水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用
阅读：428发布：2021-09-18
专利汇可以提供水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 水 稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用，水稻基因组信息，挖掘水稻中的Seh1同源基因，克隆其全长cDNA序列，对其进行 氨 基酸序列分析、亚细胞 定位 及水杨酸抗病途径中的表达分析，并对转基因阳性植株进行抗纹枯病的抗性鉴定，以初步明确Seh1基因在水稻抗病中的功能，为广谱抗病水稻品种育种提供遗传学的理论 基础 。，下面是水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用专利的具体信息内容。
1.水稻抗病基因OsSeh1，其特征在于，其核糖核酸分子序列信息计算机可读版本是：
ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGCAGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。
2.权利要求1所述水稻抗病基因OsSeh1的克隆方法，其特点在于，按照以下步骤具体实施：
步骤一、材料的准备
水稻品种‘中花11’用于转化过表达及RNAi载体，并作为水杨酸处理的阴性对照；水稻品种‘日本晴’用于RNA提取；还准备大肠杆菌DH5α、农杆菌EH105、立枯丝核菌株；
步骤二、水稻基因OsSeh1的克隆
以拟南芥序列进行BLAST，搜索到‘日本晴’水稻基因组中与其同源性最高的基因序列(NP_001043597，Gene ID:4326622)，命名为OsSeh1，其CDS全长为972bp，编码323个氨基酸，用Primer 5.0设计一对特异性引物Seh-F(5′-TATGGTACCATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGA-3′)和Seh-R(5′-GCTCTAGACTAGTGAGACACATTGCAGTC-3′)，分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点，用以扩增OsSeh1基因全长，同时设计另一对特异性引物mirF(5′-CGGATCCATGGTTACTGCATACTCAGATGG-3′)和mirR(5′-CGTCGACCTGAGGTGAGCCAAGCTCAA-3′)，分别加BamHI和SalI酶切位点，用以扩增RNA干涉片段；
取日本晴三叶期的水稻幼苗，Trizol试剂法提取总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板，扩增OsSeh1基因的PCR反应体系为：2.0mmol/L的MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、
0.25μg模板cDNA、1μmol/L上下游引物、1U Taq酶，反应体系总体积25μl，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸1min，进行32个循环；72℃总延伸10min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，进行TA克隆，载体为pEASY-T1。
3.权利要求1所述水稻抗病基因OsSeh1的功能鉴定方法，其特点在于，按照以下步骤具体实施：
步骤一、过表达载体与RNAi载体构建及转化
测序正确的OsSeh1基因全长，以p1301a载体为骨架，构建过表达载体OsSeh1-p1301a，干涉片段与pUCCRNAi载体用BamHI/BglII、SalI/XhoI两对同尾酶进行酶切，T4连接酶连接，构建双向插入片段的干涉重组质粒2Seh1-pUCC，用PstI单酶切验证，验证正确的
2Seh1-pUCC质粒与p1301a载体用SalI、PstI双酶切，T4连接酶连接，构建干涉融合表达载体2Seh1-pUCC-p1301a，构建好的载体验证正确后经农杆菌介导转化水稻品种中花11，通过GUS染液对转基因植株根和叶进行染色，显蓝色的为阳性植株，过表达载体上带有潮霉素抗性筛选标记基因，设计引物hyF(5′-ACTCACCGCGACGTCTGT-3′),hyR(5′-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3′)对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1009bp大小片段为阳性植株；
