一种龙骨马尾杉外植体培养方法
阅读：421发布：2021-09-19
专利汇可以提供一种龙骨马尾杉外植体培养方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种龙骨 马 尾杉外植体培养方法。为了解决龙骨马尾杉生长速度慢、资源更新周期较长的问题，本 发明人 对龙骨马尾杉的快速繁殖技术进行了深入的研究和改进，利用外植体组织培养技术成功获得了龙骨马尾杉，改变了 现有技术 中难以获得龙骨马尾杉再生植株的现状。，下面是一种龙骨马尾杉外植体培养方法专利的具体信息内容。
1.一种龙骨马尾杉的培养方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)取龙骨马尾杉外植体，进行消毒；和
(2)步骤(1)处理后的外植体在培养基中培养，所述培养基包括1/2MS盐，其中含有B5维生素；所述培养基还包含葡萄糖以及椰子水。
2.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，所述的外植体为茎尖；较佳地为幼嫩且无分枝的茎尖。
3.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，进行两步消毒：先以0.5±
0.1％(v/v)次氯酸钠溶液消毒，再以0.25±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液消毒。
4.如权利要求3所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，以0.5±0.1％(v/v)，较佳地
0.5±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液消毒12±2分钟，较佳地12±1分钟；之后以0.25±0.05％(v/v)，较佳地0.25±0.03％次氯酸钠溶液消毒3±1分钟，较佳地3±0.5分钟。
5.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，在利用次氯酸钠溶液消毒前，还包括：将外植体材料放入Tween20溶液中浸泡；较佳地，所述的Tween20溶液浓度为0.1±0.02％v/w；较佳地，浸泡时间3～15分钟。
6.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(1)中，在利用次氯酸钠溶液消毒前，还包括：将外植体材料放入乙醇溶液中灭菌；较佳地，所述的乙醇溶液浓度为70±5％v/v的乙醇；较佳地，乙醇处理时间60±20秒。
7.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，培养基中葡萄糖浓度为5±
2g/L；较佳地5±1g/L。
8.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，培养基中椰子水的浓度为10±3mL/L；较佳地10±2mL/L；更佳地10±1mL/L。
9.如权利要求1所述的培养方法，其特征在于，步骤(2)中，培养条件为：温度25±5℃，光照周期16±2h/天，光照强度7000±2000lux。
10.一种生产石杉碱甲的方法，其特征在于，所述方法包括：以权利要求1～9任一所述的方法培养龙骨马尾杉，收获植株，从植株中提取石杉碱甲。
11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，培养45～70天；较佳地55～65天后收获植物。
12.一种用于培养龙骨马尾杉的培养基，其特征在于，所述培养基包含：1/2MS盐，其中含有B5维生素；所述培养基还包含葡萄糖以及椰子水，且其中葡萄糖浓度为5±2g/L，椰子水的浓度为10±3mL/L；较佳地，葡萄糖浓度为5±1g/L，椰子水的浓度为10±2mL/L。
13.一种用于培养龙骨马尾杉的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：
容器，以及位于容器中的权利要求12所述的培养基。
14.如权利要求13所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包含：
