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引发剂衍生肽及其用途

阅读:43发布:2020-05-11

专利汇可以提供引发剂衍生肽及其用途专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且公开了引发非超敏响应的肽和引发弱超敏响应的肽,所述肽诱导主动 植物 响应,并展现出改善的 溶解度 、 稳定性 、对化学降解的抗性或这些特性的组合。还公开了这些肽或融合多肽、组合物、重组宿主细胞或编码这些肽或融合多肽的DNA构建体用于以下的用途:调节植物生化 信号 传导、赋予植物抗病性、增强植物生长、赋予对 生物 胁迫的耐受性、赋予对 非生物胁迫 的耐受性和抗性、赋予从观赏植物移取的插条抗干燥性、赋予果实或蔬菜 收获 后抗病性或收获后抗干燥性或者提高果实或蔬菜成熟寿命。,下面是引发剂衍生肽及其用途专利的具体信息内容。

1.一种分离的肽,其包括以下的基酸序列
(L/M)-X-X-(L/M)-X-X-L-(L/M)-X-(L/I)-(E/L/F)-X-X-(L/I)-X-X-X-L-(L/F)(SEQ ID NO:1),其中每个X独立地是任何氨基酸。
2.根据权利要求1所述的分离的肽,其中每个X独立地是R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G、P、Y、W、A、IsoD或IsoE中的一个。
3.根据权利要求1所述的分离的肽,其中每个X独立地是E、P、S、Q、K、A、D或T中的一个。
4.根据权利要求3所述的分离的肽,其中:
位置2处的X选自由E和S组成的组;
在位置3处的X选自由E和P组成的组;
在位置5处的X是E;
在位置6处的X选自由E和Q组成的组;
在位置9处的X选自由E、K和A组成的组;
在位置12处的X选自由E和A组成的组;
在位置13处的X选自由E和D组成的组;
在位置15处的X选自由E和T组成的组;
在位置16处的X选自由E和Q组成的组;并且
在位置17处的X选自由E和S组成的组。
5.根据权利要求1所述的分离的肽,其中所述肽包含以下的氨基酸序列:
(L/M)-X-X-(L/M)-E-(E/Q)-L-(L/M)-X-(L/I)-(E/L/F)-X-X-(L/I)-X-(E/Q)-X-L-(L/F)(SEQ ID NO:2)
其中每个X独立地是任何氨基酸。
6.根据权利要求5所述的分离的肽,其中每个X独立地是R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G、P、Y、W、A、IsoD或IsoE中的一个。
7.根据权利要求5所述的分离的肽,其中每个X独立地是E、S、P、K、A、D或T中的一个。
8.根据权利要求5所述的分离的肽,其中:
在位置2处的X选自由E和S组成的组;
在位置3处的X选自由E和P组成的组;
在位置9处的X选自由E、K和A组成的组;
在位置12处的X选自由E和A组成的组;
在位置13处的X选自由E和D组成的组;
在位置15位的X选自由E和T组成的组;并且
在位置17处的X选自由E和S组成的组。
9.根据权利要求5所述的分离的肽,其中所述肽包含以下中的一个的氨基酸序列:
10.根据权利要求5所述的分离的肽,其中所述肽包含以下中的一个的氨基酸序列:
11.根据权利要求5所述的分离的肽,其中所述肽包含以下中的一个的氨基酸序列:
12.根据权利要求1所述的分离的肽,其中所述肽包含以下的氨基酸序列:
(L/M)-X-X-(L/M)-E-X-L-(L/M)-X-I-F-X-X-I-X-X-X-L-F(SEQ ID NO:3)
其中每个X独立地是R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G、P、Y、W或A中的一个。
13.根据权利要求12所述的分离的肽,其中每个X是E、S、P、Q、K、A、D或T中的一个。
14.根据权利要求12所述的分离的肽,其中:
在位置2处的X选自由E和S组成的组;
在位置3处的X选自由E和P组成的组;
在位置6处的X选自由E和Q组成的组;
在位置9处的X选自由E和K组成的组;
在位置12处的X选自由E和A组成的组;
在位置13处的X选自由E和D组成的组;
在位置15处的X选自由E和T组成的组;
在位置16处的X选自由E和Q组成的组;并且
在位置17处的X选自由E和S组成的组。
15.根据权利要求1所述的分离的肽,其中在所述肽的C末端处引入精氨酸或赖氨酸残基并且将任何赖氨酸或精氨酸残基改变为谷氨酸或另一种氨基酸。
16.根据权利要求1所述的分离的肽,其中所述肽包含以下的氨基酸序列:
T-S-G-(L/M)-S-P-(L/M)-E-Q-L-(L/M)-K-I-F-A-D-I-T-Q-S-L-F(SEQ ID NO:4)。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的分离的肽,其中所述肽的长度小于100个氨基酸。
18.根据权利要求17所述的分离的肽,其中所述肽的长度为最多50个氨基酸。
19.根据权利要求1至18中任一项所述的分离的肽,其中所述分离的肽当溶解于或水溶液中时是稳定的。
20.根据权利要求1至19中任一项所述的分离的肽,其中所述分离的肽当溶解于含有生物剂的缓冲水溶液中时是抗化学降解的。
21.根据权利要求1至20中任一项所述的分离的肽,其中所述分离的肽在水或水溶液中的溶解度大于约0.1%。
22.根据权利要求1至21之一所述的分离的肽,其中所述肽为至少90%纯。
