技术领域
[0001] 本
发明属于
生物工程技术领域，涉及一种抗菌肽VIP类似肽及其制备方法。
背景技术
[0002] 和谐
畜牧业是我国当前畜牧业发展的主题，其重要内容之一就是动物-人-自然的和谐，而动物健康直接关系到动物源性食品品质与安全以及环境。然而，抗生素的大量使用甚至滥用导致病原菌耐药性菌株甚至超级细菌产生、抗生素在畜禽产品中残留以及随动物粪尿排出污染环境等一系列严峻问题，严重影响了畜产品品质和人类健康。因此，研制安全、高效、环保型防病保健促生长添加剂来替代抗生素已显得极为迫切。抗菌肽因其具有广谱抗菌、耐热、无毒无药残、不易产生耐药菌株等众多的优点，其研究开发已成为世界上研究抗生素新产品的前沿性课题，被认为是新型抗生素研究的新资源和重要途径。抗菌肽VIP具有开发为防病保健
饲料添加剂的优势和潜
力：(1)结构简单明确：由28个
氨基酸残基组成的直链肽；(2)具有多种生物学活性，而且活性较强：免疫调节、抗炎，对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌等具有较强的抑杀作用；(3)作用浓度小：由于VIP属于内源性的胃肠道
激素类抗菌肽(脑肠肽)，因此，以较小的作用浓度(nmoL级)就能发挥较强的生物活性。VIP本身具有的特性使它具有开发为高效、安全的防病保健饲料添加剂的潜力和广阔的应用前景。
[0003] 然而，由于抗菌肽天然资源有限，化学合成肽类成本高，而基因工程方法大量表达抗菌肽使之成为新兴饲料和饲料添加剂的途径更为现实，并显示出良好前景。随着对抗菌肽构效关系、作用机制及其基因表达调控机制认识的不断深化，设计高效、有利于人类健康的抗菌肽作为抗生素替代品是完全可行的。利用基因工程方法获得抗菌肽的尝试已在原核和真核体系获得成功，但异源高效表达抗菌肽仍面临多种困难，一是抗菌肽的编码基因转录后的mRNA较小，一般只有100～200bp，同时其表达的抗菌肽在表达细胞中也容易被降解，很难实现抗菌肽的大量表达；二是抗菌肽具有抗菌作用，表达宿主，如细菌或
酵母细胞表达的抗菌肽会反馈性抑制宿主细胞活性，影响抗菌肽的进一步表达。由此可见，如何进一步提高表达
水平，在高表达的同时充分保持抗菌肽的生物学活性，提高基因表达产物的
稳定性，设计并表达抗菌活性更强、抗菌谱更广的抗菌肽等都是值得深入探究的问题。
发明内容
[0004] 本发明的目的是提供一种抗菌肽VIP类似肽及其制备方法，以解决
现有技术存在的结构复杂、抗菌活力不足和抗菌谱不广的局限性。
[0005] 本发明所采用的技术方案是，一种抗菌肽VIP类似肽，抗菌肽VIP类似肽为如下氨基酸序列：
[0006] HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN。
[0007] 本发明所采用的另一种技术方案是，一种抗菌肽VIP类似肽的制备方法，按照以下步骤实施：
[0008] 步骤1、抗菌肽VIP类似肽基因的合成：
[0009] 根据GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、结构特征和理化性质，将D3、D8替换为K3、K8，对其进行改良；改良后的氨基酸序列为：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN；
[0010] 将TrxA与改良抗菌肽VIP进行融合表达，在抗菌肽VIP类似肽的核苷酸序列3’端添加终止密码子TAA，5’端添加了肠激酶(Enterokinase,EK)识别序列DDDDK，以便融合蛋白被EK切割，释放出具有N端无额外氨基酸的VIP类似肽；使用XhoI和KpnI限制性内切酶构建重组质粒，在基因两端分别设计了与pET32a(+)XhoI和KpnI位点相同的序列，便于双酶切；
[0011] 改良后的核苷酸序列为119bp：GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGCGG，
[0012] 上述序列中：方框显示分别为XhoI和KpnI酶切位点；下划线标识为EK识别序列；TAA为终止密码子；
黑体倾斜部分为VIP类似肽基因序列；
[0013] 为了获得上述目的基因，由此设计合成了3条引物P1、P2和P3，引物扩增长度为119bp，经测序鉴定说明已成功合成该抗菌肽基因；P1:5'-GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3'；
