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镰刀菌赤霉病抗性

阅读:765发布:2021-04-13

专利汇可以提供镰刀菌赤霉病抗性专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能变体或功能 片段 的重组构建物。还提供用基因转化的 植物 细胞和植物材料,包括植物细胞培养物、 种子 和植物,包括转化的植物细胞。,下面是镰刀菌赤霉病抗性专利的具体信息内容。

1.一种重组构建物,该重组构建物包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列或SEQ ID NO.1的功能变体,或其功能片段,该功能变体与SEQ ID NO.1具有至少70%的序列一致性。
2.根据权利要求1所述的重组构建物,其中所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少约
80%的序列一致性。
3.根据权利要求1或2所述的重组构建物,其中所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少约94%的序列一致性。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的重组构建物,其中所述功能变体为SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10。
5.根据权利要求4所述的重组构建物,其中所述功能变体为SEQ ID NO.3。
6.根据前述权利要求中任一项所述的重组构建物,其中所述构建物是表达载体。
7.一种宿主细胞,该宿主细胞包含权利要求1至6中任一项所述的重组构建物。
8.一种转化平台,该转化平台包含权利要求1至6中任一项所述的重组构建物。
9.一种用权利要求1至6中任一项所述的重组构建物或权利要求8所述的转化平台遗传转化的植物材料。
10.根据权利要求9所述的植物材料,其中所述植物材料能够过表达SEQ ID NO.1的核苷酸、其功能变体或功能片段。
11.一种遗传转化植物材料的方法,该方法包括用权利要求1至6中任一项所述的重组构建物或权利要求8所述的转化平台转化植物材料的一个或多个细胞的步骤。
12.根据权利要求11所述的方法,其中转化的细胞或每个转化的细胞能够过表达SEQ ID NO.1的核苷酸或其功能变体或功能片段。
13.一种生产具有FHB病抗性的植物或植物材料的方法,所述方法包括用权利要求1至6中任一项所述的重组构建物,或权利要求8所述的转化平台转化植物或植物材料,并种植所述植物或植物材料的步骤。
14.根据权利要求9或10所述的植物材料或根据权利要求11至13中任一项所述的方法,其中所述植物材料选自植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物种子和植物。
15.根据权利要求14所述的植物材料,其中所述植物为谷物。
16.根据权利要求15所述的植物材料,其中所述谷物选自包括玉米、稻、小麦、大麦高粱、粟、燕麦、大豆和黑麦的组。
17.一种分离的核苷酸,该分离的核苷酸包括SEQ ID NO.1的序列或SEQ ID NO.1的功能变体,或其功能片段,该功能变体与SEQ ID NO.1具有至少70%的序列一致性。
18.根据权利要求17所述的分离的核苷酸,其中所述功能变体包括与SEQ ID NO.1至少
80%的序列一致性。
19.根据权利要求17所述的分离的核苷酸,其中所述功能变体包括与SEQ ID NO.1至少
94%的序列一致性。
20.一种分离的肽,该分离的肽包括SEQ ID NO.2的序列或SEQ ID NO.2的功能变体,或其功能片段,该功能变体与SEQ ID NO.2具有至少70%的序列一致性。
21.根据权利要求20所述的分离的肽,其中所述功能变体与SEQ ID NO.2具有至少约
80%的序列一致性。
22.根据权利要求20所述的分离的肽,其中所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少约
90%的序列一致性。
23.根据权利要求20所述的分离的肽,其中所述功能变体为SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.13。
24.权利要求1至6中任一项所述的重组构建物、权利要求7所述的宿主细胞、权利要求8所述的转化平台、权利要求17或18所述的核苷酸,或权利要求20至23中任一项所述的肽用于增强或提供植物或植物材料FHB抗性的用途。
25.SEQ ID NO.1的核苷酸或SEQ ID NO.2的肽作为FHB抗性标记的用途。
26.一种测定植物或植物材料FHB抗性的方法,该方法包括在所述植物或植物材料中检测或测量SEQ ID NO.1的核苷酸或与SEQ ID NO.1具有至少70%序列一致性的功能变体或其功能片段,或SEQ ID NO.2的肽,或与SEQ ID NO.2具有至少70%序列一致性的功能变体或其功能片段的表达。
27.一种筛选FHB小麦品种的方法,该方法包括在所述小麦品种中检测或测量SEQ ID NO.1的核苷酸或与SEQ ID NO.1具有至少70%序列一致性的功能变体或其功能片段,或SEQ ID NO.2的肽,或与SEQ ID NO.2具有至少70%序列一致性的功能变体或其功能片段的表达。