23.根据权利要求1至18之一所述的分离的肽,其中所述肽是包括经由肽键与所述氨基酸序列偶联的第二氨基酸序列的融合多肽。
24.根据权利要求23所述的分离的肽,其中所述第二氨基酸序列包含纯化标记。
25.根据权利要求24所述的分离的肽,其中所述第二氨基酸序列进一步包含在所述纯化标记与所述氨基酸序列之间的可切割的接头序列。
26.根据权利要求23所述的分离的肽,其中所述肽是包含与所述肽的第二氨基酸序列连接的所述肽的第一氨基酸序列的融合多肽。
27.根据权利要求23所述的分离的肽,其中所述第二氨基酸序列包含N末端或C末端亲水性氨基酸序列。
28.根据权利要求27所述的分离的肽,其中所述亲水性氨基酸序列包含多个Glu(E)氨基酸残基。
29.一种融合多肽,其包含串联连接在一起的多个氨基酸序列,所述多个氨基酸序列中的每一个包括根据权利要求1至28之一所述的肽。
30.根据权利要求29所述的融合多肽,其中所述多个氨基酸序列通过可切割的接头序列连接在一起。
31.根据权利要求29所述的融合多肽,其中所述多个氨基酸序列各自包括纯化标记、N末端或C末端亲水性氨基酸序列或两者。
32.一种组合物,其包含一种或多种根据权利要求1至28中任一项所述的肽或根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、和载体。
33.根据权利要求32所述的组合物,其中所述组合物是澄清的细胞提取物。
34.根据权利要求32所述的组合物,其进一步包含选自由以下组成的组的添加剂:肥料除草剂杀虫剂、杀真菌剂、线虫剂、杀细菌剂、生物接种剂植物调节剂及其混合物。
35.根据权利要求34所述的组合物,其中所述杀虫剂是新烟杀虫剂、有机磷酸酯杀虫剂、拟除虫菊酯杀虫剂、大环内酯杀虫剂、氨基甲酸酯杀虫剂、二酰胺杀虫剂、阿维菌素杀虫剂、几丁质合成抑制剂或其任何组合。
36.根据权利要求34所述的组合物,其中所述杀真菌剂是嗜球果伞素杀真菌剂、三唑杀真菌剂、琥珀酸脱氢酶杀真菌剂、苯基酰胺杀真菌剂、苯基吡咯杀真菌剂、邻苯二甲酰亚胺杀真菌剂、二硫代氨基甲酸酯杀真菌剂、苯并咪唑杀真菌剂或其任何组合。
37.根据权利要求34所述的组合物,其中所述杀线虫剂是氨基甲酸酯杀线虫剂。
38.根据权利要求34所述的组合物,其中所述杀细菌剂是双氯酚和苄醇半缩甲杀细菌剂、异噻唑啉杀细菌剂或其组合。
39.根据权利要求34所述的组合物,其中生物接种剂是慢生根瘤菌属物种、芽孢杆菌属物种、链霉菌属物种、木霉属物种、巴斯德氏菌属物种或其任何组合。
40.根据权利要求34所述的组合物,其中所述组合物包含:
肽P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种或多种;以及
噻虫胺、噻虫胺和坚硬芽孢杆菌的组合、吡虫啉、或吡虫啉和坚硬芽孢杆菌的组合。
41.根据权利要求34所述的组合物,其中所述组合物包含:
肽P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种或多种;以及噻虫嗪;噻虫嗪、精甲霜灵和咯菌腈的组合;噻虫嗪、精甲霜灵、咯菌腈和嘧菌酯的组合;噻虫嗪和阿巴克丁的组合;噻虫嗪、阿巴克丁和巴斯德氏菌属杀线虫剂的组合;或噻虫嗪、精甲霜灵、咯菌腈、嘧菌酯、噻菌灵和阿巴克丁的组合。
42.根据权利要求34所述的组合物,其中所述组合物包含:
肽P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种或多种;以及
生物接种剂,所述生物接种剂包含慢生根瘤菌属物种、芽孢杆菌属物种及其组合。
43.根据权利要求32所述的组合物,其中所述载体是水性载体。
44.根据权利要求43所述的组合物,其中所述水性载体进一步包含杀生物剂、蛋白酶抑制剂、非离子表面活性剂或其组合中的一种或多种。
45.根据权利要求32所述的组合物,其中所述载体是微粒形式的固体载体。
46.根据权利要求32所述的组合物,其中所述固体载体为干粉。
47.一种包含转基因的重组宿主细胞,所述转基因包含与编码根据权利要求1至31所述的肽或融合多肽的核酸分子可操作地偶联的启动子有效核酸分子,其中所述重组宿主细胞是赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的植物以第一种益处的微生物,并且所述植物肽或融合多肽赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的植物以第二种益处。
48.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述微生物是细菌。
49.根据权利要求48所述的重组宿主细胞,其中所述细菌选自由以下组成的组:假单胞菌属、鞘氨醇单胞菌属、芽孢杆菌属、链霉菌属、根瘤菌属、弗兰克氏菌属和固氮螺菌属。
50.根据权利要求48所述的重组宿主细胞,其中所述细菌选自由以下组成的组:放射形土壤杆菌、圆褐固氮菌、洋葱伯克霍尔德菌、食酸戴尔福特菌、浸麻芽孢杆菌、成团泛菌和嗜虫沙雷氏菌。
51.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述微生物是真菌。
52.根据权利要求51所述的重组宿主细胞,其中所述真菌选自由以下组成的组:红酵母属、曲霉属和木霉属。
53.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述转基因被稳定地整合到所述微生物的基因组中。
54.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述转基因存在于表达载体中。