步骤二、亚细胞定位载体构建、转化及观察
设计引物sF(5′-AACTAGTATGGCGGAGCGGCAGGTG-3′),sR(5′-TACCCGGGGTGAGACACATT
GCAGTC-3′),将OsSeh1 CDS序列的终止子切除，两端分别加上SpeI和SmaI酶切位点测序正确后，连接到p1305.1-GFP载体，酶切验证正确，电转法导入农杆菌EH105得到转化子，将转化子注射到烟草中，以注射携带空载体1305.1-GFP的EH105菌株作为阴性对照，
2
注射后的烟草进行暗培养，36h后，在离注射孔1cm左右处剪取0.5cm大小烟草叶片，制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位；
步骤三、OsSeh1水杨酸诱导表达分析
生长到株高15cm左右的野生型日本晴幼苗用5mmol/L水杨酸叶面喷洒处理，分别在处理后的0、12、24、36、48和72h取样，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，对OsSeh1基因进行荧光定量PCR试验，观察水杨酸处理后该基因在不同时间段的表达水平，实验采用水稻－△△CT
Actin作为内参基因，每个样本重复测量3次，结果以2 值表示基因表达的相对值，以
3个样本测定结果的平均值作为最终结果，荧光定量PCR的Seh1和Actin引物分别如下：
Seh1F(5′-CAGATGGCCAAGTGAAGGTTTAT-3′)，Seh1R(5′-GTTCTGGAACTCCGCCTGAA-3′)；
ActinF(5′-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3′)，ActinR(5′-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3′)；
步骤四、OsSeh1转基因植株体内水杨酸含量测定及抗病性鉴定
利用高效液相色谱，对转基因植株以及对照植株叶片中自由态水杨酸含量进行测定；
根据峰面积所占的比例，分别计算出对照与过表达植株T1-1/2/3以及RNAi植株体内游离态SA的含量，每组实验重复3次，采用牙签嵌入接种法对过表达植株、干涉植株、对照中花
11野生型植株分别进行纹枯病病原菌接种，重复2次，每次各接种15株，利用加湿器和温室，控制温度在35℃左右及湿度90％以上的条件下生长，15天后对水稻病菌侵染症状进行观察统计，按病斑面积占叶鞘总面积的比例来判定植株的感病情况。
4.根据权利要求3所述的水稻抗病基因OsSeh1功能鉴定方法，其特点在于：步骤四的游离态SA的含量的计算，实验数据均用SPSS统计软件处理和统计分析，方法为单因素方差分析，P<0.05为差异显著，p>0.05为差异不显著。
5.权利要求1所述水稻抗病基因OsSeh1的应用，其特点在于，其应用于水稻纹枯病的防治。
水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法、应用
技术领域
背景技术
[0002] 水稻(Oryza sativa)是世界性重要的粮食作物[1]，也是谷类生物学的模式植物[2,3]。纹枯病(Rice sheath blight)是世界性水稻(Oryza sativa)三大病害之一，其发生[1]
面积广，危害程度重，严重影响水稻的产量和品质 。至今在水稻种质资源中尚未发现对水稻纹枯病完全免疫或高抗的水稻品种。纹枯病由真菌引起，从水稻秧苗期到抽穗期均可发[2]
病，侵染包括叶鞘、叶片、甚至穗子在内的各种组织，造成结实率下降 。水稻对纹枯病的抗[3]
性属于典型的数量性状抗病性，不存在主效抗病基因 。因此，研究水稻对纹枯病广谱抗性的分子机理非常重要。目前，水稻广谱抗病相关的分子机理研究主要集中在几丁质酶基因上，如许多研究表明水稻植株中过表达几丁质酶或将几丁质酶基因和葡聚糖基因一起转入[4-9]
水稻可以破坏纹枯病病原菌细胞壁结构，从而提高植株抗性 。
面积广，危害程度重，严重影响水稻的产量和品质 。至今在水稻种质资源中尚未发现对水稻纹枯病完全免疫或高抗的水稻品种。纹枯病由真菌引起，从水稻秧苗期到抽穗期均可发[2]
病，侵染包括叶鞘、叶片、甚至穗子在内的各种组织，造成结实率下降 。水稻对纹枯病的抗[3]
性属于典型的数量性状抗病性，不存在主效抗病基因 。因此，研究水稻对纹枯病广谱抗性的分子机理非常重要。目前，水稻广谱抗病相关的分子机理研究主要集中在几丁质酶基因上，如许多研究表明水稻植株中过表达几丁质酶或将几丁质酶基因和葡聚糖基因一起转入[4-9]
水稻可以破坏纹枯病病原菌细胞壁结构，从而提高植株抗性 。
