技术领域
[0001] 本
发明涉及
微生物领域，具体而言，涉及一种生产纽莫康定B0的基因重组菌株及选育方法和应用。
背景技术
[0002] 棘白菌素类抗
真菌药物为一种新型的脂肽类化合物，通过非竞争抑制真菌细胞壁中特有的β-1-3-葡聚糖合酶活性进而抑制真菌细胞壁的合成，且对人体不造成影响。这种明显不同于两性霉素这类传统抗生素药物的作用机制，使得棘白菌素类具有广谱性强、耐药性小、药物间相互作用小的特点，成为了未来低毒、安全、广谱性的新型抗生素的发展方向。
[0003] 卡泊芬净是第一个被批准上市的棘白菌素类抗真菌药，由丝状真菌Glarea lozoyensis的
次级代谢产物纽莫康定B0经化学修饰衍生而得，默克公司开发其作为一种广谱的抗真菌/抗
肺囊虫药物。卡泊芬净于2001年2月在美国上市，主要用于
治疗患有侵染性的曲霉病而又不适合用两性霉素B或伊曲康唑治疗的患者。除此之外，在无免疫应答患者中，此药可用于曲霉病、假丝
酵母病的初期治疗用药；还可用于对抗生素产生抗性的嗜中性白细胞减少症患者以及某些儿科适应症。
[0004] Glarea lozoyensis
发酵生产纽莫康定B0的过程中，会产生多种结构类似物，包括纽莫康定A0、纽莫康定C0、纽莫康定B1、纽莫康定B2和纽莫康定D0等。其中主要的结构类似物A0和C0对后期的分离提取造成了极大的困难。默克公司对原始菌株ATCC20868进行了诱变选育，获得了纽莫康定B0高产菌株ATCC20957，但是该菌株的纽莫康定B0产量仅285mg/L，且纽莫康定A0含量较高，两者浓度之比(B0/A0)为10。随后对ATCC20957进行NTG诱变，获得了纽莫康定B0高产菌株ATCC74030，纽莫康定B0的产量得到的了提升，纽莫康定A0的含量进一步降低，纽莫康定B0/纽莫康定A0为80，纽莫康定C0<5％。目前纽莫康定B0发酵的最高产量为5.2g/L。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种能稳定高产纽莫康定B0且副产物少的基因重组菌。
[0006] 本发明的另一目的是提供选育该基因重组菌的方法。
[0007] 本发明的另一目的是利用该基因重组菌发酵生产纽莫康定B0的方法。
[0008] 本发明的目的是通过下列技术方案实现的：
[0009] 一、一种生产纽莫康定B0的基因重组菌株，其分类命名为Glarea lozoyensis Q45，该菌株由中国典型培养物保藏中心保藏，保藏登记号为CCTCC NO：M 2014416，保藏时期为2014年9月14。
[0010] 二、本发明所述的生产纽莫康定B0的基因重组菌株Glarea lozoyensis Q45的选育方法，包括下列步骤：
[0011] (1)原生质体的制备
[0012] 将Glarea lozoyensis原始菌株接入
种子培养基培养，收集菌丝，用酶解液酶解，制成原生质体；
[0013] 2)原始突变子库
[0014] 将步骤1)制备的原生质体体积均分为两组，分别采用常压室温
等离子体(ARTP)和氯化锂进行诱变处理，将获得的突变株涂布于再生培养基上，挑取生长良好的菌落进行发酵测定纽莫康定B0，挑选产量高的突变株进行斜面传代考察
稳定性，获得多株性质稳定的高产突变株，形成突变子库；
[0015] 3)原生质体的融合
[0016] 将步骤2)得到的性状稳定的突变菌株，按照步骤1)制备原生质体，每株突变株的原生质体都等体积均分为两组，一组采用ARTP注入灭活，另一组采用热灭活，将两组灭活后的原生质体混合加入融合液进行随机融合；
[0017] 4)融合子的筛选
[0018] 通过步骤3)获得的融合后的原生质体用高渗缓冲离心洗涤后，涂布于再生培养基上，挑取生长良好的菌落进行发酵测定纽莫康定B0，得到纽莫康定B0高产基因重组菌株；
[0019] 5)以步骤4)所得的纽莫康定B0高产基因重组菌株为出发菌株，多次重复进行步骤3)-5)的原生质体制备、融合、筛选工作；
[0020] 6)遗传稳定性考察
[0021] 对步骤5)获得纽莫康定B0高产基因重组菌株进行遗传稳定性实验检测，获得一株产纽莫康定B0高且稳定的突变株，即本发明所述的基因重组菌株Glarea lozoyensis Q45。
[0022] 三、利用本发明所述的Glarea lozoyensis Q45的菌株发酵生产纽莫康定B0的方法：是将Glarea lozoyensis Q45的菌丝接种于种子培养基培养后，再接种于发酵培养基中进行发酵生产纽莫康定B0。
[0023] 具体步骤包括：
[0024] 1)将斜面培养好的Glarea lozoyensis Q45菌株的菌丝接入到种子培养基中，在24-28℃，180-300rpm条件下培养2-3天，得种子液；
[0025] 2)将种子液按发酵培养基体积5-15％的接种量接种于发酵培养基中，在24-28℃，200-500rmp条件下培养9-11天。