55.根据权利要求54所述的重组宿主细胞,其中所述表达载体是噬菌体、质粒、病毒或逆转录病毒载体。
56.根据权利要求54所述的重组宿主细胞,其中所述表达载体包括在所述重组宿主细胞中可操作的复制起点。
57.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述重组微生物是附生植物的。
58.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述重组微生物是内生植物的。
59.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述第一种益处包括为植物提供营养,产生刺激生长或减少胁迫信号传导的植物激素类似物或者与病原生物竞争。
60.根据权利要求47所述的重组宿主细胞,其中所述第二种益处包括抗病性、生长增强、对生物胁迫源的耐受性和抗性、对非生物胁迫的耐受性、从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性、和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
61.一种组合物,其包含多个根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞。
62.根据权利要求61所述的组合物,其中所述组合物是干粉形式。
63.根据权利要求62所述的组合物,其中所述干粉包括载体和所述重组宿主细胞。
64.根据权利要求61所述的组合物,其中所述组合物是水性溶液或悬浮液形式。
65.根据权利要求61所述的组合物,其中所述组合物包含两种或更多种不同重组宿主细胞的混合物。
66.一种混合物,其包含一种或多种植物种子和根据权利要求32至46或61至65之一所述的组合物。
67.一种赋予植物以抗病性的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效赋予抗病性。
68.根据权利要求67所述的方法,其中所述疾病是病毒性疾病、细菌性疾病或真菌性疾病。
69.根据权利要求67所述的方法,其中所述施用是对植物进行的。
70.根据权利要求69所述的方法,其中所述植物是对至少一种除草剂耐受的。
71.根据权利要求67所述的方法,其中所述施用是对植物种子进行的,所述方法进一步包括将用所述肽或组合物处理的种子种植在天然或人工土壤中,并从种植在所述土壤中的种子繁殖出植物。
72.根据权利要求67所述的方法,其中所述施用是在所述植物正在生长或预期生长的场所进行的。
73.根据权利要求67所述的方法,其中所述植物选自各自呈天然或基因修饰形式的农业、造林、观赏和园艺植物。
74.根据权利要求67所述的方法,其中所述植物是基因修饰的植物。
75.根据权利要求67所述的方法,其中待处理的所述植物选自由以下组成的组:苜蓿、苹果、杏、芦笋、油果、香蕉、大麦、豆类、山毛榉(水青冈属物种)、秋海棠、桦木、黑莓、蓝莓、卷心菜、樟脑、卡诺拉、胡萝卜、蓖麻、樱桃、肉桂、柑橘、可可豆、咖啡、玉米、花、黄瓜、葫芦、桉树、冷杉、亚麻、饲料甜菜、倒挂金钟、大蒜、老鹳草、葡萄、落花生、大麻、蛇麻草、唐棣属植物、芥菜(里蕻)、黄麻、小扁豆、生菜、亚麻籽、瓜、芥、橡树、燕麦、油棕、油菜(oil-seed rape)、橄榄、洋葱、红辣椒、豌豆、桃、梨、天竺葵、胡椒、矮牵牛、松树(松属物种)、白杨(杨属物种)、仁果、铃薯、油菜(rape)、覆盆子、稻、橡胶树、黑麦、高粱、大豆、菠菜、杉、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、茶、柚木、烟草、番茄、黑小麦、草皮、西瓜、小麦和柳树(柳属物种)。
76.一种增强植物生长的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效增强植物生长。
77.根据权利要求76所述的方法,其中所述增强的生长包括提高的植物活、增加的植物重量、增加的生物量、增加的每株植物的花的数量、更高的籽粒和/或果实产量、更多的分蘖或侧枝、更大的叶片、增加的枝条生长、增加的蛋白质含量、增加的油含量、增加的淀粉含量、增加的色素含量、增加的叶绿素含量及其组合。
78.根据权利要求76所述的方法,其中所述施用是对植物进行的。
79.根据权利要求78所述的方法,其中所述植物是对至少一种除草剂耐受的。
80.根据权利要求76所述的方法,其中所述施用是对植物种子进行的,所述方法进一步包括将用所述肽或组合物处理的种子种植在天然或人工土壤中,并从种植在所述土壤中的种子繁殖出植物。
81.根据权利要求76所述的方法,其中所述施用是在所述植物正在生长或预期生长的场所进行的。
82.根据权利要求76所述的方法,其中所述植物选自各自呈天然或基因修饰形式的农业、造林、观赏和园艺植物。
83.根据权利要求76所述的方法,其中所述植物是基因修饰的植物。
84.根据权利要求76所述的方法,其中待处理的所述植物选自由以下组成的组:苜蓿、苹果、杏、芦笋、牛油果、香蕉、大麦、豆类、山毛榉(水青冈属物种)、秋海棠、桦木、黑莓、蓝莓、卷心菜、樟脑、卡诺拉、胡萝卜、蓖麻、樱桃、肉桂、柑橘、可可豆、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、葫芦、桉树、冷杉、亚麻、饲料甜菜、倒挂金钟、大蒜、老鹳草、葡萄、落花生、大麻、蛇麻草、唐棣属植物、芥菜(雪里蕻)、黄麻、小扁豆、生菜、亚麻籽、瓜、芥、橡树、燕麦、油棕、油菜(oil-seed rape)、橄榄、洋葱、红辣椒、豌豆、桃、梨、天竺葵、胡椒、矮牵牛、松树(松属物种)、白杨(杨属物种)、仁果、马铃薯、油菜(rape)、覆盆子、稻、橡胶树、黑麦、高粱、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、茶、柚木、烟草、番茄、黑小麦、草皮、西瓜、小麦和柳树(柳属物种)。