0.5±0.1％(v/v)次氯酸钠溶液和0.25±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液。
一种龙骨马尾杉外植体培养方法
技术领域
背景技术
[0002] 石杉碱甲是一种重要的石松类生物碱，具有横纹肌松弛作用，也是高效、可逆和高选择的乙酰胆碱酯酶的抑制剂，可用于预防和治疗阿尔兹海默症、改善记忆力、治疗重症肌无力和多种神经退行性疾病(Ma X，Gang D R.The lycopodium alkaloids[J].Natural product reports，2004，21(6)：752-772；袁经权等，蛇足石杉化学成分和药理作用研究进展；中草药，2012，43(2)：399-407)。石杉碱甲因其重要药用价值引起了人们的广泛重视。由于尚不能工业化合成，石杉碱甲仍主要以蛇足石杉为来源。野生资源少、自然界生长慢、人工栽培种植技术和组培快繁体系尚不成熟、全草中石杉碱甲含量低等限制因素，使蛇足石杉资源遭到严重破坏。因此，寻找可替代蛇足石杉的植物材料，规模化生产石杉碱甲是十分必要的。
[0003] 龙骨马尾杉是马尾杉属的代表物种，也含有丰富的石杉碱甲，是蛇足石杉的重要替代材料(Luo H，Li Y，Sun C，et al.；Comparison of 454-ESTs from Huperzia serrata and Phlegmariurus carinatus reveals putative genes involved in lycopodium alkaloid biosynthesis and developmental regulation.BMC plant biology，2010，10(1)：209)。
[0004] 龙骨马尾杉(Phlegmariurus carinatus)属于蕨类植物门(Pteridophyta)、石松纲(Lycopodiinae)、石松目(Lycopodiales)、石杉科(Huperziaceae)、马尾杉属(Phlegmariurus)，又名大千金草、大伸筋草、马尾千金草、裤带藤，是重要的中药材，用于治疗跌打损伤、肌肉痉挛、筋骨疼痛、风湿关节痛、风湿性关节炎和肥大性脊柱炎等。主要分布于台湾、广东、广西、贵州和云南等南方地区也广泛分布在日本、泰国、越南等亚洲地区。该植物多分布于0-700米的山脊、山谷、丘陵密林中石上或树上，茎簇生，成熟枝下垂，1至多回二叉分枝，长31-49厘米，枝较粗，枝连叶绳索状，第三回分枝连叶直径大于2.5毫米，侧枝不等长。叶螺旋状排列，但扭曲呈二列状。营养叶密生，针状，紧贴枝上，强度内弯，长不足5毫米，长达8毫米，宽约4毫米，基部楔形，下延，无柄，有光泽，顶端渐尖，近通直，向外开张，背面隆起呈龙骨状，中脉不显，坚硬，全缘。孢子囊穗顶生，直径约3毫米。孢子叶卵形，基部楔形，先端尖锐，具短尖头，中脉不显，全缘。孢子囊生于孢子叶腋，藏于孢子叶内，不显，肾形，2瓣开裂，黄色(中国植物志；http://frps.eflora.cn/frps/Phlegmariurus％
20carinatus)。
20carinatus)。
[0005] 但是，目前野生的龙骨马尾杉生长速度慢，资源更新周期较长，无法满足市场需求，而尚没有人成功地通过外植体培养方法成功培养龙骨马尾杉。因此，本领域亟待开发一种有效的龙骨马尾杉外植体组织培养方法。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种龙骨马尾杉外植体培养方法。
[0007] 在本发明的第一方面，提供一种龙骨马尾杉的培养方法，所述方法包括：
[0008] (1)取龙骨马尾杉外植体，进行消毒；和
[0010] 在另一优选例中，所述的1/2MS盐(含有B5维生素)中，B5维生素含量为100～120mg/L；较佳地为112mg/L；更佳地，该培养基使用的MS基盐(含有B5维生素)购自Duchefa Biochemie公司，货号：M0231.0050。
[0011] 在另一优选例中，所述的外植体为茎尖；较佳地为幼嫩且无分枝的茎尖。
[0012] 在另一优选例中，步骤(1)中，进行两步消毒：先以0.5±0.1％(v/v)次氯酸钠溶液消毒，再以0.25±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液消毒。
