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一种抑制禾谷镰刀菌生长的 植物精油乳液的制备方法

阅读：798发布：2020-05-08

专利汇可以提供一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法，属于食品防腐保鲜技术领域。该方法以植物精油为油相，卵磷脂为乳化剂，乙酸盐缓冲液为水相，利用高速剪切结合高压均质的乳化方法，制备了无需添加奥氏熟化抑制剂的抑制禾谷镰刀菌生长的精油乳液。本发明制得的植物精油乳液分散均匀，具有较好的物理稳定性。同时，由于本发明的植物精油乳液中没有引入的玉米油或MCT等其他油相，本发明的植物精油在相对较低的浓度是就能实现较好的抑菌效果，其中利用丁香油配制的植物精油乳液在乳液浓度为40mL/L时，对禾谷镰刀菌的抑制率为75.7％，为粮食仓储、加工过程中的真菌生物量及真菌毒素的控制提供了新的方法。，下面是一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：
(1)将植物精油作为油相，将卵磷脂溶于乙酸盐缓冲液制得乳化剂溶液；
(2)将步骤(1)中的油相与乳化剂溶液混合、进行两步均质，得到植物精油乳液。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的乳化剂溶液的制备方法为：将质量分数为1％～3％的卵磷脂溶于10mM乙酸盐缓冲液，冰浴搅拌溶解2-3h，双层滤布过滤，得到乳化剂溶液。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述卵磷脂的质量分数是
1％。
4.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(1)中所述的植物精油为丁香油或山苍子油中的任一种。
5.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的油相的体积占植物精油乳液体积的1％-8％。
6.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于，步骤(2)中所述的两步均质包括搅拌均质和高压均质。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述搅拌均质所使用仪器为手持式均质机，均质条件为在32000rpm下搅拌均质2min。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述高压均质使用仪器为GEA高压均质机，均质条件为在压力1000bar下高压循环均质1～1.5min。
9.根据权利要求1-8所述的制备方法得到的抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液。
10.权利要求9所述植物精油乳液在制麦、饲料及粮食存储领域的应用。

说明书全文

一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法，属于食品防腐保鲜技术领域。

背景技术

[0002] 目前，小麦、大麦及燕麦等谷物普遍遭受着由镰刀菌引起的赤霉病的污染，镰刀菌侵染农产品后，在适宜的条件下开始萌发繁殖，并不断地分解农产品中的营养成分，进而影响农产品的质量和产量。其中，禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)是造成赤霉病的一种主要菌种，并且会在田间及粮食仓储过程中产生脱氧雪腐镰刀菌烯醇等毒素，对人们的生命健康造成严重的威胁。目前研究人员正在开发各种新型的绿色抑菌防霉剂，以减少传统防霉方法(辐射、化学杀菌剂等)带来的负面影响。

[0003] 精油(Essential oils,EOs)是一种天然抗菌剂，由许多植物产生以保护自身免受感染，在食品工业和农业中在对抗病原微生物方面具有很大的潜力。一些精油，如丁香油，百里香油，茶树油和肉桂油，具有广谱抗菌性能。同时精油具有生物降解性、高挥发性和低残留等特点，不会像化学杀菌剂一样对生态环境造成负面影响，因此精油可作为绿色杀菌剂的重要来源之一。但是植物精油有着低溶解度、热不稳定性及高挥发性等缺点，导致其难以较好的利用。最近，人们越来越关注纳米乳液作为精油的输送系统的应用，纳米乳液比其他类型的胶体输送系统具有一些潜在优势，例如较强的物理稳定性和抗菌活性。将精油包裹入乳液，既可以增强其水溶性，扩宽精油的应用范围，又能提升精油的稳定性，延长精油的作用时间。

[0004] 然而将精油直接乳化往往会出现小液滴汇聚成大液滴形成絮凝沉淀等不稳定的现象，目前常见的方法是加入奥氏熟化抑制剂(如中链甘油三酯MCT、玉米油)来提升其稳定性，水包油形式的乳液传输系统可以显著提高精油的水溶性。但是，在乳液制备过程中引入的玉米油或MCT等其他油相会弱化精油乳液的抑菌效果，且乳化剂包裹油相的能力有限，因此提升乳液的抑菌能力，必须提高抑菌精油的比例，减少其他油的引入。

发明内容

[0005] 为了解决上述问题，本发明提供了一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法，本发明通过改变高压均质条件制备了稳定性较好的以纯植物精油作为油相的乳液，不需要添加油相稳定剂，显著提高了其抑制禾谷镰刀菌生长的能力。