[0003] 近年来，越来越多研究表明植物体的非特异性防御反应涉及多种核质运输的参与，不同的R蛋白(Resistance proteins)在运输途径中起重要作用。在水稻中已初步分[10]离鉴定到了NBS-LRR类的R蛋白抗 病基因家族 ，但其功能尚未被验证。此外，真核细胞中蛋白质和RNA在细胞质和细胞核中的运输主要通过核孔蛋白复合体(NPCs)进行。植物体的防御反应被激活时，NPCs可以特异调节NB-LRRR蛋白、免疫原件及相关转录调控因子[11]
和丝裂原活化蛋白激酶细胞膜上的转运，转入细胞核，使植物启动抗病反应 。植物核孔蛋白(Nup)是NPCs的重要组成部分。尽管Nups在动物免疫过程中起重要作用早已被证明[[12,13]
，然而，关于Nups参与许多植物的抗性调控因子转运的研究尚少，已鉴定的Nups也非常少。
和丝裂原活化蛋白激酶细胞膜上的转运，转入细胞核，使植物启动抗病反应 。植物核孔蛋白(Nup)是NPCs的重要组成部分。尽管Nups在动物免疫过程中起重要作用早已被证明[[12,13]
，然而，关于Nups参与许多植物的抗性调控因子转运的研究尚少，已鉴定的Nups也非常少。
[0004] 在模式植物拟南芥(Arabidopsis thaliana)中已发现了一个核孔编码蛋白的基因，AtSeh1(GenBank登录号AEE34229)，其产物是核孔蛋白复合体Nup107-160D的组成部分。它不能够直接对病原微生物进行作用，但可以特异性的识别TNL(Toll interleukin 1receptor/nucleotide-binding/leucine-rich repeat)类抗性蛋白，从而参与植物SAR(systemic acquired resistance)反应，通过调节植物免疫调节因子EDS1(enhanced disease susceptibility 1)的含量以及控制抗性蛋白的运输参与到水杨[14,15]酸抗病途径中 。目前，水稻中已克隆的抗病基因中大部分基因编码类受体类蛋白激酶(Receptor-like protein kinase,RLK)，直接参与对病原菌的识别和防御，如Pi2，X21等[16,17]
，而关于Nup的研究较少。迄今为止，水稻Seh1基因的研究未见报道。因此，对水稻中Seh1基因进行克隆和功能研究具有重要意义。
，而关于Nup的研究较少。迄今为止，水稻Seh1基因的研究未见报道。因此，对水稻中Seh1基因进行克隆和功能研究具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明提供水稻抗病基因OsSeh1、克隆方法、功能鉴定方法、 应用，填补水稻Seh1基因研究的空白。
[0006] 本发明采用的技术方案是，
[0007] 水稻抗病基因OsSeh1，其核糖核酸分子序列信息计算机可读版本是：
[0008] ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCGTCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGC AGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。
[0009] 所述水稻抗病基因OsSeh1的克隆方法，按照以下步骤具体实施：
[0010] 步骤一、材料的准备
[0011] 水稻品种‘中花11’用于转化过表达及RNAi载体，并作为水杨酸处理的阴性对照；水稻品种‘日本晴’用于RNA提取；还准备大肠杆菌DH5α、农杆菌EH105、立枯丝核菌株；
[0012] 步骤二、水稻基因OsSeh1的克隆
[0013] 以拟南芥序列进行BLAST，搜索到‘日本晴’水稻基因组中与其同源性最高的基因序列(NP_001043597，Gene ID:4326622)，命名为OsSeh1，其CDS全长为972bp，编码323个氨基酸，用Primer 5.0设计一对特异性引物Seh-F
[0014] (5′-TATGGTACCATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGA-3′)和Seh-R
[0015] (5′-GCTCTAGACTAGTGAGACACATTGCAGTC-3′)，分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点，用以扩增OsSeh1基因全长，同时设计另一对特异性引物mirF
[0016] (5′-CGGATCCATGGTTACTGCATACTCAGATGG-3′)和mirR
[0017] (5′-CGTCGACCTGAGGTGAGCCAAGCTCAA-3′)，分别加BamHI和SalI酶切位点，用以扩增RNA干涉片段；
