一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法
阅读：382发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种酪 氨 酸循环 发酵 和分离提取方法，首先发酵获得酪氨酸发酵液，然后经过两级低速离心分离大部分酪氨酸晶体和菌液，菌液经高速离心或陶瓷 膜过滤 浓缩，浓缩后的菌体接种到另一个 发酵罐 中，进行新一批的发酵。该方法在初步分离出大部分酪氨酸产品晶体的同时，菌体得到循环使用，提高了设备利用率和生产效率，压缩了非生产时间，节约了 能源 资源。，下面是一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法专利的具体信息内容。
1.一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：
(1)进行种子培养和发酵，发酵结束后，获得酪氨酸发酵液；
(2)将步骤(1)获得的发酵液进行一级低速离心，分离晶体和菌液，离心机使用碟片式离心机；
(3)将步骤(2)得到的菌液进行二级低速离心，进一步分离菌液中的晶体，离心条件与步骤(2)一致；
(4)将步骤(3)得到的菌液进行浓缩，浓缩方法采用离心法或陶瓷膜过滤法；
(5)将步骤(4)浓缩后的菌体接入另一个含有发酵培养基的发酵罐中，进行下一批发酵，发酵方法与步骤(1)相同。
2.根据权利要求1所述的酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：所述步骤(1)发酵结束终点的判定标准为产酸速率0.25-1g/L/h。
3.根据权利要求1所述的酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：所述步骤(2)离心条件为：分离因子Fr＝100-250，离心时间1-5min。
4.根据权利要求1所述的酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：所述步骤(2)一级低速离心后的晶体体积：菌液体积比为1：2-4。
5.根据权利要求1所述的酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：所述步骤(3)二级低速离心后，晶体体积：菌液体积比为1：9-20。
6.根据权利要求1所述的酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：所述步骤(4)离心法使用碟片式离心机，离心条件为：分离因子Fr＝1600-2000，分离1-3min；离心浓缩比
1：30-50。
7.根据权利要求1所述的酪氨酸循环发酵和分离提取方法，其特征在于：所述步骤(4)陶瓷膜过滤法浓缩菌液，陶瓷膜过滤条件为工作压力0.2-0.6MPa,浓缩比1：3-5。
一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种氨基酸的提取方法，尤其是一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法。
背景技术
[0002] L-酪氨酸(L-tyrosine；L-Tyr)的化学名称为L-2-氨基-3-对羟苯基丙酸，它是一种含有酚羟基的芳香族极性α-氨基酸，为白色结晶性粉末，从水中结晶为针状或片状体。相对密度1.456(20℃)，等电点5.66，水溶解性0.45g/L(25℃)，在食品、医药和化工等领域具有广泛应用。工业上通常是使用蛋白水解法和酶法来进行酪氨酸的生产，但这些方法具有很多缺点，如原料来源有限、稳定性差、工艺繁琐、产品成分复杂等。微生物发酵法生产酪氨酸具有成本低、工艺相对简单可控等优势，但目前还没有成熟的发酵法生产技术来进行大规模的酪氨酸工业化生产，且酪氨酸发酵方法和提取方法方面也处于不成熟状态。
[0003] 循环发酵可以利用上一批发酵培养培养的菌体，接种新的发酵培养基在合适条件下，进行下一批发酵的技术。循环发酵技术的运用可省略下一批发酵的种子培养过程、缩短下一批发酵阶段从延滞期到稳定期时间，不仅节约时间成本还节约了能源资源，压缩生产成本，提高生产效率。