[0026] 为了提高纽莫康定B0的产量，在步骤2)的发酵过程中的第3-11天，以-1 -1 -10.05-0.4g ·L ·h 的速度流加浓度为10-20％(v/v)的甘露醇。
[0027] 所述培养基为：种子培养基配方为(g/L)：
碳源10-70，氮源10-80，KH2PO40-1，FeSO4·7H2O0.005-0.015，MnSO4·4H2O 0.005-0.015，ZnSO4·7H2O 0.001-0.003，CaCl2·2H2O0.005-0.015，CuCl2·2H2O 0.0001-0.0005，H3BO30.0002-0.0006，(NH4)6Mo7O24·4H2O
0.0002-0.0006；
[0028] 发酵培养基配方为(g/L)：碳源40-150，氮源1-50，
氨基酸0.1-20，KH2PO40-3，FeSO4·7H2O0.005-0.015，MnSO4·4H2O 0.005-0.015，ZnSO4·7H2O 0.001-0.003，CaCl2·2H2O0.005-0.015，CuCl2·2H2O 0.0001-0.0005，H3BO30.0002-0.0006，(NH4)6Mo7O24·4H2O
0.0002-0.0006；
[0029] 所述碳源包括
葡萄糖、果糖、甘露醇、可溶性
淀粉、甘油、麦芽糖、
蔗糖、肉豆蔻酸中的一种或多种；所述氮源包括黄豆粉、黄豆饼粉、
棉籽饼粉、玉米蛋白粉、蛋白胨、大豆蛋白胨、酵母粉、酵母
浸出粉、玉米浆、
硫酸铵、
氯化铵、尿素中的一种或多种任一比例的混合物；所述氨基酸包括谷氨酸、谷氨酸钠、脯氨酸、赖氨酸、精氨酸、
鸟氨酸、苏氨酸、异亮氨酸中的一种或多种任一比例的混合物。
[0030] 本发明的有益效果：
[0031] Glarea lozoyensis Q45发酵11天后纽莫康定B0产量可以达到6g/L，而副产物纽莫康定C0的含量小于3％，纽莫康定A0的含量未检测到，因而此基因重组菌除能够高产纽莫康定B0外，还具有副产物少、发酵周期短的优点；另外由于利用此工艺生产的纽莫康定B0有利于后续的分离提取和工艺放大，因此具有巨大的工业价值。
具体实施方式
[0032] 一般性说明
[0033] PDA培养基(g/L)：土豆200,蔗糖20。
[0034] 再生培养基(g/L)：NaCl 46.7，土豆200,蔗糖20，琼脂2.2。
[0035] 氯化锂再生培养基(g/L)：LiCl 3.5，NaCl 46.7，土豆200,蔗糖20，琼脂2.2。
[0036] 高渗缓冲液I的配制方法为：取2.7218g KH2PO4，4.64g NaCl加入80ml哇哈哈
水溶解，用NaOH调PH到6.0，用水定容到100ml；
[0037] 高渗缓冲液II的配制方法为：0.6mol/L的葡萄糖溶液；
[0038] 酶解液的制备方法为：取Yatalse 80g，融壁酶80g，蜗
牛酶80g，用1L高渗缓冲液I溶解。
[0039] 发酵液的预处理：
[0040] 取1ml发酵液，加入9ml
乙醇，剧烈振荡10min，然后离心3000rpm，10min，离心后的上清用于进一步检测。
[0041] 纽莫康定A0、纽莫康定B0的检测：
[0042] 采用戴安高效液相色谱U3000测定，其具体方法为：色谱柱，C18柱；流动相A，乙腈；流动相B，0.1％的
磷酸；洗脱程序，0min-20min，A:B＝40:60，20min-40min，A:B＝50:50；流速1.5ml/min，检测
波长，210nm；检测
温度，25℃。
[0043] 纽莫康定C0的检测：
[0044] 采用戴安高效液相色谱P680测定。其具体方法为：色谱柱，Inertsil 5u Si柱；流动相乙酸乙酯:甲醇:水的＝84:9:7；流速，1.2ml/min；检测波长，278nm；检测温度，25℃。
[0045]
实施例1基因重组菌株Glarea lozoyensis的选育方法
[0046] 出发菌株：购买自美国模式培养物集存库(ATCC)的Glarea lozoyensis 74030。
[0047] (1)原生质体的制备
[0048] 将纯化后生长最旺盛、纽莫康定B0产量最高的Glarea lozoyensis菌株接入装有50ml PDA液体培养基的250ml摇瓶中，于26℃、220r/min条件下培养3天，取8ml培养液到无菌的10ml离心管中，1800r/min，4℃，离心10min去上清，用高渗缓冲液I清洗2次后收集菌丝体，在收集的菌丝体中加入2ml新配置的酶解液，26℃，100r/min下振荡培养3h，得酶解好的液体；取2ml离心管，在离心管中加入0.2ml的1.2M的蔗糖溶液将酶解好的液体加入其中，1800rpm，4℃，离心10min，轻轻弃去上清液，再补加0.2ml高渗缓冲II，1800rpm，