85.一种提高植物对生物胁迫的耐受性的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效增加所述植物对生物胁迫因素的耐受性,所述生物胁迫因素选自由以下组成的组:昆虫、蛛形类、线虫、杂草及其组合。
86.根据权利要求85所述的方法,其中所述施用是对植物进行的。
87.根据权利要求86所述的方法,其中所述植物是对至少一种除草剂耐受的。
88.根据权利要求85所述的方法,其中所述施用是对植物种子进行的,所述方法进一步包括将用所述肽或组合物处理的种子种植在天然或人工土壤中,并从种植在所述土壤中的种子繁殖出植物。
89.根据权利要求85所述的方法,其中所述施用是在所述植物正在生长或预期生长的场所进行的。
90.根据权利要求85所述的方法,其中所述植物选自各自呈天然或基因修饰形式的农业、造林、观赏和园艺植物。
91.根据权利要求85所述的方法,其中所述植物是基因修饰的植物。
92.根据权利要求85所述的方法,其中待处理的所述植物选自由以下组成的组:苜蓿、苹果、杏、芦笋、牛油果、香蕉、大麦、豆类、山毛榉(水青冈属物种)、秋海棠、桦木、黑莓、蓝莓、卷心菜、樟脑、卡诺拉、胡萝卜、蓖麻、樱桃、肉桂、柑橘、可可豆、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、葫芦、桉树、冷杉、亚麻、饲料甜菜、倒挂金钟、大蒜、老鹳草、葡萄、落花生、大麻、蛇麻草、唐棣属植物、芥菜(雪里蕻)、黄麻、小扁豆、生菜、亚麻籽、瓜、芥、橡树、燕麦、油棕、油菜(oil-seed rape)、橄榄、洋葱、红辣椒、豌豆、桃、梨、天竺葵、胡椒、矮牵牛、松树(松属物种)、白杨(杨属物种)、仁果、马铃薯、油菜(rape)、覆盆子、稻、橡胶树、黑麦、高粱、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、茶、柚木、烟草、番茄、黑小麦、草皮、西瓜、小麦和柳树(柳属物种)。
93.一种提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效增加所述植物对非生物胁迫因素的耐受性,所述非生物胁迫因素选自由以下组成的组:盐胁迫水分胁迫、臭胁迫、重金属胁迫、冷胁迫、热胁迫、营养胁迫及其组合。
94.根据权利要求93所述的方法,其中所述施用是对植物进行的。
95.根据权利要求94所述的方法,其中所述植物是对至少一种除草剂耐受的。
96.根据权利要求93所述的方法,其中所述施用是对植物种子进行的,所述方法进一步包括将用所述肽或组合物处理的种子种植在天然或人工土壤中,并从种植在所述土壤中的种子繁殖出植物。
97.根据权利要求93所述的方法,其中所述施用是在所述植物正在生长或预期生长的场所进行的。
98.根据权利要求93所述的方法,其中所述植物选自各自呈天然或基因修饰形式的农业、造林、观赏和园艺植物。
99.根据权利要求93所述的方法,其中所述植物是基因修饰的植物。
100.根据权利要求93所述的方法,其中待处理的所述植物选自由以下组成的组:苜蓿、苹果、杏、芦笋、牛油果、香蕉、大麦、豆类、山毛榉(水青冈属物种)、秋海棠、桦木、黑莓、蓝莓、卷心菜、樟脑、卡诺拉、胡萝卜、蓖麻、樱桃、肉桂、柑橘、可可豆、咖啡、玉米、棉花、黄瓜、葫芦、桉树、冷杉、亚麻、饲料甜菜、倒挂金钟、大蒜、老鹳草、葡萄、落花生、大麻、蛇麻草、唐棣属植物、芥菜(雪里蕻)、黄麻、小扁豆、生菜、亚麻籽、瓜、芥、橡树、燕麦、油棕、油菜(oil-seed rape)、橄榄、洋葱、红辣椒、豌豆、桃、梨、天竺葵、胡椒、矮牵牛、松树(松属物种)、白杨(杨属物种)、仁果、马铃薯、油菜(rape)、覆盆子、稻、橡胶树、黑麦、高粱、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、茶、柚木、烟草、番茄、黑小麦、草皮、西瓜、小麦和柳树(柳属物种)。
101.一种赋予从观赏植物移取的插条以抗干燥性的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于植物或所述植物正在生长的场所,其中所述施用有效赋予从所述观赏植物移取的插条以抗干燥性。
102.根据权利要求101所述的方法,其中所述施用是对观赏植物进行的。
103.根据权利要求101所述的方法,其中所述施用是在所述观赏植物正在生长的场所进行的。
104.根据权利要求101所述的方法,其中所述观赏植物是基因修饰的观赏植物。
105.根据权利要求101所述的方法,其中待处理的所述植物选自由以下组成的组:山毛榉(水青冈属物种)、秋海棠、桦木、观赏性卷心菜、冷杉、倒挂金钟、大蒜、老鹳草、橡树、观赏洋葱、天竺葵、矮牵牛、松树(松属物种)、杨树(杨属物种)、向日葵、柚木、烟草、草皮和柳树(柳属物种)。
106.一种赋予果实或蔬菜以收获后抗病性或收获后抗干燥性的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于含有果实或蔬菜的植物或者所述植物正在生长的场所,或者将有效量的所述分离的肽或所述组合物施用于收获的果实或蔬菜,