[0018] 取日本晴三叶期的水稻幼苗，Trizol试剂法提取总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板，扩增OsSeh1基因的PCR反应体系为：2.0mmol/L的MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.25μg模板cDNA、1μmol/L上下游引物、1U Taq酶，反应体系总体积25μl，PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸1min，进行32个循环；72℃总延伸10min，PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，进行TA克隆，载体为pEASY-T1。
[0019] 水稻抗病基因OsSeh1的功能鉴定方法，按照以下步骤具体实施：
[0020] 步骤一、过表达载体与RNAi载体构建及转化
[0021] 测序正确的OsSeh1基因全长，以p1301a载体为骨架，构建过表达载体OsSeh1-p1301a，干涉片段与pUCCRNAi载体用BamHI/BglII、SalI/XhoI两对同尾酶进行酶切，T4连接酶连接，构建双向插入片段的干涉重组质粒2Seh1-pUCC，用PstI单酶切验证，验证正确的2Seh1-pUCC质粒与p1301a载体用SalI、PstI双酶切，T4连接酶连接，构建干涉融合表达载体2Seh1-pUCC-p1301a，构建好的载体验证正确后经农杆菌介导转化水稻品种中花11，通过GUS染液对转基因植株根和叶进行染色，显蓝色的为阳性植株，过表达载体上带有潮霉素抗性筛选标记基因，设计引物hyF(5′-ACTCACCGCGACGTCTGT-3′),hyR(5′-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3′)对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1009bp大小片段为阳性植株；
[0022] 步骤二、亚细胞定位载体构建、转化及观察
[0023] 设计引物sF(5′-AACTAGTATGGCGGAGCGGCAGGTG-3′),
[0024] sR(5′-TACCCGGGGTGAGACACATT
[0025] GCAGTC-3′),将OsSeh1CDS序列的终止子切除，两端分别加上SpeI和SmaI酶切位点测序正确后，连接到p1305.1-GFP载体，酶切验证正确，电转法导入农杆菌EH105得到转化子，将转化子注射到烟草中，以注射携带空载体1305.1-GFP的EH105菌株作为阴性对2
照，注射后的烟草进行暗培养，36h后，在离注射孔1cm左右处剪取0.5cm大小烟草叶片，制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位；
照，注射后的烟草进行暗培养，36h后，在离注射孔1cm左右处剪取0.5cm大小烟草叶片，制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位；
[0026] 步骤三、OsSeh1水杨酸诱导表达分析
[0027] 生长到株高15cm左右的野生型日本晴幼苗用5mmol/L水杨酸叶面喷洒处理，分别在处理后的0、12、24、36、48和72h取样，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA，对OsSeh1基因进行荧光定量PCR试验，观察水杨酸处理后该基因在不同时间段的表达水平，实验采用－△△CT水稻Actin作为内参基因，每个样本重复测量3次，结果以2 值表示基因表达的相对值，以3个样本测定结果的平均值作为最终结果，荧光定量PCR的Seh1和Actin引物分别如下：Seh1F
[0028] (5′-CAGATGGCCAAGTGAAGGTTTAT-3′)，Seh1R
[0029] (5′-GTTCTGGAACTCCGCCTGAA-3′)；
[0030] ActinF(5′-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3′)，ActinR
[0031] (5′-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3′)；
[0032] 步骤四、OsSeh1转基因植株体内水杨酸含量测定及抗病性鉴定利用高效液相色谱，对转基因植株以及对照植株叶片中自 由态水杨酸含量进行测定；根据峰面积所占的比例，分别计算出对照与过表达植株T1-1/2/3以及RNAi植株体内游离态SA的含量，每组实验重复3次，采用牙签嵌入接种法对过表达植株、干涉植株、对照中花11野生型植株分别进行纹枯病病原菌接种，重复2次，每次各接种15株，利用加湿器和温室，控制温度在35℃左右及湿度90％以上的条件下生长，15天后对水稻病菌侵染症状进行观察统计，按病斑面积占叶鞘总面积的比例来判定植株的感病情况。