4℃，离心10min，轻轻弃去上清液，将沉淀原生质体重悬于0.5ml的高渗缓冲溶液II中，即为所得的原生质体。
[0049] (2)原始突变子库制备
[0050] (a)ARTP诱变：将步骤(1)制备好的原生质体调整浓度为107cfu/ml，取10μL原-3生质体置于无菌小
铁片上，小铁片放置于ARTP诱变机载物台上，靶室抽
真空至10 Pa，选用
14 2
15KeV氦离子，50-300*10 /cm剂量对这些原生质体进行处理。然后将小铁片迅速取下放置于990ul高渗缓冲II溶液中，取100μL涂布于再生培养基上再生，26℃，
培养箱避光培养，7天后观察结果。将再生平板上长出的菌落点接种到PDA固体培养基上，26℃，培养箱避光培养11天，挑取生长良好的菌落进行液体发酵，11天后通过HPLC测定纽莫康定B0产量，获得2株产量较高的菌株—ARTP-Q1、ARTP-Q2，分别较原始菌株提高40％和28％，如表
1所示。
[0051] (b)氯化锂诱变：将步骤(1)制备好的原生质体调整浓度为107cfu/ml，取100μL原生质体涂布于氯化锂再生平板上，26℃，培养箱避光培养，9天后观察结果。将再生平板上长出的菌落点接种到PDA固体培养基上，26℃，培养箱避光培养11天，挑取生长良好的菌落进行液体发酵，11天后通过HPLC测定纽莫康定B0产量。高产突变菌株经斜面传代5次考察稳定性，最后获得2株产量较高的菌株—LiCl-Q1、LiCl-Q2，分别较原始菌株提高26％和22％(如表1所示)。
[0052] 表1原始突变子库
[0053]编号 纽莫康定B0浓度(g/L)
ATCC74030 0.81
ARTP-Q1 1.13
ARTP-Q1 1.04
LiCl-Q1 1.02
LiCl-Q2 0.99
[0054] (3)原生质体的融合
[0055] 将步骤(2)得到的4个菌株按照步骤(1)的方法制备成原生质体后等体积混匀后均分为两组，一组置于ARTP仪中处理30-120s，另一组置于60℃水浴中处理5-30min完全灭活后，混合后1800rpm离心10min，弃上清，加入26℃预热的PEG融合液1ml使两组原生质体进行融合。其中PEG融合液的制备方法为：70g PEG-4000溶于100ml去离子水中，121℃灭菌20min，4℃保存，使用前置于26℃保温20min，4000rpm离心后取上清备用。
[0056] (4)融合子的筛选
[0057] 融合后的原生质体用高渗缓冲液I离心洗涤3次，并作适当稀释，取0.2ml涂布于再生培养基上，26℃培养7天观察长出菌落。将菌落接种到PDA固体培养基上，挑取生长良好的菌落，接种于1.5ml发酵培养基中，置于转速为250rpm的恒温摇床上，26℃培养11天，测定其纽莫康定B0产量。该发酵培养基配方为(g/L)：葡萄糖20，甘露醇80，玉米淀粉20，K2HPO42.5，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.002，CaCl2·2H2O 0.001，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0002，pH 6.8。挑选纽莫康定B0产量最高的4株，分别为RHF1-14、RHF1-42、RHF1-75、RHF1-77。
[0058] 表2第一轮重组菌株摇瓶初筛
[0059]
[0060] (5)将上述4株纽莫康定B0产量较高的RHF1菌株重复步骤(3)-(4)所述的原生质体制备、原生质体融合与融合子的筛选，共进行五轮基因重组，得到7株产量比RHF4突变株高30％以上的融合菌株—RHF5-03、RHF5-07、RHF5-19、RHF5-32、RHF5-57、RHF5-68、RHF5-88。
[0061] (6)突变菌株的遗传稳定性试验
[0062] 将第五轮重组菌株RHF5-03、RHF5-07、RHF5-19、RHF5-32、RHF5-57、RHF5-68、RHF5-88分别进行PDA固体培养基传代5次，对每一代菌株进行液体发酵产纽莫康定B0实验，测定纽莫康定B0产量。如表3结果所示，RHF5-03和RHF5-07的产量较为稳定，考虑到工业生产中要求遗传性质稳定的菌种，因此选用产量更为稳定的RHF5-07，该菌株重新命名为Glarea lozoyensis Q45。Glarea lozoyensis Q45产纽莫康定B0的平均产量为6.12g/L。
[0063] 表3遗传稳定性考察
[0064]
[0065] 实施例2利用Glarea lozoyensis Q45在5L
发酵罐上进行纽莫康定B0生产的方法。
[0066] 1.斜面种子培养
[0067] 固体培养方法：菌株接种于PDA固体斜面培养基上，25℃培养11天。
[0068] 2.摇瓶种子培养
