技术领域
[0001] 本
发明涉及
植物组织培养技术领域，尤其涉及一种重瓣臭茉莉快速繁殖方法。
背景技术
[0002] 重瓣臭茉莉(Clerodendrum philippinum)为
马鞭草科大青属灌木植物，又被称为臭茉莉、臭朱桐、山茉莉等。我国主要在贵州、
云南、福建、台湾、广西、广东有分布，老挝、泰国、柬埔寨等亚洲热带和亚热带地区也有分布，在毛里求斯、夏威夷等地有归化生长；植物整株高50-120cm。重瓣臭茉莉自然生长多分布于溪旁或林下，也有人工栽培作为观赏植物。
[0003] 重瓣臭茉莉因花冠呈红色、淡红色或白色，散发
香味，具有观赏价值，可作观赏植物。也可以根、叶入药，性味平苦，用于多种人体病症的医治；或进行茎叶挥发油提取，作日用香料。全草含黄
酮苷、酚类、皂苷、鞣质，有祛
风利湿、化痰止咳、活血消肿等功效。可用于医治支气管炎、湿疹、
皮肤瘙痒、风湿性关节炎、脚气
水肿、白带等病症。
[0004] 目前，对重瓣臭茉莉的研究较少，其研究方向主要是植株体内有效成分的提取分离及含量检测，关于重瓣臭茉莉组织培养方面的研究目前未见报道。中国
专利申请号为CN201711084711.1、
发明名称为“一种臭牡丹的组织培养及繁殖方法”，公开了马鞭草科大青属植物臭牡丹的组织培养快速繁殖方法，虽然该物种与重瓣臭茉莉都是马鞭草科大青属植物，但是属于完全不同的种，二者生理特性等也不同，而且，该方法诱导出的丛生芽的个数最多仅为10个，芽诱导率最高仅为90％，而且，本申请的
发明人通过试验结果证明，该方法用于重瓣臭茉莉的快速繁殖，丛生芽的个数和诱导率更低，繁殖效率有待提高。
[0005] 如前所述，重瓣臭茉莉具有很大的观赏价值和药用价值，但其野生资源有限，植物全草自然生长周期较长。为扩大生产，缩短臭茉莉植株的繁殖周期，满足市场需求，研究其快速繁殖方法并提高繁殖效率降低快繁成本很有必要。
发明内容
[0006] 本发明的目的就在于提供一种重瓣臭茉莉快速繁殖方法，以解决上述问题。
[0007] 为了实现上述目的，本发明采用的技术方案是这样的：一种重瓣臭茉莉快速繁殖方法，依次包括以下步骤：
[0008] (1)材料获取及处理：选用重瓣臭茉莉盆栽植物抽出的幼嫩茎尖、茎段作为外植体，并进行无菌处理得到无菌外植体，然后将外植体接种于培养基，置于恒温培养室中培养出大量用于丛生芽诱导的无菌外植体；
[0009] (2)丛生芽诱导：无菌条件下，剪取重瓣臭茉莉的顶芽和茎段，接种于培养基中进行丛生芽的诱导，所采用的培养基为MS培养基+ZT(1.0-3.0)mg/L或MS培养基+KT(1.0-3.0)mg/L；
[0010] (3)生根培养：剪取步骤(2)所得的健壮的丛生芽单芽，进行生根培养，得到组培苗；所采用的培养基为1/2MS培养基+NAA(0.1-0.3)mg/L；
[0011] (4)炼苗、移栽：待步骤(3)所得的组培苗长至3-5cm，进行炼苗、移栽。
[0012] 作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述的无菌处理的方法为：先去除外植体表面杂质，流水下冲洗，然后在超净
工作台里，浓度75％的酒精消毒1min，无菌水清洗3次，0.1％氯化汞溶液消毒6min，无菌水清洗5次，
滤纸吸干水分，无菌
剪刀剪去黑色
坏死组织。
[0013] 作为优选的技术方案：步骤(1)中，所述的培养基为MS+NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L。在MS+NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L培养基中，芽长势较快，可以较快培养出无菌材料，如顶芽和茎段，反复转接，即可获得大量无菌的顶芽和茎段外植体，以备丛生芽诱导实验。