[0013] 在另一优选例中，步骤(1)中，以0.5±0.1％(v/v)，较佳地0.5±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液消毒12±2分钟，较佳地12±1分钟；之后以0.25±0.05％(v/v)，较佳地0.25±0.03％次氯酸钠溶液消毒3±1分钟，较佳地3±0.5分钟。
[0014] 在另一优选例中，步骤(1)中，在利用次氯酸钠溶液消毒前，还包括：将外植体材料放入Tween20溶液中浸泡；较佳地，所述的Tween20溶液浓度为0.1±0.02％v/w(更佳地0.1±0.01％v/w)；较佳地，浸泡时间3～15分钟(更佳地4～10分钟)。
[0015] 在另一优选例中，步骤(1)中，在利用次氯酸钠溶液消毒前，还包括：将外植体材料放入乙醇溶液中灭菌；较佳地，所述的乙醇溶液浓度为70±5％v/v的乙醇(更佳地70±3％v/v)；较佳地，乙醇处理时间60±20秒(更佳地60±10秒)。
[0016] 在另一优选例中，步骤(2)中，培养基中葡萄糖浓度为5±2g/L；较佳地5±1g/L。
[0017] 在另一优选例中，步骤(2)中，培养基中椰子水的浓度为10±3mL/L；较佳地10±2mL/L；更佳地10±1mL/L。
[0018] 在另一优选例中，步骤(2)中，培养条件为：温度25±5℃，光照周期16±2h/天(更佳地16±1h/天)，光照强度7000±2000lux(较佳地7000±1000lux；更佳地7000±500lux)。
[0019] 在本发明的另一方面，提供一种生产石杉碱甲的方法，所述方法包括：以前面任一所述的方法培养龙骨马尾杉，收获植株，从植株中提取石杉碱甲。
[0020] 在另一优选例中，培养45～70天；较佳地55～65天后收获植物。
[0021] 在本发明的另一方面，提供一种用于培养龙骨马尾杉的培养基，所述培养基包含：1/2MS盐，其中含有B5维生素；所述培养基还包含葡萄糖以及椰子水，且其中葡萄糖浓度为5±2g/L，椰子水的浓度为10±3mL/L；较佳地，葡萄糖浓度为5±1g/L，椰子水的浓度为10±
2mL/L。
2mL/L。
[0023] 在另一优选例中，所述试剂盒还包含：
[0024] 0.5±0.1％(v/v)次氯酸钠溶液和0.25±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液。
[0027] 图1、不同浓度的次氯酸钠处理后培养两周的外植体的变化；
[0028] A、0.5％次氯酸钠处理后再经更低浓度的0.25％次氯酸钠的两步灭菌法处理后培养两周的外植体；
[0029] B、用0.5％次氯酸钠处理后培养两周的外植体；
[0030] C、用1％次氯酸钠处理后培养两周的外植体；
[0031] 其中，实线箭头代表污染的外植体；虚线箭头表示变黄的外植体。
[0032] 图2、龙骨马尾杉不剪切基部第一代培养图；
[0033] A、培养基I；
[0034] B、培养基II；
[0035] C、培养基III；
[0036] D、培养基IV；
[0037] 其中，实线箭头表示新芽，虚线箭头表示新根。
[0038] 图3、培养基II中第三代培养图；
[0039] A、第一代剪掉基部；
[0040] B、不剪基部；
[0041] 其中，实线箭头表示新芽；虚线箭头表示新根。
[0042] 图4、培养基II中龙骨马尾杉外植体生物量和石杉碱甲含量随培养时间的变化。
具体实施方式
[0043] 为了解决龙骨马尾杉生长速度慢、资源更新周期较长的问题，本发明人对龙骨马尾杉的快速繁殖技术进行了深入的研究和改进，利用外植体组织培养技术成功获得了龙骨马尾杉，改变了现有技术中难以获得龙骨马尾杉再生植株的现状。
[0044] 龙骨马尾杉作为一种特定的物种，现有技术中尚没有人成功地通过外植体培养方法成功培养龙骨马尾杉，说明其人工离体培养过程中还存在一些难以克服的阻碍因素，需要找到导致这些阻碍因素，并寻求克服这些因素的手段。
[0045] 龙骨马尾杉外植体组织培养成功的另一个关键是确定较佳的培养基。本领域中已经进行的外植体的培养，采用的培养基不尽相同。对于一些难以离体成功繁育的植物而言，最大的阻碍培养成功的因素是植物外植体的过于敏感，难以找到适合的培养养料以为其提供健康生长的环境。尽管现有技术中已经开发了很多有助于植物生长发育的生长激素以及各种培养成分，但是并非养分越多越好，而是需要找到最为合适的。本发明人在研究过程中发现，对于龙骨马尾杉这一特定的物种而言，不能简单地依靠植物生长激素配以其它营养成分而成功培育。在此基础上，本发明提供了一种用于培养龙骨马尾杉外植体的培养基：所述培养基包括1/2MS盐(含有B5维生素)，其中还包含葡萄糖以及椰子水。
