一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺
专利汇可以提供一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种病毒性 肝炎 治疗 药物干扰素的生产工艺，包括如下步骤：(1)获取目的基因；(2)PCR扩增：在微量离心管中,以步骤(1)中得到的1μg/mL目的基因为模板DNA，加入适量的缓冲液、4种dNTP混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶体系、一对0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物,体系pH为6.8-7.8；(3)基因重组；(4)转化；(5)分离纯化；(6)基因表达；(7)修饰；(8)冻干，本发明的干扰素能够在短时间内大量生产，用聚乙二醇修饰之后，延长了干扰素的 半衰期 ，提高了对肝炎病毒靶向性，并且 抗原 性弱，不会引起人体的免疫反应，药效好，固定化生产， 稳定性 好，适于推广应用。，下面是一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺专利的具体信息内容。
1.一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，包括如下步骤：
(1)获取目的基因：从病毒性肝炎患者体内获取效应T细胞，在温度为37℃，PH为7.0的条件下，用限制性内切酶对DNA进行部分酶解，得到控制干扰素合成的目的基因，备用；
(2)PCR扩增：在微量离心管中,以步骤(1)中得到的1μg/mL目的基因为模板DNA，加入适量的缓冲液、4种dNTP混合物、0.5-2.5U/50μL的DNA聚合酶体系、一对
0.1-0.5μmol/L合成DNA的引物,体系PH为6.8-7.8，PCR扩增包括如下基本反应步骤：
①预变性：温度92℃，反应5min，使双链DNA模板解离成为单链；
②变形：温度92℃，反应65s，使双链DNA模板解离成为单链
③复性：温度55℃，反应45s，引物与模板DNA单链互补配对结合；
④延伸：温度72℃，反应5min，“模板-引物结合物”在DNA聚合酶作用
下，以脱氧核糖核苷为原料，以靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成新的DNA链。
⑤重复“变性--复性--延伸”的循环25次，得到所需数量的目的基因；
(3)基因重组:以质粒作为运载体，运用步骤(1)中的限制性内切酶切割质粒以及目的基因，使其产生相同的黏性末端，再经过DNA聚合酶将步骤(2)中得到的扩增后的目的基因导入质粒基因中，得重组质粒；
(4)转化:将大肠杆菌悬浮于3℃的0.4mol/L氯化钙溶液中，并加入步骤(3)中的重组质粒，混合后放置约半小时，然后短暂升温至42℃使细菌进入热休克状态，加入富营养培养基以进行复苏，使之处于感受态主动摄取外源遗传物质。
(5)分离纯化:在牛肉膏蛋白胨培养基上培养步骤(4)得到的大肠杆菌，挑取含有标记基因的菌落，将其接种到另一培养基中培养，重复挑取培养过程，直至达到纯度要求；
(6)基因表达:经过分离纯化的工程菌置于发酵罐中培养，控制温度为37℃，PH为
6.8，从发酵罐流出液中即可提取，得到干扰素；
(7)修饰:向反应釜里加入分子量20000直链单甲氧基聚乙二醇、步骤(6)所得干扰素、50mmol/L磷酸盐缓冲液，混合均匀，在温度为25℃、PH为8.5、200r/min震荡反应4h，用30％的冰醋酸终止反应，反应产物经过0.45μm尼龙膜过滤、脱气后，让流动相通过色谱柱，采用线性梯度洗脱和等度洗脱相结合的方法进行提纯，得修饰干扰素；
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(8)冻干:将样品稀释至1×10IU/ml，加入2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶作为保护剂，分装至西林瓶中，每瓶1ml，放入冻干箱冻干，得产品。
2.根据权利要求1所述的病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，所述DNA聚合酶为TaqDNA聚合酶。
3.根据权利要求1所述的病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，所述步骤(2)中，所述缓冲液为10-50mmol/L的磷酸缓冲液、50mmol/L的KCl、5mmol/L的二硫苏糖醇、100μg/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg2+的混合溶液。
4.根据权利要求1所述的病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺，其特征在于，所述步骤(8)中，所述保护剂中各物质含量为2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶。
一种病毒性肝炎治疗药物干扰素的生产工艺
技术领域
背景技术
发明内容
KCl、5mmol/L的二硫苏糖醇、100μg/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L-2mmol/L的Mg 的混合溶液。
Mg 是DNA聚合酶的激活剂，影响酶的活性和真实性，浓度在0.5mmol/L-2mmol/L之间时，酶的活性高，采用聚乙二醇对干扰素进行氨基化修饰，增加了干扰素的分子量,稳定性得到提高，减少药物排泄，屏蔽了一些干扰素分子表面的抗原决定簇,减少免疫原性,降低体内清除率，并减缓了蛋白酶的水解，延长干扰素的半衰期，冻干步骤中加入2％蔗糖、3％甘
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氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶，有效的保证了干扰素的生物活性在1.4×10IU/mg以上，且在4℃、6个月的环境下仍具有良好的温定性能。
具体实施方式
100μg/mL的牛血清白蛋白、0.5mmol/L的Mg 的混合溶液，而且，所述步骤(8)中，所述保护剂中各物质含量为2％蔗糖、3％甘氨酸、0.5％吐温-80，0.2％明胶。
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