫酸特布他林，肾上腺素，甲泼尼龙，硫酸奥 西那林。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗COPD的治疗药物的非限 制性例子包括下面的：硫酸沙丁胺醇/异丙托品，溴化异丙托品，沙美 特罗/氟地松，沙丁胺醇，沙美特罗xinafoate，倍氯米松二丙酸盐， 泼尼松，无水茶叶碱，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，孟鲁司特钠，布地奈德， 福莫特罗富马酸盐，曲安柰德，左氟沙星，愈创甘油醚，阿奇霉素，倍 氯美松二丙酸盐，levalbuterol盐酸盐，氟尼缩松，头孢曲松钠，阿 莫西林三水合物，加替沙星，扎鲁司特，阿莫西林/克拉维酸钾，氟尼缩 松/薄荷醇，扑尔敏/氢可酮，硫酸奥西那林，甲泼尼龙，糠酸毛他松，p- 黄麻碱/cod/扑尔敏，乙酸吡布特罗，p-黄麻碱/氯雷他定，硫酸特 布他林，tiotropium bromide，(R，R)-福莫特罗，TgAAT， Cilomilast，Roflumilast。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗HCV的治疗药物的非限 制性例子包括下面的：干扰素-α-2a，干扰素-α-2b，干扰素-α-conl， 干扰素-α-n1，PEG化干扰素-α-2a，PEG化干扰素-α-2b，利巴韦 林，PEG化干扰素-α-2b+利巴韦林，熊去氧胆酸，甘草酸，胸腺法 新，Maxamine，VX-497和用下面的靶物干扰用来治疗HCV的任何化合 物：HCV聚合酶，HCV蛋白酶，HCV helicase，HCV IRES(内部核糖 体进入位点)。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗特发性肺纤维化的治疗 药物的非限制性例子包括下面的：泼尼松，硫唑嘌呤，沙丁胺醇，秋水 仙碱，硫酸沙丁胺醇，地高辛，γ干扰素，甲泼尼龙钠琥珀酸盐，劳 拉西泮，呋塞米，赖诺普利，硝酸甘油，螺内酯，环磷酰胺，异丙托 品，放线菌素d，阿替普酶，丙酸氟地松，左氟沙星，硫酸奥西那林， 硫酸吗啡，盐酸羟可待酮，氯化钾，曲安奈德，无水他克莫司，钙， 干扰素-α，甲氨喋呤，霉酚酸酯，干扰素-γ-1β。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗心肌梗塞的治疗药物的 非限制性例子包括下面的：阿司匹林，硝酸甘油，酒石酸美托洛尔，依 诺肝素钠，肝素钠，氯吡格雷二硫酸盐，卡维地洛，阿替洛尔，硫酸 吗啡，琥珀酸美托洛尔，法华林钠，赖诺普利，单硝酸异山梨酯，地 高辛，呋塞米，辛伐他汀，雷米普利，替尼普酶，马来酸依那普利， torsemide，瑞替普酶，氯沙坦钾，盐酸喹那普利，碳酸镁，布美他尼， 阿替普酶，依那普利拉，胺碘酮盐酸盐，盐酸替罗非班m-水合物，盐 酸地尔硫卓，卡托普利，依贝沙坦，缬沙坦，盐酸普萘洛尔，福辛普 利钠，盐酸利多卡因，表非替得，头孢唑啉钠，硫酸阿托品，亮氨酸， 螺内酯，干扰素，盐酸索他洛尔，氯化钾，琥珀辛酯钠，盐酸多巴酚丁 胺，阿普唑仑，普伐他汀钠，阿托伐他汀钙，盐酸咪达唑仑，盐酸度 冷丁，硝酸异山梨酯，肾上腺素，盐酸多巴胺，比伐卢定， rosuvastatin，ezetimibe/辛伐他汀，avasimibe，cariporide。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗牛皮癣的治疗药物的非 限制性例子包括下面的：钙泊三烯，丙酸氯倍他索，曲安奈德， halobetasol丙酸盐，他佐罗汀，甲氨喋呤，氟轻松醋酸酯，增长的倍 他米松，氟轻松，阿维A，焦油香波，缬草酸倍他米松，糠酸毛他松，酮 康唑，普拉莫星/氟轻松，缬草酸氢化可的松，氟氢缩松，脲，倍他米 松，丙酸氯倍他索/伊莫，氟地松丙酸盐，阿奇霉素，氢化可的松，加 湿配方，叶酸，地奈德，pimecrolimus，煤焦油，二乙酸二氟拉松， etanercept folate，乳酸，甲氧沙林，hc/bismuthsubgal/znox/ resor，乙酸甲泼尼龙，强的松，防晒剂，哈西奈德，水杨酸，蒽林，新 戊酸氯可托龙，煤提取物，煤焦油/水杨酸，煤焦油/水杨酸/硫，去羟 米松，安定，润滑药，氟轻松醋酸酯/润滑药，矿物油/蓖麻油/nalact， 矿物油/花生油，石油/十四酸异丙酯，补骨脂素，水杨酸，皂/三溴沙 仑，硫贡撒/硼酸，塞来昔布，英夫单抗，环孢菌素，alefacept， efalizumab，tacrolimus，pimecrolimus，PUVA，WB，柳氮磺胺吡 啶。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗牛皮癣关节炎的治疗药 物的非限制性例子包括下面的：甲氨喋呤，etanercept，罗非克西，塞 来昔布，叶酸，柳氮磺胺吡啶，萘普生，来氟洛米，乙酸甲泼尼龙， 消炎痛，硫酸羟氯喹，强的松，舒林酸，渐增的二丙酸倍他米松，英 夫单抗，甲氨喋呤，叶酸盐，曲安奈德，二氯酚酸钠，二甲基亚砜，吡 罗昔康，双氯芬酸钠，酮洛芬，美洛昔康，甲泼尼龙，萘普酮，托美 丁钠，钙泊三烯，环孢菌素，双氯芬酸钠/米索普特，氟轻松醋酸酯，硫 酸葡萄糖胺，硫羟苹果酸金钠，氢可酮酒石酸氢酯/扑热息痛，布洛芬， 利塞膦酸钠，磺胺嘧啶，硫鸟嘌呤，valdecoxib，alefacept， efalizumab。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗再狭窄的治疗药物的非 限制性例子包括下面的：西罗莫司，紫杉醇，everolimus， tacrolimus，ABT-578，扑热息痛。
本发明的抗体或抗体部分能与之联合治疗坐骨神经痛的治疗药物 的非限制性例子包括下面的：氢可酮酒石酸氢酯/扑热息痛，罗非克西， 盐酸环苯扎林，甲泼尼龙，萘普生，布洛芬，盐酸氧可酮/扑热息痛，塞 来昔布，valdecoxib，乙酸甲泼尼龙，强的松，磷酸可卡因/扑热息 痛，盐酸曲马朵/扑热息痛，美他沙酮，美洛昔康，美索巴莫，盐酸利 多卡因，双氯芬酸钠，加巴喷丁，地塞米松，卡立普多，酮洛酸，氨 丁三醇，消炎痛，扑热息痛，安定，萘普酮，盐酸氧可酮，替扎尼定盐 酸盐，双氯芬酸钠/米索普特，丙氧芬二硫硫胺/扑热息痛，阿司匹林 /oxycod/羟可待酮ter，布洛芬/少量氢可酮，盐酸曲马朵，乙哚乙 酸，盐酸丙氧芬，盐酸阿米替林，肌安宁/磷酸可卡因/阿司匹林，硫酸 吗啡，多种维他命，萘普生钠，邻甲苯海拉明柠檬酸盐，替马西泮。
本发明的抗体或抗原结合部分能与之联合治疗SLE(狼疮)的治疗 药物的优选例子包括下面的：NSAIDS，例如，双氯芬酸，萘普生，布洛 芬，吡罗昔康，消炎痛；COX2抑制剂，例如，塞来昔布，罗非克西， valdecoxib；抗疟药，例如，羟氯喹；类固醇，例如，强的松，氢化 泼尼松，budenoside，地塞米松；细胞毒素，例如，硫唑嘌呤，环磷 酰胺，霉酚酸酯，甲氨喋呤；PDE4的抑制剂或嘌呤合成抑制剂，例 如麦考酚酸吗啉乙酯。本发明的抗体或抗原结合部分还可以与下面的 药物联合，例如柳氮磺胺吡啶，5-氨基水杨酸，奥沙拉嗪，硫唑嘌呤， 和干扰促炎性细胞因子例如IL-1的合成，制备或作用的药物，例如胱 天蛋白酶抑制剂，象IL-1β转化酶抑制剂和IL-1ra联合。本发明的 抗体，或其抗原结合部分还可以与T细胞信号传导抑制剂使用，例如， 酪氨酸激酶抑制剂；或瞄向T细胞激活分子的分子，例如，CTLA-4-IgG 或抗-B7家族抗体，抗-PD-1家族抗体。本发明的抗体或抗原结合部分 还可以与IL-11或抗-细胞因子抗体联合，例如，fonotolizumab(抗 -IFNg抗体)，或抗-受体受体抗体，例如，抗-IL-6受体抗体和抗B- 细胞表面分子抗体。本发明的抗体或抗原结合部分还可以与下面的药 物联合使用：LJP 394(abetimus)，减少或灭活B-细胞的药物，例如， 利妥希玛(抗-CD20抗体)，lymphostat-B(抗-BlyS抗体)，TNF拮抗 剂，例如，抗-TNF抗体，D2E7(PCT公开No.WO97/29131；HUMIRA)， CA2(REMICADE)，CDP 571，TNFR-Ig构建体，(p75TNFRIgG(ENBREL) 和p55TNFRIgG(LENERCEPT))。
本发明的药物组合物可以含有″治疗有效量″或″预防有效量″本发 明的抗体或抗体部分。″治疗有效量的″指实现期望的治疗结果的必需 的剂量和给药时间的有效量。本发明的抗体或抗体部分的治疗有效量 可以由本领域技术人员确定并且根据个体因素例如疾病状态，年龄， 性别和体重，以及抗体或抗体部分激发个体期望的响应的能力而不 同。治疗有效量也是其中治疗有益作用比抗体或抗体部分的毒性或有 害作用更重要的量。″预防有效量″指实现期望的预防结果的必需的剂 量和给药时间的有效量。典型地，在疾病之前或早期使用预防剂量，预 防有效量比治疗有效量小。
调节给药方案提供最佳期望响应(例如，治疗或预防响应)。例如， 可以施用一次大丸剂，也可以在一定时间施用几次分开的剂量，或者 根据治疗状况紧急情形显示的，可以相应减小或增加剂量。以易于给 药和剂量均匀性的单位剂型配制肠胃外用组合物是特别有利的。这里 使用的单位剂型指适合作为要治疗的哺乳动物受治疗者的单一剂量的 物理分散的单位；各个单位含有经计算产生期望的治疗效果的预定量 的活性化合物和必需的药物载体。根据(a)活性化合物的独特特征和要 实现的特定的治疗或预防效果，和(b)化合物领域固有的限制如活性化 合物对于个体治疗灵敏性，指示本发明的单位剂型的说明，并且该说 明直接根据(a)和(b)。
作为例子，本发明的抗体或抗体部分治疗或预防有效量的非限制 范围是0.1-20毫克/千克，更优选1-10毫克/千克。注意，剂量值 可以随着要减轻的症状的类型和严重程度而变化。要进一步明白，对 于任何特定受治疗者，应该根据个体需要和实施或监督组合物的给与 的人的专业判断，随时间调节具体给药方案，这里给出的剂量范围只 是例举而不是为了限制要求的组合物的范围或实施。
II.IL-18易感基因
IL-18在巨噬细胞，树突状细胞，星形细胞，小神经胶质细胞，上 皮细胞，角质形成细胞，肠上皮细胞，软骨细胞，滑液成纤维细胞和 成骨细胞，以及在肾上腺皮质和脑垂体腺中表达。在一些细胞中，例如 人单核细胞和树状细胞中，表达是组成型的，而在其他细胞中，一定是 重新诱导。
除了γ干扰素表达之外，对于IL-18单独诱导的或者与其他细胞因 子协调的其他基因知之甚少。
本发明的一个实施方案提供了调控感兴趣的基因的基因表达的方 法，包括下面的步骤：提供IL-18或IL-18调节剂；使IL-18或调节 剂接触细胞，细胞中感兴趣的基因选自下面的表中给出的基因。
表3  IL-18易感基因   Genbank ID   基因名称  Unigene备注   NM_000389   p21  细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21，Cip1)   NM_002198   IRF1  干扰素调控因子1   NM_002163   ICSBP1  干扰素共有序列结合蛋白1   NM_006144   GZMA  粒酶A   NM_006515   SETMAR  SET结构域和mariner转座酶融合基因   NM_007185   TNRC4  包含三核苷酸重复4   NM_002288   LAIR2  白细胞-相关Ig-样受体2   NM_003661   APOL1  载脂蛋白L，1   NM_021958   HLX1  H2.0样同源异形框1(果蝇)   NM_001335   CTSW  组织蛋白酶W(lymphopain)   Hs.382006   FCGR1B  FcRI b形式(AA 1-344)   NM_020125   BLAME  亮氨酸氨基肽酶3   NM_007210   GALNT6  UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺   NM_021798   IL21R  白介素21受体   NM_013324   CISH  包含细胞因子可诱导SH2-蛋白质   M11313   A2M  α-2-巨球蛋白   D88152   ACATN  乙酰基辅酶A转运蛋白   NM_001103   ACTN2  辅肌动蛋白，α2   U37519   ALDH8  醛脱氢酶8   NM_000697   ALOX12  花生四烯酸12-脂氧合酶   J03600   ALOX5  花生四烯酸5-脂氧合酶   NM_014578   ARHD  Ras同系物基因家族，成员   S66793   ARR3  抑制蛋白3，视网膜的(X-抑制蛋白)   U47054   ART3  ADP-核糖基转移酶3   L19871   ATF3  激活转录因子3   M81181   ATP1B2  ATP酶，Na+/K+转运   NM_001188   BAK1  BCL2-拮抗剂/杀伤者1   U15460   BATF  碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF-样   NM_014417   BBC3  Bcl-2结合成分3   Z23115   BCL2L1  BCL2-样1   NM_001713   BHMT  甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶
  U45878   BIRC3   包含IAP重复的杆状病毒3   U37546   BIRC3   包含IAP重复的杆状病毒3   U72649   BTG2   BTG家族，成员2   U49187   C6ORF32   染色体6开放读框32   J03507   C7   补体成分7   U50360   CAMK2G   CaM激酶IIγ   XM_071866   CAT56   CAT56蛋白质   NM_005623   CCL8   Z32765   CD36   CD36抗原(胶原I型/TSP受体)   HG2981-   HT3127   CD44   CD44抗原   Z11697   CD83   CD83抗原   XM_071866   CDR2   小脑变性-相关蛋白(62kD)   U51096   CDX2   尾侧同源异形框转录因子2   M83667   CEBPD   CCAAT/增强子结合蛋白(C/EBP)，δ   D87469   CELSR2   钙黏着蛋白，EGF LAG七跨膜区G-型受体2   L07765   CES1   羧酯酶1   U66468   CGR11   带有EF-HAND的细胞生长调控结构域   X14830   CHRNB1   胆碱能受体，烟酸，β多肽1   L29217   CLK3   CDC-样激酶3   X15880   COL6A1   胶原，IV型，α1   NM_001851   COL9A1   胶原，IX型，α1   M27691   CREB1   CAMP响应元件结合蛋白1   M37435   CSF1   集落刺激因子1(巨噬细胞)   HG3548-   HT3749   CUTL1   切(CCAAT置换蛋白)   X13589   CYP19   细胞色素P450，亚家族XIX   X16866   CYP2D7AP   细胞色素P450，亚家族IID   X59131   D13S106E   带高电荷蛋白   NM_004393   DAG1   肌营养不良蛋白聚糖1   U73328   DLX4   distal-less同源异形框4   L19267   DMWD   肌强直性营养不良，WD重复基序   U53445   DOC1   卵巢癌中的负调节1   X68277   DUSP1   双重特异性磷酸酶1   U48807   DUSP4   双重特异性磷酸酶4   NM_001950   E2F4   E2F转录因子4，p107/p130-结合   U87269   E4F1   E4F转录因子1   M57730   EFNA1   肝配蛋白-A1   X52541   EGR1   早期生长响应1   J04076   EGR2   早期生长响应2(Krox-20同系物)   X63741   EGR3   早期生长响应3   L07077   EHHADH   烯酰辅酶A   M62831   ETR101   即时早期蛋白   M60830   EVI2B   亲嗜性病毒整合位点2B   U53786   EVPL   外被斑蛋白   NM_001988   EVPL   外被斑蛋白   NM_000141   FCGBP   IgG结合蛋白的Fc片段   M23668   FDX1   铁氧化还原蛋白1   U60062   FEZ1   束状&伸长蛋白质ζ1(zygin 1)
  NM_000141   FGFR2   成纤维细胞生长因子受体2   U49973   FLJ10803   推定的蛋白质FLJ10803   U89995   FOXE1   Forkhead基因盒(甲状腺转录因子2)   U27326   FUT3   岩藻糖转移酶3   A28102   GABRA3   γ-氨基丁酸(GABA)受体   M25667   GAP43   生长相关蛋白43   L34357   GATA4   GATA-结合蛋白4   U19523   GCH1   GTP环化水解酶1   L01406   GHRHR   生长激素释放激素受体   U03486   GJA5   间隙连接蛋白，α5，40kD(肌联蛋白40)   X68285   GK   甘油激酶   Z18859   GNAT2   鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)   HG870-HT870   GOLGA3   高尔基体自身抗原，高尔基体亚家族a，3   D49958   GPM6A   糖蛋白M6A   D43772   GRB7   生长因子受体-结合蛋白7   AC000099   GRM8   谷氨酸受体，代谢型8   M57731   GRO2   GRO2致癌基因   X53800   GRO3   GRO3致癌基因   M91036   HBG2   血红蛋白，γG   D16583   HDC   组氨酸脱羧酶   X64877   HFL3   H因子(补体)-样3   X58431   HOXB6   同源异形框B6   M16937   HOXB7   同源异形框B7   NM_014468   HPX42B   造血祖先同源异形框   X92814   HREV107   类似于大鼠HREV107   L19314   HRY   毛状(果蝇)-同系物   M26665   HTN3   Histatin3   D10995   HTR1B   5-羟色胺(血清素)受体1B   L41147   HTR6   5-羟色胺(血清素)受体6   M24283   ICAM1   细胞间黏着分子1(CD54)   S81914   IER3   即时早期响应3   J03171   IFNAR1   干扰素(α，β和ε)受体1   J00219   IFNG   干扰素γ   NM_000619   IFNG   干扰素γ   NM_000585   IL15   白介素15   U31628   IL15RA   白介素15受体，α   X04500   IL1B   白介素1，β   M27492   IL1R1   白介素1受体，I型   X01057   IL2RA   白介素2受体，α   M26062   IL2RB   白介素2受体，β   Y00081   IL6   白介素6(干扰素，β2)   Y00787   IL8   白介素8   Z31695   INPP5A   肌醇聚磷酸盐-5-磷酸酶，40kD   X06256   ITGA5   整联蛋白，α5   X57206   ITPKB   肌醇1，4，5-三磷酸3-激酶B   U20734   JUNB   连接B原型致癌基因   NM_014879   KIAA0001   UDP-葡萄糖的推导的G蛋白偶联受体   D31762   KIAA0057   TRAM-样蛋白质   D42038   KIAA0087   KIAA0087基因产物
  NM_005551   KIAA0133   KIAA0133基因产物   NM_014846   KIAA0196   KIAA0196基因产物   X06182   KIT   V-试剂盒致癌基因同系物   NM_005551   KLK2   血管舒缓素2，前列腺的   X07730   KLK3   血管舒缓素3，(前列腺特异性抗原)   M13955   KRT7   胶蛋白7   M57710   LGALS3   凝集素，半乳糖苷-结合，可溶性，3(半乳凝集素3)   S83362   LIFR   白血病抑制因子受体   NM_002314   LIMK1   LIM结构域激酶1   NM_005569   LIMK2   LIM结构域激酶2   U49957   LPP   包含LIM结构域   U89922   LTB   淋巴毒素β(TNF超家族，成员3)   X14008   LYZ   溶菌酶(肾淀粉样变性)   U59914   MADH6   MAD)同系物   D14497   MAP3K8   促细胞分裂剂-激活的蛋白质激酶激酶激酶8   X59727   MAPK4   促细胞分裂剂-激活的蛋白质激酶4   NM_000429   MAT1A   甲硫氨酸腺苷转移酶I，α   HG1877-   HT1917   MBP   髓磷脂碱性蛋白   HG3115-   HT3291   MBP   髓磷脂碱性蛋白   U43944   ME1   苹果酶1，NADP(+)-依赖性，胞质   X72755   MIG   γ干扰素诱导的单核因子   NM_021230   MLL3   骨髓/淋巴样或混合血统白血病3   NM_005951   MT1H   金属硫蛋白   X78710   MTF1   金属-调控转录因子1   X70991   NAB2   NGFI-A结合蛋白2(ERG1 bp 2)   M32011   NCF2   嗜中性白细胞胞质因子2   S77763   NFE2   核因子(类红细胞-产生的)，45kD   M58603   NFKB1   核因子κB(p105)   S76638   NFKB2   核因子κB   M69043   NFKBIA   核因子κB   U91616   NFKBIE   核因子κB   D86425   NID2   巢蛋白2   L13740   NR4A1   核受体亚家族4，A族，成员1   U44848   NRF1   核呼吸因子1   U79251   OPCML   阿片样物质-结合蛋白/细胞黏合分子-样   HG4115-   HT4385   OR1E3P   嗅神经受体   M27288   OSM   制瘤素M   AF000234   P2RX4   嘌呤能受体P2X   D50640   PDE3B   磷酸二酯酶3B，cGMP-抑制的   L20971   PDE4B   磷酸二酯酶4B，cAMP-特异性   L10343   PI3   蛋白酶抑制剂3，皮肤-产生的(SKALP)   U77735   PIM2   pim-2致癌基因   NM_003579   PIP5K2A   磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶   U17034   PLA2R1   磷脂酶A2受体1，180kD   AB000584   PLAB   前列腺分化因子   X63131   PML   前髓细胞白血病