[0046] 在本发明的优选方式中，培养基中葡萄糖浓度为5±2g/L；较佳地5±1g/L。培养基中椰子水的浓度为10±3mL/L；较佳地10±2mL/L；更佳地10±1mL/L。尽管上述的培养基所含成分中并没有激素等的参与，但本发明人发现其是最有利于龙骨马尾杉的外植体的培育和生长的，获得的植物生物量高，且石杉碱甲含量高。本发明的该培养基成分易于获得，且成本低廉，有利于规模化培育龙骨马尾杉。
[0047] 所述的培养基中还可包括支持物，例如琼脂、Gelrite等，这些是本领域技术人员可以常规确定的。
[0048] 本发明人还发现，提高龙骨马尾杉外植体组织培养效力的一个因素是确定较佳的消毒方法。本领域中对于植物再生培养的消毒的方法多种多样，采用的试剂种类也多样，包括升汞、84消毒液、乙醇、次氯酸钠等。本领域人员对于消毒试剂的功效，一般认为大同小异，并不关注消毒试剂对于植物外植体后续生长的影响，且往往会根据经验或现有提供的用量进行消毒。而本发明人经过深入研究和反复试验比较，发现消毒试剂的选择及其剂量和消毒时间与龙骨马尾杉这一物种的外植体后续生长密切相关。在此基础上，本发明人确定了采用次氯酸钠进行较低剂量地多于一次的消毒。
[0049] 本发明的较佳的龙骨马尾杉的消毒方法，包括：取龙骨马尾杉外植体，进行两步消毒：先以0.5±0.1％(v/v)次氯酸钠溶液消毒，之后以0.25±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液消毒。在本发明的优选方式中，以0.5±0.1％(v/v)，较佳地0.5±0.05％(v/v)次氯酸钠溶液消毒12±2分钟，较佳地12±1分钟；之后以0.25±0.05％(v/v)，较佳地0.25±0.03％次氯酸钠溶液消毒3±1分钟，较佳地3±0.5分钟。
[0050] 在更优选的方式中，在利用次氯酸钠溶液消毒前，还包括：将外植体材料放入Tween20溶液中浸泡；较佳地，所述的Tween20溶液浓度为0.1±0.02％v/w，更佳地0.1±0.01％v/w；较佳地，浸泡时间3～15分钟,更佳地4～10分钟。
[0051] 在更优选的方式中，在利用次氯酸钠溶液消毒前，还包括：将外植体材料放入乙醇溶液中灭菌；较佳地，所述的乙醇溶液浓度为70±5％v/v的乙醇，更佳地70±3％v/v；较佳地，乙醇处理时间60±20秒，更佳地60±10秒。
[0052] 对于外植体部位的选择，根据植物的不同，本领域常选择茎段、叶片、花粉、茎尖、胚珠等。对于龙骨马尾杉，本发明人采用茎尖，较佳地为幼嫩且无分枝的茎尖。
[0053] 利用本发明的方法和培养基培养获得的龙骨马尾杉，在收获植株后，可从植株中提取获得石杉碱甲。作为本发明的优选方式，在培养45～70天；较佳地55～65天后收获植物，这个阶段已经获得较高的生物量
[0054] 下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
[0055] 1、植物材料
[0056] 龙骨马尾杉(Phlegmariurus carinatus)于2017年12月购自广西百色，由中国科学院上海辰山植物科学研究中心严岳鸿研究员鉴定。
[0057] 2、培养基组成
[0058] 培养基I：1/2MS盐(含有B5维生素，其中B5维生素含量为112mg/L)+5g/L葡萄糖；
[0059] 培养基II：1/2MS盐(含有B5维生素，其中B5维生素含量为112mg/L)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水(coconut water，购自PhytoTechnologyLaboratories公司，货号：C195)；
[0060] 培养基III：1/2MS盐(含有B5维生素，其中B5维生素含量为112mg/L)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水+0.25mg/L NAA；
[0061] 培养基IV：1/2MS盐(含有B5维生素，其中B5维生素含量为112mg/L)+5g/L葡萄糖+0.25mg/L NAA。
[0062] 配制好的培养基高压灭菌，灭菌时间15分钟，灭菌温度为121℃。