[0034] 水稻抗病基因OsSeh1应用于水稻纹枯病的防治。
[0035] 本发明的有益效果是：克隆了日本晴水稻中的编码核孔蛋白的基因OsSeh1，完成氨基酸序列分析、亚细胞定位、水杨酸诱导表达及转基因植株的抗病性鉴定，初步明确了OsSeh1基因在水稻抗病中的功能，为水稻广谱抗病分子机理和水稻广谱抗性品种分子育种提供理论基础。附图说明
[0036] 图1本发明的2Seh-pUCC-p1301a构建流程示意图；
[0037] 图2本发明的水稻遗传转化流程图；
[0038] 图3本发明的p1305.1-GFP载体图谱示意图；
[0039] 图4本发明的OsSeh1PCR产物在琼脂糖凝胶上的电泳图示意 图；
[0040] 图5本发明的基于5个物种的Seh1同源基因氨基酸序列的NJ进化树；
[0041] 图6本发明的5个不同物种间Seh1氨基酸序列排列图；
[0042] 图7本发明的OsSeh1在水杨酸诱导下‘日本晴’叶片中的表达模式。
[0043] 图8本发明的OsSeh1在烟草叶片细胞中的亚细胞定位
[0044] 图9本发明的不同水稻植株体内游离水杨酸的含量
[0045] 图10本发明的不同水稻植株接种纹枯病菌后的抗病性
具体实施方式
[0046] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0047] 本发明利用水稻基因组信息，挖掘水稻中的Seh1同源基因，克隆其全长cDNA序列，对其进行氨基酸序列分析、亚细胞定位及水杨酸抗病途径中的表达分析，并对转基因阳性植株进行抗纹枯病的抗性鉴定，以初步明确Seh1基因在水稻抗病中的功能，为广谱抗病水稻品种育种提供遗传学的理论基础。
[0048] 第一部分、水稻抗病基因OsSeh1及克隆方法、功能鉴定方法
[0049] 水稻抗病基因OsSeh1，其核糖核酸分子序列信息计算机可读版本是：
[0050] ATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGAGCTGGGGGCCGGCGCGGCGTGCGTAGGCTGGAACCACTGCGGCCGCCGCCTCGCCGCCGGCGCCGTCGACGGCTTCGTCTCCGTCTACGACTCCCAGTCCCAGCCG TCGCCTTCCTCCAAGTGGCAGGCCCACAAGCATGCGATCCTGAATATCGTGTGGCTTCCTCCGGACTATGGGGATGCTATAGCTTGTGTTTGTGCTGATGGGACGCTATCTTTGTGGGAGGAGGTCAGTGAAGATGATCAACTTCCAACCTGGAGGAAATGTAAAGTATTTGAGAGTGGCAATTCTCACATACTACACGTACAGTTTGGATTACAACTGTCTAGTCTAAAAATGGTTACTGCATACTCAGATGGCCAAGTGAAGGTTTATGAGCTCTTGGACTCGTTGGAATTAGACAAGTGGCAGCTTCAGGCGGAGTTCCAGAACATTACAGATCCTGTTTCCCGATCTGGGAAGCCAGCATGTACTTCTGCATCAATTGCATGGAGTCCAAGAAGAGGTGAAAGTCAGCAGGCTAGTTTTGCTATTGGTTTCAATTCAGACTCTCCAAATTTCAACTCTTGTAAGATTTGGGAGTTCGAAGAAGCTCACCAGCGTTGGCTCCCCCTTGTTGAGCTTGGCTCACCTCAGGATAAGGGGGATATAGTGCATGCTGTAGCATGGGCTCCTAACATCGGCAGACCATATGAGATCATAGCAGTTGCGACATGTAAAGGAATCGCAATCTGGCATATAGGCTTAAGCGCTGAATCTGACGGCAGCCTGTCAACTGAGAATGTGGCTGTACTTTCTGGCCATGATGGGGAGGTCCTGCAACTGGAATGGGACATGGGCGGTATGACACTCGCATCGACCGGAGGTGATGGCATGGTTAAGCTATGGCAGGCTAACCTGAATGGAGTTTGGCATGAACAAGCTGTGCTTGACTGCAATGTGTCTCACTAG。
[0051] 水稻抗病基因OsSeh1的克隆方法，按照以下步骤具体实施：
[0052] 步骤一、材料的准备
[0053] 水稻品种‘中花11’(Oryza sativa L.japonica cv.zhonghua11)用于转化过表达及RNAi载体，并作为水杨酸处理的阴性对照；水稻品种‘日本晴’用于RNA提取。还准备大肠杆菌DH5α、农杆菌EH105、立枯丝核菌株(Rhizoctonia solani)。