[0006] 本发明的第一个目的是提供一种抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液的制备方法，所述制备方法包括如下步骤：

[0007] (1)将植物精油作为油相，将卵磷脂溶于乙酸盐缓冲液制得乳化剂溶液；

[0008] (2)将步骤(1)中的油相与乳化剂溶液混合、进行两步均质，得到植物精油乳液。

[0009] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的乳化剂溶液的制备方法为：将质量分数为1％～3％卵磷脂溶于10mM乙酸盐缓冲液，冰浴搅拌溶解2-3h，双层滤布过滤。

[0010] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述卵磷脂的质量分数为1％。

[0011] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述乙酸盐缓冲液的浓度为10mM。

[0012] 在本发明的一种实施方式中，步骤(1)中所述的植物精油为丁香油或山苍子油。

[0013] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的油相的体积占植物精油乳液体积的1％-8％。

[0014] 在本发明的一种实施方式中，步骤(2)中所述的两步均质包括搅拌均质和高压均质。

[0015] 在本发明的一种实施方式中，所述搅拌均质使用仪器为手持式均质机，均质条件为在32000rpm下搅拌均质2min。

[0016] 在本发明的一种实施方式中，所述高压均质使用仪器为GEA高压均质机，均质条件为在压力1000bar下高压循环均质1～1.5min。

[0017] 本发明的第二个目的是提供一种上述制备方法得到的抑制禾谷镰刀菌生长的植物精油乳液。

[0018] 本发明的第三个目的是提供上述植物精油乳液制麦、饲料及粮食存储领域的应用。

[0019] 本发明的有益效果：

[0020] (1)本发明利用天然植物精油具有较好的抑菌防霉的作用，采用高速剪切及高压均质两步乳化的方法将植物精油包裹入以卵磷脂为乳化剂的纳米乳液中，无需添加奥氏熟化抑制剂，仅通过改变均质条件就获得了具有较好稳定性及分散性的纳米乳液。

[0021] (2)本发明制备的植物精油乳液对禾谷镰刀菌的生长具有较好的抑制效果，克服了精油作为防霉剂时水溶性差、稳定性差等缺点。同时，由于本发明中的植物精油乳液中没有引入的玉米油或MCT等其他油相，本发明的植物精油在相对较低的浓度是就能实现较好的抑菌效果，其中利用丁香油配制的植物精油乳液在乳液浓度为40mL/L时，对禾谷镰刀菌的抑制率为75.7％。附图说明

[0022] 图1为实施例3中在400bar及1000bar下均质1min的丁香油和山苍子油乳液粒径分布对比图；其中，曲线A为400bar下均质0.5min的丁香油乳液，曲线B为1000bar下均质1min的丁香油乳液，曲线C为400bar下均质0.5min的山苍子油乳液，曲线D为1000bar下均质1min的山苍子油乳液。

[0023] 图2为实施例3中在400bar及1000bar下均质1min的山苍子油乳液放置一天实物图；其中，A为1000bar下均质1min的山苍子油乳液放置一天实物图，B为400bar下均质0.5min的山苍子油乳液放置一天实物图。

[0024] 图3为实施例4中卵磷脂浓度对丁香油和山苍子油乳液平均粒径的影响曲线。

[0025] 图4为实施例5中不同浓度的丁香油乳液对禾谷镰刀菌的抑制照片。

[0026] 图5为实施例6中不同稳定性的丁香油乳液及丁香油对禾谷镰刀菌的菌丝抑制率的影响；其中，A为卵磷脂浓度为1wt％的在1000bar下均质1min的丁香油乳液(40mL/L)，B为卵磷脂浓度为1wt％的在400bar下均质0.5min的丁香油乳液(40mL/L)，C为卵磷脂浓度为0.1wt％的在1000bar下均质1min的丁香油乳液(40mL/L)，D为稀释的纯丁香油(40mL/L)。

具体实施方式

[0027] 禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)ACCC36938，购自中国农业微生物菌种保藏中心。卵磷脂购自上海麦克林生化科技有限公司，山苍子油购自上海源叶生物科技有限公司，丁香油、PDA培养基及其他试剂购自国药集团化学试剂有限公司。

[0028] 配制10mM乙酸盐缓冲液：取5.9g冰醋酸与0.238g二水合乙酸钠，蒸馏水定容至1L，加HCl调pH至3.0。

[0029] 乳液稳定性评价方法：采用Malvern公司的纳米粒度及zeta电位分析仪(NANO ZSE)测定乳液的平均粒径及粒径分布。

[0030] 以下实施例和对比例中使用的高压均质机的型号为PANDA PLUS 200C，购于GEA公司；使用的手持式匀浆机的型号为T30K，购于上海班诺生物科技有限公司。