28.一种根据权利要求11至13中任一项所述的方法遗传转化的植物或植物材料。

说明书全文

镰刀菌赤霉病抗性

技术领域

[0001] 本发明涉及对镰刀菌赤霉病(Fusarium head blight disease)的抗性。具体地,本发明涉及抗镰刀菌赤霉病的基因及包含所述基因的重组构建物。本发明还涉及用所述基
因转化的植物细胞和植物材料,包括植物细胞培养物、种子和植物,包括转化的植物细胞。

背景技术

[0002] 镰刀菌赤霉病(FHB)是植物中(尤其是谷物中,例如小麦、大麦和燕麦)的真菌性病害。它由镰刀菌引起,其中在世界上大多数地区物种禾谷镰刀菌是该病害的主要致病因子。
在小麦中,该真菌会感染植株的头部并导致麦粒枯萎。它还可以产生真菌毒素,进一步降低麦粒质量。这些毒素也可以对动物和人类有害。
[0003] 众所周知,FHB是小麦的经济预兆,其会导致收获后的谷粒损失和因积累真菌毒素脱腐镰刀菌烯醇(DON)对动物和人类相当大的健康险。考虑到FHB的经济问题,已经
制定了一些控制策略来避免FHB蔓延。这些策略包括抗FHB的品种和系统以及化学和生物
治。
[0004] 利用宿主抗性被认为是控制小麦FHB的有效手段,前文已经描述了几种方法。针对持久抗病和产量稳定的杂交系的培育和挑选花费时间,并且杂交系在不同环境下的表现也
不同。用这种方法开发的系还可能发生抗性丧失。
[0005] EBI登录号EMBL:HP612298描述了小麦(Triticum aestivum)品种Bobwhite的序列。EBI登录号UNIPROT:W5GU67描述了中国春小麦的非特异性蛋白质序列。EBI登录号EMBL:
GU084176描述了小麦LRR受体样激酶mRNA序列。该基因是LRR受体样激酶基因。它对胁迫和
条锈病的发展有响应。EBI登录号描述了小麦LRR受体样激酶序列。该基因是LRR受体样激酶基因。这些出版物都没有公开重组构建物,也不涉及抗FHB。此外,所公开的序列中没有一个与本发明SEQ ID NO.1的序列等同,本文所定义的它们的功能变体或功能片段与本发明SEQ ID NO.1的序列也不等同。
[0006] CN102586291公开了编码中国小麦品种Wangshuibai的LRR受体激酶的序列。该序列不等同于本发明的SEQ ID NO.1的序列,该序列的功能变体或功能片段也不等同于本发
明的SEQ ID NO.1的序列。
[0007] WO2015/184331公开了编码LRR受体激酶的序列,存在于位于3B染色体的fhb1 QTL内。该序列不等同于本发明的SEQ ID NO.1的序列,该序列的功能变体或功能片段也不等同于本发明的SEQ ID NO.1的序列。
[0008] WO2016008942公开了位于小麦染色体4A上的序列,它既不是LRR受体样激酶基因,也与FHB抗性完全无关。该序列不等同于本发明的SEQ ID NO.1的序列,该序列的功能变体
或功能片段也不等同于本发明的SEQ ID NO.1的序列。
[0009] 本发明的目的是提供在植物中提供FHB抗性的基因。目前还没有这种激酶的描述。

发明内容

[0010] 本发明的第一方面提供重组构建物,该重组构建物包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能变体或功能片段(或由SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能变体或功能片段组
成)。
[0011] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少30%的序列一致性。
[0012] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少70%的序列一致性。
[0013] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少90%的序列一致性。
[0014] 本发明的另一方面还提供了重组宿主细胞,并且如本文所述,所述重组宿主细胞包含本发明构建物。
[0015] 本发明还提供了转化平台,该转化平台包含本发明的重组构建物。
[0016] 本发明还提供了植物材料,该植物材料经本发明的核苷酸、重组构建物或转化平台遗传转化或修饰得到。通常,所述植物材料包含携带转基因的植物细胞,其中所述转基因包括SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能变体或功能片段(或由SEQ ID NO.1的核苷酸序列
或其功能变体或功能片段组成)。
[0017] 本发明还提供植物材料的遗传转化方法,包括用本发明的核苷酸、重组构建物或转化平台转化植物材料的一个或多个细胞的步骤。
[0018] 优选地,转化的细胞能够过表达SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其功能变体。本发明还提供了生产转基因植物或植物材料的方法,包括根据本发明的方法对植物或植物材料进
行遗传转化的步骤。