其中所述施用有效赋予所述果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性。
107.根据权利要求106所述的方法,其中所述施用是对植物进行的。
108.根据权利要求107所述的方法,其中所述植物是对至少一种除草剂耐受的。
109.根据权利要求106所述的方法,其中所述施用是在所述植物正在生长的场所进行的。
110.根据权利要求106所述的方法,其中所述施用是对收获的果实或蔬菜进行的。
111.根据权利要求106所述的方法,其中所述植物是基因修饰的植物。
112.根据权利要求106所述的方法,其中所述植物选自由以下组成的组:苹果、杏、芦笋、牛油果、香蕉、黑莓、蓝莓、卷心菜、胡萝卜、樱桃、柑橘、玉米、黄瓜、葫芦、饲料甜菜、大蒜、葡萄、唐棣属植物、芥菜(雪里蕻)、生菜、瓜、芥、橄榄、洋葱、豌豆、桃、梨、胡椒、仁果、马铃薯、油菜、覆盆子、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、茶、番茄、黑小麦和西瓜。
113.一种提高果实或蔬菜成熟寿命的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于含有果实或蔬菜的植物或者所述植物正在生长的场所,或者将有效量的所述分离的肽或所述组合物施用于收获的果实或蔬菜,
其中所述施用有效提高了果实或蔬菜成熟寿命。
114.根据权利要求113所述的方法,其中所述施用是对植物进行的。
115.根据权利要求113所述的方法,其中所述植物是对至少一种除草剂耐受的。
116.根据权利要求113所述的方法,其中所述施用是在所述植物正在生长的场所进行的。
117.根据权利要求113所述的方法,其中所述施用是对收获的果实或蔬菜进行的。
118.根据权利要求113所述的方法,其中所述植物是基因修饰的植物。
119.根据权利要求113所述的方法,其中所述植物选自由以下组成的组:苹果、杏、芦笋、牛油果、香蕉、黑莓、蓝莓、卷心菜、胡萝卜、樱桃、柑橘、玉米、黄瓜、葫芦、饲料甜菜、大蒜、葡萄、唐棣属植物、芥菜(雪里蕻)、生菜、瓜、芥、橄榄、洋葱、豌豆、桃、梨、胡椒、仁果、马铃薯、油菜、覆盆子、菠菜、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、茶、番茄、黑小麦和西瓜。
120.一种调节植物生化物信号传导的方法,其包括:
将有效量的根据权利要求1至28之一所述的分离的肽、根据权利要求29至31之一所述的融合多肽、根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求32至46或61至
65之一所述的组合物施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效调节植物生化信号传导。
121.根据权利要求120所述的方法,其中所述植物生化信号传导选自由以下组成的组:
诱导一氧化氮产生、过氧化物产生或次级代谢产物;乙烯信号传导途径的激动调节和诱导响应乙烯的基因表达;水杨酸信号传导途径的激动调节和诱导响应水杨酸的基因表达;脱落酸途径的激动调节和诱导响应脱落酸的基因表达;赤霉素信号传导途径的激动调节和诱导响应赤霉素的基因表达;茉莉酸信号传导的拮抗调节和抑制响应茉莉酸的基因的表达;
诱导蛋白酶抑制剂表达;诱导植物组织中活性氧物质产生;诱导免疫有关肽和抗微生物肽产生;以及诱导膨胀素基因表达和产生。
122.一种处理植物种子的方法,其包括:
提供一种或多种植物种子;以及
将根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求61至65之一所述的组合物施用于所提供的一种或多种植物种子。
123.根据权利要求122所述的方法,其中所述施用包括将包含所述重组宿主细胞的干粉与所述一种或多种植物种子混合。
124.根据权利要求122所述的方法,其中所述施用包括用包含所述重组宿主细胞的水性溶液或悬浮液浸泡或喷洒所述一种或多种植物种子。
125.一种处理植物的方法,其包括:
提供一种或多种植物;以及
将根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求61至65中任一项所述的组合物施用于所提供的一种或多种植物。
126.根据权利要求125所述的方法,其中所述施用包括用包含所述重组宿主细胞的水性溶液或悬浮液喷洒所述一种或多种植物。
127.根据权利要求125所述的方法,其中所述施用包括将包含所述重组宿主细胞的干粉撒在所述一种或多种植物上。
128.一种处理植物的方法,其包括:
将根据权利要求47至60之一所述的重组宿主细胞或根据权利要求61至65中任一项所述的组合物施用于植物正在生长或预期生长的场所;以及
使一种或多种植物在施用所述重组宿主细胞或所述组合物的所述场所生长。
129.根据权利要求128所述的方法,其中所述重组宿主细胞或所述组合物是在将种子种植在所述场所之前施用的。
130.根据权利要求128所述的方法,其中所述重组宿主细胞或所述组合物是在将种子种植在所述场所之后施用的。
131.根据权利要求128所述的方法,其中所述重组宿主细胞或所述组合物是在所述场所种植一株或多株籽苗之前施用的。
132.根据权利要求128所述的方法,其中所述重组宿主细胞或所述组合物是在所述场所种植一株或多株籽苗之后施用的。
133.根据权利要求128所述的方法,其中所述重组宿主细胞或所述组合物是当植物正在所述场所生长时施用于所述场所。
134.根据权利要求128所述的方法,其中所述场所包括人工或天然土壤、聚合物生长培养基或水培生长培养基。