[0014] 作为优选的技术方案：步骤(2)中，所采用的培养基为MS培养基+ZT2.0mg/L。在此培养基上，平均每个外植体诱导的丛生芽数可达19.30个，诱导率达96.50％，产生的丛生芽健壮，
叶片量多且浓绿、肥厚。
[0015] 作为优选的技术方案：步骤(2)中，诱导时间为21d。
[0016] 作为优选的技术方案：步骤(3)中，所采用的培养基为1/2MS培养基+NAA0.1mg/L。在该培养基中，生根诱导的平均根长为2.66cm，平均根数最多，为12.33条，生根率100％，根粗壮发散。
[0017] 作为优选的技术方案：步骤(3)中，培养时间为21d。
[0018] 作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述炼苗的方法为，将组培苗置于通光室内，打开培养罐，让组培苗接受自然光照，保持湿度在65-75，优选注入少量无菌水，以刚好
覆盖培养基表面为标准。
[0019] 作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述炼苗时间为2-3d。
[0020] 作为优选的技术方案：步骤(4)中，所述移栽基质为
质量比计的腐质土:蛭石:
河沙＝1:1:1。
[0021] 与目前
现有技术相比，本发明的优点在于：本发明利用现代植物组织培养技术探索重瓣臭茉莉植株快速繁殖体系，采用本发明的方法，平均每个外植体诱导的丛生芽数达19.30个，生根诱导的平均根数为12.33条，生根率达100％，繁殖效率高，同时，本发明为重瓣臭茉莉的深入研究提供理论支持，也对重瓣臭茉莉规模化、标准化生产提供技术参考。
附图说明
[0022] 图1为本发明
实施例1所得的重瓣臭茉莉丛生芽图；
[0023] 图2为本发明实施例1所得的重瓣臭茉莉生根图；
[0024] 图3为本发明实施例1所得的重瓣臭茉莉移栽成活图。
具体实施方式
[0025] 下面将结合附图对本发明作进一步说明。
[0026] 本实施例中
[0027] 试验材料：
[0028] 重瓣臭茉莉植株取材于广西百色市。将重瓣臭茉莉植株栽植于恒温培养室内进行培养，待植株抽出新芽，取长势健壮的幼嫩芽、茎段作为外植体进行实验。
[0029] 培养条件：
[0030]
腋芽和丛生芽诱导及增殖壮苗均使用MS为基本培养基。在生根培养过程中使用1/2MS培养基，1/2MS培养基为MS基本培养基中大量元素减半，其他成分不变。在基本培养基中，根据实验目的添加不同浓度、不同种类的
植物生长调节剂。培养基中
蔗糖、琼脂添加量分别为30.00g/L和10.20g/L，pH调至5.85，培养基灭菌条件为121℃，101KPa，灭菌20min。
[0031] 恒
温室培养条件为：光照周期12h/d，光照强度1500-2000lx，
温度为24士1℃。
[0032] 试验器材：
[0033] SW-CJ-2FD双人单面超净操作台、SanYon全自动高压灭菌锅、MilliQbiool超纯水系统、培养架、组培罐、pH计、
电子天平、称量纸、
镊子、剪刀、滤纸、酒精灯、药匙、烧杯、玻璃棒、容量瓶、培养皿、移液枪、量筒、烘箱。
[0035] 培养基母液成分：
[0036] 大量元素：KNO3、NH4NO3、MgSO4·7H2O、KH2PO4、CaCl2·2H2O；
[0037] 微量元素：H3BO3、MnSO4·4H2O、ZnSO4·7H2O、KI、Na2MoO4·2H2O、CuSO4·5H2O、CoCl2·6H2O；
[0038]
铁盐：FeSO4·7H2O、Na2EDTA·2H2O；
[0039] 有机物：肌醇、
盐酸硫胺素(VB1)、烟酸(VB5)、盐酸吡哆酸、甘
氨酸。
[0040] 大量元素、微量元素、铁盐、有机物均配制成20、100、100、200倍母液，于4℃保存备用。培养基各成分含量及生产厂商见表1；
[0041] 表1 MS培养基的组分、含量及生产厂商表