[0019] 优选地,所述转基因植物或植物材料与未经修饰或未转基因的植物相比对FHB具有抗性或对FHB的抗性增强。
[0020] 通常,植物材料选自包括植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子的组。
[0021] 优选地,植物是谷物。通常,所述谷物选自于包括玉米、稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、大豆和黑麦的组。优选地,所述谷物为小麦。
[0022] 本发明的另一方面提供了分离的核苷酸的序列,该序列包括SEQ ID NO.1或其功能变体或其功能片段(或由SEQ ID NO.1或其功能变体或其功能片段组成)。
[0023] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少55%的序列一致性。
[0024] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少70%的序列一致性。
[0025] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.1具有至少90%的序列一致性。
[0026] 本发明的另一方面提供了分离的肽,该分离的肽包括SEQ ID NO.2或其功能变体或其功能片段(或由SEQ ID NO.2或其功能变体或其功能片段组成)。
[0027] 本发明还提供了由本发明核苷酸编码的分离的蛋白质,或具有SEQ ID NO.2的序列或其功能变体或其功能片段。
[0028] 优选地,所述功能变体与SEQ ID NO.2具有至少70%的序列一致性。
[0029] 所述分离的核苷酸或分离的肽用于增强或提供植物或植物材料中的FHB抗性。
[0030] 定义
[0031] 除非另有特别说明,否则在本文使用的以下术语除了本领域中术语可能享有的更广泛(或更窄)的含义外,还具有以下含义:
[0032] 除非上下文另有要求,否则本文使用的单数应理解为包括复数,反之亦然。与实体相关的术语“一(a)”或“一(an)”应理解为指该实体的一个或多个。因此,术语“一(a)”(或“一(an)”)、“一个或多个”和“至少一个”在本文中可以互换使用。
[0033] 在说明书中,术语“包括(comprise)、包括(comprises)、包括(comprised)和包括(comprising)”或其任何变体,术语“包含(include)、包含(includes)、包含(included)和包含(including)”或其任何变体认为是完全可互换的,应给予它们尽可能广泛的释义,反之亦然。
[0034] 本文中使用“TaLRRK-6D”时是指能够增强或提供植物对FHB抗性的基因。它是一种跨膜激酶蛋白,属于LRR-RLK家族。其核苷酸序列长度为3096个核苷酸,基酸序列长度为1031个氨基酸,并且具有信号肽、富含亮氨酸重复序列(LLR)结构域、跨膜结构域和激酶结构域。它具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列或其变体。
[0035] 本文中定义的“FHB抗性”是指减少FHB在植物上或植物内的生长。FHB抗性可以通过FHB症状在植物中的减少或消失来衡量。这可以通过实施例2的方法来确定。
[0036] 本文中使用短语“FHB症状”时是指感染FHB的影响,包括但不限于以下一种或多种:小穗损伤、小穗过早变色和/或漂白、谷粒的脱氧雪腐镰刀菌烯醇真菌毒素污染、核仁萎缩和/或起皱。本领域已知分析表型效应的方法。
[0037] 如本文所用,术语“其变体”应理解为指与给定序列基本相同的序列,但与给定序列相比,在一个或多个氨基酸残基或核苷酸残基方面改变了的序列,以这样的方式不显著改变所要求保护的功能。通常,变体是与给定序列具有约30%到约99%序列一致性的(核苷酸或氨基酸)序列。通常,变体是与给定序列具有约70%到约99%(核苷酸或氨基酸)序列一致性的序列,优选地,与给定序列具有70、75、80、85、86、88、87、89、90、91、92、93、94、95、96、
97、98或99%的序列一致性,并且通常能够增强或提供植物对FHB的抗性,即变体是功能变体。这种改变包括氨基酸残基或核苷酸残基的插入、添加、删除和/或取代。可以有1、2、3、4或5个改变。这种变体可以理解为是自然发生的变体,也可以是非自然变体。术语“变体”还包括序列的片段。关于肽的变体,天然氨基酸和修饰氨基酸的插入、添加和取代都已考虑。
变体可以具有保守氨基酸的变化,其中引入的氨基酸在结构、化学或功能上与被取代的氨
基酸相似。
[0038] 本文使用的术语“功能变体”被认为是指SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的变体,其能够增强或提供植物对FHB的抗性。
[0039] 术语“片段”是指给定序列的一段。通常,片段具有约10到1000个连续氨基酸,优选为约50、100、200、300、400、500、600、700、800或900个氨基酸。通常,片段具有10到3000个连续核苷酸,优选地,具有约100、250、500、750、1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500或2750个核苷酸。所述片段是功能片段,即SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2的片段,其能够增强或提供植物对FHB的抗性。本发明功能变体的功能片段也已提供。