135.一种DNA构建体,其包括编码根据权利要求1至28之一所述的多肽或分离的肽或根据权利要求29至31之一所述的融合多肽的第一核酸分子,以及与所述第一核酸分子可操作地偶联的启动子有效核酸分子。
136.一种包括根据权利要求135所述的DNA构建体的重组表达载体。
137.一种包括根据权利要求135所述的DNA构建体的转基因植物。
138.一种包括权利要求135所述的DNA构建体的转基因植物种子。
139.一种赋予植物以抗病性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予抗病性的条件下生长。
140.一种增强植物生长的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以增强植物生长的条件下生长。
141.一种赋予植物以抗病性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予抗病性的条件下生长。
142.一种提高植物对生物胁迫的耐受性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以增加所述植物对生物胁迫因素的耐受性的条件下生长,所述生物胁迫因素选自由以下组成的组:昆虫、蛛形类、线虫、杂草及其组合。
143.一种提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以增加所述植物对非生物胁迫因素的耐受性的条件下生长,所述非生物胁迫因素选自由以下组成的组:盐胁迫、干旱胁迫、臭氧胁迫、重金属胁迫和冷胁迫及其组合。
144.一种赋予从观赏植物移取的插条以抗干燥性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因观赏植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予从所述转基因观赏植物移取的插条以抗干燥性的条件下生长。
145.一种赋予果实或蔬菜以收获后抗病性或收获后抗干燥性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予从所述转基因植物移取的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性的条件下生长。
146.一种提高果实或蔬菜成熟寿命的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物;以及
使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以提高从所述转基因植物移取的果实或蔬菜的成熟寿命的条件下生长。
147.一种赋予植物以抗病性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物种子;
在土壤中种植所述转基因植物种子;以及
从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而赋予抗病性。
148.一种增强植物生长的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物种子;
在土壤中种植所述转基因植物种子;以及
从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而增强植物生长。
149.一种赋予植物以抗病性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物种子;
在土壤中种植所述转基因植物种子;以及
从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而赋予抗病性。
150.一种提高植物对生物胁迫的耐受性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物种子;
在土壤中种植所述转基因植物种子;以及
从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而增加所述植物对生物胁迫因素的耐受性,所述生物胁迫因素选自由以下组成的组:昆虫、蛛形类、线虫、杂草及其组合。
151.一种提高植物对非生物胁迫的耐受性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物种子;
在土壤中种植所述转基因植物种子;以及
从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而增加所述植物对非生物胁迫因素的耐受性,所述非生物胁迫因素选自由以下组成的组:盐胁迫、干旱胁迫、臭氧胁迫、重金属胁迫和冷胁迫及其组合。
152.一种赋予从观赏植物移取的插条以抗干燥性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因观赏植物种子;
在土壤中种植所述转基因观赏植物种子;以及
从所述转基因观赏植物种子繁殖转基因观赏植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而赋予从所述转基因观赏植物移取的插条以抗干燥性。
153.一种赋予果实或蔬菜以收获后抗病性或收获后抗干燥性的方法,其包括:
提供用根据权利要求135所述的DNA构建体转化的转基因植物种子;
在土壤中种植所述转基因植物种子;以及