[0014] P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3'；
[0015] P3:5'---CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG---3'；
[0016] 上述序列P1和P2中的方框分别表示XhoI和KpnI酶切位点；
[0017] 步骤2、抗菌肽VIP类似肽重组大肠杆菌表达载体的构建和鉴定：
[0018] 对重叠延伸PCR法(SOE-PCR)扩增获得的基因和pET32a(+)分别同时进行双酶切，然后进行连接，以将目的基因构建到到表达载体上，获得的重组质粒可编码TrxA-VIP2融合蛋白。使用双酶切连接法构建重组质粒时，按外源基因与质粒摩尔数比为3：1的比例进行混合，反应体系为10uL，16℃过夜，同样转化DH5a感受态细胞，经测序进行鉴定，说明抗菌肽VIP类似肽的表达载体构建成功；
[0019] 步骤3、抗菌肽VIP类似肽对大肠杆菌感受态细胞的转化及诱导表达：将融合表达质粒pET32-VIP2转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到pET32-VIP2/BL21(DE3)重组菌；重组菌接种至15mL LB培养基中过夜培养，以BL21(DE3)和pET32a(+)为对照，按1％接种量分别接种于30mL新鲜培养基中，吸光度A600达0.6左右时用IPTG诱导(终浓度0.3mmol/L)，诱导前及诱导后4h分别测定A600，分别取适量的菌体量进行SDS-PAGE；
[0020] 步骤4、融合蛋白的纯化：
[0021] 培养pET32-VIP2/BL21(DE3)，诱导表达4h后收集菌体，用A液(20mmol/L PBS+0.5mol/L NaCl,pH8.0)清洗，8000r/min离心5min，重复清洗1次，再以1:10的比例(V：OD)的比例将菌体重悬于A液，超声
破碎后，4℃15000r/min离心15min，收集上清液，经TMBeaverBeads
金属离子螯合
磁珠进行纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，可得到纯化后的融合蛋白TrxA-VIP2；
[0022] 步骤5、抗菌肽VIP类似肽的释放：
[0023] 为获得改良抗菌肽VIP，需用人工引入的肠激酶切割位点切割融合蛋白TrxA-VIP2，去除担体蛋白，释放目标抗菌肽；将纯化后的融合蛋白经Sephadex G-25柱脱盐和
超滤管浓缩后进行肠激酶切割，成功释放重组表达抗菌肽VIP类似肽。
[0024] 进一步的，步骤1中的抗菌肽VIP类似肽基因的PCR反应体系为：10×Buffer含2+
Mg 5μL，dNTP 2.5mM 4μL，引物P15μM 10μL，引物P25μM 0.5μL，引物P35μM 10μL，pfu 0.5μL；PCR反应条件为：94℃预变性5min；94℃30s，60℃40s，72℃1min进行30个循环；72℃延伸5min；25℃保存，使用1.5％琼脂糖凝胶
电泳鉴定PCR产物。
[0025] 进一步的，步骤2中转化DH5a感受态细胞的方法如下：从-80℃
冰箱中取出制备好的DH5a大肠杆菌感受态细胞，迅速置于冰水浴中；将上述10uL连接体系加入到感受态中，冰浴30min；42℃水浴脉冲60s，快速移至冰水浴中放置2min，加入500uLLB，37℃180rpm摇床培养1h；取部分菌液涂布于LB平板(含100ug/mL氨苄青霉素)；37℃倒置培养12～16h，有单菌落长出。
[0026] 进一步的，步骤5中肠激酶酶切反应体系为：10×重组
牛肠激酶反应缓冲液5μL，融合蛋白40μL，重组牛肠激酶0.5U，ddH2O 4.5μL，总反应体系为50μL，25℃温浴反应12h和16h后，Tricine-SDS-PAGE
[0027] 观察酶切效果。
[0028] 本发明的有益效果是，抗菌肽VIP类似肽的生产工艺简单，生产成本低，抑菌能力强且抗菌谱广，极具市场前景。
附图说明
[0029] 图1是本发明的重叠PCR产物电泳图；
[0030] 图2是本发明的pET32-VIP2在BL21(DE3)中的表达图；
[0031] 图3是本发明的BL21-pET32-EK-VIP2表达及纯化的融合蛋白的电泳图；
[0032] 图4是本发明的肠激酶酶切融合蛋白的电泳图；