[0040] 就“序列同源性”而言,该术语应理解为,当变体(或同系物)的比对残基的百分比与参考序列中相应残基相同或保守取代时,与参考序列具有定义百分比的相似性或一致性的变体(或同系物),并且其中变体(或同系物)与参考序列具有相同功能。
[0041] 在本说明书中,“同源性”、“一致性”或“相似性”是指基于序列比对,两个肽或两个核苷酸序列之间的关系。本文使用术语“一致性”时是指当序列比对且横跨整个序列长度时,两个序列中相应位置的氨基酸或核苷酸残基的相同或保守取代的百分比,例如与参考
序列具有70%序列一致性的变体(或同系物)是在变体(或同系物)整个序列长度中任何
70%比对残基与参考序列中的相应残基相同或保守取代。为比较序列,一个序列充当参考
序列,将测试序列与其进行比较。
[0042] 利用本领域已知的软件程序(例如BLAST、EMBOSS Needle或Clustal Omega)使用默认参数可以来确定这种比对和同源性、相似性或序列一致性的百分比。有关这些程序的
详细信息可在以下网址查询:http://www.ncbi.nlm.nih.gov。
[0043] 如本文所用,术语“遗传修饰”应用于细胞,包括微生物,是指使用重组DNA技术进行基因工程化,通常涉及合成适当的表达载体(见下文),然后将表达载体转染(即稳定地或暂时地)到宿主细胞(通常稳定转染)的步骤。
[0044] 如本文所用,术语“重组细胞”、“转化的细胞”,“重组植物”或“转化的植物”是指包含稳定整合到细胞基因组中的外源核酸的细胞或植物,该外源核酸包含编码TaLRRK-6D的核苷酸序列。在另一实施方案中,它可以是包含非整合的(例如游离型)外源核酸,如质粒、粘粒、噬菌粒或线性表达元件,其包含适于基因表达的编码序列。在其他实施方案中,本发明提供了通过将包含本发明表达载体的质粒稳定地转染宿主细胞(例如植物宿主细胞)而
产生的细胞系。在一个实施方案中,细胞被工程化用于基因的异源表达。
[0045] 术语“编码”应用于核苷酸序列时是指一种核苷酸,如果在其自然状态下或当由本领域技术人员熟知的方法操纵时,它可以转录和/或翻译以产生用于多肽和/或其片段的mRNA,称其为“编码”多肽或肽。
[0046] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”在本文互换使用并意指氨基酸残基的聚合物。这些术语还适用于其中一个或多个氨基酸残基是修饰残基或非天然存在的残基(例如对应天然氨基酸的人工化学模拟物)的氨基酸聚合物,以及天然存在的氨基酸聚合物。肽可以是或者可以不是“分离的”,也就是说将其从天然存在时周围存在的成分中转移。
[0047] 本文所使用的术语“氨基酸”是指天然存在的和合成的氨基酸,以及具有类似于天然存在的氨基酸的功能的氨基酸类似物和氨基酸模拟物。天然存在的氨基酸是由遗传密码编码的,以及在细胞中翻译后修饰的氨基酸(例如羟脯氨酸、γ羧谷氨酸和O-磷酸丝氨酸)。
短语“氨基酸类似物”是指化合物具有与天然存在的氨基酸相同的基本化学结构(与氢、羧基、氨基和R基团结合的α-)但具有修饰的R基团或修饰的主链(如高丝氨酸、正亮氨酸、蛋氨酸亚砜、蛋氨酸甲基锍(methionine methyl sulphonium))。短语“氨基酸模拟物”是指具有与天然存在的氨基酸不同结构但功能相似的化学化合物。应当认识到,由于遗传密码的
简并性,编码特定多肽的核酸分子可以具有一系列多聚核苷酸序列。例如,密码子GCA、GCC、GCG和GCT都编码氨基酸丙氨酸。术语“核酸分子”在本文用于包括未经修饰的DNA或RNA或经修饰的DNA或RNA。例如,本发明的核酸分子或多聚核苷酸可以由单链和双链DNA,单链和双链区域混合的DNA,单链和双链RNA,以及单链和双链区域混合的RNA,包含DNA和RNA的、可以是单链的、或更典型为双链的或者是单链和双链区域混合的杂交分子。此外,核酸分子可以由包含RNA或DNA或RNA和DNA两者的三链区域组成。本发明的核酸分子还可以包含一个或多
个修饰的基或出于稳定性或其他原因而修饰的DNA或RNA主链。“修饰的”碱基包括,例如,氚碱基和不寻常的碱基(例如肌苷)。可以对DNA和RNA进行各种修饰;因此“核酸分子”包括化学、酶或代谢修饰形式。术语“多聚核苷酸”应具有相应的含义。
[0048] 在本说明书中,术语“植物材料”应理解为包含植物细胞的植物的任何组成,包括植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。
[0049] 术语“细胞”应理解为来自植物的细胞。在具体优选的实施方案中,细胞是选自以下组成的组的植物细胞:玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、大豆和黑麦。术语“转基因细胞”应理解为是指包含整合到其基因组中的转基因,理想情况下转基因是稳定地整合到其基因组中的细胞。
[0050] 术语“转化平台”应理解为指将转基因转入细胞所需的遗传系统(genetic machinery),通常包括生物体,例如细菌,能够介导细胞转化并含有本发明的重组构建物。