 D11428   PMP22  外周髓磷脂蛋白质22  NM_032940   POLR2C  聚合酶(RNA)II多肽  NM_005035   POLRMT  聚合酶(RNA)线粒体(DNA方向)  NM_003579   POU2F2  POU结构域，2类，转录因子2  M18255   PRKCB1  蛋白质激酶C，β1  L01087   PRKCQ  蛋白质激酶C，θ  D38128   PTGIR  前列腺素I2(前列腺环素)受体(IP)  Y10375   PTPNS1  酪氨酸磷酸酶，非受体酶作用物1  D15049   PTPRH  蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体型，H  M31166   PTX3  pentaxin-相关基因  U59877   RAB31  RAB31，成员RAS致癌基因家族  NM_003579   RAD54L  RAD54(啤酒糖酵母)-样  U64675   RANBP2L1  RAN结合蛋白2-样1  S57153   RBBP1  成视网膜细胞瘤-结合蛋白1  NM_002903   RCV1  恢复蛋白  NG_000013   RDBP  RD RNA-结合蛋白  X75042   REL  v-rel  M83221   RELB  v-rel  NM_000537   REN  肾素  U22314   REST  RE1-缄默转录因子  S59049   RGS1  G-蛋白信号的调节剂1  U70426   RGS16  G-蛋白信号的调节剂16  U22377   RLF  重排L-myc融合序列  U38480   RXRG  视网膜样X受体，γ  L10338   SCN1B  钠通道多肽  M23178   SCYA3  小的可诱导细胞因子A3  M69203   SCYA4  小的可诱导细胞因子A4  NM_005409   SCYB11  小的可诱导细胞因子亚家族B：CXC11  D79206   SDC4  黏结蛋白聚糖4(双栖蛋白聚糖，抗凝蛋白聚糖)  NM_005065   SEL1L  sel-1(lin-12的抑制剂，C.elegans)-样  NM_004186   SEMA3F  脑信号蛋白3F  J03764   SERPINE1  连接蛋白，纤溶酶原激活剂抑制剂1型  NM_006802   SF3A3  剪接因子3a，亚基3，60kD  HG3925-  HT4195   SFTPA2  表面活性剂，肺-相关蛋白质A2  D89077   SLA  Src-样-接头  NM_003037   SLAM  信号淋巴因子激活分子  M91463   SLC2A4  可溶性载体家族2葡萄糖转运蛋白  D82326   SLC3A1  可溶性载体家族3  L05568   SLC6A4  可溶性载体家族6(血清素)  U96094   SLN  sarcolipin  X83301   SMA3  SMA3  D21267   SNAP25  突触小体相关蛋白，25kD  L31529   SNTB1  肌养蛋白结合蛋白，肌养蛋白-相关蛋白A1  HG961-HT961   SOS1  无七区(果蝇)同系物1的产物  M62800   SSA1  (52kD，核糖核蛋白自身抗原SS-A/Ro)  NM_021014   SSX3  滑膜肉瘤，X断点3  Z35093   SURF1  马荨麻疹1  NM_005816   TACTILE  T细胞激活，增加的晚期表达
 L25444   TAF2E  TATA盒结合蛋白(TBP)-相关因子  M95787   TAGLN  转凝蛋白  NM_005421   TAL2  T-细胞急性淋巴细胞白血病2  L47345   TCEB3  转录延长因子B(110kD，延伸蛋白A)  M57732   TCF1  肝核因子(HNF1)  NM_003205   TCF12  螺旋-环-螺旋转录因子4  M96956   TDGF1  畸形瘤-产生的生长因子1tctor 1  U19878   TMEFF1  带有EGF和促滤泡素抑制素样跨膜蛋白  M92357   TNFAIP2  肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白2  M59465   TNFAIP3  肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白3  X83490   TNFRSF6  肿瘤坏死因子受体成员6  U37518   TNFSF10  肿瘤坏死因子成员10  NM_003294   TPSB1  类胰蛋白酶β1  U19261   TRAF1  TNF受体-相关因子1  U78798   TRAF6  TNF受体-相关因子6  S69790   WASF3  WAS蛋白质家族，成员3  U53476   WNT7A  wingless-型MMTV整合位点家族  L15309   ZNF141  锌指蛋白141(克隆pHZ-44)  U78722   ZNF165  锌指蛋白165  HG4333-  HT4603   ZNF79  锌指蛋白79(pT7)  X57809  λ轻链可变区  HG3111-  HT3287  未知的人克隆HH409  U79249  人克隆23839序列  AB000464  克隆：RES4-24A  HG4593-  HT4998  电压控制钠通道(SCN1A)  X77744  人FLJ00032蛋白质，部分  U79248  人克降23826序列  AI420129  ESTs
实施例3公开了IL-18调控的基因的鉴定方法。这些研究表明 IL-18是真实促炎性细胞因子，并且能直接调控编码其他炎性原介质的 几种基因的表达。使用人血样的研究表明对于IL-18的很多响应在人 群中广泛发生，并且证实了它们作为生物化学标记的用途，以及接着的 抗-IL18功能。
IL-18的调节剂可以是激动剂和拮抗剂。优选地，调节剂是结合蛋 白或中和结合蛋白。
举例的IL-18抑制剂包括但不限于，结合IL-18的抗体及其片段； 结合IL-18R的抗体；结合IL-18RAcP的抗体；IL-18bp；IL-18R 片段(例如，IL-18受体的溶解的胞外结构域)；结合IL-18并且减小或 防止它与IL-18R相互作用的肽；结合IL-18R并且减小或防止它与 IL-18或IL-18RAcP相互作用的肽；结合IL-18RAcP并且减小或防止 它与IL-18R相互作用的肽；减小或防止IL-18产生或者IL-18，IL- 18R，和IL-18RAcP任何一个之间的相互作用的小分子。
下面文献描述了一些IL-18抑制剂，例如，1994年7月14日公 开的美国专利No.5,912,324；1999年12月8日公开的EP 0962531； 1994年11月15日公开的EP 712931；1994年7月14日公开的美国 专利No.5,914,253；1997年7月10日公开的WO 97/24441；2000 年5月9日公开的美国专利No.6,060,283；1996年12月26日公 开的EP850 952；1998年9月16日公开的EP 864 585；1998年9 月24日公开的WO 98/41232；2000年4月25日公开的美国专利No. 6,054,487；1997年8月14日公开的WO 99/09063；1997年11 月3日公开的WO 99/22760；1998年1月23日公开的WO 99/37772； 1998年3月20日公开的WO 99/37773；2000年1月26日公开的EP 0 974 600；2000年3月9日公开的WO 00112555；1997年10月31 日公开的日本专利申请JP 111,399194；1998年2月8日公开的以 色列专利申请IL 121554AO；这些文献为了任何目的在此引作参考。
对于本领域技术人员显而易见的是这里描述的本发明的其他合适 的修饰和改变是显而易见的，并且不脱离本发明的范围或这里公开的 实施方案使用合适的等同物可以进行。在详细描述本发明的基础上，参 照下面的实施例，更清楚地理解，实施例只是为了详细说明的目的而不 是要限制本发明的范围。
实施例
实施例1：重组IL-18的制备和表征
实施例1.1：IL-18生物活性测定试验
实施例1和实施例2中，除非另有说明，利用下面的试验测定 IL-18的生物活性。
实施例1.1.A：KG-1生物测定
KG-1(ATCC#CCL-246)是组成型表达低水平功能IL-18受体的人 骨髓单核细胞系。使用TNF治疗增量调节这些细胞上功能IL-18受体 的IL-18Rα和β亚基。通过ELISA，将TNF-处理的KG-1细胞与重组 人IL-18(rhu-IL-18)温育进行KG-1生物测定，测定IL-18-诱导的人 IFNγ产生的水平(Konishi，K.，等(1997)J.Immunol.Methods 209：187-191)。利用KG-1生物测定来测定IL-18拮抗剂的中和能 力。例如，抗-IL-18抗体与不同浓度的rhu-IL-18温育，然后在37 ℃下在96-孔板中与TNF-处理的KG-1细胞温育16-18小时。收集上 清液并且通过ELISA测定人IFNγ水平。该项试验测得IL-18拮抗剂 低至4×10-11至6×10-11M的IC50值
实施例1.1.B：人全血分析
简要地说，人全血分析(WBA)测定生理学背景下IL-18拮抗剂 抗天然IL-18的中和效力。在各项试验中，读出的是内源IL-18-依赖 性人IFNγ产生的抑制。在37℃下在存在或不存在IL-18拮抗剂下， 用LPS(1μg/mL)加IL-12(50pg/mL)刺激全血。LPS加IL-12刺激之 后18-24小时通过ELISA测定人IFNγ浓度。
实施例1.1.C：受体结合试验
简要地说，在受体结合试验(RBA)中，125I标记的rhu-IL-18被用 来测定IL-18与IL-18受体的结合。125I-rhu-IL-18特异性结合TNF 处理的KG-1细胞上IL-18Rαβ(～7,000位点/细胞)。.125I-rhu- IL-18具有和没有标记的IL-18一样的特异活性并且能被没有标记的 IL-18竞争掉。
定义两种抑制方式，A和B。在中和模式A中，IL-18与高亲和性 IL-18受体(IL-18Rαβ)的结合没有效果，但是IL-18-介导的信号 转导(即IFNγ产生)被阻断。在中和模式B中，IL-18与IL-18Rαβ 的结合被阻断，从而接着没有发生受体-介导的信号转导。
实施例1.2：重组IL-18的产生
实施例1.2.A：质粒构建，人IL-18原的表达和纯化
通过在SF-9昆虫细胞中表达IL-18母体形式产生重组人IL-18。 应用本领域公知的标准分子生物学方法，一公开的序列(Ushio，S.， 等(1996)J.Immunol.156：4274-4279)为基础利用特异PCR引物 制备全长人IL-18原cDNA，并且接着克隆到杆状病毒(BV)转移载体 pVL1393(BD Biosciences，San Jose，CA；Cat#51-21201P)。用 来制备全长人IL-18原cDNA的5′PCR引物包含编码6-组氨酸区的序 列，使得IL-18原的N-末端包含6-HIS-标签。
用带有包含IL-18cDNA的pVL1393载体的杆状病毒转染SF9 I昆 虫细胞。将转染的SF9细胞溶解并且将溶胞产物流经镍柱以纯化重组 HIS-标记的IL-18原(rhu proIL-18)(BD Biosciences，San Jose， CA；Cat#554802)。通过用人胱天蛋白酶-1消化进一步处理重组HIS- 标记的IL-18原，产生生物活性IL-18(成熟IL-18)(Ghayur T.， (1997)Nature 386：619-623)。
实施例1.2.B：IL-18的NEM处理
从日本Hayashibara Biochemical Laboratories获得的重组人 IL-18表现特异活性和IL-18结合亲和性的分批差异。成熟IL-18中 四个半胱氨酸不同对之间，IL-18包含二硫键。这些引起分批的结构和 功能异质性，和差异。利用IL-1b配位的人IL-18的同源性模型表明， 成熟人IL-18的位置38和68的半胱氨酸残基是暴露的，因此是有活 性的。
用N-乙基马来酰亚胺(NEM)处理实施例1.2，A获得的重组人IL- 18，保护半胱氨酸不被氧化。NEM-IL-18是单体的，不形成聚集体， 它是稳定的并且随着时间保持高特异活性。NEM-IL-18保留中和表 位，因为抗-huIL-18中和抗体结合并中和NEM-IL-18。尽管NEM处理 IL-18，根据抗-IL-18抗体中和人WBA中NEM-IL-18和天然人IL-18 的生物活性的能力所测定的，NEM-IL-18上中和表位保留了。NEM- IL-18用于测定全长人抗-人-IL-18mAbs的最优化和选择和初步特 征。
实施例1.2.C：IL-18的4C/A突变体的产生和表征
通过将成熟IL-18中四个半胱氨酸突变成丙氨酸制备IL-18的 4C/A突变体(″4C/A-huL-18″)。根据下面表4中总结的，IL-18的 4C/A突变体与NEM-huIL-18比较，表明两种蛋白质的生物学和生物化 学性质完全不同。通过动态光散射(DLS)和大小排阻层析(SEC)分 析，IL-18和NEM-huIL-18的4C/A突变体是单体，圆二色性分析表 明构象和物理稳定性相似。IL-18和NEM-huIL-18的4C/A突变体的 生物活性在KG-1试验中是相同的，IL-18结合的IL-18BP和抗-IL-18 抗体的两种形式具有相似的亲和性。4C/A-huL-18没有氧化不稳定 性，并且容易在大肠杆菌中高水平表达。
表4  NEM-IL-18和4C/A-huIL-18的比较表明它们的构象和寡聚 物纯度，物理稳定性，和与抗体或细胞结合的受体结合的量度是相等 的。   性质   量度   NEM-huIL-18   (4C/A)-huIL-18   寡聚物状态   SEC   单体   单体   DLS   单体   单体   构象   CD(波长扫描)   210nmCD最小   210nmCD最小   稳定性   CD(温度扫描)   高至40℃稳定   高至40℃稳定   生物活性   2ng/mL IL-18引起   的IFNγ产生   8ng/mL IFNγ   8ng/mL IFNγ   表位   参照结合蛋白对   IFNγ产生的中和   IL-18BP-Fc，125-2H和   IL-18Rα的中和   IL-18BP-Fc，125-2H   和IL-18Rα的中和   Biacore(KD)   IL-18BP-Fc，0.098nM   125-2H：0.2nM   2.5(E)mg1：0.3nM   IL-18BP-Fc，0.135nM   125-2H：0.2nM   2.5(E)mg1：0.2nM
实施例1.2.D：生物素化rhuIL-18(生物素化-IL-18)的产 生和表征
利用本领域公知的标准技术，子阿赖氨酸残基上对来自实施例1.2. B的NEM-IL-18进行生物素化(Sulfo-NHS-LC-Biotin， Pierce，Rockford，IL；Cat#21335)，获得的生物素化rhu-IL- 18(biot-IL-18)是每huIL-18含有带有1，2，3，或4个生物素的物 质的不均匀混合物。此外，在biot-IL-18中每个huIL-18带有2或3 个生物素的物质是主要物质。根据ELISA分析，Biot-IL-18是生物 活性的，结合的抗-IL-18抗体，并且被试验的所有中和抗-huIL-18 抗体中和。Biot-IL-18结合的KG-1细胞在细胞表面上表达高亲和性 的IL-18Rαβ，利用抗-生物素抗体(Sigma-Aldrich，St Louis，MO； cat#B 3640)通过FACS分析检测KG-1细胞表面上biot-IL-18。因 此生物素化作用不干扰受体结合，不屏蔽rhuIL-18的中和表位。
实施例1.2.E：125I标记的rhuIL-18的产生和表征
应用Amersham描述的条件(Piscataway，NJ；Cat#IM5861)， 用125I标记实施例1.2.B获得的NEM-IL-18上赖氨酸残基。保留了 其特异活性的125I标记的IL-18与没有修饰的IL-18竞争，并且特异性 结合KG-1细胞上的IL-18R。通过中和抗-huIL-18单克隆抗体阻断 125I标记的IL-18与IL-18受体的结合。因此，碘化作用不影响IL- 18的受体结合，因此不屏蔽中和IL-18上的表位。在受体结合试验中， 使用125I标记的IL-18测定抗-IL-18抗体的中和模式和能力。
实施例2：抗IL-18抗体的产生和分离
实施例2.1：鉴定抗-IL-18抗体的试验
在实施例3中，除非另有说明，利用下面的试验鉴定和表征抗- IL-18抗体。
实施例2.1.A：ELISA
进行ELISA，筛选结合人IL-18的抗体。在这项ELISA中，生物 素化NEM-huIL-18(参见实施例1.2.B)被山羊-生物素化IgG捕获或 者被捕获到链霉抗生物素包被的平板上。使用杂交瘤或B细胞上清 液，并且利用HRP-偶联的抗-人IgGs，根据本领域公知的标准ELISA方 法，检测IL-18-结合的抗体。
实施例2.1.B：应用BIACORE技术的亲和性测定
BIACORE试验(Biacore，Inc，Piscataway，NJ)测定抗体的亲 和性，测定生成，离解速率常数的动力学常数。利用共价连接的第二 抗体(例如山羊抗-人IgG或抗-小鼠IgG)，将抗体捕获到生物传感器 芯片上，然后使用不同浓度的重组IL-18。结合记录为时间的函数，并 且计算动力学速率常数。在该项试验中，测得生成速率象106M-1s-1这样 快，离解速率象10-6M-1s-1这样慢。
实施例2.1.C：表位图谱
应用BIACORE技术测绘IL-18拮抗剂例如抗-IL-18抗体识别的 表位的图谱。简要地说，一种IL-18拮抗剂被捕获到Biacore芯片上， rhuIL-18与固定化试剂结合。然后分析另一种抗-IL-18拮抗剂与这 种复合体的结合。两种试剂同时结合证明，这两者识别不同的表位。
实施例2.2：使用XENOMOUSE的抗-IL-18HuMAbs的产生
应用XENOMOUSE转基因小鼠技术(Abgenix，Inc.，Fremont，CA) 获得全人抗-人IL-18单克隆抗体(HuMAbs)。这项技术包括转基因小 鼠携带带有VH，DH，和JH，Cμ，Cδ的人可变重链基因座，和单链人 IgG恒定重链基因座和轻链基因座。用感兴趣的抗原免疫之后，这些 小鼠产生抗该抗原的全人抗体。
实施例2.2.A：用IL-18抗原对XENOMOUSE的免疫
对于所有注射，通过足垫途径对XENOMOUSE动物接种。每次注射 的总体积是每只小鼠50微升，每只足垫25微升。对于每只小鼠，初 次免疫注射，在与TiterMax Gold以1∶1v/v混合的无热源DPBS中 含有40微克人IL-18(NEM-rhuIL-18)。接着对每只小鼠施用与25微 克Adju-Phos(磷酸铝凝胶)混合的无热源DPBS中40微克人IL-18进 行加强免疫6次，然后对每只小鼠使用没有辅助剂的无热源DPBS中40 微克人IL-18进行最后一次加强免疫。在此方案中，在第0，4，8，11，17， 21，25和35天对动物免疫接种。在第39天进行融合。上述免疫方案 后，将小鼠处以安乐死，然后回收腹股沟和腰部淋巴结。
实施例2.2.B：杂交瘤的制备
通过对腹股沟和腰部淋巴结机械破碎来释放根据实施例2.2.A获 得的淋巴细胞，使用组织研磨机，通过CD90阴性选择排除T细胞。以 1∶1的比例混合洗涤过的富集B细胞和从ATCC购得的非分泌骨髓瘤 P3X63Ag8.653细胞，cat#CRL 1580(Kearney等，J.Immunol. 123，1979，1548-1550)，进行杂交瘤融合。通过以800g离心使细胞 混合物温和沉淀。完全去除上清液之后，细胞用2-4毫升链霉蛋白酶 溶液(CalBiochem，San Diego，CA；cat.#53702；0.5毫克/毫 升PBS溶液)处理不超过2分钟。然后加入3-5毫升FBS以中止酶 活性，并且使用电细胞融合溶液，ECFS(0.3M蔗糖，Sigma-Aldrich， St Louis，MO；Cat#S7903，0.1mM乙酸镁，Sigma，Cat# M2545，0.1mM乙酸钙，Sigma-Aldrich，St Louis，MO；Cat#C4705) 将悬浮液调节至40毫升总体积。离心之后去除上清液，并且将细胞再 悬浮于40毫升ECFS。反复这种洗涤步骤，再次将细胞重新悬浮于ECFS 至2×106细胞/毫升浓度。
使用ECM2001型，Genetronic，Inc.，San Diego，CA融合发 生器进行电-细胞融合。使用的融合室大小是2.0毫升，使用下面的仪 器设置：校准条件：电压：50v，时间：50秒；膜破碎条件：电压：3000 v，时间：30秒；融合后保留时间：3秒。
融合之后，细胞重新悬浮于杂交瘤融合培养基中：DMEM(JRH Biosciences)，15％FBS(Hyclone)，含有0.5XHA(Sigma-Aldrich， St Louis，MO；cat#A9666)，并且补加有L-谷氨酰，pen/strep，OPI (草酰乙酸盐，丙酮酸盐，牛胰岛素)(都从Sigma获得)和IL-6 (Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)，在37℃和10％CO2的 空气中培养。以每孔4×104细胞在平底96-孔组织培养板上将细胞平板 培养。培养物在杂交瘤融合培养基中保持2周，然后转移到杂交瘤培 养基：DMEM(JRH Biosciences，Lenexa，KS)，15％FBS(Hyclone， Logan，Utah)，并且补充有L-谷氨酰，pen/strep，OPI(草酰乙酸 盐，丙酮酸盐，牛胰岛素)(都从Sigma获得)和IL-6(Boehringer Mannheim，Indianapolis，IN)。以在0.5XHA杂交瘤融合培养基中 存活来筛选杂交瘤，并且通过ELISA对含有杂交瘤的那些孔筛选抗原 反应性。ELISA格式详细描述了在抗原包被的平板(人IL-18包被平 板)上温育上清液，并且使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗-人 IgG检测人抗-人IL-18结合抗体，然后通过平行进行两组ELISA来证 实所有的阳性样品，详细描述了在抗原包被的平板(人IL-18包被平板) 上温育上清液，并且使用辣根过氧化物酶(HRP)标记的小鼠抗-人γ和 κ链检测人抗-人IL-18结合抗体。
利用限制稀释平板培养在选择的抗原-阳性孔上进行克隆。对平板 目测检查单一菌落生长的存在，然后通过上述抗原-特异性ELISA筛选 单一菌落孔的上清液。通过多样ELISA，使用Luminex仪器，分析高 反应性克隆，证实人γ和κ链的纯度。
实施例2.2.C：XENOMAX技术
或者，对实施例2.2.B中获得的淋巴细胞实施选择淋巴细胞抗体- 产生方法(SLAM)，该方法确定了XENOMAX抗体选择技术(Abgenix， Inc.，Fremont，CA)。在96孔板中平板培养单一B细胞，通过空斑 形成细胞试验鉴定在产生抗期望抗原(人IL-18)的人单克隆抗体的B 细胞(Babcook，J.S.，Leslie，K.B.，Olsen，O.A.，Salmon， R.A.，和Schrader，J.W.，Isolation of functional antibody genes from single lymphocytes of defined antigen-specificity. Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93：7843-7848，1996)，对于VH和 Vk前导序列使用5′引物，和对于人Cγ和Cκ特异的3′引物，通过对 分离的B细胞进行单细胞RT-PCR，克隆IgG基因。根据实施例2.2.E 和2.2.G所述在哺乳动物细胞中表达获得的重组IgG基因。
实施例2.2.D：抗-IL-18抗体的鉴定
应用生物素化IL-18ELISA(参见实施例2.1.A)，鉴定根据实施 例2.2.B和2.2.C制备的杂交瘤和产生结合IL-18的抗体的B-细胞。 然后在根据实施例1.1.A进行的KG-1生物试验中，对含有结合IL-18 的抗体的杂交瘤和B细胞上清液测定IL-18中和能力。将中和抗-IL-18 抗体(来自杂交瘤和SLAM aproaches)亚克隆导哺乳动物载体中，在 COS细胞中表达，纯化，并且在KG-1生物试验中再次试验(参见表 5)。
表5KG-1生物试验中抗-IL-18HuMAbs的中和能力   HuMAb#   KG-1测定(IC50′M)   NEM-rhuIL-18   杂交瘤   2.5.1   3E-10；4E-10   2.13.1   2E-10；1E-10；7E-11   2.3.3   1E-9；2E-10；7E-10   XENOMAX   215   1E-10；3E-10；1E-10；   444   1E-10；2E-10；2E-10   478   7E-10；2E-9；3E-10   435   8E-10；7E-10；4E-10；   413   1E-9；7E-10；7E-10   581   7E-10；3E-10；3E-9   231   1E-10；3E-11；2E-9   521   6E-10；3E-10；2E-9   336   7E-10   351   2E-10   490   5E-10   550   TBD   268   7E-9
在表1中描述了表5中抗体的可变区。
实施例2.2.E：中和抗-IL-18HuMAbs亚克隆到哺乳动物表达载体 中
根据生产商说明书，在CMV启动子的调控下，在pCDNA (Invitrogen，Carlsbad，Ca)载体中克隆抗体的重链和轻链基因。通 过电穿孔，使用本领域公知的标准条件，用相应于各克隆的重链和轻 链，使用包含人基因组γ-2和κ序列的这些质粒共同转染COS细胞。
回收细胞，在补充有谷酰胺的无血清DMEM中培养细胞，并分泌抗 体72小时。然后收集培养物上清液，离心澄清并且过滤，并且上 Protein-A树脂。用PBS洗涤柱子，用低pH缓冲剂洗脱抗体，并且用1M Tris溶液快速中和。在Amicon-30旋转过滤器上用PBS对抗体制备物 进行缓冲剂交换。通过在OD280下的光谱测定法和SDS-PAGE分析抗体 的浓度和纯度，然后对它们测定IL-18中和能力。
为了实现人抗体在COS细胞中更高水平表达，在延长因子启动子 的调控下，一些抗体的重链和轻链亚克隆导载体pEF-BOS(Mizushima， S.和Nagata，S.(1990)Nucleic acids Research Vol 18，No.17)。
简言之，以这样的方式设计用于重链可变区的PCR引物，使得它 们被插入包含IgG信号肽和人IgG1恒定区的序列[野生型(SEQ ID No. 2)或失活突变体(SEQ ID No.3)]的盒pEF-BOS质粒中。前向VH PCR 引物包含限制位点NruI，象信号肽的核苷酸序列一样。反向VH PCR引 物包含SalI限制位点，它也经基因工程导入γ-1Fc序列的5′端。用 NruI/SalI消化VH PCR片段，并且克隆到pEF-BOS人IgG1野生型或 pEF-BOS人IgG1突变体构建体中。通过HindE限制消化，整个轻链 以来自pCDNA载体的κ形式存在，转移到pEF-BOS载体中，用T4聚合 酶填充突出端，接着用NotI消化。然后将这些钝的/NotI轻链片段克 隆到Srfl/NotI消化的pEF-BOS载体中。