[0033] 图5是本发明的抗菌肽VIP类似肽对大肠杆菌ATCC 25922的抑菌活性；
[0034] 图6是本发明构建的抗菌肽VIP类似肽的重组表达质粒图谱。
[0035] 在图2中，M.蛋白marker，1.诱导前全菌蛋白，2.诱导4h后全菌蛋白，3.超声上清中的蛋白，4.超生沉淀中的蛋白；
[0036] 在图3中，M.蛋白marker，1.诱导4h后全菌蛋白，2.超声上清中蛋白，3.纯化后的目的蛋白；
[0037] 在图4中，M.蛋白marker，1和2.EK切割前的融合蛋白，3和4.EK切割后的融合蛋白；
[0038] 在图5中，1.化学合成抗菌肽VIP类似肽，浓度为32μg/mL，2.重组表达抗菌肽VIP类似肽，肠激酶酶切融合蛋白后的溶液50μL。
具体实施方式
[0039] 下面结合附图和具体实施方式对本发明进行详细说明。
[0040] 本 发 明提 供 了 一 种抗 菌 肽VIP 类 似 肽 为 如下 氨 基 酸 序列：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN。
[0041]
实施例1：抗菌肽VIP类似肽的制备方法：
[0042] (1)抗菌肽VIP类似肽基因的合成：
[0043] 天然动物源性抗菌肽是一种神经免疫调节肽，结构简单明确，具有多种生物学活性，而且作用浓度小，具有开发潜力；但是其抗菌活性相对较低，针对此，通过分子，在保留其安全性的
基础上提高到期抗菌活性，并通过基因工程的方法进行制备，以提高其应用性。
[0044] 根据GeneBank中抗菌肽VIP的氨基酸序列、结构特征和理化性质，将D3、D8替换为K3、K8，对其进行改良。改良前后的氨基酸序列如下：
[0045] 改良前：HSDAVFTDNYTRLRKQMAVKKYLNSILN
[0046] 改良后：HSKAVFTKNYTRLRKQMAVKKYLNSILN
[0047] 为避免本发明抗菌肽VIP类似肽对大肠杆菌宿主菌的毒性，将TrxA与改良抗菌肽VIP进行融合表达，在抗菌肽VIP类似肽的核苷酸序列3’端添加终止密码子TAA，5’端添加了肠激酶(Enterokinase,EK)识别序列DDDDK，以便融合蛋白被EK切割，释放出具有N端无额外氨基酸的VIP；使用XhoI和KpnI限制性内切酶构建重组质粒，在基因两端分别设计了与pET32a(+)XhoI和KpnI位点相同的序列，便于双酶切；新的核苷酸序列为119bp：GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACACTCGTCTGCGTAAGCAGATGGCTGTCAAGAAGTACCTGAACTCCATCCTGAACTAACTCGAGCGG
[0048] 上述序列中：方框显示分别为XhoI和KpnI酶切位点；下划线标识为EK识别序列；蓝色显示为终止密码子；黑体倾斜部分为VIP类似肽的基因序列。
[0049] 为了获得上述目的基因，由此，设计合成了3条引物P1、P2和P3，引物扩增长度为119bp，PCR扩增的反应体系及反应条件见下述说。其PCR产物的电泳检测结果如附图1所示，进一步经测序鉴定，说明已成功合成该抗菌肽基因；
[0050] P1:
[0051] 5'-GGGGTACCGACGACGACGACAAGCACAGCAAGGCTGTCTTCACTAAGAACTACAC-3'；
[0052] P2:5'-CCGCTCGAGTTAGTTCAGGATGGAGTTCAGGTACTTCTTGACAGCCATCTG-3'；
[0053] P3:
[0054] 5'---CTTCTTGACAGCCATCTGCTTACGCAGACGAGTGTAGTTCTTAGTGAAG---3'；
[0055] 上述序列P1和P2中的方框分别表示XhoI和KpnI酶切位点。
[0056] 该抗菌肽VIP类似肽基因的PCR反应体系为：10×Buffer含Mg2+5μL，dNTP 2.5mM4μL，引物P15μM 10μL，引物P25μM 0.5μL，引物P35μM 10μL，pfu 0.5μL。PCR反应条件如下：94℃预变性5min；94℃30s，60℃40s，72℃1min进行30个循环；72℃延伸5min；
25℃保存，使用1.5％琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。
[0057] (2)抗菌肽VIP类似肽的重组大肠杆菌表达载体的构建和鉴定：