[0069] 种子培养基(g/L)：葡萄糖40，黄豆粉20，玉米浆10，KH2PO41，FeSO4·7H2O0.01，MnSO4·4H2O0.01，ZnSO4·7H2O 0.002，CaCl2·2H2O 0.001，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0002，pH调为5.0。
[0070] 培养温度：25℃
[0071] 培养时间：3天
[0072] 摇床转速：220rpm
[0073] 摇瓶种子培养方法：从固体斜面培养基上取出一
块1cm2大小的菌接入装液量为50ml的250ml摇瓶中，培养3天。
[0074] 3、5L发酵罐发酵
[0075] 5L发酵罐培养基
[0076] 发酵培养基(g/L)：葡萄糖20，甘露醇80，蛋白胨30，脯氨酸2，K2HPO43，FeSO4·7H2O0.01，MnSO4·4H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.002，CaCl2·2H2O 0.01，CuCl2·2H2O0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0002，pH 6.8。
[0077] 装液量：5L罐装培养基3L，121℃灭菌30min。
[0078] 5L罐的培养方法：将培养好的摇瓶种子液300mL接入发酵罐中，在400rpm，1vvm，-1 -1 -126℃条件下培养11天。在发酵第3天开始以0.15g ·L ·h 的速度流加流加20％的甘露醇。
[0079] 发酵终点判断：菌丝
颜色深，
空泡较多，菌丝有断裂、自溶现象。
[0080] 按照上述发酵条件和工艺，在5L罐上进行3批发酵实验，发酵单位分别为：6.22g/L、6.53g/L、6.75g/L。
[0081] 实施例3-6Glarea lozoyensis Q45利用其它碳源、氮源以及营养成分代谢生产纽莫康定B0的情况
[0082] 实施例3-6培养方法采用实例2中所用的方法进行培养。
[0083] 实施例3-6种子培养基中碳源采用可溶性淀粉40g/L；氮源采用黄豆粉20g/L和酵母粉2g/L；其他无机盐为(g/L)：KH2PO41，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，ZnSO4·7H2O0.002，CaCl2·2H2O 0.01，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0002；
pH调为5.2；
[0084] 实施例3发酵培养基中碳源采用果糖80g/L；氮源采用蛋白胨20g/L；氨基酸采用谷氨酸钠20g/L；其他无机盐(g/L)：K2HPO43，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O0.01，ZnSO4·7H2O 0.002，CaCl2·2H2O 0.01，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0002，pH 6.8。
[0085] 实施例4发酵培养基中碳源采用甘露醇150g/L；氮源采用玉米蛋白粉50g/L；氨基酸采用鸟氨酸0.1g/L；其他无机盐(g/L)：K2HPO43，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O 0.01，ZnSO4·7H2O0.002，CaCl2·2H2O 0.01，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0002，pH6.8。
[0086] 实施例5发酵培养基中碳源采用果蔗糖10g/L；氮源采用棉籽饼粉40g/L；氨基酸采用精氨酸1g/L；其他无机盐(g/L)：K2HPO43，FeSO4·7H2O 0.01，MnSO4·4H2O
0.01，ZnSO4·7H2O 0.002，CaCl2·2H2O 0.01，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O 0.0002，pH 6.8，。
[0087] 实施例6发酵培养基中碳源采用麦芽糖60g/L；氮源采用氯化铵1g/L；氨基酸采用异亮氨酸2.5g/L或赖氨酸0.5g/L；其他无机盐(g/L)：K2HPO43，FeSO4·7H2O0.01，MnSO4·4H2O 0.01，ZnSO4·7H2O 0.002，CaCl2·2H2O 0.01，CuCl2·2H2O 0.00025，H3BO30.00056，(NH4)6Mo7O24·4H2O0.0002，pH 6.8。
[0088] 测定结果如表4所示：
[0089]实施例编号 纽莫康定B0浓度(g/L)
实施例3 5.87
实施例4 6.6
实施例5 5.52