从最初杂交瘤系克隆抗体的VH和VL区。从产生抗体的细胞制备 RNA，使用如上所述设计的引物进行RT-PCR，即对于VH用Nrul/SaII 引物，对VL用NruI/BsiWI引物。将全长IgG1和κ链组装成盒载体。
进一步修饰选择的抗体。天然存在的抗体有谷酰胺(Q)或谷氨酸 (E)，这好似重链和/或轻链NH2-末端。Q作为NH2-末端的抗体的制备 得到NH2-末端异源性，由于谷酰胺环化为谷氨酸。因此，一些抗体的 NH2-末端处谷酰胺残基突变为谷氨酸。还有两个残基，Fc部分的绞合 区中亮氨酸234和亮氨酸235突变，妨碍了抗体的效应子功能。简要 地说，利用标准分子生物学技术，用丙氨酸置换亮氨酸234和亮氨酸 235(Lund，J.等，J.Immunology(1991)147：2657-2662；Winter， 等美国专利No.5,648,260；5624821；5,624,821)。这些Fc- 突变抗体有专门术语(mg1)。下面实施例2.2.J 6进一步表征了这些 突变体。
实施例2.2.F：选择的中和抗-IL-18抗体的表征
在哺乳动物细胞中产生具有不同种系序列的几种重组抗-人IL-18 抗体，纯化并且在各种试验中进行功能表征(见表6)。
表6：一些抗-IL-18抗体的体外抗原结合，细胞检测和骨架序列 特征   抗体   技术a   Biacoreb   (KD，nM) RBA (IC50，nM) KG-1b (IC50，nM) WBA (IC50，nM)     基因家族c     序列多样性   2.5(E)mg1   杂交瘤   0.31 2.38 0.20 3   VL-L2   VH5-51   2.5(E)wtg1   杂交瘤   0.40 2.38 0.30 3   VL-L2   VH5-51   215(E)mg1d   Xenomax   0.23 1.17 0.17 3   VL-A27   VH4-31   444(Q)mg1d   Xenomax   1.61 2.49 0.13 1   VL-   A27(7)   VH4-   31(1)   581(E)mg1d   Xenomax   2.00 1.28 1.3 3   VL-A2   VH3-30   2.3.1(E)wtg1   杂交瘤   0.23 0.20 0.63 2   VL-02   VH4-59   2.13.1(E)wtg1   杂交瘤   0.20 0.20 0.12 2   VL-   A27(8)   VH4-   31(18)
使用NEM-cys保护的rhuIL-18。
括号中的数字指明克隆盒中氨基酸与种系序列的差异。
实施例2.2.G：产生2.5(E)mg1的CHO细胞系的产生
根据下面描述的方法制备表达2.5(E)mg1抗体的稳定的CHO细胞 系。
实施例2.2.G 1：表达载体的构建
构建质粒pA510用于哺乳动物细胞系中抗体的高水平表达。这种 pUC19-衍生的质粒包含大肠杆菌ColE1复制起点和用于氨苄青霉素抗 性的β-内酰胺酶基因。
简要地说，应用标准分子生物学技术，克隆相应于2.5(E)mgl抗 体的VH和VL区的cDNA，分别与突变的人γ-1和κ恒定区基因，制得 编码天然全人IgG1/κ抗体的DNA。将这些DNAs导入表达构建体 pA510。得到的质粒包含下面顺序的基因或调控元件的序列(不包括 pUC19)：5′-CMV增强子，腺病毒主要晚期启动子，人免疫球蛋白信号 肽，2.5(E)mg1重链免疫球蛋白可变区，人γ-1免疫球蛋白恒定区， SV40聚腺苷酸化序列，人促胃液素转录中止序列，SV40复制起点 (SV40启动子/增强子)，鼠二氢叶酸还原酶序列，来自单纯疱疹病毒 的胸苷激酶聚腺苷酸化序列，CMV增强子，腺病毒主要晚期启动子，人 免疫球蛋白信号肽，2.5(E)mg1轻链免疫球蛋白可变区，人κ免疫球 蛋白恒定区，SV40聚腺苷酸化序列-3′。将该编码区插入趋动抗体基 因转录的强病毒启动子的下游。载体还编码小鼠DHFR基因的表达，根 据不存在核苷的培养基中的生长能力筛选转化的细胞。
实施例2.2.G 2：表达载体转染到双亲细胞系
使用细胞系，CHO DUX B11.(Urlaub，G.和Chasin L.A.Proc Natl Acad Sci USA 77：4216-4220(1980))，二氢叶酸还原酶(DHFR) 基因表达缺陷，转染实施例2.2.G1中描述的表达载体。应用本领域公 知的磷酸钙沉淀法用载体转染CHODUX B 11细胞(Current Protocols in Molecular Biology；Ausubel，F.V.，Brent，R.， Moore，D.M.，Kingston，R.E.，Seidman，J.G.，Smith，J.A.， 和K.Struhl eds；Wiley Interscience，N.Y.，N.Y.(1990))， 有下面的改进。对培养板抽吸并且向各板加入9毫升F12培养基。培 养板在37℃保温2小时。将150微克DNA溶解于50毫升圆锥形试管 中2.7毫升水中。加入300微升2.5M CaCl2，一次一滴，将该DNA 混合物加给50毫升圆锥形试管中3毫升2x Hepes缓冲盐水(HeBS)。
将得到的混合物涡流5秒钟并且在室温下温育20分钟。各个板均 匀分布1毫升(仍然在F12中)，培养板在37℃保温4小时。温育之后， 对培养板抽吸，并且向各板加入2毫升F12中10％DMSO。DMSO处理 持续1分钟，然后向各板加入5毫升磷酸盐缓冲盐水(PBS)稀释DMSO。
对培养板抽吸，并且用PBS洗涤两次以上。加入10毫升有核苷的 Gibco αMEM，培养板在37℃保温过夜。第二天，培养基换成没有核 苷的有5％透析的胎牛血清(FBS)t的GibcoαMEM，6小时之后，如下将 细胞接种到96-孔板中。利用胰蛋白酶消化收获10厘米板中的细胞， 并且重新悬浮于总共300毫升没有核苷有5％血清(FBS)t的Gibcoα MEM中。以10毫升/板，100微升/孔，接种20个96-孔板。加入100 毫升相同的培养基，保持100毫升细胞，并且如上所述接种20个另 外的96-孔板(这是第二次稀释)。一周之后更换96-孔板中的培养 基，又一周后再次更换。使用没有核苷的αMEM培养基选择表达DHFR 的细胞，从而选择表达载体。
实施例2.2.G 3：产生2.5(E)mg1细胞的选择
应用对于人IgG特异性的ELISA，对转染CHO细胞的培养物上清 液检测分泌的抗体2.5(E)mg1的存在。一旦筛选了一组CHO转染子 用于表达人抗体，用另外的选择分离有扩增数目的整合到CHO基因组 中的表达载体的那些细胞。使用药物甲氨喋呤(MTX)选择扩增系。对 MTX存在下培养的培养物测定它们产生免疫球蛋白的能力。对比它们 MTX-敏感前期物质表达更多抗体的MTX-抗性系进行另一轮更高浓度 MTX的筛选，并且测定免疫球蛋白产生。在1或15升生物反应器中培 养表达2.5(E)mg1的CHO细胞，并且在进行两周时测定抗体产率是～ 1.0克/升。
实施例2.2.H：CHO细胞-产生的2.5(E)mg1的物理化学特征
进行CHO产生的2.5(E)mg1的初步物理和化学表征。试验测定 2.5(E)mg1的分子量大约是149kDa，与理论分子量很好吻合。应用 肽图谱技术(K Biemann Annu.Rev.Biochem.1992，61 977-1010； D A.Lewis Accelerated Articles，Anal.Chem.1994，66，585- 595)，证明2.5(E)mg1对于轻链和重链具有正确的N-末端。有非常 小的重链C末端可变性，因为99％的2.5(E)mg1分子重链羧基末端没 有赖氨酸。各个2.5(E)mg1重链包含有寡甘露糖和复合体的单一N- 连接糖基化位点，有0，1或2个半乳糖残基的岩藻糖基化两耳结构。
实施例2.2.1：CHO细胞-产生的2.5(E)mg1的溶解性和稳定 性
纯的2.5(E)mg1是可溶的，在pH 5，6和7缓冲剂中至少62毫 克/毫升最短4周。在37℃下在这些缓冲剂中进行使用2.5(E)mg1 的加速稳定性研究来鉴定稳定性-指征分析和最佳长期贮存pH。通过 大小排阻HPLC和SDS-PAGE  周间隔对样品进行分析，测定聚集作用 和片段化作用，用于S-S键检测的LC-MS/MS肽图谱，用于活性测定 的抗原-ELISA和/或以细胞为基础的生物试验，和阳离子交换HPLC和 用于电荷不均匀性测定的iso-Asp定量测定。SEC(大小排阻色谱法)， SDS-PAGE和阳离子交换色谱法对样品的初步分析表明所有三项分析 证明了稳定性，因此2.5(E)mg1在～pH6下更稳定。
实施例2.2.J：CHO-细胞-产生的抗-IL-18HuMAb，2.5(E)mg1 的表征
实施例2.2.J 1：IL-18物种特异性
评价了2.5(E)mg1结合和/或中和人，cynomolgus猴，小鼠，大 鼠和狗的IL-18的能力。利用BIACORE分析，根据生产商说明书(参见 实施例2.1.B)，证明2.5(E)mg1结合成熟人IL-18，但是不结合小鼠 IL-18。另外，免疫沉淀数据表明2.5(E)mg1结合cynomolgus猴 IL-18(对于狗IL-18的IC50＝9.1E×10-11)，但是不结合狗或大鼠 IL-18。2.5(E)mg1以相似方式功能结合人和cynomolgus IL-18生 物活性，但是没有看到狗，大鼠或小鼠IL-18的抑制作用。
实施例2.2.J 2：人细胞因子特异性
根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)，利用BIACORE分析，评 价了2.5(E)mg1对于IL-18的特异性。2.5(E)mg1抗体被捕获到生 物传感器芯片上，并且测定其与溶液中一组已知人细胞因子结合的能 力。如表7所示，2.5(E)mg1结合重组人成熟IL-18和IL-18-原。 相反，2.5(E)mg1不结合试验的其他23种人细胞因子的任何一种， 包括IL-1家族成员IL-1α和IL-1β。
表7  2.5(E)mg1与细胞因子结合的Biacore分析   可溶性重组细胞因子(1μM)   捕获的2.5(E)mg1(25mg/mL)   2.5(E)mg1结合   IFNγ   -   IL-1α   -   IL-1β   -   其它细胞因子a   -   IL-18b   +   IL-18原   +
a对另外的细胞因子检测结合，包括IL-2，IL-3，IL-4，IL-5，IL-6， IL-7，IL-8，IL-9，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，IL-16，IL- 17，IL-21，TNF，LT，LTα1β2，和LTα2β1。
2.5(E)mg1与这些细胞因子的任一种都不结合。
半胱氨酸＞丙氨酸突变体BV产生的重组人IL-18
实施例2.2.J 3：亲和性测定
表8给出应用BIACORE试验根据生产商说明书测定的2.5(E)mg1 的体外IL-18结合性质。2.5(E)mg1抗体具有快的生成速率，缓慢 的解离速率，总亲和性是0.196nM。为了比较，给出两种参照IL-18 拮抗剂(125-2H和IL-18结合蛋白)的动力学速率参数。
表8  2.5(E)mg1和参照试剂的IL-18结合性质 试剂              Biacore参数  生成速率  (×103M-1s-1)   解离速率   (×10-6s-1)   KD   (nM) 2.5(E)mg1a  268   52.4   0.196 鼠抗人IL-18(125-2H)b  190   110   0.550 IL-18BP-Fcc  140   26   0.190
在BIACORE中分析(4C/A)-HuIL-18。
b-125-2H，中和小鼠抗-人IL-18IgG1 mAb
c-IL-18BP-Fc，天然IL-18拮抗剂的Fc融合
实施例2.2.J 4：体外IL-18中和能力
在KG-1生物实验中，受体结合试验(RBA)和人WBA(参见实施例 1.1.A-1.1.C)，测定2.5(E)mg1的体外中和能力。如表8所示， 2.5(E)mg1抗体中和重组(KG-1和RBA)和中和IL-18(WBA)，(在KG-1 中IC50＜0.5nM，在RBA中＜2nM，在WBA中＜5nM)，并且与其 IL-18结合亲和性吻合。
表8  2.5(E)mg1和参照试剂的中和能力   试剂      体外中和能力(IC50，nM)   KG-1a   RBAb   WBAc   2.5(E)mg1   0.2   2.4   3.0   鼠抗人IL-18   mAb(125-2H)   0.2   ＞300d   3.0   IL-18BP-Fc   0.03   1.0   5.7   抗-IL-18R mAb(M-840)   1.5   1.7   2.7
bKG-1生物试验，平均值
c在该项试验中使用(4C/A)-huIL-18
d受体结合分析
使用4-6个供体的人全血分析。给出平均值。
125-2H中和IL-18生物活性，虽然不能抑制受体结合。
实施例2.2.J 5：2.5(E)mg1的体内中和能力
为了评价2.5(E)mg1体内在炎症环境中中和天然人IL-18-诱导 的IFNγ的能力，使用严重合并免疫缺陷(SCID)小鼠模型，对小鼠注射 人PBMCs，并且体内刺激细胞产生人IL-18(HuPBMC-SCID模型)。结 果(表9)表明2.5(E)mg1体内抑制人IL-18-依赖性人IFNγ产生， 两种给药途径都是清除的剂量-响应关系。分别通过腹膜内或静脉内给 药，2.5(E)mg1的ED50大约是1微克或0.1微克/小鼠(＝0.05毫 克/千克或0.005毫克/千克)。
表9A  对HuPBMC-SCID小鼠模型i.p.施用2.5(E)mg1的体内 功效
  组   huIFNg(pg/ml)   ％抑制率   2.5(E)mg1 0.025μg/小鼠   70±17   61   2.5(E)mg1 0.25μg/小鼠   112±29   36   2.5(E)mg1 2.5μg/小鼠   36±10   80   2.5(E)mg1 25μg/小鼠   10±8   94   2.5(E)mg1 250μg/小鼠   3±2   98   没有处理   193±59   HuIgG对照250μg/小鼠   177±33
表9B  对HuPBMC-SCID小鼠模型i.v.施用2.5(E)mg1的体内功 效   组   huIFNg(pg/ml)   ％抑制率   2.5(E)mg1 0.025μg/小鼠   156±45   36   2.5(E)mg1 0.25μg/小鼠   27±9   89   2.5(E)mg1 2.5μg/小鼠   36±8   85   2.5(E)mg1 25μg/小鼠   11±6   96   2.5(E)mg1 250μg/小鼠   4±2   98   没有处理   279±26   HuIgG对照250μg/小鼠   245±22
实施例2.2.J 6：效应子功能
抗体的Fc部分介导几种重要的效应子功能，例如细胞因子诱导， 抗体-依赖性细胞-介导的细胞毒性(ADCC)，吞噬作用，补体依赖性细 胞毒性(CDC)，和抗体和抗原-抗体复合体的半存留期/清除速率。在一 些情况下，这些效应子功能对于治疗性抗体是期望的，但是在其他情 况下，可能不是必需的，甚至可能是有害的，取决于治疗主体。一些人 IgG同位型，特别是IgG1和IgG3，通过分别与FcγRs和补体C1q结 合而介导ADCC和CDC。新生Fc受体(FcRn)是测定抗体的循环半存留 期的重要成分。
与2.5(E)mg1相比，2.5(E)mg1中L234A和L235A突变不影 响2.5(E)mg1 HuMAb总的亲合力或中和能力(表10)。然而，正如所 预期的，这些突变消除与FcγR和C1q的结合。
表10：残基L234和L235突变为丙氨酸不影响2.5(E)mg1的亲 合力或中和能力              动力速率参数   KG-1生物测定   Ab   On-rate   (103M-1s-1)   解离速率   (×10-6s-1)   KD   (nM)   IC50   (nM)   2.5(E)wtg1   281   47.8   0.170   0.4   2.5(E)mg1   268   52.4   0.196   0.2
实施例2.2.J 6.1：FcγRI结合
人FcγRI(CD64)对于IgG1免疫复合体具有相对高的亲合力 (KD1E-8～1E-9M)。在单核细胞和巨噬细胞和多种骨髓细胞系上表达， 包括U937。通过荧光-激活细胞分类(FACS)(CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY.Vol(1)5.3.1，J.E.Coligan等编著，John Wiley &Sons，Inc.出版，2002)测定2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1与U937 细胞的结合。获得的数据(参见表11)证明2.5(E)wtg1结合U937 细胞，但是正如所预料的，2.5(E)mg1不结合。为了证实这种结合通 过FcγRI介导，使用小鼠抗-hFcγRI阻断抗体(10.1)进行竞争试验。 这些结果表明，在下面试验的浓度下，抗体10.1以剂量依赖性方式阻 断2.5(E)wtg1与U937细胞的结合，因此，2.5(E)wtg1结合U937 细胞上的FcγRI。
表11.证明与2.5(E)wtg1相反，2.5(E)wg1不能结合U937 细胞上的FcγRI(数据以MFI+/-SD给出)   抗体浓度   (μM)   1.00E-09   1.00E-08   1.00E-07   1.00E-06   1.00E-05   1.00E-04   1.00E-03   1.00E-02   1.00E-01   2.5(E)wtg1   0.50+0.00   0.50+0.00   0.63+0.12   0.57+0.05   0.60+0.00   1.10+0.00   5.80+0.05   29.60+0.05   38.76+5.19   2.5(E)mg1   0.67+0.09   0.67+0.09   0.60+0.00   0.80+0.14   0.63+0.05   0.67+0.05   0.53+0.05   0.60+0.05   0.63+0.08
实施例2.2.J 6.2：FcγR II结合
人FcγRII(CD32)对于IgG1免疫复合体具有相对低的结合亲合 力(KD1E-5～1E-7M)。在生理条件下，它要求生成多价免疫复合体用于 激活。使用对于FcγR I，II源特异性的荧光素异硫代氰酸酯(FITC) 标记的抗体，并且通过流式细胞计数进行测定，我们证实K562细胞上 FcγRII的表达。单体2.5(E)wtg1与K562细胞的结合非常弱。因 此，使用抗-κ链抗体使IgG1分子与模拟多价免疫复合体预先交联，并 且测定它们与K562细胞上FcγRII的结合。交联之后，2.5(E)wtg1 与K562细胞结合，但即使交联之后，2.5(E)wtg1即使表现出，也只 是非常小的结合(表12)。抗-FcγRII抗体，克隆IV3，阻断2.5(E) wtg1的结合，因此2.5(E)wtg1与K562的结合是FcγRII介导的。
表12.交联之后2.5(E)wtg1和2.5(E)wg1与K562细胞上Fc γRII的结合(数据以MFI+/-SD给出)   抗体浓度   (μM)   1.00E-08   1.00E-07   1.00E-06   1.00E-05   1.00E-04   1.00E-03   1.00E-02   1.00E-01   1.00E+00   2.5(E)wtg1   0.37+0.05   0.37+0.05   0.40+0.00   0.43+0.05   0.80+0.08   3.43+0.21   19.7+0.70   93.33+4.90   134.37+12.93   2.5(E)mg1   0.30+0.00   0.40+0.00   0.40+0.00   0.37+0.05   0.37+0.05   0.40+0.00   0.50+0.00   1.60+0.08   5.37+0.38
实施例2.2.J 6.3：C1q结合
通过C1q与IgG分子的Fc部分的结合，通过常规途径的细胞的补 体激活和溶解被激活。应用本领域公知的标准ELISA技术(Hezareh， M.，等，(2001)J.Virology，75(24)：12161-12168)，测定C1q 与2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1的结合。将2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1 HuMAbs包被到塑料板上，接着与人C1q温育。然后用山羊-抗-人C1q 和兔抗-山羊IgG碱性磷酸酶偶联物的混合物检测结合的C1q分子。 结果表明2.5(E)wtg1结合C1q，但是2.5(E)mg1不结合(表13)。
表13.ELISA证明与2.5(E)wtg1相反，2.5(E)wg1不能结合 C1q(数据以D405+/-SD给出)   C1q浓度   (μg/ml)   0   20   40   60   80   100   120   2.5(E)wtg1   0.09+0.00   0.78+0.00   0.98+0.00   1.06+0.07   1.14+0.06   1.32+0.13   1.24+0.06   2.5(E)mg1   0.10+0.01   0.12+0.00   0.16+0.00   0.18+0.00   0.21+0.01   0.21+0.01   0.22+0.00
实施例2.2.J 6.4：新生儿Fc受体(FcRn)结合
提出IgG与内皮细胞中新生儿Fc受体(也称作Bramble受体) 的相互作用是IgG质量控制系统和IgG长半寿期的关键决定因素 [Ghetie，V.，等(1997)Nat.Biotechnol.15：637-640]。通过 饮液吸收的IgG分子以及成功地与细胞液泡中FcRn结合返回循环。 不能结合FcRn的IgG分子降解。
对人IgG与FcRn结合的关键残基作出图谱连接CH2-CH3结构域 (Kim J.K.，等(1999)Eur.J.Immunol.29：2819-2825)。重要地， 这些FcRn结合残基在人和小鼠免疫球蛋白之间是保守的，并且人免疫 球蛋白结合小鼠FcRn，使得可以对小鼠进行结构活性相关性研究。
为了测定L234A和L235A突变对FcRn结合的影响，利用FcRn表达 CHO细胞系，测定野生型2.5(E)wtg1和突变体2.5(E)mg1与FcRn 体外结合。2.5(E)wtg1和2.5(E)mg1与FcRn表达CHO细胞在pH 6.5 下温育，接着与FITC-偶联抗-人IgG(2Ab)温育。将细胞洗涤并且通过 FACS分析。
与0.5nM浓度相比，500nM浓度的2.5(E)mg1和2.5(E)wtg1 表现出与FcRn显著结合，这与单独用细胞的背景类似。
实施例2.2.K：小鼠药动学
在筛选小鼠研究中评价2.5(E)mg1的药动学(PK)，测定Fc突变 的引入(L234A，L235A)是否防止2.5(E)mg1结合FcγR，以及C1q 是否副作用影响血清PK曲线。小鼠FcRn结合小鼠和人IgG同样好地 使小鼠成为相关物种，用于小鼠结构活性相关性研究(Ober，R.J.，等 (2001)Int.Immunol.13：1551-1559)。在小鼠中，估计最终2.5(E) mg1半寿期是12天。在类似研究中，其他人单克隆抗体的半寿期是 10-14天。
对雌性小鼠(Jackson Labs，C57BL/6n)评价2.5(E)mg1的药动 学，一次静脉内施用剂量0.2毫克(相当于10毫克/千克的平均值)。 总共对24小鼠给药，并且从每只小鼠取3个样品。取样方案持续7 天。2.5(E)mg1显示一个分布期，接着是一个排除期。分布和消除半 寿期估计值大约是1.6小时和12天，取决于两个隔室开放模型(表 14)。
表14  对小鼠一次静脉内给药产生的2.5(E)mg1的关键药动学参 数总结   t1/2α   (hr)   t1/2β   (天数)   Cmax   (g/mL)   CL   (mL/hr)   Vss   (mL)   V1   (mL)   V2   (mL)   MRT   (天数)   AUC   (hr*μg/mL)   1.58   12.2   63.2   0.0162   6.82   3.15   3.67   17.5   12250
疾病模型
实施例2.2.L：疾病模型中抗-IL-18抗体的作用
实施例2.2.L.1：抗-muIL-18mAbs对LPS-诱导的IFNg产生的 抑制作用
LPS-诱导的IFNγ产生取决于IL-18表达(Ghayur，T.，等， 1997.Nature 386：619-623.)。利用LPS-诱导的IFNγ产生试验来 测定93-10C体内抑制IL-18-依赖性LPS-诱导的IFNγ产生的效力。 对小鼠iv施用单一剂量的93-10C(50微克)。30分钟之后，用LPS(20 毫克/千克)攻击小鼠，4小时之后取血。通过ELISA测定血清IFNγ 滴度。如表15所示，93-10C将LPS-诱导的IFNγ产生抑制70％。