[0042]
[0043] 本发明的1/2MS培养基，是指MS基本培养基中大量元素减半，其他成分不变。
[0044] 植物生长调节剂：
[0045]
萘乙酸(NAA)、玉米素(ZT)、6-苄氨基腺嘌呤(6-BA)、激动素(KT)。
[0046] NAA以无水
乙醇预溶；ZT、6-BA、KT以0.1ml/LNaOH加热预溶，均配置成1mg/L的母液。
[0047] NAA、6-BA、KT母液于4℃低温保存；ZT母液于-18℃低温保存备用。
[0048] 实验用植物生长调节剂均来自德国sigma公司。
[0049] 消毒剂：
[0050] 75％的乙醇溶液，0.1％的氯化汞溶液。
[0051] 分析方法：
[0052] 接种培养后，定期观察培养基污染，培养物死亡等生长情况。每隔7d对材料的污染率，死亡率等指标进行统计，本实验采用SPSS17.0对实验结果进行单因素方差分析，并以此为根据建立重瓣臭茉莉快速繁殖体系。
[0053] 污染率(％)＝(污染数/接种数)×100％；
[0054] 丛生芽诱导率(％)＝(产生丛生芽的外植体数/接种外植体数)×100％；
[0055] 生根率(％)＝(生根株数/接种株数)×100％；
[0056] 死亡率(％)＝(接种死亡数/接种总数)×100％。
[0057] 本发明采用直接器官发生方式，即利用重瓣臭茉莉顶芽、茎段直接诱导产生从生芽。直接器官发生方式与间接发生方式相比，其优势在于降低了产生
体细胞变异的概率，缩短了培育重瓣臭茉莉完整植株的周期，确保培养的再生植物的遗传稳定。
[0058] 实施例1：
[0059] 一种重瓣臭茉莉快速繁殖方法，其特征在于，依次包括以下步骤：
[0060] (1)材料获取及处理：先以毛刷蘸取少量洗衣粉，轻刷去除外植体表面杂质，流水下冲洗2h；超净工作台里，浓度75％的酒精消毒1min，无菌水清洗3次，0.1％氯化汞溶液消毒6min，无菌水清洗5次，滤纸吸干水分，无菌剪刀剪去黑色坏死组织，得无菌外植体；将外植体接种于MS+NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L，置于恒温培养室中；
[0061] 在MS+NAA0.1mg/L+6-BA2.0mg/L培养基中，芽长势较快，可以较快培养出无菌材料，如顶芽和茎段，反复转接，即可获得大量无菌的顶芽和茎段外植体，以备从生芽诱导实验；
[0062] (2)丛生芽诱导：剪取重瓣臭茉莉的顶芽和茎段，接种于附加不同
激素浓度配比的MS培养基中进行丛生芽的诱导。所用的细胞分裂素为6-BA、KT、ZT，诱导培养基的激素配比见表2，每个处理接种20个外植体，培养温度为24±1℃，每7d观察一次，对褐化或染菌的外植体进行处理，21d后统计丛生芽数、分化率和生长情况，其结果见表3。
[0063] 表2诱导丛生芽的不同激素浓度配比
[0064]
[0065] 结果表明，重瓣臭茉莉丛生芽诱导效果较好，整体诱导率均大于40％。各实验组的平均每个外植体诱导的丛生芽数均大于8个，但各培养基诱导得到的丛生芽数及其生长情况存在差异：1、2、3、6号培养基平均每个外植体诱导的丛生芽数均小于12个，诱导率小于60％，诱导效果差；4、7、8号培养基平均每个外植体诱导的丛生芽数为13.5个左右，诱导率为70％左右，诱导效果一般；9号培养基平均每个外植体诱导的丛生芽数达17.57个，诱导率达87.85％，但丛生芽生长情况较差，因此综合诱导效果较差。5号培养基(MS+ZT2.0mg/L)内的平均每个外植体诱导的丛生芽数最多，为19.30个，诱导率为96.50％，且产生的丛生芽生长健壮，叶片量多且浓绿。并且5号培养基诱导效果与其他培养基之间均存在显著性差异，诱导效果最好。综合考虑，诱导丛生芽的最佳培养基为：MS培养基+ZT2.0mg/L。在此培养基上，平均每个外植体诱导的丛生芽数可达19.30个，诱导率达96.50％，产生的丛生芽健壮，叶片量多且浓绿、肥厚，其照片如图1所示。