转化平台的例子包括大肠杆菌、根癌土壤杆菌(A.tumefaciens)、粘着箭菌(E.adhaerens)
和某些“转化菌”菌株。其他例子包括:基因枪转化(biolistic transformation)和浸花法(floral dipping)。
[0051] 术语“转基因”应理解为指本发明的核苷酸及其功能变体。
[0052] 术语“过表达”是指基因或蛋白质相对于野生型的表达量提高。在一个实施方案中,可以通过将含有表达TaLRRK-6D必要系统的表达载体转染到宿主细胞来增强表达。可以通过启动子产生多个mRNA拷贝和大量选定的产物TaLRRK-6D来增强表达。宿主细胞可能已
经表达内源性TaLRRK-6D。
[0053] 本文使用的短语“本发明的核苷酸”是指SEQ ID NO.1或其功能变体或其功能片段。
[0054] 本文使用的短语“本发明的氨基酸序列”或“本发明的肽”是指SEQ ID NO.2或其功能变体或其功能片段。附图说明
[0055] 本发明将通过以下对其实施方案的描述得到更加清楚的理解,仅以举例的方式给出,并参考附图,其中:
[0056] 图1A显示了Poceace家族的遗传图谱;
[0057] 图1B是5个谷物家族的同源图;
[0058] 图2A显示了跨膜激酶蛋白,TaLRRK-6D;
[0059] 图2B是LRR-RLK家族图谱;
[0060] 图3是在小麦穗中接种镰刀菌后和用真菌毒素DON处理后TaLRRK-6D的表达水平图;
[0061] 图4显示了特异于TaLRRK-6D的克隆的1300bp的比对;
[0062] 图5显示了编码小麦染色体6DL上小麦TaLRRK-6D的mRNA中片段的位置,该位置是基因沉默和病毒诱导的基因沉默(VIGS)研究的qRT-PCR的靶点。数字表示在TaLRRK-6D 
mRNA序列中的bp位置;
[0063] 图6是两个VIGS构建物和对TaLRRK-6D的特异性图示,两个VIGS构建体(BSMV:LRR1和BSMV:LRR2)与TaLRRK-6D在Clonemanger v.9.0中使用clustalW2多重对比进行比对,以
证实BSMV:LRR1和BSMV:LRR2特异于沉默TaLRRK-6D;
[0064] 图7是显示在未经毒素处理植物(模拟)中TaLRRK-6D的表达的图,不论是对照(BSMV:00)还是沉默的植物(BSMV:LRR1和BSMV:LRR2);
[0065] 图8显示了接种(FHB处理的、BSMV:00处理的植物)后0、7、14和21天的Remus(易感)和CM(抗性)小麦穗的FHB症状;
[0066] 图9显示了FHB在经BSMV:LRR1和BSMV:LRR2处理植物和未沉默的植物BSMV:00中诱导的小穗损伤;
[0067] 图10显示了FHB在TaLRRK-6D沉默和BSMV:00处理的小穗中诱导的损伤;
[0068] 图11显示了含有BSMV:LRR1和BSMV:LRR2构建物的大麦品种Akashinriki沉默系和BSMV:00处理系中的损伤;
[0069] 图12是显示在BSMV:LRR1和BSMV:LRR2沉默系和用BSMV:00处理的野生型品种Akashinriki系的叶上生长的分生孢子数量的图。

具体实施方式

[0070] 本发明人惊讶地发现,在抗病品种的小麦穗中TaLRRK-6D高度诱导以响应FHB,其基因沉默会导致FHB症状增加。
[0071] 本发明提供了植物中抗镰刀菌赤霉病(FHB)的基因。
[0072] 更具体地,本发明提供了富含亮氨酸受体激酶基因的特异性小麦(基因组D同系物),用于植物中抗FHB的TaLRRK-6D及其变体。本发明基因称为的TaLRRK-6D。TaLRRK-6D仅限于Poceace家族(图1)。它在跨植物物种中发现,但仅限于谷物植物家族(图2)。
[0073] 有利的是,由于TaLRRK-6D是来自品种的天然基因,因此大大降低了抗性崩溃的风险。这在所有条件和遗传背景下提供了更长和持续的抗性。
[0074] TaLRRK-6D是属于LRR-RLK家族的跨膜激酶蛋白。它的氨基酸序列长度为1031个氨基酸,并具有信号肽、富含亮氨酸重复序列(LLR)结构域、跨膜结构域和激酶结构域。
[0075] 本发明基因TaLRRK-6D具有SEQ ID NO.1的核苷酸序列,如下所示:
[0076]
[0077]
[0078]
[0079] TaLRRK-6D具有SEQ ID NO.2的氨基酸序列,如下所示:
[0080]
[0081] 在本发明的一实施方案中,还提供了所述基因的变体。通常,所述变体与SEQ ID NO.1具有至少约30%的序列一致性。在一实施方案中,所述变体与SEQ ID NO.1具有至少约
40%、50%、60%或70%的序列一致性。在优选实施方案中,变体包括至少约70、75、80、81、
82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%与SEQ ID NO.1的序列一致性,通常与SEQ ID NO.1具有约91.5%至约95%的序列一致性。通常,所述变体为功能变体。
[0082] 变体可以具有包括SEQ ID NO.3、10SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10的序列(或由SEQ ID NO.3、10SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.9或SEQ ID NO.10组成的序列)。