表15  93-10C体内抑制LPS-诱导的IFNg产生   组   muIFNg(pg/ml)   ％抑制率   Rat IgG 250μg/小鼠   7239±365   N/A   MBT 93-10C 250μg/小鼠   2395±711   67
实施例2.2.L.2：角叉藻聚糖-诱导的爪水肿的抑制
嗜中性白细胞集中在炎症位点中涉及IL-18。角叉藻聚糖-诱导 的爪垫水肿是单核细胞和嗜中性白细胞-依赖性炎症模型。通过中和 IL-18的生物活性，这个模型的水肿能显著被抑制(Leung，B.P.，等 (2001)J.Immunol.167：2879-2886)。用1C5(400微克) (Hyashibara Laboratories，日本)或93-10C(100微克)(Medical and Biological Laboratories(MBL)Co.Watertown MA.)或对照 抗体在后爪垫对小鼠给药(ip)，然后用角叉藻聚糖注射(sc)。从24小 时至96小时每天测量角叉藻聚糖-诱导的水肿。攻击之后，从24小时 至96小时，1C5和93-10C显著抑制角叉藻聚糖-诱导的水肿(～50％ 抑制作用)(表16)。除了阻断嗜中性白细胞渗滤，93-10C还阻断这种 模型中炎症位点的TNF表达(Leung，B.P.，等(2001)J.Immunol. 167：2879-2886)。
表16角叉藻聚糖-诱导的爪水肿的体内抑制   角叉藻聚糖             爪肿胀变化(mm)   时间(hrs)   24   48   72   96   125-2H@400   0.357   0.557   0.543   0.414   1C5@400ug   0.214   0.300   0.286   0.200   大鼠IgG@100ug   0.300   0.500   0.550   0.450   93-10C@100ug   0.157   0.271   0.243   0.157   P＜0.05对对照IgG
实施例2.2.L.3：胶原-诱导的关节炎
类风湿性关节炎(RA)特征在于关节的慢性炎症，和骨和关节软骨 的损失。虽然认为RA是自身免疫疾病，但是还没有鉴定涉及的自身抗 原，并且疾病的精确病因学还不清楚。胶原-诱导的关节炎(CIA)是广 泛使用的RA模型并且具有与人基本类似的病理组织学特征(Bendele， A.，等(1999)Toxicol Pathol.27：134-142；Trentham，D.E.等 (1977)J.Exp.Med.146：857-868)。在这个模型中，用弗氏完全佐 剂中II型胶原(CII)免疫易受遗传影响的小鼠或大鼠。得到的多关节 炎特征在于软骨破坏，骨吸收，滑膜炎，和关节周炎症(Bendele，A.， 等(1999)Toxicol Pathol.27：134-142)。DBA/1背景的IL-18 KO 小鼠表现比野生型小鼠降低的发生率和CIA严重度(Wei，X.Q.，等 (2000)J.Immunol.166：517-521)。
为了找到内源IL-18在CIA的发病机理中的作用，用中和小鼠 IL-18的兔多克隆IgG(BA77)处理小鼠。从致敏时起给药14天时， BA77推迟疾病发作并且导致疾病严重程度的显著减轻。BA77还显著 抑制IgG2a抗-胶原抗体的产生。这些结果与对于rIL-18KO小鼠报道 的那些类似，并且证实和早期CIA中重要促炎症细胞因子一样的 rIL-18的作用。
来自IL-18 KO小鼠和抗-IL-18IgG处理的野生型小鼠的数据表 明，在CII-I诱导的最初的T细胞激活中，IL-18起着重要的促炎症 作用。为了更好地理解IL-18在CIA启动期间的作用，用CII免疫小 鼠，并且在疾病发作之前开始用大鼠IgG或93-10C处理，这大概要14 天。与对照大鼠IgG相比，用93-10C治疗导致疾病发作和严重度的 显著延迟(表17)。这些数据表明IL-18是有效的因子，不仅是在T 细胞引发中，而且还在CII-特异性T细胞激活之后促进 arthritogenic响应中。
表17  抗-IL-18mAb 93-10C延迟发病并且减轻CIA严重性   处理                           平均关节炎评分   天   11   12   13   14   15   16   17   18   大鼠IgG@200μg   0.00   0.13   0.13   0.13   0.27   0.53   1.20   1.20   93-10C@200μg   0.00   0.00   0.00   0.00   0.07   0.00   0.20   0.47   地塞米松-21-P@1mpk   0.00   0.00   0.27   0.27   0.13   0.13   0.13   0.13   处理时间   P＜0.05对大鼠IgG
  处理                             平均关节炎评分   天   19   20   21   22   23   25   26   27   大鼠IgG@200μg   1.53   1.73   1.93   2.27   2.53   4.20   4.27   4.53   93-10C@200μg   0.47   0.80   1.00   1.00   1.13   2.20   2.27   2.87   地塞米松-21-P@1mpk   0.07   0.07   0.07   0.00   0.00   0.00   0.07   0.20   处理时间   P＜0.05对大鼠IgG
实施例2.2.L.4：脓毒性关节炎
IL-18在脓毒性关节炎的小鼠模型的发病机理中是重要因子。一 般不认为这是RA的模型，但是同样有一些炎性成分和与RA相关的病 理。在这个模型中，向膝关节注射活B组链球菌(GBS)诱发疾病。跟 着发生的关节炎的严重度与IL-10和IL-6的全身和局部水平有关，而 与TNF无关(Tissi L.，等(1999)Infect.Immunol.67：4545- 50)。用血清型IV(GBS)注射后12小时这样早就在关节中测定了显著 IL-18水平，接着在5天之后IL-18产生达到峰值(处理的1C5中～ 550pg/ml，对IgG对照物中～30pg/ml)。注射后5天在血清中测 得提高的IL-18水平(处理的1C5中～180pg/ml，对IgG对照物中～ 20pg/ml)。
在施用GBS之前1小时注射1C5时，从第二天至第十天关节损伤 频率有显著抑制作用(关节指数：处理的1C5中1.0，对IgG对照物中 2.5)。另外，1C5处理还导致关节中细胞因子包括IL-6和IL-1β的水 平显著减小(没有给出数据)。
实施例2.2.L.5：SLE
大多研究的狼疮模型涉及小鼠品系(MRL/lpr和NZB/NZW F1)， 该小鼠品系自发发生狼疮样症状，伴有严重肾小球肾炎，自身抗体产生 (抗-DNA，抗RNP等)，脾大，淋巴结病，和一定程度关节炎和结节性脉 管炎。通常在3-5月龄时观察到肾涉及，发展快速，6-10个月是致命 的。充分研究两个小鼠品系，弄明白了临床疾病。
选择NZB/NZW F1(B/W)小鼠模型(The Jackson Laboratory， Maine，USA)作为评价外源IL-18对狼疮样疾病进程的影响的最相关 模型。通常在7-9月龄发现B/W小鼠开始疾病进程，12-14个月作为 肾衰竭结果是致命的。为了研究狼疮发病机理中IL-18的作用，在7月 龄开始每天用r-muIL-18或赋形剂对照物治疗B/W小鼠。通过测定蛋 白尿程度评价肾功能。与PBS赋形剂治疗组相比，每天用50微克/千 克IL-18治疗B/W小鼠导致促进严重蛋白尿的开始。IL-18治疗的 B/W小鼠还显示加速死亡。这些观察与上面对于MRL/lpr小鼠描述的 那些相吻合，并且划线于自身免疫基本中IL-18的促炎作用。
为了研究SLE小鼠模型中IL-18阻断的治疗效果，建立了B/W小 鼠诱导-保持处理方案，它概括了用于狼疮肾炎的临床治疗法。在该项 研究中，严重肾炎的B/W小鼠接受5周环磷酰胺给药(诱导期)，接着是 长期1C5或小鼠IgG对照(125-2H)处理(保持期)。
结果证明，与对照物IgG1 125-2H相比，继续130天保持处理，1C5 显著延长了BW小鼠的存活期。125-2H是小鼠IgG1 mAb，它不识别 muIL-18(P＜0.05，)。除了延长存活期，延迟了严重蛋白尿的开始， 降低了1C5处理的BW小鼠中的IgG2a和IgG1抗-dsDNA。1C5处理对 抗-dsDNA的减少是瞬时的，不是统计学意义的。检测抗1C5抗体(小 鼠抗-小鼠抗体[MAMA])，根据存活率的迅速降低和在抗dsDNA滴度 和蛋白尿减少中作用的丧失所证明的，130天之后效能丧失。结论是， 尽管抗体的存在响应1C5，1C5阻断IL-18延长存活期，延迟严重蛋白 尿的发生，并且减小B/W小鼠抗-dsDNA滴度。这些数据证明IL-18在 促进炎症响应中的作用导致肾功能缺损，最后死亡。
实施例2.2.L.6：多发性硬化
研究了IL-18对试验性变应性脑脊髓炎(EAE；MS鼠模型)的贡 献。认为复发-缓解EAE是人类疾病的适当模型，因为有相似的疾病 过程，临床征兆，和CNS病理学。在这些研究中，对IL-18KO小鼠和 WTC57/B16诱导疾病。
IL-18KO小鼠表现出与WT小鼠相比疾病症状发生稍微延迟，在后 来的时间点，疾病发展严重程度显著减小(表18)。在免疫后0-14 天，用BA77(抗-小鼠IL-18IgG(250毫克，2X/wk)处理WT小鼠， 在后来的时间点延迟疾病病症的发生并且显著限制疾病的严重程度 (表18)。在后来的时间点，即使在停止治疗之后，还能观察到抗-IL-18 IgG的保护作用。
表18抗-IL-18Ab处理的小鼠和IL-18敲除小鼠发生严重度减 小的EAE疾病   免疫后第14天   平均临床评分   SJL/J小鼠中  IgG(BA77)   PLP诱导的EAE 抗-IL-18抗体   4   2.7   第18天平均临床评分   IL-18KO和WT大鼠中  WT   MOG诱导的EAE       KO   3.6   2.1
实施例2.2.L.7：肝损伤
刀豆球蛋白A(Con A)-诱导的肝炎/肝损伤是T-细胞-介导肝病的 动物模型。Con A对肝内T-细胞的激活导致局部产生炎性传递质介体 (例如IFNγ和Fas配基)。Fas-Fas配基相互作用导致IL-18的产生， 其进一步诱导IFNγ，Fas配基和TNF产生。因此，确立阳性反馈圈， 其导致肝损伤和将死细胞过量产生肝酶例如ALT和AST。在静脉内施 用150微克Con A之前1小时，注射(ip)1C5或93-10C mAbs。Con A注射后24小时对小鼠取血，并且测定肝酶(ALT&AST)的血清滴度。 1C5和93-10C都阻断LPS-诱导的肝酶提高，但是在低剂量时93-10C 也有效(表19)。
表19  93-10C对ConA-诱导的肝炎的体内抑制   处理   AST   stdv   ALT   stdv   PBS   57   16   30   2   ConA只有   1138   416   1294   481   ConA+93-10C(50ug)   183   70   153   88   ConA+93-10C(12.5ug)   635   427   443   256   ConA+大鼠IgG1(50ug)   3924   1062   3455   753
实施例2.2.L.8：脓毒症
IL-18已经显示是内毒素休克的重要的传递质。IL-18可能是内 毒素诱导的肺，肝和多器官衰竭的决定性介体(Neeta，M.G.，等(2000) J.Immunol.164：2644-2649)。IL-18的这种作用可能以其调节细 胞毒性介体产生的能力以及其激活先天免疫应答的能力和对局部炎症 部位补充嗜中性白细胞的能力为基础。另外，LPS攻击诱导IFNγ，TNF 和IL-1血清水平升高，这些细胞因子对LPS-诱导的死亡率有贡献。 用LPS攻击的IL-18敲除小鼠LPS-诱导IFNγ不足，并且比WT小 鼠产生少得多的TNF和IL-1(Takeda，K.，等(1998)Immunity 8： 383-390)。
如下进行LPS诱导死亡率实验。第0天对动物称重并且确定合适 的给药剂量。在T＝-1小时，用500微升0.9％盐水中抗-IL-18抗 体或对照抗体对动物腹膜内(IP)注射。在T＝0，用100微升0.9％盐 水中20毫克/千克脂多糖(LPS)(大肠杆菌血清型0111：B4 Sigma Cat#L-4130 lo#71K4110)对动物静脉内注射。4小时后，通过心脏 穿刺对动物采血。通过muIFNy ELISA(R&D Systems)测定血清muIFN γ滴度。
保护用抗-muIL-18mAbs，1C5或93-10C处理的WT小鼠免受LPS- 诱导的致死率(表20)(125-2H，和1C5具有相同的失活同位型，但是 不结合作为对照物的muIL-18)。另外，据报道，抗-IL-18IgG处理的 小鼠在LPS攻击之后具有减小的肺和肝损伤，这与减少的嗜中性白细 胞聚集有关(Neeta，M.G.，等(2000)J.Immunol.164：2644- 2649)。
表20  1C5和93-10CmAbs防止高剂量LPS致死性     致死性                                 存活百分率     时间(小时)     0     8     24     32     48     56     72     120     144     盐水     100     100     100     50     10     10     10     10     10     125-2H@400     100     100     80     70     10     10     10     10     10     1C5@400μg     100     100     100     90     80     80     80     80     80
  致死性                               存活百分率   时间(小时)     0     8     24     32     48     56     72     120     144   盐水     100     100     90     40     10     10     10     10     10   大鼠IgG@100μg     100     100     100     100     70     40     40     40     40   93-10C@100μg     100     100     100     100     100     100     100     100     100
实施例2.2.M：2.5(E)Fab片段的结晶
为了证明本发明的抗体能被结晶，从而能制备含有结晶抗体的制 剂和组合物，进行下面的实验。
实施例2.2.M.1：2.5(E)抗体Fab片段的制备和纯化
在SR-286培养基中在CHO细胞中表达2.5(E)人IgG。溶胞之后上 清液通过0.5微米过滤器过滤并且加载到在Protein A缓冲剂A(1XPBS) 中预平衡的Protein A柱上。然后用Protein A缓冲剂B(0.1M乙 酸钠pH 3.5，150 mM NaCI)洗脱IgG。将合并的IgG浓缩至20毫 克/毫升，与50％木瓜蛋白酶凝胶浆状物混合，巨烈搅拌下在37℃ 下温育24小时。然后4℃下抗体/浆液混合物对50mM Tris缓冲剂 pH 7.0透析过夜，从缓冲剂去除半胱氨酸。通过用100毫升缓冲剂A (50mM Tris pH 7.0)制备25毫升蛋白质A琼脂糖4 Fast Flow亲和 柱(Amersham Pharmacia)。透析的上清液应用到亲和柱上(流速2毫 升/分钟)。在流通池中收集2.5(E)Fab级分(在280nm下通过UV吸 光度测定)。将含有浓度大于0.3毫克/毫升(在280nm下通过UV 吸光度测定)的2.5(E)Fab的级分合并，并且使用Ultrafree-15 Biomax 10kDa截留分子量(MWCO)离心过滤装置(Millipore)浓缩 至-20毫克/毫升并且在-80℃下冷冻。在下面描述的结晶学实验中 使用该浓缩样品。应用SDS-PAGE测定样品纯度。
实施例2.2.M.2：2.5(E)Fab片段的结晶
冷冻2.5(E)Fab贮存液(～20毫克/毫升)在冰上解冻。Fab(2 微升)与2微升的由25-30％聚乙二醇(PEG)400，100mM CAPS pH 10.5 组成的贮存液混合，并且在大约4℃下在硅化玻璃载玻片下面的贮存液 上悬浮。一天之内出现杆状晶体。测得杆状晶体是2.5(E)Fab片段晶 体(没有给出数据)。
实施例3：IL-18响应基因
实施例3.1：材料和方法
实施例4中，除非另有说明，使用下面的材料和方法。
实施例3.1.A：细胞处理和RNA制备
实施例3.1.A.1：KG-1细胞
在四个处理组中，对各试验条件使用大约3.0×107个KG1细胞 (ATCC#CCL-246)。首先，有或没有与10毫克/毫升放线菌酮预先温 育30分钟情况下，用50ng/mL重组IL18处理细胞。30分钟之后或2 小时之后，对细胞收集RNA。其次，有或没有与10毫克/毫升放线 菌酮预先温育30分钟情况下，用0，0.5，2.0，10或50ng/mL重组IL18 处理细胞。2小时之后，对细胞收集RNA。第三，用0或10ng/mL TNF 处理细胞。过夜温育之后，有或没有与10毫克/毫升放线菌酮预先 温育30分钟情况下，用0，0.5，2.0，10或50ng/mL重组IL18处理 细胞。2小时之后，对细胞收集RNA。在最后的处理组中，有或没有 与10毫克/毫升放线菌酮预先温育30分钟情况下，用0或10ng/mL TNF和0或2.0ng/mL重组IL18同时处理细胞。2小时之后，对细胞 收集RNA。
使用TRIZOL试剂(Life Technologies，Rockville，MD)制备总 RNA。根据生产商说明进行初始阶段分离，并且接着使用一半体积的 苯酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1，Life Technologies，Rockville，MD) 进行另外的萃取。根据生产商TRIZOL程序说明进行RNA沉淀和洗涤。 在1.0％琼脂糖/甲醛变性凝胶上对大约3微克RNA进行电泳测定性 质。
对于需要TNF预先温育的实验，KG-1细胞与2ng/ml TNF温育12 小时，然后用2，10或40ng/ml的IL-18刺激。如上所述制备RNA。
实施例3.1.A.2：人全血分析
2.5mL等份全血装入15毫升圆锥形试管并且用IL18，IL12， IL18+IL12，IL18+IL12+抗-IL18或IL18+1L12，IL18+1L12+对照抗 体处理。最终浓度如下：IL12-500pg/mL，IL18(YK27-1)～50ng/mL， mIgG～5ug/mL，抗-IL18 1252H～5ug/mL，和抗-IL18 2.5～4ug/mL。 37℃下，温和地间歇式地反转下将混合物温育。温育之后，通过加入5 毫升1X溶胞缓冲液(在Depc中以1：10稀释的PharM溶解氯化铵溶 解试剂)，利用氯化铵回收红细胞。在冰上5分钟之后，以1200rpm 将混合物离心5分钟。将该程序重复一次，得到白色血白细胞沉淀物。 接着应用上述Trizol程序分离RNA。对于微量阵列分析，所有的样品 体积增加4倍。
实施例3.1.B：探针的制备和靶物杂交
使用10微克总RNA和用于cDNA合成的SuperScript Choice System(Gibco BRL，Gaithersburg，MD)来合成双链cDNA。根据 Affymetrix(Santa Clara，CA)程序进行合成，需要T7-(dT)24寡 聚物引物(GENSET)代替试剂盒提供的寡(dT)或随机引物，并且在温度 调节和第一个链合成步骤期间在42℃下温育。得到的cDNA用Phase Lock Gel Light 2毫升试管(Eppendorf AG，Hamburg，DE)清洗， 沉淀物悬浮于12微升DEPC-H2O。与BioArray High Yield RNA转录 标记试剂盒(Enzo，Farmingdale，NY)联合使用5微升cDNA，通过 从T7RNA聚合酶启动子体外转录(IVT)，制备生物素-标记cRNA靶物。 使用RNeasy Mini Columns(Qiagen，Hilden，DE)从IVT反应去除 游离的核苷酸。然后根据Affymetrix方法将15微克生物素-标记的 cRNA片段化。将全部片段化样品与5微升对照物寡核苷酸B2 (Affymetrix)，15微升20X Eukaryotic Hybridization Control (Affymetrix)，3微升超声处理的鲑精DNA(10毫克/毫升， Stratagene，La Jolla，CA)，3微升乙酰化BSA(50毫克/毫升， Gibco BRL)，150微升2X MES杂交缓冲液，和水，达到300微升终体 积。根据Affymetrix方法，预先用1X MES湿润Genechip HuGeneFL Arrays(Affymetrix)。然后将杂交混合物加热并离心，并且将200 微升加载到芯片上。芯片在45℃烤箱中自旋16小时。
实施例3.1.C：对探针阵列洗涤，染色和扫描
从芯片取出杂交混合物并且用非严谨洗涤缓冲液置换。利用 EukGE-WS2方案，在GeneChip Fluidics Station 400上，根据生产 商说明书(Affymetrix)；用链霉抗生素素蛋白藻红蛋白(SAPE)染色溶 液和抗体溶液对芯片染色的方法，将芯片洗涤和染色。所有的需要的 缓冲洗涤液和染色剂都根据Affymetrix方法制备。与GeneChip software(Affymetrix)联合使用GeneArray Scanner(Agilent， Palo Alto，CA)来扫描染色阵列。
实施例3.1.D：数据分析
基因芯片数据从Affymetrix MAS4传给Microsoft Excel，然 后上载到Spotfire Decisionsite 7.0。
实施例3.2：IL-18调控的基因表达
实施例3.2.1：单独的IL18直接调控基因在KG1细胞中形成股
为了测定IL18直接调控的转录体，在存在和不存在蛋白质合成抑 制剂放线菌酮下，使用KG1细胞进行细胞因子滴定试验。表1所示的 是在存在和不存在放线菌酮的至少一种条件下已经被调控2倍或更多 的67个不同探针组(由于芯片上的冗余性)代表的62个转录体的列 表，p值小于0.05(利用斯氏t分析)。这些基因包括各种功能分类， 包括转录因子，激酶，和分泌的蛋白质。因为这些基因是受调控的，没 有从头合成蛋白质，这些基因直接响应IL18诱导的信号。12个基因 编码分泌的蛋白质，并且13个编码表面分子(制备这些可行抗体靶 物)。其余编码细胞核和胞质蛋白质(见表21)。