[0054] 步骤二、水稻基因OsSeh1的克隆及分析
[0055] 以拟南芥AtSeh1(At1g64350)序列进行BLAST，搜索到‘日本晴’水稻基因组中与其同源性最高的基因序列(NP_001043597，Gene ID:4326622)，命名为OsSeh1，其CDS全长[18]为972bp，编码323个氨基酸。用Primer 5.0 设计一对特异性引物Seh-F
[0056] (5′-TATGGTACCATGGCGGAGCGGCAGGTGGCGGA-3′)和Seh-R
[0057] (5′-GCTCTAGACTAGTGAGACACATTGCAGTC-3′)，分别加上KpnI和XbaI两个酶切位点，用以扩增OsSeh1基因全长。同时设计另一对特异性引物mirF
[0058] (5′-CGGATCCATGGTTACTGCATACTCAGATGG-3′)和mirR
[0059] (5′-CGTCGACCTGAGGTGAGCCAAGCTCAA-3′)。分别加BamHI和SalI酶切位点，用以扩增RNA干涉片段。
[0060] 取日本晴三叶期的水稻幼苗，Trizol试剂法提取总RNA，反转录成cDNA，作为PCR反应模板。扩增OsSeh1基因的PCR反应体系为：2.0mmol/L的MgCl2、0.2mmol/L的dNTPs、0.25μg模板cDNA、1μmol/L上下游引物、1U Taq酶，反应体系总体积25μl。PCR反应程序为：94℃预变性5min；94℃变性30s、60℃复性30s、72℃延伸1min，进行32个循环；72℃总延伸10min。PCR产物用 1％琼脂糖凝胶电泳检测并纯化，进行TA克隆，载体为pEASY-T1，挑选3个阳性克隆菌液送去测序。
[0061] 通过BLAST搜索禾本科中的Seh1同源基因序列，利用DNAman[19]进行蛋白序列比[20]对分析，并应用MEGA4.0 构建基于氨基酸序列和邻接法(NJ)的进化树。
[0062] 所述水稻抗病基因OsSeh1的功能鉴定方法，按照以下步骤具体实施：
[0063] 步骤一、过表达载体与RNAi载体构建及转化
[0064] 测序正确的OsSeh1基因全长，以p1301a载体为骨架，构建过表达载体OsSeh1-p1301a。干涉片段与pUCCRNAi载体用BamHI/BglII、SalI/XhoI两对同尾酶进行酶切，T4连接酶连接，构建双向插入片段的干涉重组质粒2Seh1-pUCC。用PstI单酶切验证。验证正确的2Seh1-pUCC质粒与p1301a载体用SalI、PstI双酶切，T4连接酶连接。构建干涉融合表达载体2Seh1-pUCC-p1301a，2Seh-pUCC-p1301a载体构建流程如图1所示。构建[21]
好的载体验证正确后经农杆菌介导转化水稻品种中花11，转化流程如图2所示 ，图中a为诱导培养，b为分化培养，c为生根，d为炼苗。通过GUS染液对转基因植株根和叶进行染色，显蓝色的为阳性植株。过表达载体上带有潮霉素抗性筛选标记基因，设计引物hyF(5′-ACTCACCGCGACGTCTGT-3′),hyR(5′-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3′)对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1009bp大小片段为阳性植株。
好的载体验证正确后经农杆菌介导转化水稻品种中花11，转化流程如图2所示 ，图中a为诱导培养，b为分化培养，c为生根，d为炼苗。通过GUS染液对转基因植株根和叶进行染色，显蓝色的为阳性植株。过表达载体上带有潮霉素抗性筛选标记基因，设计引物hyF(5′-ACTCACCGCGACGTCTGT-3′),hyR(5′-TTTCTTTGCCCTCGGACG-3′)对转基因植株潮霉素基因的一段进行扩增，能扩增出1009bp大小片段为阳性植株。
[0065] 步骤二、亚细胞定位载体构建、转化及观察
[0066] 设计引物sF(5′-AACTAGTATGGCGGAGCGGCAGGTG-3′),sR(5′-TACCCGGGGTGAGACACATTGCAGTC-3′),将OsSeh1CDS序列的终止子切除，两端分别加上SpeI和SmaI酶切位点[21]测序正确后，连接到p1305.1-GFP载体，酶切验证正确，如图3，电转法导入农杆菌EH105得到转化子，将转化子注射到烟草中，以注射携带空载体1305.1-GFP的EH105菌株作为阴
2
性对照。注射后的烟草进行暗培养，36h后，在离注射孔1cm左右处剪取0.5cm大小烟草叶片，制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位。
2