[0063] 实施例1、外植体的选择
[0064] 选取幼嫩、无分枝的龙骨马尾杉茎尖作为外植体材料，进行组织培养。
[0065] 实施例2、不同消毒方法对外植体诱导的影响
[0066] 1、消毒方法
[0067] 实施例1选取的外植体，采取多消毒的方式：
[0068] (1)一步法
[0069] 根据所选择的外植体材料的情况，用自来水冲洗5～10min后，放入0.1％v/w20溶液中浸泡5min，再用蒸馏水冲洗3次；接着将外植体浸入体积分数为70％(v/v)的乙醇中表面灭菌60s后，立即转移至0.5～1％v/v次氯酸钠(含有5.2％的有效氯)溶液
90rpm缓慢振荡12min；然后在超净台中用无菌水将外植体冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体上多余水分，然后置于培养基I中进行培养。
90rpm缓慢振荡12min；然后在超净台中用无菌水将外植体冲洗3次，用无菌滤纸吸干外植体上多余水分，然后置于培养基I中进行培养。
[0070] (2)两步法
[0071] 第一步，同前述“(1)”的一步法步骤，培养7天。
[0072] 第二步，第一步中，培养7天后的培养基I，观察外植体，将污染的外植体用0.25～0.5％(v/v)次氯酸钠溶液清洗3分钟，然后用无菌水冲洗3次，吸干外植体上的多余水分，然后置于培养基I中进行培养。
[0073] 2、消毒后的生长情况
[0074] 较高浓度的次氯酸钠(1％)的一步灭菌法处理12min，能获得60％的无菌外植体率，但是继续培养和观察发现，后续造成外植体茎尖的严重变黄，从而会导致外植体的死亡，从而在一定程度上降低了无菌外植体获得率(表1，图1C)。
[0075] 12min低浓度的次氯酸钠(0.5％)的一步灭菌法能获得50％的无菌外植体率(表1)，但培养30天后仍然会出现黄化现象，造成无菌外植体获得率降低(表1，图1B)。
[0076] 12min低浓度的次氯酸钠(0.5％)后再经3min更低浓度的次氯酸钠(0.25％)的两步灭菌法能获得70％的无菌外植体率，经30天培养后仍能获得60％的无菌外植体率(表1，图1A)。
[0077] 上述结果表明，低浓度的次氯酸钠(0.5％)后再经更低浓度的次氯酸钠(0.25％)的两步灭菌法更适宜于无菌外植体的获得。
[0078] 表1、不同浓度一步灭菌法和两步灭菌法对无菌外植体率的影响
[0079]
[0080]
[0081] 实施例3、不同培养基对外植体诱导的影响
[0082] 1、组培方法
[0083] (1)第一次消毒(两步法的第一步)后的外植体，置于培养基I(1/2MS盐(含有B5培养基的维生素)+5g/L葡萄糖)在温度25±5℃，光照周期16h/天，光照强度7000lux条件下培养7天；
[0084] (2)组培7天后被污染的外植体，重新用0.5％v/v次氯酸钠溶溶液90rpm缓慢振荡12min进行灭菌，然后用无菌水冲洗3次，吸干外植体上的多余水分(两步法消毒的第二步)；
[0085] (3)第一代培养：培养基I中培养7天的无菌外植体(培养7天的无菌外植体为0代，之后每换一次培养基培养算一代)，一部分(不剪切掉外植体基部)转移至培养基I(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖)、培养基II(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水)、培养基III(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水+0.25mg/L NAA)和培养基IV(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+0.25mg/L NAA)中分别培养；另一部分，切取1～2cm获得的无菌外植体茎尖(切取茎尖也即减掉基部)，转移至培养基I(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖)、培养基II(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水)、培养基III(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水+0.25mg/L NAA)或培养基IV(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+0.25mg/L NAA)中分别培养。培养条件为：温度25±5℃，光照周期16±1h/天，光照强度7000±500lux。