[0058] 对重叠延伸PCR法(SOE-PCR)扩增获得的基因和pET32a(+)分别同时进行双酶切，然后进行连接，以将目的基因构建到到表达载体上，获得的重组质粒可编码TrxA-VIP2融合蛋白。使用双酶切连接法构建重组质粒时，按外源基因与质粒摩尔数比为3：1的比例进行混合，反应体系为10uL，16℃过夜，同样转化DH5a感受态细胞，转化方法如下：从-80℃冰箱中取出制备好的DH5a大肠杆菌感受态细胞，迅速置于冰水浴中；将上述10uL连接体系加入到感受态中，冰浴30min；42℃水浴脉冲60s，快速移至冰水浴中放置2min，加入500uLLB，37℃180rpm摇床培养1h；取部分菌液涂布于LB平板(含100ug/mL氨苄青霉素)；
37℃倒置培养12～16h，有单菌落长出，进一步通过测序进行鉴定，结果表明测定结果与设计的基因序列完全一致，说明抗菌肽VIP类似肽的表达载体构建成功，图6是本发明构建的抗菌肽VIP类似肽的重组表达质粒图谱。
[0059] (3)抗菌肽VIP类似肽对大肠杆菌感受态细胞的转化及诱导表达：
[0060] 将融合表达质粒pET32-VIP2转化E.coliBL21(DE3)感受态细胞，得到pET32-VIP2/BL21(DE3)重组菌。重组菌接种至15mL LB培养基中过夜培养，以BL21(DE3)和pET32a(+)为对照，按1％接种量分别接种于30mL新鲜培养基中，吸光度A600达0.6左右时用IPTG诱导(终浓度0.3mmol/L)，诱导前及诱导后4h分别测定A600，分别取适量的菌体量进行SDS-PAGE，结果如附图2所示，说明该抗菌肽VIP类似肽已经在大肠杆菌中得到了高效表达。
[0061] (4)融合蛋白的纯化：
[0062] 培养pET32-VIP2/BL21(DE3)，诱导表达4h后收集菌体，用A液(20mmol/L PBS+0.5mol/L NaCl,pH8.0)清洗，8000r/min离心5min，重复清洗1次，再以1:10的比例(V：OD)的比例将菌体重悬于A液，超声破碎后，4℃15000r/min离心15min，收集上清液，经BeaverBeadsTM金属离子螯合磁珠进行纯化，以含500mmol/L咪唑的洗脱液洗脱，可得到纯化后的融合蛋白TrxA-VIP2，结果如附图3所示，说明通过该纯化方法，可以较为有效的除去杂蛋白。
[0063] (5)抗菌肽VIP类似肽的释放：
[0064] 为获得抗菌肽VIP类似肽，需用人工引入的肠激酶切割位点切割融合蛋白TrxA-VIP2，去除担体蛋白，释放目标抗菌肽；将纯化后的融合蛋白经Sephadex G-25柱脱盐和超滤管浓缩后进行肠激酶切割；肠激酶酶切反应体系如下：10×重组牛肠激酶反应缓冲液5μL，融合蛋白40μL，重组牛肠激酶0.5U，ddH2O 4.5μL，总反应体系为50μL，25℃温浴反应12h和16h后，Tricine-SDS-PAGE观察酶切效果，结果如附图4所示，说明采用肠激酶可以有效酶切该融合蛋白，成功释放重组表达抗菌肽VIP类似肽。
[0065] 实施例2抗菌肽VIP类似肽的抗菌活性的测定：
[0066] 使用牛津杯法测定纯化的抗菌肽VIP类似肽的抗菌活性，培养大肠杆菌ATCC25922至OD600约为0.5，配制含有1.5％琼脂的MHB培养基100mL，将灭菌的MH培养基冷却到50℃左右加入上述菌液1mL，混匀后倒板。待培养基
凝固后在培养基表面垂直放上牛津杯，并在牛津杯中加入待测样品，包括重组表达的抗菌肽VIP类似肽(肠激酶酶切融合蛋白液)以及化学合成的抗菌肽VIP，37℃培养16～18h。牛津杯抑菌试验中，抗菌物质呈球面扩散，离杯越近，抗菌物质浓度越大，离杯越远抗菌物质浓度越小。随着抗菌物质浓度减小，有一条
最低抑菌浓度带，在带范围内，菌不能生长，而呈透明的圆圈即抑菌圈，样品抗菌活性越高、浓度越高，则抑菌圈越大。检测结果如图5所示，说明基因工程重组表达的抗菌肽VIP类似肽具有较强的抗菌活性。
[0067] 根据常见抗菌肽的杀菌特点、抗菌机制及其构效关系，以天然抗菌肽VIP为
模版，根据其理化特性，自行设计了一种新型抗菌肽VIP类似肽氨基酸序列。在此基础上，选用大肠杆菌偏爱密码子，使用套叠PCR(SOE-PCR)扩增基因，克隆于大肠杆菌中表达，获得新型的抗菌肽VIP类似肽的重组大肠杆菌表达菌株，并将
发酵规模放大到
发酵罐水平，实现抗菌肽VIP产品的高
密度发酵和高效表达。发酵液进一步纯化后制成粉剂、液体等抗菌制剂。基因工程重组抗菌肽制剂可作为畜禽饲料添加剂或用于畜禽
疾病的
预防和
治疗。