表21.IL18诱导的基因 Genbank ID   位置/   功能   基因名称   Unigene备注   0.5   ng/ml   2   ng/ml   10   ng/ml   50   ng/ml L29217   激酶   CLK3   CDC-样激酶3   9.1   7.4   8   15.0 D14497   激酶   MAP3K8   促细胞分裂剂-激活的蛋白质激酶激酶激酶8   6.6   2.9   5.8   3.9 L19871   两个都不   ATF3   激活转录因子3   1.0   1.1   3.3   2.6 U15460   两个都不   BATF   碱性亮氨酸拉链转录因子，ATF-样   1.5   1.7   2.4   2.8 U45878   两个都不   BIRC3   包含杆状病毒IAP重复3   7.0   6.2   10.2   10.0 U37546   两个都不   BIRC3   包含杆状病毒IAP重复3   29.4   26.9   76.6   63.6 U72649   两个都不   BTG2   BTG家族，成员2   3.1   4.7   6.6   5.9 L07765   两个都不   CES1   羧酸酯酶1   1.0   1.3   2.1   2.1 M27691   两个都不   CREB1   cDNA响应元件结合蛋白1   0.9   2.4   4.9   3.1 HG3548- HT3749   两个都不   CUTL1   切补(CCAAT替代蛋白质)   2.5   2.1   1.3   0.7 X59131   两个都不   D13S106E   高电荷蛋白质   2.1   0.5   1.5   2.3 U53445   两个都不   DOC1   卵巢癌1中负调节   2.0   3.3   3.0   3.8 X68277   两个都不   DUSP1   双重特异性磷酸酶1   2.5   3.1   4.1   3.3 U48807   两个都不   DUSP4   双重特异性磷酸酶4   2.0   2.3   2.9   2.0 X52541   两个都不   EGR1   早期生长响应1   15.5   12.7   32.4   20.3 X63741   两个都不   EGR3   早期生长响应3   5.9   7.3   15.1   9.0 L07077   两个都不   EHHADH   烯脂酰辅酶A   3.4   2.3   1.8   2.5 M62831   两个都不   ETR101   即时早期蛋白质   3.4   5.8   6.3   6.8 L19314   两个都不   HRY   毛发(果蝇)同系物   2.3   2.5   2.3   2.0 S81914   两个都不   IER3   即时早期响应3   17.0   18.6   32.9   29.6 X51345   两个都不   JUNB   jun B原癌基因   7.2   6.1   10.7   96 U20734   两个都不   JUNB   jun B原癌基因   10.2   21.8   25.0   25.4 U49957   两个都不   LPP   包含LIM结构域   2.2   1.1   2.0   1.9 M58603   两个都不   NFKB1   核因子κB(p105)   1.6   2.0   2.9   2.3 S76638   两个都不   NFKB2   核因子κB   1.7   2.2   3.5   4.3 M69043   两个都不   NFKBIA   核因子κB   9.6   10.4   15.5   15.8 U91616   两个都不   NFKBIE   核因子κB   11.6   14.8   20.7   21.0 L13740   两个都不   NR4A1   核受体亚家族4，族A，成员1   2.0   2.7   2.4   2.5 HG4115- HT4385   两个都不   OR1E3P   嗅感受蛋白   4.5   12.0   4.2   4.1 L20971   两个都不   PDE4B   磷酸二酯酶4B，cAMP-特异性   2.4   2.8   4.2   3.5 U64675   两个都不   RANBP2L1   RNA结合蛋白2-样1   1.1   1.8   2.2   2.2 S57153   两个都不   RBBP1   成视网膜细胞瘤-结合蛋白1   2.5   3.4   5.0   4.1 X75042   两个都不   REL   v-rel   1.6   2.5   3.9   3.7 M83221   两个都不   RELB   v-rel   2.3   2.8   2.8   2.6 S59049   两个都不   RGS1   G-蛋白质信号调控剂1   10.9   12.7   22.4   17.8 U70426   两个都不   RGS16   G-蛋白质信号调控剂16   3.9   4.7   7.5   6.7 U22377   两个都不   RLF   重排L-myc融合序列   2.5   2.0   2.5   2.6 M95787   两个都不   TAGLN   转凝蛋白   6.6   4.7   1.0   1.6 L47345   两个都不   TCEB3   转录延伸因子B(110kD，延伸   蛋白A)   3.6   5.3   2.3   4.2 M59465   两个都不   TNFAIP3   肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白质3   9.9   12.4   25.4   20.6 U19261   两个都不   TRAF1   TNF受体结合因子1   2.8   2.8   4.9   4.1 U78798   两个都不   TRAF6   TNF受体结合因子6   1.2   2.0   2.1   2.2 M37435   分泌的   CSF1   集落刺激因子1(巨噬细胞)   2.9   2.9   2.1   2.6 M57731   分泌的   GRO2   GR02致癌基因   15.2   20.9   26.3   27.0 X53800   分泌的   GRO3   GR03致癌基因   4.1   5.5   14.8   9.9 X04500   分泌的   IL1B   白介素1，β   2.2   3.4   5.7   4.7 M28130   分泌的   IL8   白介素8   6.2   10.0   13.4   14.5 Y00787   分泌的   IL8   白介素8   5.8   7.4   8.3   8.5 U89922   分泌的   LTB   淋巴毒素β(TNF超家族，成员3)   5.0   5.7   11.0   12.8
Genbank ID   位置/   功能   基因名称  Unigene备注   0.5   ng/ml   2   ng/ml   10   ng/ml   50   ng/ml M31166   分泌的   PTX3  Pentaxin-相关基因，IL-1β  快速诱导   3.1   5.2   10.3   6.4 M23178   分泌的   SCYA3  小的可诱导细胞因子A3   1.8   2.0   5.0   3.8 M69203   分泌的   SCYA4  小的可诱导细胞因子A4   0.9   1.9   7.0   5.6 J04130   分泌的   SCYA4  小的可诱导细胞因子A4   1.0   2.6   5.9   4.5 M92357   分泌的   TNFAIP2  肿瘤坏死因子，α-诱导蛋白质2   4.2   6.4   20.3   19.3 Z32765   表面   CD36  CD36抗原(胶原I型/TSP受体)   1.6   2.0   1.4   1.2 Z11697   表面   CD83  CD83抗原   4.7   8.2   19.6   16.7 M57730   表面   EFNA1  肝配蛋白-A1   9.8   6.0   9.5   15.2 A28102   表面   GABRA3  γ-氨基丁酸(GABA)受体   3.0   2.5   1.6   2.7 M24283   表面   ICAM1  细胞胞间粘着分子1(CD54)   7.5   11.5   14.5   13.9 M55024   表面   ICAM1  细胞胞间粘着分子1(CD54)   2.5   3.4   3.2   3.7 J03171   表面   IFNAR1  干扰素(α，β和ε)受体1   3.2   2.5   2.8   2.6 X01057   表面   IL2RA  白介素2受体，α   0.7   0.4   3.9   3.6 L10338   表面   SCN1B  钠通道肽   1.8   2.3   1.5   1.5 D79206   表面   SDC4  黏结蛋白聚糖4(双栖蛋白聚糖，抗凝蛋白聚糖)   4.0   4.2   7.2   6.1 HG961- HT961   表面   SOS1  Sos蛋白(果蝇)同系物1   6.3   6.2   9.1   9.9 X83490   表面   TNFRSF6  肿瘤坏死因子受体成员6   1.1   1.3   3.8   3.3 U19523   两个都不   GCH1  GTP环化水解酶1   2.1 U37518   表面   TNFSF10  肿瘤坏死因子受体成员10   1.4   1.4   2.3   1.6
实施例3.2.2：细胞因子暴露历史影响KG-1细胞对IL-18的响 应
因为在免疫应答中细胞因子一般接着出现，对IL18处理之前与 TNF一起温育KG-1细胞的效果进行分析。该项试验还验证了细胞因子 暴露历史可以影响它们对接着的细胞因子暴露的响应的假设。在加入 IL18之前用2ng TNF将细胞处理12小时并且在4小时之后收获。
IL18调控这些条件下大约125种基因的表达(表2)。获得这组基 因使用的过滤条件由于TNF而变化小于50％，由于10ng/mL和40ng/mL IL18而变化两倍或更大。这些基因包括各种各样的功能分类，包括转 录因子，激酶，和分泌的蛋白质(表22)。与这里试验的其他条件相反， 我们发现干扰素γmRNA和暴露TNF之后IL18诱导的蛋白质。
表22.TNF处理后IL18调控的基因
 Genbank ID   基因名称   Unigene备注   折叠10ng   折叠40ng  J00219   IFNG   干扰素，γ   26.3   31.8  U17034   PLA2R1   磷酸酯酶A2受体1，180kD   29.6   28.7  M57710   LGALS3   凝集素，半乳糖苷-结合，可溶性，3(半乳凝集素3)   27.5   25.4  X97748   PTX3   pentaxin-相关基因，IL-1诱导的   15.2   13.6  M27288   OSM   制瘤素M   23.1   12.0  X57809   λ轻链可变区   10.9   10.0  Y00081   IL6   白介素6(干扰素，β2)   9.2   9.4  D16583   HDC   组氨酸脱羧酶   8.0   9.4  X07730   KLK3   血管舒缓素3(前列腺特异性抗原)   5.6   8.8  HG3111-HT3287   未知的人克隆HH409   9.5   7.5  M57732   TCF1   肝核因子(HNF1)   2.0   7.2  U77735   PIM2   pim-2致癌基因   7.1   7.1  U96094   SLN   sarcolipin   12.2   6.1  D50640   PDE3B   磷酸二酯酶3B，cGMP-抑制的   4.0   5.4  X14008   LYZ   溶菌酶(肾淀粉样变性)   3.0   5.4  M91036   HBG2   血红素，γG   3.4   5.4  X72755   MIG   γ干扰素诱导的单核因子   5.2   5.2  AC000099   GRM8   谷氨酸受体，代谢型8   2.3   4.3  D11428   PMP22   外周髓磷脂蛋白质22   5.0   4.0  M83667   CEBPD   CCAAT/增强子结合蛋白   4.3   4.0  L19267   DMWD   肌强直性营养不良，WD重复基序   3.0   3.8  M81181   ATP1B2   ATP酶，Na+/K+运输   3.5   3.8  U79249   人克隆23839序列   3.1   3.7  U49973   FLJ10803   假定蛋白FLJ10803   3.2   3.6  HG870-HT870   GOLGA3   高尔基体自身抗原，高尔基体亚家族a，3   3.5   3.6  X13589   CYP19   细胞色素P450，亚家族XIX   3.0   3.5  AB000464   克隆：RES4-24A   2.9   3.5  M96956   TDGF1   畸胎瘤-产生的生长因子1   2.6   3.5  U31628   IL15RA   白介素15受体，α   6.4   3.3  D38128   PTGIR   前列腺素I2(前列腺环素)受体(IP)   8.8   3.3  J03507   C7   补体成分7   2.3   3.1  M32011   NCF2   嗜中性白细胞胞质因子2   3.5   3.0  X63131   PML   前髓细胞白血病   4.7   3.0  D82326   SLG3A1   溶质载体家族3   4.0   3.0  L10343   PI3   蛋白酶抑制剂3，皮肤-产生的(SKALP)   2.1   3.0  U89995   FOXE1   叉头盒E1(甲状腺转录因子2)   2.6   2.9  M62800   SSA1   (52kD，核糖核蛋白自身抗原SS-A/Ro)   3.1   2.9  AB000584   PLAB   前列腺分化因子   2.4   2.8  U37519   ALDH8   醛脱氢酶8   2.2   2.7  D21267   SNAP25   突触体-结合蛋白，25kD   2.2   2.7  M25667   GAP43   生长相关蛋白43   2.5   2.7  L34357   GATA4   GATA-结合蛋白4   2.3   2.7  U43944   ME1   苹果酶1，NADP(+)-依赖性，胞质   3.0   2.7  M16937   HOXB7   同源异型框B7   2.9   2.6  U27326   FUT3   岩藻糖转移酶3   2.6   2.6
  Genbank ID   基因名称   Unigene备注   折叠10ng   折叠40ng   Z23115   BCL2L1   BCL2-样1   2.2   2.6   HG1877-HT1917   MBP   髓磷脂碱性蛋白   2.4   2.6   D10995   HTR1B   5-羟酪胺(血清素)受体1B   2.5   2.6   M91463   SLC2A4   溶质载体家族2葡萄糖转运蛋白   3.1   2.5   U19878   TMEFF1   跨膜蛋白，EGF和促滤泡素抑制素样   2.9   2.4   U66468   CGR11   带有EF-hand结构域的细胞生长调控   2.2   2.4   U44848   NRF1   核呼吸因子1   3.5   2.4   U73328   DLX4   distal-less同源异型框4   3.2   2.4   HG4593-HT4998   电压控制钠通道(SCNlA)   2.3   2.4   X78710   MTF1   金属调节转录因子1   2.7   2.4   X59727   MAPK4   促细胞分裂剂-激活蛋白质激酶4   2.3   2.4   J03600   ALOX5   花生四烯酸5-脂加氧酶   2.2   2.3   U87269   E4F1   E4F转录因子1   3.4   2.3   Y10375   PTPNS1   酪氨酸磷酸酶，非受体作用物1   4.5   2.2   D49958   GPM6A   糖蛋白M6A   3.3   2.2   U60062   FEZ1   成束和伸长蛋白质ζ1(zygin)   3.3   2.2   X14830   CHRNB1   胆碱能受体，烟碱，β多肽1   2.4   2.1   J04076   EGR2   早期生长响应2(Krox-20同系物)   3.0   2.1   HG2981-HT3127   CD44   CD44抗原   2.2   2.1   U49187   C6ORF32   染色体6开放读框32   3.8   2.1   X77744   人FLJ00032蛋白质，部分   2.3   2.1   X68285   GK   甘油激酶   2.4   2.0   HG3925-HT4195   SFTPA2   表面活性剂，肺-相关蛋白质A2   3.9   2.0   M26062   IL2RB   白介素2受体，β   0.2   0.5   X06182   KIT   V-试剂盒致癌基因同系物   0.4   0.5   U79251   OPCML   阿片样物质-结合蛋白/细胞粘着分子-样   0.5   0.5   J03764   SERPINE1   连接蛋白，纤溶酶原激活剂抑制剂1型   0.5   0.5   X92814   HREV107   与大鼠HREV107类似物   0.3   0.5   L01087   PRKCQ   蛋白激酶C，θ   0.2   0.5   D43772   GRB7   生长因子受体-结合蛋白7   0.2   0.5   X15880   COL6A1   胶原VI型，α1   0.5   0.5   HG3115-HT3291   MBP   髓磷脂碱性蛋白   0.4   0.5   X83301   SMA3   SMA3   0.5   0.5   D87469   CELSR2   钙黏着蛋白，EGF LAG七跨膜区G-型受体2   0.4   0.5   M11313   A2M   α-2-巨球蛋白   0.4   0.4   X64877   HFL3   H因子(补体)-样3   0.4   0.4   Z18859   GNAT2   鸟嘌呤核苷酸结合蛋白(G蛋白)   0.4   0.4   D89077   SLA   Src-样-接头   0.4   0.4   L25444   TAF2E   TATA盒结合蛋白(TBP)-相关因子   0.2   0.4   M26665   HTN3   Histatin3   0.4   0.4   S69790   WASF3   WAS蛋白质家族，成员3   0.4   0.4   U79248   人克隆23826序列   0.4   0.4   L15309   ZNF141   锌指蛋白141(克隆pHZ-44)   0.3   0.4   L41147   HTR6   5-羟酪胺(血清素)受体6   0.4   0.4   X58431   HOXB6   同源异型框B6   0.4   0.4   U50360   CAMK2G   CaM激酶IIγ   0.2   0.4   D88152   ACATN   乙酰辅酶A转运蛋白   0.4   0.4   U38480   RXRG   视网膜样X受体，γ   0.3   0.4   X16866   CYP2D7AP   细胞色素P450，亚家族IID   0.4   0.4
 Genbank ID   基因名称   Unigene备注   折叠10ng   折叠40ng  X70991   NAB2   NGFI-A结合蛋白2(ERG1 bp2)   0.2   0.4  M60830   EVI2B   嗜亲性病毒整合位点2B   0.4   0.4  M27492   ILIR1   白介素1受体，I型   0.4   0.4  Z35093   SURF1   马荨麻疹1   0.4   0.4  D86425   NID2   巢蛋白2   0.3   0.3  U59914   MADH6   MAD)同系物6   0.4   0.3  M18255   PRKCB1   蛋白质激酶C，β1   0.4   0.3  AF000234   P2RX4   嘌呤能受体P2X   0.3   0.3  S77763   NFE2   核因子(红细胞-产生的2)，45kD   0.4   0.3  U78722   ZNF165   锌指蛋白165   0.3   0.3  L05568   SLC6A4   溶质载体家族6(血清素)   0.3   0.3  L31529   SNTB1   肌养蛋白-相关蛋白A1   0.3   0.3  U47054   ART3   ADP-核糖基转移酶3   0.4   0.3  M13955   KRT7   角蛋白7   0.4   0.3  D15049   PTPRH   蛋白质酪氨酸磷酸酶，受体型，H   0.4   0.3  U03486   GJA5   间隙连接蛋白，α5，40kD(连接蛋白)   0.5   0.3  X06256   ITGA5   整联蛋白，α5   0.4   0.3  U22314   REST   RE1-缄默转录因子   0.3   0.3  U51096   CDX2   尾侧型同源异形框转录因子2   0.2   0.2  D31762   KIAA0057   TRAM-样蛋白   0.4   0.2  M23668   FDX1   铁氧化还原蛋白1   0.2   0.2  U53476   WNT7A   无翼型MMTV整合位点家族   0.2   0.2  X57206   ITPKB   肌醇1，4，5-三磷酸酶3-激酶B   0.2   0.2  Z31695   INPP5A   肌醇聚磷酸酶-5-磷酸酶，40kD   0.4   0.2  S66793   ARR3   视紫红质抑制蛋白3，视网膜的(X-抑制蛋白)   0.2   0.2  U59877   RAB31   RAB31，成员RAS致癌基因家族   0.2   0.2  U53786   EVPL   外被斑蛋白   0.2   0.2  S83362   LIFR   白血病抑制因子受体   0.3   0.2  D42038   KIAA0087   KIAA0087基因产物   0.3   0.2  HG4333-HT4603   ZNF79   锌指蛋白79(pT7)   0.1   0.1  L01406   GHRHR   生长激素释放激素受体   0.4   0.1
实施例3.2.3：人白细胞对IL18的响应
试验了人白细胞(分离的白细胞生成)对单独的IL18或者与IL12 联合的IL18的响应。也分析了抗-IL18单克隆抗体抑制转录应答的能 力。根据实施例4.1所述处理细胞。分离RNA并且用于探测Affymetrix Genechips(Hugene，FL)。表23给出结果，列出了IL18+IL12诱导的 被抗-IL18抗体反转的49个转录物。几种基因与免疫系统有关。这些 基因中的很多也由KG-1细胞中的IL18诱导。
表23.根据使用Affymetrix Genechips所测定的，从人白细胞 样品中IL18+IL12正调节4倍或更多并且由125 2H反转的转录物中 选择的其他有效IL18/IL12标记物
  基因名称   Unigene备注   Unigene   KIAA0001   假定G蛋白偶联受体，用于UDP-葡萄糖   Hs.2465   LIMK2   LIM结构域激酶2   Hs.278027   KIAA0196   KIAA0196基因产物   Hs.8294   IFNG   干扰素，γ   Hs.856   POLR2C   聚合酶(RNA)II多肽   Hs.79402   DAG1   营养不良蛋白聚糖1   Hs.76111   TPSB1   类胰蛋白酶β1   Hs.250700   CDR2   小脑变性-相关蛋白质(62kD)   Hs.75124   TCF12   螺旋-环-螺旋转录因子4   Hs 21704   TACTILE   晚期表达增加的T细胞激活   Hs.142023   PIP5K2A   磷脂酰肌醇-4-磷酸5-激酶   Hs.108966   SF3A3   剪接因子3a，亚基3，60kD   Hs.77897   SEL1L   sel-1(lin-12的抑制剂，C.elegans)-样   Hs.181300   IL15   白介素15   Hs.168132   BAK1   BCL2-拮抗剂/杀伤者1   Hs.93213   SLAM   信号淋巴细胞激活分子   Hs.32970   SCYB11   小的可诱导细胞因子亚家族B(Cys-X-Cys)，成员11   Hs.103982   LIMK1   LIM结构域激酶1   Hs 36566   CAT56   CAT56蛋白质   Hs.118354   POLRMT   聚合酶(RNA)线粒体(DNA指示)   Hs.153880   SCYA4   小的可诱导细胞因子A4/Mip-1b   Hs.75703   MIG   γ干扰素诱导的单核因子   Hs.77367   SSX3   滑膜肉瘤，X断点3   Hs.178749   TNFRSF6   肿瘤坏死因子受体亚家族，成员6   Hs.82359   MAT1A   蛋氨酸腺苷转移酶I，α   Hs.323715   KIAA0133   KIAA0133基因产物   Hs.57730   FCGBP   IgG结合蛋白的Fc片段   Hs.111732   ARHD   Ras同系物基因家族，成员   Hs.15114   FGFR2   成纤维细胞生长因子受体2   Hs.278581   COL9A1   胶原，IX型，α1   Hs.154850   HPX42B   造血先祖同源异形框   Hs.125231   TAL2   T-细胞急性淋巴细胞白血病2   Hs.247978   ESTs   Hs.196244   REN   肾素   Hs.3210   POU2F2   POU结构域，2类，转录因子2   Hs.1101   ALOX12   花生四烯酸12-脂氧合酶   Hs.1200   ACTN2   辅肌动蛋白，α2   Hs.83672   KLK2   血管舒缓素2，前列腺的   Hs.181350
  基因名称 Unigene备注   Unigene   RCV1 恢复蛋白   Hs.80539   E2F4 E2F转录因子4，p107/p130-结合   Hs.108371   SEMA3F 免疫球蛋白结构域(Ig)，短的碱性结构域，分泌的，(脑信号蛋白)3F   Hs.32981   BHMT 甜菜碱-高半胱氨酸甲基转移酶   Hs.80756   EVPL 外被斑蛋白   Hs.25482   BBC3 Bcl-2结合成分3   Hs.87246   SLN Sarcolipin   Hs.15219   RDBP RD RNA-结合蛋白   Hs.106061   MT1H 金属硫蛋白   Hs.2667   RAD54L RAD54(啤酒糖酵母)-样   Hs.66718   MLL3 骨髓/淋巴样或混合-血统白血病3   Hs.288971
实施例3.2.4：人全血对IL18的响应