[0031] 实施例1制备丁香油乳液

[0032] (1)取8mL丁香油作为油相，将浓度为1wt％的卵磷脂溶于10mM的乙酸盐缓冲液，双层滤布过滤得到乳化剂溶液；

[0033] (2)取步骤(1)制得的乳化剂溶液92mL、丁香油8mL进行混合，混合体系100mL，使用手持式均质机在32000rpm下均质2min，然后通过高压均质机，在压力1000bar下以9L/h的速度循环均质1min，得到丁香油乳液。

[0034] 实施例2制备山苍子油乳液

[0035] (1)取8mL山苍子油作为油相，将浓度为1wt％的卵磷脂溶于10mM的乙酸盐缓冲液，双层滤布过滤得到乳化剂溶液；

[0036] (2)取步骤(1)制得的乳化剂溶液92mL、山苍子油8mL进行混合，混合体系100mL，使用手持式均质机在32000rpm下均质2min，然后通过高压均质机，在压力1000bar下以9L/h的速度循环均质1min，得到山苍子油乳液。

[0037] 实施例3改变均质条件

[0038] (1)分别取8ml丁香油、8ml山苍子油作为油相，将浓度为1wt％的卵磷脂溶于10mM的乙酸盐缓冲液，双层滤布过滤得到乳化剂溶液；

[0039] (2)取步骤(1)制得的乳化剂溶液，分别与8mL丁香油和8mL山苍子油进行混合，混合体系100mL，使用手持式均质机在32000rpm下均质2min，然后以9L/h的速度通过高压均质机，在五种压力(400、700、1000、1300和1600bar)和三种均质时间下(0.5、1和1.5min)得到一系列的丁香油乳液和山苍子油乳液。

[0040] 经过不同均质压力及不同均质时间所得到的乳液的平均粒径如表1所示。在400bar下均质0.5min以及1000bar下均质1min的丁香油乳液和山苍子油乳液的粒径分布如图1所示。在400bar下均质0.5min以及1000bar下均质1min的丁香油乳液放置一天的实物图如图2所示。

[0041] 表1不同均质压力及均质时间所得到的丁香油和山苍子油乳液的平均粒径(nm)[0042]

[0043] 如表1所示，随着均质压力从700bar增加至1000bar及均质时间从0.5min增加至1.5min，所得乳液的平均粒径逐渐减小，随着均质压力从1000bar增加至1600bar及均质时间从1.0min增加至1.5min，乳液平均粒径基本不变。如图1及图2所示，在1000bar均质1min的条件下得到的丁香油乳液和山苍子油乳液均呈现单分散的分布，稳定性较好，在400bar下均质0.5min得到的乳液则分散不均匀，并且在放置一天后出现明显的油相分离，综合来看在1000bar均质1min的均质条件为最佳均质条件。

[0044] 实施例4改变卵磷脂浓度

[0045] (1)取8mL丁香油或山苍子油作为油相，将不同浓度(0.1wt％、0.25wt％、0.5wt％、1wt％、2wt％、及3wt％)的卵磷脂溶于10mM的乙酸盐缓冲液，双层滤布过滤得到乳化剂溶液；

[0046] (2)取步骤(1)制得的不同卵磷脂浓度的乳化剂溶液92mL，分别与8mL丁香油和8mL山苍子油进行混合，混合体系100mL，使用手持式均质机在32000rpm下均质2min，然后通过高压均质机，在压力1000bar下以9L/h的速度循环均质1min，得到一系列的丁香油乳液和山苍子油乳液。

[0047] 如图3所示，当卵磷脂的浓度小于1wt％时，丁香油乳液和山苍子油乳液的平均粒径都随着卵磷脂浓度的增加而不断降低，当卵磷脂浓度为1wt％时，丁香油乳液和山苍子油乳液的平均粒径最低，分别为118.2nm和209.7nm，在此基础上继续增大卵磷脂的浓度，丁香油乳液和山苍子油乳液的平均粒径基本保持不变。

[0048] 实施例5禾谷镰刀菌抑制试验

[0049] 菌丝抑制实验：选用实施例1和实施2中制备的丁香油乳液和山苍子油乳液进行禾谷镰刀菌抑制试验，使用10mM的乙酸盐缓冲液将香油乳液和山苍子油乳液进行稀释，分别稀释为40mL植物精油/L乳液、30mL植物精油/L乳液、20mL植物精油/L乳液、10mL植物精油/L乳液、5mL植物精油/L乳液、2.5mL植物精油/L乳液及1mL植物精油/L乳液。接种禾谷镰刀菌于PDA平板，27℃培养4天，用打孔器于菌丝边缘取一直径6mm的新鲜的菌丝塞，接于涂布100μL上述稀释的乳液的PDA平板中央，培养4天后测量菌丝的直径，计算菌丝抑制率(mycelial growth inhibition，MGI)。