[0004] 利用专利：一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法(申请号CN201810963798.8)中所述的菌种和方法进行发酵实验，可知酪氨酸发酵过程属于非生长偶联型，即酪氨酸在菌体到达稳定器后才开始大量合成，循环发酵能缩短菌体的培养时间，快速到达稳定期；同时由于酪氨酸溶解度非常低，当酪氨酸被大量合成时在发酵液中积累并大量结晶，利用晶体和菌液的密度差，通过离心技术使晶体和菌液的初步分离，完成酪氨酸产品的初步分离提取；菌液中的菌体可以通过离心法或膜过滤的方式进行浓缩，并去除部分菌液中的盐酸等有毒有害物质，使下一批发酵中接入健康安全的菌体种子。因此循环发酵对于提高酪氨酸生产效率有很大应用潜力。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题在于提供一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法，实现菌体循环利用。
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：
[0007] 一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法，包括以下步骤：
[0008] (1)进行种子培养和发酵，发酵结束后，获得酪氨酸发酵液，所述种子培养和发酵方法采用申请号CN201810963798.8中一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法中所述的菌种和方法进行，发酵在一号发酵罐中进行；
[0010] (3)将步骤(2)得到的菌液经离心泵进入二级碟片式离心机进行二级低速离心，进一步分离菌液中的晶体，离心条件与步骤(2)一致；鉴于二级低速离心后菌液中酪氨酸晶体量已非常少，出于成本考虑，不再进一步分离；
[0011] (4)将步骤(3)得到的菌液泵入高速碟片式离心机或陶瓷膜过滤组件进行浓缩，浓缩方法采用离心法或陶瓷膜过滤法；浓缩的目的：除去因长时间发酵培养残留在菌液中的盐酸等有害物质，减少原培养基成分对下一批发酵培养基的影响；
[0012] (5)将步骤(4)浓缩后的菌体接入含有发酵培养基的二号发酵罐中，进行下一批发酵，发酵方法与步骤(1)相同。
[0013] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(1)发酵结束终点的判定标准为产酸速率0.25-1g/L/h，若高于该标准则引起该批次发酵不充分，造成生产效率下降，若低于该标准，则造成菌体老化，对下一轮发酵产生不利影响。
[0014] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(2)离心条件为：分离因子Fr＝100-250，离心时间1-5min，在该离心条件下，晶体密度较大，沉淀在离心机的底部，从离心机固相出口排出，菌体悬浮在菌液内部密度较小，分布在离心机上部，从离心机液相出口流出，从而实现分离；若分离因子或离心时间大于该范围，则易造成晶体中夹杂的菌体过多，引起菌体收率下降和晶体纯度下降；若分离因子或离心时间小于该范围，则易造成晶体和菌液分离不开，引起提取收率下降。
[0015] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(2)一级低速离心后的晶体体积：菌液体积比为1：2-4，由于分离因子太小，一级低速离心得到的菌液中仍含有一部分晶体，为保证提取收率需要对一级低速离心的菌体进行第二级低俗离心，进一步收集晶体。
[0016] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(3)二级低速离心后，晶体体积：菌液体积比为1：9-20。
[0017] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(4)离心法使用碟片式离心机，离心条件为：分离因子Fr＝1500-2500，分离1-3min；离心浓缩比1：30-50。
[0018] 上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(4)离心法浓缩菌液，固液分离效果高好、浓缩比较高，但是由于分离因子较高，易造成离心机能耗过高，工作噪音较大；若离心条件小于该标准，则造成菌体收率低，造成下一批发酵接种量少，降低生产效率下降；若大于该标准，造成能耗浪费，增加生产成本。