[0083] 优选地,变体包括SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的序列(或由SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5的序列组成)。
[0084] SEQ ID NO.3如下所示:
[0085]
[0086]
[0087] SEQ ID NO.4如下所示:
[0088] (品种Remus染色体6D变体-TaALRRK-6D)
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] SEQ ID NO.5如下所示:
[0093] 2号品种中国春(CS)染色体6D变体-TRIAE_CS42_6DL_TGACv1_527217_AA1700660.1
[0094]
[0095]
[0096] SEQ ID NO.6如下所示:
[0097] TRIAE_CS42_2AL_TGACv1_093509_AA0281510.6
[0098]
[0099]
[0100] SEQ ID NO.7如下所示:
[0101] TRIAE_CS42_2BL_TGACv1_132242_AA0436300.1
[0102]
[0103]
[0104]
[0105] SEQ ID NO.8如下所示:
[0106] 25TRIAE_CS42_2DL_TGACv1_158196_AA0512090.2
[0107]
[0108]
[0109] SEQ ID NO.9如下所示:
[0110] TRIAE_CS42_6AL_TGACv1_471249_AA1505410.2
[0111]
[0112]
[0113]
[0114] SEQ ID NO.10如下所示:
[0115] TRIAE_CS42_6BS_TGACv1_514259_AA1657570.3
[0116]
[0117]
[0118] 还提供了SEQ ID NO.2的变体。
[0119] 通常,所述变体与SEQ ID NO.2具有至少约30%、40%、50%、60%或70%的序列一致性。
[0120] 在优选实施方案中,变体与SEQ ID NO.2具有至少约70%的序列一致性。优选地,变体包括具有与SEQ ID NO.2至少约70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列一致性的序列(或由具有与SEQ ID NO.2至少约70、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列一致性的序列组成)。通常,变体与SEQ ID NO.2具有约74%至约89%的序列一
致性。通常,变体为功能变体。
[0121] 在一实施方案中,变体可以具有包括SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13的序列(或由SEQ ID NO.11、SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13组成的序列)。
[0122] SEQ ID NO.11如下所示:
[0123]
[0124]
[0125] SEQ ID NO.12如下所示:
[0126]
[0127] SEQ ID NO.13如下所示:
[0128]
[0129] 在本发明的一实施方案中,提供了SEQ ID NO.1的片段。该片段是SEQ ID NO.1的功能片段。在一实施方案中,片段具有10到3000个连续核苷酸,优选约100、250、500、750、
1000、1250、1500、1750、2000、2250、2500或2750个核苷酸。
[0130] 在本发明的一实施方案中,提供了SEQ ID NO.2的片段。该片段是SEQ ID NO.2的功能片段。在一实施方案中,该片段具有约10至1000个连续氨基酸,优选约50、100、5 200、
300、400、500、600、700、800或900个氨基酸。
[0131] 本发明提供了包含SEQ ID NO.1的核苷酸序列或本文描述的变体或片段的构建物。
[0132] 构建物可以是表达载体。该载体可以包括调节系统,例如启动子、终止剂和/或增强子。核苷酸可以受启动子区域的控制。启动子可以是构建型植物细胞特异性启动子。应当理解,可以使用本领域已知的任何合适的植物细胞特异性启动子。启动子可以产生多个
TaLRRK-6D拷贝。在一实施方案中,载体是病毒,如噬菌体,并且除了本发明的核酸序列外,还包括用于噬菌体复制的核酸序列,例如结构蛋白、启动子、转录激活剂等。
[0133] 在本发明的一实施方案中,本发明和本文所述的构建物可用于转化植物宿主细胞以产生重组细胞以表达TaLRRK-6D或合成所述蛋白质。这赋予或增强了植物对FHB的抗性。
[0134] 在进一步的实施方案中,本发明还提供了包含本文所述构建物的重组宿主细胞。宿主细胞可以是任何可以培养于培养基中并用于表达重组基因的生物植物细胞。
[0135] 本发明还提供了包含本发明重组构建物的转化平台。通常,转化平台包括能够介导细胞转化的细菌。