试验了全血细胞对单独的IL18或者与IL12联合的IL18的响应。 也分析了抗-IL18单克隆抗体抑制转录应答的能力。根据实施例4.1 所述处理正常的供体血样。分离RNA，并且用来探测Affymetrix Genechips(HugeneFL)。表24给出结果，它列出IL18+IL12显著调 控的并且抗-IL18抗体反转的从两名健康供体分离的全血样中16个转 录体。几个基因与免疫系统有关。我们应用定量PCR平行对10名正常 供体的这些基因中的三个测定响应。表25对于干扰素γ给出这个人 可变性研究的结果；表26给出CXCL9的结果，表27给出CCL8的结 果。可变性研究的结果表明，人血液中IL18对这些转录体的调控在 人中可能是普遍的。
表24.从两名供体分离的然后用IL18+IL12处理的全血正调节转 录体选择的其他IL18/IL12有效标记物   探针组ID   标题   Unigene   202284_s_at   细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂1A(p21，Cip1)   Hs.179665   202531_at   干扰素调控因子1   Hs.80645   204057_at   干扰素共有序列结合蛋白1   Hs.14453   205488_at   粒酶A(粒酶1，细胞毒素T-淋巴细胞相关丝氨酸   酯酶3)   Hs.90708   206554_x_at   SET结构域和mariner转座酶融合基因   Hs.265855   206817_x_at   包含三核苷酸重复单元4   Hs.26047   207509_s_at   白细胞-相关Ig-样受体2   Hs.43803   209546_s_at   载脂蛋白L，1   Hs.114309   214438_at   H2.0-样同源异形框1(果蝇)   Hs.74870
  214450_at   组织蛋白酶W(lymphopain)   Hs.87450   216950_s_at   FcRI b形式(AA1-344)[人]，mRNA序列   Hs.382006   217933_s_at   亮氨酸氨基肽酶3   Hs.182579   219386_s_at   B淋巴细胞激活剂，巨噬细胞表达的   Hs.20450   219956_at   UDP-N-乙酰基-α-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰基   氨基半乳糖基转移酶6   Hs.151678   219971_at   白介素21受体   Hs.210546   221223_x_at   细胞因子可诱导SH2-包含蛋白质   Hs.8257
表25.10个人血样中干扰素γ性能。全抗体的抑制作用p＜0.05  IFN   没有刺激的   刺激的   抗-IL18 2.5   抗-IL18 125-2H  供体3n   0.001   0.187   0.014   0.026  供体5n   0.003   0.012   0.006   0.006  供体9n   0.001   1.250   0.037   0.000  供体10n   0.002   0.361   0.024   0.002  供体1n   0.002   0.339   0.022   0.070  供体2n   0.001   0.032   0.003   0.003  供体4n   0.001   0.082   0.011   0.027  供体6n   0.002   0.076   0.006   0.010  供体7n   0.002   0.049   0.009   0.012  供体8n   0.002   0.049   0.009   0.012
表26.10个人血样中MIG/CXCL9性能。全抗体的抑制作用p＜ 0.05   CXCL9   没有刺激的   刺激的   抗-IL18 2.5   抗-IL18 125-2H   供体1   0.000   0.170   0.082   0.010   供体10   0.000   0.015   0.000   0.000   供体2   0.001   0.006   0.001   0.001   供体3   0.000   0.067   0.010   0.006   供体4   0.000   0.023   0.012   0.003   供体5   0.000   0.004   0.000   0.000   供体6   0.000   0.070   0.001   0.001   供体7   0.001   0.034   0.001   0.000   供体8   0.001   0.034   0.001   0.000   供体9   0.000   0.035   0.000   0.001
表27.10个人血样中MCP2/CCL8性能。全抗体的抑制作用p＜ 0.05
  CCL8   没有刺激的   刺激的   抗-IL18 2.5   抗-IL18 125-2H   供体1   0.036   8.941   4.054   1.051   供体10   0.004   0.987   0.009   0.025   供体2   0.036   1.225   0.105   0.057   供体3   0.012   3.923   0.648   0.663   供体4   0.021   2.227   0.994   0.630   供体5   0.001   0.005   0.001   0.001   供体6   0.000   0.023   0.002   0.001   供体7   0.001   0.009   0.001   0.001   供体8   0.001   0.009   0.001   0.001   供体9   0.001   2.438   0.003   0.059
实施例4：抗-IL-18HuMAb，2.13(E)mg1的表征
实施例4.1：人细胞因子特异性
应用BIACORE试验，根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)， 评价2.13(E)mg1对人IL-18的特异性。2.13(E)mg1捕获到生 物芯片商，并且测定其与溶液中一组已知人细胞因子结合的能力。如 图28所示，2.13(E)mg1结合重组成熟人IL-18。然而，2.13(E)mg1 不与人IL-18原结合，也不与试验的其他23种人细胞因子结合，包括 IL-1家族成员IL-1α和IL-1β。
表282.13(E)mg1和2.5(E)mg1对细胞因子结合的Biacore分 析 可溶性重组 人细胞因子，(1μM)   捕获的2.13(E)mg1   (25mg/mL)   捕获的2.5(E)mg1   (25mg/mL)   2.13(E)mg1结合   2.5(E)MG1结合 IFNγ   -   - IL-1α   -   - IL-Iβ   -   - 其它细胞因子a   -   - IL-18b   +   + Pro-IL-18   -   +
c用于结合试验的另外的细胞因子包括IL-2，IL-3，IL-4，IL- 5，IL-6，IL-7，IL-8，IL-9，L-10，IL-11，IL-12，IL-13，IL-15，L-16， IL-17，IL-21，TNF，LT，LTα1β2，和LTα2β1。2.13(E)mg1与这 些细胞因子的任一个都不结合。
半胱氨酸＞丙氨酸突变体BV衍生的重组人IL-18
实施例4.2：与其他抗体竞争结合人IL-18
应用BIACORE试验，根据生产商说明书(参见实施例2.1.B)，评 价几种抗-IL-18抗体与2.13(E)mg1竞争结合人IL-18的能力。简要 地说，多克隆抗-人或抗-小鼠抗体捕获到生物芯片上。然后，导入抗- IL-18抗体，并且用固定在上述生物芯片上的多克隆抗-人或抗-小鼠 (仅对125-2H)抗体(第一固定化抗体)捕获。然后导入重组人IL-18并 且由第一固定化抗体捕获。最后，导入第二可溶性抗-IL-18抗体。该 试验测定第二可溶性抗-IL-18抗体结合重组IL-18并且与第一抗体竞 争的能力。2.13(E)mg1不与2.5(E)mg1或IL-18BP竞争。鼠抗 -huIL-18单克隆抗体125-2H与2.13(E)mg1竞争结合人IL-18。
表29结合人IL-18的抗体竞争BIACORE a分析   20可溶性   Ab                                           10固定化Ab   125-2H   2.5(E)mg1   215   444   581   435   2.13(E)mg1   23   IL-18BP   125-2H   -   +   -   -   +   +   -   -   -   2.5(E)mg1   +   -   +   +   -   -   +   +   +   215   -   +   -   -   +   +   -   -   +   444   -   +   -   -   +   +   -   -   +   581   +   -   +   +   -   -   +   +   +   435   +   -   +   +   -   -   +   +   +   2.13(E)mg1   -   +   -   -   +   +   -   -   +   2.3   -   +   -   -   +   +   -   -   +   IL-18BP   +   +   +   +   +   +   +   +   -
+指第一和第二抗体同时结合
-指第二抗体不能结合捕获的IL-18
本发明参考了分子生物学领域公知的全部技术。这些技术包括， 但不限于，下面出版物中描述的技术：
Ausubel，F.M.等编著， Short Protocols In Molecular Biology(第四版1999)John Wiley & Sons，NY.(ISBN 0-471- 32938-X)。
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                       参考文献
美国专利
5,545,806    5,545,807    5,591,669    5,612,205    5,625,126
5,625,825    5,627,052    5,633,425    5,643,763    5,661,016
5,721,367    5,770,429    5,789,215    5,789,650    5,814,318
5,912,324    5,916,771    5,939,598    5,985,615    5,994,619
5,998,209    6,054,487    6,060,283    6,075,181    6,091,001
6,114,598    6,130,364
美国专利申请公开20030186374
美国专利登记号No.09/428,082
外国专利文献
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虽然上面描述了很多实施方案和特征，本领域技术人员明白可以 对所描述的实施方案和特征进行修饰和改变而不脱离本发明公开内容 后面权利要求书定义的本发明。这里提到的各个公开物在此引作参 考。
                        序列表
<110>Ghayur，Tariq
Labkovsky，Boris
Voss，Jeffrey
Green，Larry
Babcook，John
Jia，Xiao-chi
Wieler，James
Kang，Paul
Hegberg，Brad
<120>IL-18结合蛋白
<130>BBC-085US
<140>not yet assigned
<141>filed concurrently herewith
<160>47
<210>1
<211>193
<212>PRT
<213>人
<400>1
Met Ala Ala Glu Pro Val Glu Asp Asn Cys Ile Asn Phe Val Ala Met
1               5                   10                  15
Lys Phe Ile Asp Asn Thr Leu Tyr Phe Ile Ala Glu Asp Asp Glu Asn
            20                  25                  30
Leu Glu Ser Asp Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile
        35                  40                  45
Arg Asn Leu Asn Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro
    50                  55                  60
Leu Phe Glu Asp Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg
65                  70                  75                  80
Thr Ile Phe Ile Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met
                85                  90                  95
Ala Val Thr Ile Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys
            100                 105                 110
Glu Asn Lys Ile Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile
        115                 120                 125
Lys Asp Thr Lys Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly
    130                 135                 140
His Asp Asn Lys Met Gln Phe Glu Ser Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe
145                 150                 155                 160
Leu Ala Cys Glu Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys
                165                 170                 175
Glu Asp Glu Leu Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu
            180                 185                 190
Asp
<210>2
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>2
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Leu Leu Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>3
<211>330
<212>PRT
<213>人
<400>3
Ala Ser Thr Lys Gly Pro Ser Val Phe Pro Leu Ala Pro Ser Ser Lys
1               5                   10                  15
Ser Thr Ser Gly Gly Thr Ala Ala Leu Gly Cys Leu Val Lys Asp Tyr
            20                  25                  30
Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Ser Trp Asn Ser Gly Ala Leu Thr Ser
        35                  40                  45
Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Ser Gly Leu Tyr Ser
    50                  55                  60
Leu Ser Ser Val Val Thr Val Pro Ser Ser Ser Leu Gly Thr Gln Thr
65                  70                  75                  80
Tyr Ile Cys Asn Val Asn His Lys Pro Ser Asn Thr Lys Val Asp Lys
                85                  90                  95
Lys Val Glu Pro Lys Ser Cys Asp Lys Thr His Thr Cys Pro Pro Cys
            100                 105                 110
Pro Ala Pro Glu Ala Ala Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro
        115                 120                 125
Lys Pro Lys Asp Thr Leu Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys
    130                 135                 140
Val Val Val Asp Val Ser His Glu Asp Pro Glu Val Lys Phe Asn Trp
145                 150                 155                 160
Tyr Val Asp Gly Val Glu Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu
                165                 170                 175
Glu Gln Tyr Asn Ser Thr Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu
            180                 185                 190
His Gln Asp Trp Leu Asn Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn
        195                 200                 205
Lys Ala Leu Pro Ala Pro Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly
    210                 215                 220
Gln Pro Arg Glu Pro Gln Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Arg Glu Glu
225                 230                 235                 240
Met Thr Lys Asn Gln Val Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr
                245                 250                 255
Pro Ser Asp Ile Ala Val Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn
            260                 265                 270
Asn Tyr Lys Thr Thr Pro Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe
        275                 280                 285
Leu Tyr Ser Lys Leu Thr Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Gln Gly Asn
    290                 295                 300
Val Phe Ser Cys Ser Val Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr
305                 310                 315                 320
Gln Lys Ser Leu Ser Leu Ser Pro Gly Lys
                325                 330
<210>4
<211>106
<212>PRT
<213>人
<400>4
Thr Val Ala Ala Pro Ser Val Phe Ile Phe Pro Pro Ser Asp Glu Gln
1               5                   10                  15
Leu Lys Ser Gly Thr Ala Ser Val Val Cys Leu Leu Asn Asn Phe Tyr
20                  25                  30
Pro Arg Glu Ala Lys Val Gln Trp Lys Val Asp Asn Ala Leu Gln Ser
                35                  40                  45
Gly Asn Ser Gln Glu Ser Val Thr Glu Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr
            50                  55                  60
Tyr Ser Leu Ser Ser Thr Leu Thr Leu Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Lys
65                  70                  75                  80
His Lys Val Tyr Ala Cys Glu Val Thr His Gln Gly Leu Ser Ser Pro
                85                  90                  95
Val Thr Lys Ser Phe Asn Arg Gly Glu Cys
            100                 105
<210>5
<211>105
<212>PRT
<213>人
<400>5
Gln Pro Lys Ala Ala Pro Ser Val Thr Leu Phe Pro Pro Ser Ser Glu
1               5                   10                  15
Glu Leu Gln Ala Asn Lys Ala Thr Leu Val Cys Leu Ile Ser Asp Phe
            20                  25                  30
Tyr Pro Gly Ala Val Thr Val Ala Trp Lys Ala Asp Ser Ser Pro Val
        35                  40                  45
Lys Ala Gly Val Glu Thr Thr Thr Pro Ser Lys Gln Ser Asn Asn Lys