[0050] MGI＝(空白组菌丝直径-实验组菌丝直径)/(空白组菌丝直径-菌丝塞直径)×100％。

[0051] 将MGI与乳液浓度进行回归分析，以SPSS 25 软件进行回归方程的模拟和半最大效应浓度(EC50)的计算。MGI、乳液浓度、总数(为1)为变量，以软件回归分析中的Probit过程进行10为对数底的logit模型转换，计算出不同抑菌物质的半最大效应浓度(EC50)；参数估计值中的PROBIT模型即为不同乳液的回归方程。两种稳定性较好的乳液对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制率及EC50值见表2和表3，不同浓度的丁香油乳液的抑菌效果图见图4。

[0052] 由表2和表3可知，本实施例中植物精油制备的乳液均可以不同程度地抑制禾谷镰刀菌菌丝的生长，其中丁香油制备的乳液抑菌效果更好，在40mL/L的浓度下对禾谷镰刀菌菌丝的抑制率达75.7％，山苍子油乳液的抑制效果相对差一些，丁香油乳液及山苍子油乳液的半最大效应浓度分别为20.8mL/L及93.5mL/L。相对于国外关于丁香油乳液抑制禾谷镰刀菌的研究，本实施例在添加的乳液浓度仅为五分之一时就达到了相当的抑菌效果。

[0053] 由图4可以看出：随着乳液浓度的增加，丁香油乳液对禾谷镰刀菌菌丝生长的抑制效果不断增加，在40mL/L时达到最大，此时抑制效果最为明显。

[0054] 表2不同浓度的两种稳定性较好的乳液对菌丝生长的抑制率(MGI)[0055]

[0056] 表3两种稳定性较好的乳液菌丝抑制率的回归分析及EC50值

[0057]

[0058] 实施例6不同稳定性的丁香油乳液和丁香油抑菌对比实验

[0059] 选择抑菌效果较好的丁香油进行不同稳定性的乳液抑菌对比实验。选择实施例3中卵磷脂浓度为1wt％的在1000bar下均质1min的丁香油乳液，卵磷脂浓度为1wt％的在400bar下均质0.5min的丁香油乳液，实施例4中卵磷脂浓度为0.1wt％的在1000bar下均质
1min的丁香油乳液以及纯丁香油进行禾谷镰刀菌抑制试验。

[0060] 使用10mM的乙酸盐缓冲液将上述三种丁香油乳液和纯丁香油均稀释至40mL丁香油/L丁香油乳液。接种禾谷镰刀菌于PDA平板，27℃培养4天，用打孔器于菌丝边缘取一直径6mm的新鲜的菌丝塞，接于涂布100μL上述稀释的丁香油乳液的PDA平板中央，培养4天后测量菌丝的直径，计算菌丝抑制率(MGI)。

[0061] MGI＝(空白组菌丝直径-实验组菌丝直径)/(空白组菌丝直径-菌丝塞直径)×100％。

[0062] 不同稳定性的丁香油乳液和丁香油对禾谷镰刀菌的MGI如图5所示。其中，A为稀释至40mL/L的、实施例3中卵磷脂浓度为1wt％的、在1000bar下均质1min的丁香油乳液，B为稀释至40mL/L的、实施例3中卵磷脂浓度为1wt％的、在400bar下均质0.5min的丁香油乳液，C为稀释至40mL/L的、实施例4中卵磷脂浓度为0.1wt％的、在1000bar下均质1min的丁香油乳液，D为稀释至40mL/L的纯丁香油。

[0063] 由图5可知，与空白实验相比，纯丁香油乳液(D)对禾谷镰刀菌菌丝生长的MGI仅为21.6％，而制备的稳定性较好的丁香油乳液，即实施例1中的丁香油乳液稀释到浓度为
40ml/L(A)的MGI为75.7％，说明精油乳液抑制禾谷镰刀菌菌丝生长的效果明显优于同等浓度的精油。另外，两种稳定性较差的丁香油乳液在同等浓度时的MGI分别为60.3％和
33.9％，说明利用均质的方法制备的植物精油乳液，在提升乳液稳定性的同时增强了乳液对精油的保护作用，从而提升了乳液的抗菌性能。

[0064] 虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。

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