[0019] 上述的离心法浓缩菌液所对应的酪氨酸循环发酵和分离提取方法使用的设备，包括：一号发酵罐，一级低速碟片式离心机，二级低速碟片式离心机，高速碟片式离心机，二号发酵罐和离心泵及连接管道、阀门等。其中一号发酵罐底部通过离心泵与一级低速碟片式离心机的料液进口相连，一级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与二级低速碟片式离心机料液进口相连，二级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与高速碟片式离心机的料液进口相连，高速碟片式离心机的固相出口通过离心泵与二号发酵罐顶部相连。
[0020] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(4)陶瓷膜过滤法浓缩菌液，陶瓷膜过滤条件为工作压力0.2-0.6MPa,浓缩比1：3-5，若陶瓷膜过滤条件大于该范围，则易引起膜堵塞，造成膜污染，增大膜清洗用水量；若小于该标准，造成浓缩目的达不到，对下一批发酵产生不利影响。
[0021] 上述的陶瓷膜过滤法浓缩菌液对应的酪氨酸循环发酵和分离提取方法使用的设备，包括：一号发酵罐，一级低速碟片式离心机，二级低速碟片式离心机，陶瓷膜过滤组件，二号发酵罐和离心泵及连接管道、阀门等。其中：一号发酵罐底部通过离心泵与一级低速碟片式离心机的料液进口相连，一级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与二级低速碟片式离心机料液进口相连，二级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与陶瓷膜过滤组件的料液进口相连，陶瓷膜过滤组件的浓液出口通过离心泵与二号发酵罐顶部相连。
[0023] 优选的，上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法,所述步骤(5)中发酵培养基是专利(申请号CN201810963798.8)中所述的酪氨酸发酵培养基。
[0024] 本发明的有益效果是：
[0025] 上述酪氨酸循环发酵和分离提取方法，具有如下优势：
[0026] (1)提高设备利用率。发酵菌体循环使用，省略了种子培养时间(一般种子培养周期6-8h)，压缩了发酵阶段从延滞期到稳定期的时间(从12-14h压缩到5-7h)，使得发酵罐的非生产时间大大减少，提高设备利用率。
[0027] (2)节约能源资源。在种子培养和发酵前往往需要投入大量昂贵的有机氮源，用以在短时间内获得较大的生物量，期间各种生产和辅助设备的运行也消耗了大量能源。循环发酵技术的运用降低了生产成本。
[0028] (3)设备自动化程度高。无论是碟片离心机还是陶瓷膜过滤设备，均是非常成熟稳定的设备，均可灭菌，符合GMP认证，整个发酵过程无菌操作，电脑自动监控过程参数，有利于精细化管理。
[0029] (4)降低染菌机率。发酵生产中，为了获得足够的生物量，往往需要逐级扩大培养，在移种过程中易造成染菌。
[0030] (5)提高生产效率。循环发酵过程中，从本批发酵液中收集菌体到接入下一批发酵液的过程可以视为移种过程。在移种的同时实现了酪氨酸晶体产品的初步分离提取，这种发酵偶联提取的方法，提高了生产效率。附图说明
[0031] 图1是本发明所述酪氨酸循环发酵和分离提取方法的工艺流程示意图。
[0032] 图2是本发明所述离心法浓缩对应的设备流程示意图。
[0033] 图3是本发明所述陶瓷膜过滤法浓缩对应的设备流程示意图。
[0034] 图4是本发明所述离心法浓缩对应设备中碟片式离心机结构示意图。
[0035] 图5是本发明所述陶瓷膜过滤法浓缩对应设备陶瓷膜过滤组件的结构示意图。
[0036] 图中：1.一号发酵罐，2.一级低速碟片式离心机，3.二级低速碟片式离心机，4.高速碟片式离心机，5.二号发酵罐，6.离心泵，7.陶瓷膜过滤组件
具体实施方式
[0037] 下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。
[0038] 实施例1
[0039] 一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法，如图1、图2和图4所示，包括以下步骤：
[0040] (1)利用专利：一种L-酪氨酸基因工程菌及其生产L-酪氨酸的方法(申请号CN201810963798.8)中所述的菌种和方法进行种子培养和发酵(酪氨酸发酵在一号发酵罐中进行)，发酵结束后，获得酪氨酸发酵液；