    50                  55                  60
Tyr Ala Ala Ser Ser Tyr Leu Ser Leu Thr Pro Glu Gln Trp Lys Ser
65                  70                  75                  80
His Arg Ser Tyr Ser Cys Gln Val Thr His Glu Gly Ser Thr Val Glu
                85                  90                  95
Lys Thr Val Ala Pro Thr Glu Cys Ser
            100                 105
<210>6
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>6
Glx Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Thr Glu Val Lys Lys Pro Gly Glu
1               5                   10                  15
Ser Leu Lys Ile Ser Cys Lys Gly Ser Gly Tyr Thr Val Thr Ser Tyr
            20                  25                  30
Trp Ile Gly Trp Val Arg Gln Met Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Met
        35                  40                  45
Gly Phe Ile Tyr Pro Gly Asp Ser Glu Thr Arg Tyr Ser Pro Thr Phe
    50                  55                  60
Gln Gly Gln Val Thr Ile Ser Ala Asp Lys Ser Phe Asn Thr Ala Phe
65                  70                  75                  80
Leu Gln Trp Ser Ser Leu Lys Ala Ser Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Val Gly Ser Gly Trp Tyr Pro Tyr Thr Phe Asp Ile Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>7
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>7
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Glu Ser Ile Ser Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Phe Ile
        35                  40                  45
Tyr Thr Ala Ser Thr Arg Ala Thr Asp Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Pro Ser
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>8
<211>121
<212>PRT
<213>人
<400>8
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Thr Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Gly His Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Ala Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Ser Gly Ser Tyr Trp Asp Tyr Trp Gly
            100                 105                 110
Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>9
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>9
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Gly Ser Arg Ser Val Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Val Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr His Gly Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>10
<211>118
<212>PRT
<213>人
<400>10
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Asn Tyr
                20                  25                  30
Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
            35                  40                  45
Gly Tyr Ile Tyr Ser Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu Lys
        50                  55                  60
Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser Leu
65                  70                  75                  80
Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Ala
                85                  90                  95
Arg Asp Arg Gly Gly Ala Ser Phe Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
            100                 105                 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>11
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>11
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Ile Gly
1               5                   10                  15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ile Ile Gly Gly Tyr
            20                  25                  30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Arg Pro Gly Lys Ala Pro Lys Phe Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Ser Thr Ser Ile Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Thr Tyr Ile Thr Pro Pro
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210>12
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>12
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly
            20                  25                  30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Gly Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>13
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>13
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Arg Ser Leu Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Tyr Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Asn Arg
            100                 105
<210>14
<211>122
<212>PRT
<213>人
<400>14
Glx Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Ser Val Gln Pro Arg Gly
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
            20                  25                  30
Ser Met Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ser Tyr Phe Ser Ser Ser Gly Gly Ile Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Ser Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Asp Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Asp Asp Ser Ser Gly Tyr Tyr Pro Tyr Phe Phe Asp Tyr Trp
            100                 105                 110
Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>15
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>15
Asp Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Ile Asn Cys Lys Ser Ser Gln Thr Val Leu Tyr Arg
            20                  25                  30
Ser Asn Asn Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
        35                  40                  45
Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65                  70                  75                  80
Ile Ser Ser Leu Gln Ala Glu Asp Val Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
                85                  90                  95
Tyr Tyr Ser Thr Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile
            100                  105                  110
Lys Arg
<210>16
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>16
Glx Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Val Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Ala Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Glu Asp Ser Ser Ala Trp Val Phe Glu His Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>17
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>17
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser His Ile Leu Ser Arg Asn
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Met Tyr Gly Ile Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Leu
                85                  90                  95
Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg
            100                 105
<210>18
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>18
Glx Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Arg Asn Tyr
            20                  25                  30
Gly Leu His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Ser Tyr Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>19
<211>108
<212>PRT
<213>人
<400>19
Glu Ile Val Met Thr Gln Ser Pro Ala Thr Leu Ser Val Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Phe Asn Ser Asn
            20                  25                  30
Leu Val Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu Ile
        35                  40                  45
Tyr Gly Ala Ser Thr Arg Ala Thr Gly Ile Pro Ala Arg Phe Ser Gly
    50                  55                  60
Ser Gly Ser Gly Thr Glu Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Ser
65                  70                  75                  80
Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Asn Asn Trp Thr Trp
                85                  90                  95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>20
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>20
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly
            20                  25                  30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Gly Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>21
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>21
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Asn Arg
            100                 105
<210>22
<211>127
<212>PRT
<213>人
<400>22
Glx Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Val Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Phe Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Lys Gly Gly Ser Gly Trp Pro Pro Phe Tyr Tyr Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>23
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>23
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1                5                  10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Asn Leu Leu Tyr Ser
            20                  25                  30
Asp Gly Glu Thr Tyr Leu Cys Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Glu Val Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Glu Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Ile Tyr Tyr Cys Met Gln Asn
                85                  90                  95
Val Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210>24
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>24
Glx Thr Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Arg
            20                  25                  30
Val Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Ser Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Glu Asp Ser Ser Ala Trp Val Phe Glu His Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>25
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>25
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Asp Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ile Leu Ser Arg Asn
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ile Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Asn Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Asp Asn Ser Leu
                85                  90                  95
Cys Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Val Lys Arg
            100                 105
<210>26
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>26
Glx Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asp Ser Arg
            20                  25                  30
Ile Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Pro Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Asn Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Glu Asp Ser Ser Ala Trp Val Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Ala Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>27
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>27
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Ile
                85                  90                  95
Asp Ser Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn Arg
            100                 105
<210>28
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>28
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly
            20                  25                  30
Asp Tyr Tyr Trp Ser Tyr Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Cys
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Gly Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>29
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>29
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Thr Ser Ile Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Ser Ile Ser Arg Leu Gly