[0086] (4)第二代培养：培养60天后的外植体，分别转入新鲜的培养基I(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖)、培养基II(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+10mL/L椰子水)、培养基III(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖++10mL/L椰子水+0.25mg/L NAA)和培养基IV(1/2MS盐(含有B5维生素)+5g/L葡萄糖+0.25mg/L NAA)中，继续培养60天。培养条件为：温度25±5℃，光照周期16±1h/天，光照强度7000±500lux。
[0087] 2、不同培养条件的培养结果
[0088] 再培养外植体时(即第一代培养)，不剪掉外植体基部，I～IV四种培养基都能诱导外植体新芽和根的形成，其中，培养基II的效果相对更好(图2)。
[0089] 四种培养基诱导新芽和根产生的概率有所不同(10％-60％)。培养三代后，培养基II仍能诱导产生新的根和芽(图3B)；剪掉外植体基部再培养外植体时，I～IV四种培养基对诱导外植体的根形成率无差别(表2)；但是，只有培养基I和II能诱导外植体产生新芽(表2)。由此可知，培养基II更适合新芽和新根的生成。
[0090] 表2、四种不同培养基诱导剪切基部与不剪切基部培养方式外植体新芽和根的生成率
[0091]
[0092] 根据上述结果，本发明人用培养基II对剪切基部的外植体(第一代)做了进一步实验：第一代剪切基部的外植体再培养时不再剪切基部。培养至第三代时，外植体仍然会生成新芽和根(图3A)。
[0093] 因此，培养基II是适合培养龙骨马尾杉外植体的培养基。
[0094] 实施例4、培养基II中外植体生物量和石杉碱甲含量的变化
[0095] 1、培养基II培养的外植体石杉碱甲的含量分析
[0096] 如前所述进行两步法消毒后，用不剪切基部的培养方法，利用培养基II进行培养。
[0097] 收获培养0，7，15，30，60，90天的龙骨马尾杉外植体，液氮冷冻研磨后，按照文献报道的方法对石杉碱甲进行靶标代谢组学分析(Wu S，Fan Z and Xiao Y.Comprehensive relative quantitative metabolomics analysis of lycopodium alkaloids in different tissues of Huperzia serrata，Synthetic and Systems Biotechnology，2018，3(1):44-55)，具体为：50mg研磨充分的外植体材料(湿重)加入500μL含0.1％的甲酸的甲醇提取液(用于提取总生物碱)(10μg/mL caffeine作为内标)，室温超声萃取15min，
17000g离心10min。上清用0.22μM PTEE滤膜过滤后UPLC-QTOF-MS分析，空白对照按同样步骤来操作，每个样品进样三次。
17000g离心10min。上清用0.22μM PTEE滤膜过滤后UPLC-QTOF-MS分析，空白对照按同样步骤来操作，每个样品进样三次。
[0098] 2、植体生物量和石杉碱甲含量的变化情况
[0099] 本发明人在培养基II中，用不剪切基部的培养方法，对培养不同天数的外植体的生物量和石杉碱甲的含量进行了分析。
[0100] 结果如图4，显示：外植体90天生长周期有很长的指数期，外植体生物量随培养天数的增加而持续增加。培养90天的外植体生物量是初始外植体生物量的4倍(达0.18g)；石杉碱甲含量先降低后增加，在培养第60天时达到最大值494μg/(g鲜重)，随后降低。
[0101] 由此表明，在培养第45～70天，更佳地50～65天，植物的生物量相对已较高且石杉碱甲含量也是相对较高的。而龙骨马尾杉外植体体外培养的最适时长是60天左右。
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