[0041] (2)将步骤(1)获得的发酵液从一号发酵罐底部经离心泵泵入一级低速碟片式离心机进行一级低速离心，分离晶体和菌液，离心机使用碟片式离心机；
[0042] (3)将步骤(2)得到的菌液经离心泵泵入二级低速碟片式离心机进行二级低速离心，进一步分离菌液中的晶体，离心条件与步骤(2)一致；
[0043] (4)将步骤(3)得到的菌液进行浓缩，浓缩方法采用离心法；
[0044] (5)将步骤(4)浓缩后的菌体接入另一个含有发酵培养基(参见申请号CN201810963798.8中所述酪氨酸发酵培养基)的发酵罐中，进行下一批发酵，发酵方法与步骤(1)相同；其中，
[0045] 步骤(1)所述的发酵结束终点的产酸速率0.8g/L/h；
[0046] 步骤(2)和(3)采用碟片式离心机为喷嘴型，离心条件为：分离因子Fr＝150，离心时间3min；离心机工作时，晶体从离心机固相出口排出，菌液从离心机液相出口排出，从而实现晶体和菌液的分离；
[0047] 步骤(2)所述的一级低速离心后的晶体体积：菌液体积比1；3；
[0048] 步骤(3)所述的二级低速离心后，晶体体积：菌液体积比1：20；
[0049] 步骤(4)所述的离心法使用高速碟片式离心机，离心条件为：分离因子Fr＝1600，分离时间3min，离心浓缩比1：40。
[0050] 如图2、图4所示，步骤(4)所述的离心法浓缩菌液所对应的酪氨酸循环发酵和分离提取方法使用的设备，包括：一号发酵罐1，一级低速碟片式离心机2，二级低速碟片式离心机3，高速碟片式离心机4，二号发酵罐5和离心泵6及连接管道、阀门等。其中：一号发酵罐底部通过离心泵与一级低速碟片式离心机的料液进口相连，一级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与二级低速碟片式离心机料液进口相连，二级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与高速碟片式离心机的料液进口相连，高速碟片式离心机的固相出口通过离心泵与二号发酵罐顶部相连。
[0051] 实施例2
[0052] 一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法，与实施例1基本相同，如图1和图3所示，不同之处在于：
[0053] 步骤(1)所述的发酵结束终点的产酸速率0.4g/L/h。
[0054] 步骤(2)采用碟片式离心机，离心条件为：分离因子Fr＝230，离心时间2min。
[0055] 步骤(2)所述的一级低速离心后的晶体体积：菌液体积为1；2。
[0056] 步骤(3)所述的二级低速离心后，晶体体积：菌液体积为1：15。
[0057] 步骤(4)所述的离心法使用碟片式离心机，离心条件为：分离因子Fr＝2000，分离1min，离心浓缩比1：50。
[0058] 实施例3
[0059] 一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法，与实施例1基本相同，不同之处在于：
[0060] 步骤(1)所述的发酵结束终点的产酸速率0.7g/L/h。
[0061] 步骤(2)和(3)采用碟片式离心机，离心条件为：分离因子Fr＝120，离心时间5min。
[0062] 步骤(2)所述的一级低速离心后的晶体体积：菌液体积为1；2.5。
[0063] 步骤(3)所述的二级低速离心后，晶体体积：菌液体积为1：12。
[0064] 步骤(4)采用陶瓷膜过滤法浓缩菌液，陶瓷膜过滤条件，工作压力0.5MPa,浓缩比1：3。
[0065] 如图3-5所示，步骤(4)采用陶瓷膜过滤法浓缩菌液对应的酪氨酸循环发酵和分离提取方法使用的设备，包括：一号发酵罐1，一级低速碟片式离心机2，二级低速碟片式离心机3，陶瓷膜过滤组件7，二号发酵罐5和离心泵6及连接管道、阀门等。其中：一号发酵罐底部通过离心泵与一级低速碟片式离心机的料液进口相连，一级低速碟片式离心机的液相出口通过离心泵与二级低速碟片离心机料液进口相连，二级低速碟片离心机的液相出口通过离心泵与陶瓷膜过滤组件的料液进口相连，陶瓷膜过滤组件的浓液出口通过离心泵与二号发酵罐顶部相连。
[0066] 上述参照实施例对该一种酪氨酸循环发酵和分离提取方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。
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