[0136] 本发明还提供了用本发明核苷酸、重组构建物或转化平台进行遗传转化或修饰的植物材料。在一实施方案中,转化的植物材料包括能够过表达TaLRRK-6D或其变体的转化的细胞。换句话说,与未修饰的宿主细胞相比,宿主细胞过表达TaLRRK-6D或其变体。
[0137] 植物材料可以是转基因植物。转基因植物对FHB具有抗性或增强的抗性(与非转基因植物相比)。
[0138] 通常,植物材料包括携带转基因的植物细胞,其中所述转基因包括本发明的核苷酸。
[0139] 在本发明中,植物材料选自但不限于植物细胞、植物细胞培养物、植物组织、植物或植物种子。应当理解,可以使用本领域已知的任何合适的植物材料。
[0140] 在本发明中,所述植物是谷物。通常,所述谷物选自但不限于包括玉米、水稻、小麦、大麦、高粱、粟、燕麦、大豆和黑麦的组。优选地,所述谷物为小麦。
[0141] 本发明还提供了遗传转化植物材料的方法,包括利用本发明的核苷酸、重组构建物或转化平台转化植物材料的一个或多个细胞的步骤。转化的细胞能够过表达本发明的核
苷酸。换句话说,与未修饰的宿主细胞相比,宿主细胞过表达TaLRRK-6D。
[0142] 本发明还提供了产生转基因植物的方法,包括根据本发明如本文所述的方法转化植物材料并从转化的细胞生成或生长出转化的植物的步骤。
[0143] 本发明还提供了生产具有FHB病抗性植物材料的方法,该方法包括以下步骤:用本发明构建物或根据本发明的转化平台转化植物材料,以及可选地种植植物材料。优选地,重组构建物包括SEQ ID NO.1或其变体。以这种方式,可以生产抗FHB的植物。通常,与非转基因植物相比,所述植物在感染镰刀菌(Fusarium fungus)时表现出减少或消失的FHB症状。
[0144] 利用本发明构建物或转化平台转化的植物或植物材料可以已经表达内源性TaLRRK-6D。这可以处于低水平。宿主细胞利用本领域已知的技术进行转化,例如但不限于电穿孔;磷酸基方法;生物技术或利用病毒载体。转染后,本发明核苷酸按需要进行转录和翻译。在一些实施方案中,合成的蛋白质允许保留在宿主细胞中以及重组宿主细胞随后
使用的培养基中。
[0145] 本发明还提供了FHB抗性的功能标记。该标记是TaLRRK-6D,标记可以是本发明的核苷酸或肽。这提供了通过标记辅助筛选和育种以开发FHB小麦品种的途径。还提供了通过检测或测量TaLRRK-6D表达水平和可选地种植FHB小麦品种来确定FHB抗性或筛选FHB小麦
品种的方法。
[0146] 在另一个实施方案中,TaLRRK-6D还起到作为可选择的标记基因的作用,其中由转化的细胞显示的特征作为转基因成功整合的选择性标记。应理解为,可通过本文所述的任
何方法整合转基因。提供了使用TaLRRK-6D作为可选择的标记的方法。这些特征可以是FHB
抗性的特征。
[0147] 标记可以是本发明的核苷酸序列或本发明的氨基酸序列。
[0148] 本发明还提供了根据本发明方法进行遗传转化的植物材料。
[0149] 本发明的另一方面提供了分离的序列,该分离的序列包括SEQ ID NO.1或其功能变体或其功能片段(或由SEQ ID NO.1或其功能变体或其功能片段组成)。
[0150] 优选地,变体与SEQ ID No.1具有至少55%的序列一致性。
[0151] 优选地,变体与SEQ ID NO.1具有至少60%或70%的序列一致性。
[0152] 在一优选实施方案中,变体与SEQ ID NO.1具有至少约70%、75%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、
97%、98%或99%的序列一致性,通常与SEQ ID NO.1具有约91.5%至约95%的序列一致
性。
[0153] 本发明的另一个方面提供了分离的肽,该分离的肽包括SEQ ID NO.2或其功能变体或其功能片段(或由SEQ ID NO.2或其功能变体或其功能片段组成)。
[0154] 本发明还提供由本发明核苷酸编码的或具有SEQ ID NO.2或其功能变体或其功能变体的分离的蛋白质。
[0155] 通常,变体与SEQ ID NO.2具有至少约30%、40%、50%、60%或70%的序列一致性。
[0156] 在一优选实施方案中,变体与SEQ ID NO.2具有至少约70%的序列一致性。优选地,变体包括与SEQ ID NO.2具有至少约70%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、
82%、83%、84%、85%、86%、87%、30 88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、
96%、97%、98%或99%序列一致性的序列(或由与SEQ ID NO.2具有至少约70%、75%、
76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、30 88%、89%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性的序列组成)。通常,变体与SEQ ID NO.2具有约74%至89%的序列一致性。
[0157] 实施例
[0158] 实施例1