[0066] 表3不同激素配比对丛生芽诱导的影响
[0067]
[0068] 注：a.数字后面含有一个或几个相同的字母，均表示数据间无显著差异(p<0.05)。
[0069] b.“+”的数量表示丛生芽综合生长情况：符号越多，丛生芽生长越好
[0070] (3)生根培养
[0071] 剪取健壮的从生芽单芽，进行生根培养。生根培养基见下表4。每个培养罐接种1-2个单芽，每种处理接种10瓶，重复实验3次。在温度24±1℃，光照度1000～1500lx的条件下培养，每7d观察一次，21d后统计平均根数、生根率、苗生长情况，其结果见表5。
[0072] 表4诱导生根的不同激素浓度配比
[0073]
[0074] 结果表面：在①、②号培养基中，诱导无菌苗平均生根数较少，生根率在70％左右，诱导的根瘦弱，脆嫩易断，诱导效果最差。④号培养基诱导的平均根长为2.88cm，平均根数为8.20条，生根率为100％，诱导的根瘦弱，根径较小，诱导效果一般。③号生根培养基：生根诱导的平均根数最多，为12.33条，与①、②、④号培养基诱导结果存在显著差异；诱导生根率100％，诱导生根率与④号培养基相同；诱导的平均根长2.66cm，平均根长与④号培养基诱导结果无显著差异；③号培养基诱导得到的根粗壮发散，诱导效果与①、②、④号培养基存在显著差异。③号培养基生根诱导结果见图2；
[0075] 可见：臭茉莉无菌苗生根诱导的最适培养基为③号培养基：1/2MS培养基+NAA0.1mg/L，在该培养基中，生根诱导的平均根长为2.66cm，平均根数最多，为12.33条，生根率100％，根粗壮发散。
[0076] 表5不同激素配比对生根诱导的影响
[0077]
[0078] 注：数字后面含有一个或几个相同的字母均表示数据间无显著差异(p<0.05)。
[0079] (4)炼苗、移栽：待步骤(3)所得的组培苗长至4cm左右，进行炼苗、移栽。移栽前进行炼苗：将组培苗置于通光室内，打开培养罐，让组培苗接受自然光照，保持湿度在70％左右，可注入少量无菌水，以刚好覆盖培养基表面为宜。炼苗2-3d后，用
自来水轻轻洗去组培苗根上黏着的培养基，再将其栽入浇透水的移栽基质(腐质土:蛭石:河沙＝1:1:1)中。移栽后轻浇薄水，将组培苗置于室外培养。每两天定时观察生长情况并浇水，注意遮阳
通风。21d后统计移栽成活率及组培苗生长状况；
[0080] 结果：移栽成活率为100％，苗长至高15cm左右，苗生长健壮，见图3。
[0081] 对比例1
[0082] 本对比例在步骤(2)中，培养基采用中国专利申请号为CN201711084711.1、发明名称为“一种臭牡丹的组织培养及繁殖方法”中的“添加6-BA1.0mg/L、NAA0.05mg/L、酸
水解酪蛋白0.2g/L和
酵母浸出物200mg/L的MS基本培养”，其余不变，结果：平均再生芽诱导数为7.9个，诱导率仅为39.5％，芽生长情况为“++”，说明该专利申请公开的培养基，根本不适合于重瓣臭茉莉的丛生芽诱导。
[0083] 对比例2
[0084] 本对比例在步骤(3)中，培养基采用中国专利申请号为CN201711084711.1、发明名称为“一种臭牡丹的组织培养及繁殖方法”中的改进后的“1/2MS培养基+NAA0.05mg/L+酸水解酪蛋白0.2g/L”，其余不变，结果：诱导的平均根数为7.90根，生根率83％，平均根长2.59cm。说明该专利申请公开的培养基，根本不适合于重瓣臭茉莉的生根培养。
[0085] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何
修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