性对照。注射后的烟草进行暗培养，36h后，在离注射孔1cm左右处剪取0.5cm大小烟草叶片，制片后在共聚焦显微镜下观察亚细胞定位。
[0067] 步骤三、OsSeh1水杨酸诱导表达分析
[0068] 生长到株高15cm左右的野生型日本晴幼苗用5mmol/L水杨酸叶面喷洒处理，分别在处理后的0、12、24、36、48和72h取样，Trizol法提取总RNA，反转录成cDNA。对OsSeh1基因进行荧光定量PCR试验，观察水杨酸处理后该基因在不同时间段的表达水平。实验采－△△CT用水稻Actin作为内参基因，每个样本重复测量3次，结果以2 值表示基因表达的相对值，以3个样本测定结果的平均值作为最终结果。荧光定量PCR的Seh1和Actin引物分别如下：Seh1F
[0069] (5′-CAGATGGCCAAGTGAAGGTTTAT-3′)，Seh1R
[0070] (5′-GTTCTGGAACTCCGCCTGAA-3′)；
[0071] ActinF(5′-TCCATCTTGGCATCTCTCAG-3′)，ActinR
[0072] (5′-GTACCCGCATCAGGCATCTG-3′)。
[0073] 步骤四、OsSeh1转基因植株体内水杨酸(SA)含量测定及抗病性鉴定[0074] 参照Bowling文献的报道[22],利用高效液相色谱(HPLC)，对转基因植株以及对照植株叶片中自由态水杨酸含量进行测定。根据峰面积所占的比例，分别计算出对照与过表达植株T1-1/2/3以及RNAi植株体内游离态SA的含量，每组实验重复3次，实验数据均用SPSS统计软件(版本为16.0)处理和统计分析，方法为单因素方差分析，P<0.05为差异显著，p>0.05为差异不显著。采用牙签嵌入接种法对过表达植株、干涉植株、对照中花11野生型植株分别进行纹枯病病原菌接种，重复2次，每次各接种15株。利用加湿器和温室，控制温度在35℃左右及湿度90％以上的条件下生长。15天后对水稻病菌侵染症状进行观察[23]统计，按病斑面积占叶鞘总面积的比例来判定植株的感病情况 。
[0075] 第二部分，水稻抗病相关基因OsSeh1的克隆及功能鉴定的结果与分析[0076] 2.1OsSeh1的克隆及进化分析
[0077] 通过RT-PCR成功扩增得到水稻日本晴的OsSeh1基因编码区，琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，片段条带大小在1Kb左右，且无非特异性条带，如图4，图中，M-5000Marker，1-OsSeh1PCR条带。测序结果表明扩增所得DNA片段核苷酸序列与NP_001043597核苷酸序列一致性为100％，说明在日本晴水稻品种中仅有一个Seh1基因拷贝，不存在其它家族成员。
[0078] 通过BLAST在禾本科中分别搜索到了高粱(Sorghum durra)、短柄草(Brachypodium distachyon)和玉米(Zea mays)中的同源基因，并基于这些氨基酸序列构建了NJ进化树(图5)，图中Os:Oryza sativa水稻,At:Arabidopsis thaliana拟南芥,Sb：Sorghum durra高粱，Bd：Brachypodium distachyon短柄草，Zm：Zea mays玉米；种名之后的数字为每条序列的GenBank登录号。NJ进化树结构显示Seh1基因符合物种进化关系，拟南芥Seh1基因与其余四个禾本科物种关系最远，高粱和玉米的Seh1基因为姐妹关系，支持率为100％，短柄草和水稻中的Seh1为姐妹关系，但支持率较低。上述5个Seh1氨基酸序列比对分析显示，这些物种中Seh1基因序列有多个保守结构域，暗示了Seh1在这些物种中的功能可能相似，如图6，每条序列名称的指代同图5。
[0079] 2.2OsSeh1在水杨酸诱导下的表达水平
[0080] 水杨酸处理后72h内，日本晴叶片中OsSeh1的表达水平有一定的变化，如图7，在处理后12h OsSeh1的表达量开始升高，在48h达到最高水平，但从0h到处理后72h每个时间点OsSeh1的相对表达量变化并不大。
[0081] 2.3OsSehI在烟草叶片中亚细胞定位
[0082] 利用农杆菌侵染的方法，获得OsSeh1基因在烟草叶片细胞中的瞬时表达信息。如图8所示，共聚焦显微镜在488nm激发光下观察，对照35S：GFP在烟草叶片的整个细胞中均能观察到荧光，而35S：OsSeh1：GFP只能在细胞核中观察到荧光。
[0083] 2.4OsSeh1过表达载体和RNAi转基因植株获得
[0084] 构建好的过表达载体、RNA干涉载体在农杆菌EH105介导下，获得转基因水稻植株，其中过表达组培苗10株，RNA干涉组培苗11株。用GUS染色法对组培苗根和叶进行染色，过表达载体有6株阳性，干涉载体有8株阳性。通过PCR对载体上潮霉素基因的检测，最终鉴定到过表达和干涉T0代转基因水稻各5株。