从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽,从而赋予从所述转基因植物移取的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性。

说明书全文

引发剂衍生肽及其用途

[0001] 本申请要求2017年5月26日提交的美国临时专利申请序列号62/511,517的优先权,其通过引用以其整体特此并入。

技术领域

[0002] 本发明涉及新的超敏响应引发剂肽及其用于诱导主动植物响应的用途,所述主动植物响应尤其包括生长增强、抗病性、有害生物抗性或昆虫抗性以及胁迫抗性。

背景技术

[0003] 超敏蛋白(harpin)蛋白质的鉴定和分离来自康奈尔大学(Cornell University)尝试了解植物病原菌如何与植物相互作用的基础研究。第一道防线是超敏响应(HR),即感染部位的局部植物细胞死亡。细胞死亡为病原体的移动创造了物理障碍,并且在一些植物中死亡细胞可以释放对入侵的病原体有毒的化合物。研究已表明,致病细菌可能具有导致触发HR的单一因素。康奈尔大学研究的基本目的是鉴定导致引发HR的特定细菌蛋白。已知靶蛋白由称为超敏响应和致病性(hrp)基因簇的一组细菌基因中的一种细菌基因编码。详细研究了导致梨和苹果火疫病的细菌解淀粉欧文氏菌(Erwinia amylovora,Ea)中的hrp簇,并鉴定了在某些植物中引发HR的单一蛋白质。将该蛋白质命名为超敏蛋白(后来称为超敏蛋白Ea),并将相应的基因命名为hrpN。这是从任何细菌物种鉴定出的这种蛋白质和基因的第一个实例。
[0004] 尤其已从欧文氏菌属(Erwinia),假单胞菌属(Pseudomonas),罗尔斯通氏菌属(Ralstonia),黄单孢菌属(Xanthomonas)和泛菌属(Pantoea)物种鉴定出许多不同的超敏蛋白。超敏蛋白虽然在一级基酸序列平上不同,但共享共同的生化特征和生物物理学特征以及生物学功能。基于其独特的特性,超敏蛋白在文献中被视为属于单一蛋白质种类。
[0005] 在对超敏蛋白进行鉴定和分离之后,随后发现超敏蛋白可以引发植物的抗病性并促进植物生长。一个重要的早期发现是,纯化的超敏蛋白的施用使植物能抵抗后来的病原体攻击,并且在植物上远离注射部位位置也是如此。这意味着超敏蛋白可以触发系统获得性抗性(SAR),即提供针对多种病毒、细菌和真菌病原体的抗性的植物防御机制。
[0006] 在农作物保护中,人们一直需要改善植物健康的组合物。期望更健康的植物,因为它们导致植物或农作物的更高的产量和/或更好的质量。更健康的植物还可以更好地抵抗生物胁迫和非生物胁迫。对生物胁迫的高抗性又允许种植者减少使用杀有害生物剂的量,从而减缓了对各种杀有害生物剂的抗性的发展。
[0007] 超敏蛋白αβ是衍生自几种不同超敏蛋白的融合蛋白。已显示超敏蛋白αβ抑制线虫产卵,增强植物的生长、质量和产量并增加植物的活。其氨基酸和核苷酸序列在美国申请公开号2010/0043095中进行了详细描述。
[0008] 迄今为止,超敏蛋白和超敏蛋白αβ产生及其在农业和园艺应用中的使用是包被在淀粉上的粉状固体的形式。这限制了超敏蛋白的使用和多功能性,因为粉状超敏蛋白在水中的液体悬浮液在发生显著降解和活性丧失之前仅具有48-72小时的有效使用寿命。超敏蛋白溶液的另一个问题是蛋白质溶解度稳定性
[0009] 期望鉴定出易溶于水溶液、稳定、抗化学降解并有效启动一种或多种主动植物响应(包括但不限于抗病性和/或抗旱性)的合成的和衍生的超敏蛋白肽。
[0010] 本发明涉及克服本领域中的这些和其他限制。

发明内容

[0011] 本发明的第一方面涉及一种分离的肽,其包括以下的氨基酸序列
[0012] (L/M)-X-X-(L/M)-X-X-L-(L/M)-X-(L/I)-(E/L/F)-X-X-(L/I)-X-X-X-L-(L/F)(SEQ ID NO:1),其中每个X独立地是任何氨基酸。
[0013] 本发明的第二方面涉及根据本发明的第一方面的分离的肽,其中所述肽包括以下的氨基酸序列
[0014] (L/M)-X-X-(L/M)-E-(E/Q)-L-(L/M)-X-(L/I)-(E/L/F)-X-X-(L/I)-X-(E/Q)-X-L-(L/F)(SEQ ID NO:2),其中每个X独立地是任何氨基酸。
[0015] 本发明的第三方面涉及根据本发明的第一方面的分离的肽,其中所述肽包括以下的氨基酸序列:
[0016] (L/M)-X-X-(L/M)-E-X-L-(L/M)-X-I-F-X-X-I-X-X-X-L-F(SEQ ID NO:3),其中每个X独立地是R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G、P、Y、W或A中的一个。
[0017] 本发明的第四方面涉及根据本发明的第一方面的分离的肽,其中所述肽包括以下的氨基酸序列T-S-G-(L/M)-S-P-(L/M)-E-Q-L-(L/M)-K-I-F-A-D-I-T-Q-S-L-F(SEQ ID NO:4)。
[0018] 本发明的第五方面涉及一种融合多肽,其包含本发明的第一、第二、第三或第四方面的肽中的一个以及纯化标记、溶解度标记或根据本发明的第一或第二方面的第二肽中的一个或多个。
[0019] 本发明的第六方面涉及一种组合物,其包含根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的一个或多个肽或者根据本发明的第五方面的融合多肽以及载体。