[0159] 在小麦穗中的TaLRRK-6D基因表达
[0160] 研究描述
[0161] 为了证实TaLRRK-6D同系物特异性响应真菌镰刀菌,采用定量RT-PCR法测定了用真菌处理的小麦穗中的基因表达水平。
[0162] 菌株
[0163] 本研究采用脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生者禾谷镰刀菌(GZ3639菌株)。
[0164] 方法
[0165] 用脱氧雪腐镰刀菌烯醇产生者禾谷镰刀菌(GZ3639菌株)接种小穗。在真菌接种后7天(在第1、2、3、5和7天)检测表达水平。还分析了GZ3639的不产生DON突变衍生菌株GZT40对TaLRRK-6D表达的影响。还分析了在真菌毒素DON处理小麦穗中TaLRRK-6D的作用。
[0166] 结果
[0167] 结果表明,TaLRRK-6D在接种后1天(dpi(day post inoculation))早期诱导表达,在2dpi诱导达高峰,随后恢复基本水平。如图3所示。
[0168] GZT40诱导的TaLRRK-6D表达在接种后所有天数中都很低(图3)。真菌毒素DON处理小麦穗中的TaLRRK-6D表达结果表明,TaLRRK-6D转录表达水平显著增加以响应毒素。在
1dpi时最大,并在接下来几天里逐渐减少(图3)。从这些结果看出,很明显TaLRRK-6D响应于FHB,说明TaLRRK-6D是宿主对镰刀菌早期响应的成分。
[0169] 实施例2
[0170] TaLRRK-6D在抗FHB中的作用
[0171] 研究描述
[0172] 利用病毒诱导基因沉默(VIGS)平台验证了TaLRRK-6D在两个小麦品种抗FHB中的作用-抗FHB品种CM82036和易感品种Remus。
[0173] 菌株
[0174] 小麦抗FHB品种CM82036和易感品种Remus。
[0175] 方法
[0176] 病毒诱导基因沉默:设计了两个独立的构建物(BSMV:LRR1和BSMV:LRR2),其靶向TaLRR基因的两个不同序列(图5)。实验中还包括含有空载体(BSMV-00)作为阳性对照的植物和不含构建物的植物(阴性对照)。图6是两个VIGS构建物对TaLRRK-6D特异性的图示。在
早穗出现前将构建物涂抹于小麦品种CM82036和品种Remus的旗叶上。两周后,在开花中期
(生长期Zadoks 65)用FHB(16.9mM)或模拟0.02%吐温20处理两个中心小穗。在FHB处理后7
天和14天,通过测定具有FHB症状(如变色)的小穗数量来分析FHB对植物的表型效应。
[0177] 结果
[0178] 在1dpi,移除一个经处理的小穗并用于定量RT-PCR法检测TaLRRK-6D的表达水平。在非毒素处理的植物(;模拟吐温处理),无论是在对照(FES),(BSMV:00)还是经沉默植物(BSMV:LRR1和BSMV:LRR2)中观察到非常低的TaLRRK-6D表达(图7)。
[0179] 在这两个品种中,沉默降低了模拟(无GZ3639)和镰刀菌(GZ3639)处理的样品(比较BSMV:LRR1和BSMV:LRR2与BSMV:00)的TaLRR-6D表达。如图8所示,由于BSMV:LRR1和BSMV:
LRR2植物处理导致TaLRRK-6D沉默,使FHB严重性增加54.5%和72.7%(与模拟和BSMV:00处理的植物相比)。
[0180] 用BSMV:LRR1和BSMV:LRR2处理的植物对FHB诱导小穗损伤的敏感性显著高于未沉默的植物BSMV:00(增加6.5倍和7.3倍),如图9所示。与BSMV:00处理相比,显示FHB诱导损伤的TaLRRK-6D沉默小穗显著反映在产量降低中(图10)。这表明TaLRRK-6D在小麦抗FHB中起
到直接作用。
[0181] 实施例3
[0182] TaLRRK-6D在大麦FHB中的作用
[0183] 研究描述
[0184] 为了解TaLRRK-6D在大麦镰刀菌赤霉病中的作用,对野生型大麦品种Akashinriki进行了研究。
[0185] 方法
[0186] 用VIGS对大麦第二(2nd)叶期LRR-RLK同源基因进行了沉默。采用(Browne&Cooke,2004)描述的离体叶片试验,评测了TaLRRK-6D沉默在大麦对大刀镰刀菌(F.culmorum)菌株
FC200的作用。在野生型品种Akashinriki叶上点接种真菌分生孢子并在4dai监测病叶面
积。
[0187] 结果
[0188] 用BSMV:LRR1和BSMV:LRR2沉默的系出现了严重病变,与BSMV:00相比,用构建物BSMV:LRR1和BSMV:LRR2沉默的Akashinriki系观察到增加了2.24和3倍的疾病症状(P<0.05),如图11所示。测定了4dai时叶上生长的分生孢子数量,两个BSMV:LRR1和BSMV:LRR2沉默的系分别比BSMV:00处理的野生型品种Akashinriki的分生孢子多出20 224%和293%
(具有统计学意义(P<0.05)),如图12所示。在4dai时,病叶面积为5.8cm2。因此,离体叶片结果表明,TaLRRK-6D沉默导致小麦叶片增强对大刀镰刀菌(F.culmorum)菌株FC200的敏感
性。
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