[0085] 2.5游离SA的HPLC测定
[0086] 植株体内自由态水杨酸含量的高低直接与植株的抗病性相关，利用高效液相色谱法，通过峰面积的计算，分别获得了对照植株及转基因T1代植株体内自由态水杨酸的含量。OsSeh13个过表达株系体内水杨酸的含量分别为101.3、98.6、99.2μg/g，显著高于对照的60.5μg/g(P<0.05)；而OsSeh1RNAi植株体内游离SA的含量只有26.3μg/g，显著低于对照组(P<0.05)。过表达三个株系之间SA含量差别不明显(P>0.05)如图9，图中，WT为野生型植株，T1-1/2/3为过表达植株T1代，T1-4为RNAi植株。
[0087] 2.6OsSeh1抗病性鉴定
[0088] 所述水稻抗病基因OsSeh1应用于水稻纹枯病的防治。
[0089] 对转基因植株接种纹枯病原菌15天以后进行发病情况的统计，过表达植株、干涉植株以及野生型对照植株的抗病性结果如图10所示。对照组野生型植株出现纹枯病感病症状，OsSeh1过表达植株相对对照组对纹枯病有明显抗性，只有轻微的感病，而RNAi植株相对对照植株有更加明显感病症状，在叶鞘部位大部分面积出现病斑，如 图10，图中CK为野生型植株。
[0090] 第三部分，结论
[0091] 本发明首次在水稻中分离到了OsSeh1基因，并进行了一系列的功能验证。氨基酸序列比对分析结果表明，水稻OsSeh1与拟南芥中的AtSeh1的氨基酸序列同源，进化树和蛋白序列比对分析表明，Seh1基因在水稻、拟南芥、玉米和短柄草中均为单拷贝，且共享多个高度保守结构域，说明其在植物中功能可能相似，支持了真核生物参与细胞核膜运输的大分子具有保守性的普遍观点。此外，Seh1基因在很多作物中都存在，如‘日本晴’水稻中存在Seh1，但在正常表达情况下没有显示明显的抗病性，很可能由于没有得到足够的表达量使得植株具备广谱抗病性，说明Seh1表达还受其它调控因子的影响。今后，可以收集不同抗病水平的水稻种质资源对Seh1进一步克隆和分析。
[0092] 通过烟草叶片瞬时表达的亚细胞定位试验结果表明，OsSeh1基因仅定位在细胞核，在亚细胞定位网站(http://www.csbio.sjtu.edu.cn/bioinf/plant-multi/#)通过OsSeh1的蛋白序列对其进行定位预测，预测结果与实验结果相一致，都是定位在细胞核。本发明结果表明OsSeh1在烟草叶片细胞中定位在细胞核内，初步证实了OsSeh1的细胞核转运功能，将来可以进一步对转基因水稻植株的叶及根部细胞进行OsSeh1亚细胞定位研究，以全面认识基因OsSeh1在水稻中表达的组织特异性。
[0093] 水杨酸在植物抗病代谢过程中起重要作用，它可以诱导植物体 内产生抗性物质，如抗病相关蛋白，进而诱导抗病的产生。本发明表明对野生型中花水稻叶片进行水杨酸处理可以诱导OsSeh1的表达，但表达变化不大，此外，相比野生型水稻，过表达OsSeh1植株的水杨酸含量显著升高，而RNA干扰的植株水杨酸含量显著下降，说明OsSeh1有助于提高SA介导的抗病性，并且作用于信号通路中SA的上游。基因OsSeh1过表达、干扰和野生型水稻植株的纹枯病抗性鉴定结果表明，水稻对纹枯病的抗性水平与OsSeh1的表达水平呈正相关。OsSeh1的过表达可以明显增强水稻植株对纹枯病的抗性。
[0094] 植物抗病反应是一个十分复杂的过程，可能涉及到多个通路。拟南芥中AtSeh1属于核孔蛋白WD家族，主要通过WD结构域与其他蛋白互作，参与体内抗病反应调控，根据WD[24]蛋白结合的蛋白不同，从而表现出功能的多效性和复杂性 。AtSeh1在抗病上为广谱抗病[14]
基因，可以抵抗多种类型的病原菌 。本发明对水稻OsSeh1的功能进行了上述的鉴定，但其结合蛋白及在整个水稻防御反应蛋白互作中的作用尚不明确，有待于进一步研究，这将[25,26]
成为水稻广谱抗病分子机理研究的重点之一 。
基因，可以抵抗多种类型的病原菌 。本发明对水稻OsSeh1的功能进行了上述的鉴定，但其结合蛋白及在整个水稻防御反应蛋白互作中的作用尚不明确，有待于进一步研究，这将[25,26]
成为水稻广谱抗病分子机理研究的重点之一 。
[0095] 水稻是重要的粮食作物，纹枯病等多种水稻真菌病害对水稻产量及品质造成重大影响，通过基因工程提高水稻的广谱抗病能力具有重要意义。本发明克隆了日本晴水稻中的编码核孔蛋白的基因OsSeh1，通过氨基酸序列分析、亚细胞定位、水杨酸诱导表达及转基因植株的抗病性鉴定，初步明确了OsSeh1基因在水稻抗病中的功能，研究结果为水稻广谱抗病分子机理和水稻广谱抗性品种分子育种提供理论 基础。
[0096] 参考文献
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