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Tyr Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Asn Arg
            100                 105
<210>30
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>30
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Gly His Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Tyr Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr His Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Arg Ser Val Ser Ala Ala Asp Thr Ala Gly Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Ser Leu Tyr Asn Gly Asn Gly Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Arg
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>31
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>31
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Ile
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Val Ser Arg Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Ala Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Asp
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Val Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Phe Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys Arg
            100                 105
<210>32
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>32
Glx Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Arg Ser
            20                  25                  30
Tyr Asp Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Pro Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Arg Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Glu Tyr Ser Thr Thr Trp Ser Ile Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                  110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>33
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>33
Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Arg Asn Asn
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile His Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Gly
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Tyr Gly Asn Ser Ile
                85                  90                  95
Ile Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Val Asn Arg
            100                 105
<210>34
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>34
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Asn Ser Gly
            20                  25                  30
Gly Tyr Tyr Trp Ser Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly His Ile Ser Tyr Arg Gly Thr Thr Tyr Ser Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Arg Gly Gly Gly Phe Phe Asp Leu Trp Gly Arg Gly
            100                 105                 110
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>35
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>35
Glu Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Asn Ser Gly
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Val Ser Ile Arg Ala Thr Asp Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Ala Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Gly Phe Ser Pro
                85                  90                  95
Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Arg Val Glu Ile Asn Arg
            100                 105
<210>36
<211>127
<212>PRT
<213>人
<400>36
Glx Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser His Cys
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Ser Tyr Asp Gly Ser Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Lys Asp His Gly Gly Ser Gly Ser Pro Pro Phe Tyr Tyr Tyr Tyr
            100                 105                 110
Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115                 120                 125
<210>37
<211>113
<212>PRT
<213>人
<400>37
Asp Ile Leu Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Ser Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Gln Pro Ala Ser Ile Ser Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu His Gly
            20                  25                  30
Asp Gly Lys Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Pro
        35                  40                  45
Pro Gln Phe Leu Ile Gln Glu Leu Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro
    50                  55                  60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65                  70                  75                  80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ser
                85                  90                  95
Leu Gln Leu Pro Leu Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Gln Ile Lys
            100                 105                 110
Arg
<210>38
<211>119
<212>PRT
<213>人
<400>38
Glx Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
1               5                   10                  15
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Tyr Tyr
            20                  25                  30
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
        35                  40                  45
Ala Val Ile Trp Tyr Asp Gly Arg Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
    50                  55                  60
Lys Gly Arg Val Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Lys Thr Leu Tyr
65                  70                  75                  80
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
                85                  90                  95
Ala Arg Glu Gly Gly Tyr Tyr Tyr Gly Met Asp Val Trp Gly Gln Gly
            100                 105                 110
Thr Thr Val Thr Val Ser Ser
        115
<210>39
<211>109
<212>PRT
<213>人
<400>39
Glu Ile Leu Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asn Val Ser Ser Ser
            20                  25                  30
Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Asn Pro Gly Gln Ala Pro Arg Leu Leu
        35                  40                  45
Ile Tyr Gly Ala Ser Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro Asp Arg Phe Ser
    50                  55                  60
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg Leu Glu
65                  70                  75                  80
Pro Glu Asp Phe Glu Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Ser Gly Ser Ser Leu
                85                  90                  95
Phe Thr Phe Gly Pro Gly Thr Lys Val Asp Ile Lys Arg
            100                 105
<210>40
<211>120
<212>PRT
<213>人
<400>40
Glx Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln
1               5                   10                  15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Arg Ser Gly
            20                  25                  30
Asp His Tyr Trp Thr Trp Ile Arg Gln His Pro Gly Lys Gly Leu Glu
        35                  40                  45
Trp Ile Gly His Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Tyr Tyr Asn Pro Ser
    50                  55                  60
Leu Lys Ser Arg Leu Thr Ile Ser Ile Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65                  70                  75                  80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
                85                  90                  95
Cys Ala Arg Asp Tyr Gly Gly Asn Gly Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
            100                 105                 110
Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser
        115                 120
<210>41
<211>114
<212>PRT
<213>人
<400>41
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1               5                   10                  15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
            20                  25                  30
Asp Asp Gly Asn Thr Tyr Leu Asp Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln
        35                  40                  45
Ser Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Thr Leu Ser Tyr Arg Ala Ser Gly Val
    50                  55                  60
Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Asn
65                  70                  75                  80
Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln
                85                  90                  95
Arg Ile Glu Phe Pro Ile Thr Phe Gly Gln Gly Thr Arg Leu Glu Ile
            100                 105                 110
Lys Arg
<210>42
<211>7
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列
<220>
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<222>(1)
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<222>(2)
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<220>
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<222>(3)
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
<221>misc_feature
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<220>
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<222>(6)
<223>Xaa是Trp，或不存在
<220>
<221>misc_feature
<222>(7)
<223>Xaa是Thr，Ser，Gly，或不存在
<400>42
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210>43
<211>17
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列
<220>
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<222>(1)
<223>Xaa是Phe，Tyr，His，Ser，或Val
<220>
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<222>(2)
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<220>
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<220>
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<222>(4)
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<220>
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<222>(5)
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<220>
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<222>(6)
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<220>
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<222>(7)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<223>Xaa是Gly，或不存在
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa
<210>44
<211>18
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列
<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<222>(8)
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<220>
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<222>(9)
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<220>
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<220>
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<222>(11)
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<400>44
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa Xaa
<210>45
<211>17
<212>PRT
<213>人工
<220>
<223>抗-IL-18抗体CDR序列
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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<220>
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10                  15
Xaa
<210>46
<211>7
<212>PRT
<213>人工
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<223>抗-IL-18抗体CDR序列
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Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工
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<223>抗-IL-18抗体CDR序列
<220>
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<400>47
Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa Xaa
1               5                   10