[0020] 本发明的第七方面涉及一种重组宿主细胞,其包括含有与分别编码根据本发明的第一、第二、第三、第四或第五方面的肽或融合多肽的核酸分子可操作地偶联的启动子有效核酸分子的转基因,其中所述重组宿主细胞是微生物,所述微生物赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的植物以第一种益处,并且所述肽或融合多肽赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的所述植物以第二种益处。
[0021] 本发明的第八方面涉及一种赋予植物以抗病性的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效地赋予抗病性。
[0022] 本发明的第九方面涉及一种增强植物生长的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效地增强植物生长。
[0023] 本发明的第十方面涉及一种增加植物对生物胁迫源的耐受性和抗性的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效地增加所述植物对生物胁迫因素的耐受性和抗性,所述生物胁迫因素选自由以下组成的组:诸如昆虫、蛛形类、线虫类的有害生物、杂草及其组合。
[0024] 本发明的第十一方面涉及一种增加植物对非生物胁迫的耐受性的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于植物或植物种子或者所述植物正在生长或预期生长的场所,其中所述施用有效地增加所述植物对非生物胁迫因素的耐受性,所述非生物胁迫因素选自由以下组成的组:盐胁迫水分胁迫(包括干旱和泛洪)、臭胁迫、重金属胁迫、冷胁迫、热胁迫、营养胁迫(磷缺乏、缺乏、氮缺乏)、漂白和光诱导的胁迫及其组合。
[0025] 本发明的第十二方面涉及一种赋予从观赏植物移取的插条以抗干燥性的方法。该方法包括:将根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于植物或者所述植物正在生长的场所,其中所述施用有效地赋予从所述观赏植物移取的插条以抗干燥性。
[0026] 本发明的第十三方面涉及一种赋予果实或蔬菜以收获后抗病性或收获后抗干燥性的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于含有果实或蔬菜的植物或所述植物正在生长的场所;或将有效量的所述分离的肽、所述融合多肽或所述组合物施用于收获的果实或蔬菜,其中所述施用有效地赋予所述果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性。
[0027] 本发明的第十四方面涉及一种提高果实或蔬菜成熟寿命的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于含有果实或蔬菜的植物或所述植物正在生长的场所;或将有效量的所述分离的肽、所述融合多肽或所述组合物施用于收获的果实或蔬菜,其中所述施用有效地提高果实或蔬菜成熟寿命。
[0028] 本发明的第十五方面涉及一种调节植物的一个或多个生物学信号传导过程的方法。该方法包括:将有效量的根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的分离的肽,根据本发明的第五方面的融合多肽,根据本发明的第六方面的组合物或根据本发明的第七方面的重组宿主细胞施用于植物或者所述植物正在生长的场所,其中所述施用有效地调节一个或多个生化信号传导过程。
[0029] 本发明的第十六方面涉及一种处理植物种子的方法。该方法包括提供一种或多种植物种子,以及将根据本发明的第七方面的重组宿主细胞或根据本发明的第六方面的组合物施用于所提供的一种或多种植物种子。
[0030] 本发明的第十七方面涉及一种处理植物的方法。该方法包括提供一种或多种植物,以及将根据本发明的第七方面的重组宿主细胞或根据本发明的第六方面的组合物施用于所提供的一种或多种植物。
[0031] 本发明的第十八方面涉及一种处理植物的方法。该方法包括将根据本发明的第七方面的重组宿主细胞或根据本发明的第六方面的组合物施用于植物正在生长或预期生长的场所,以及使一种或多种植物在施用所述重组宿主细胞或所述组合物的场所生长。
[0032] 本发明的第十九方面涉及一种DNA构建体,其包含编码根据本发明的第一、第二、第三或第四方面的肽或者根据本发明的第五方面的融合多肽的第一核酸分子;和与所述第一核酸分子可操作地偶联的启动子有效核酸分子。本发明的这一方面还包括含有所述DNA构建体的重组表达载体、含有所述DNA构建体的重组宿主细胞以及包含本发明的重组植物细胞(其含有所述DNA构建体)的转基因植物或植物种子。
[0033] 本发明的第二十方面涉及一种赋予植物以抗病性、增强植物生长、赋予对生物胁迫源的耐受性和抗性、赋予对非生物胁迫的耐受性或调节植物生化信号传导的方法。该方法包括提供用根据本发明的第十九方面的DNA构建体转化的转基因植物;以及使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以对所述转基因植物进行赋予抗病性、增强植物生长、赋予对生物胁迫的耐受性、赋予对非生物胁迫的耐受性或调节生化信号传导的条件下生长。
[0034] 本发明的第二十一方面涉及一种方法,该方法赋予从观赏植物移取的插条以抗干燥性、赋予果实或蔬菜以收获后抗病性或收获后抗干燥性或者提高果实或蔬菜成熟寿命。所述方法包括提供用根据本发明的第十九方面的DNA构建体转化的转基因植物;以及使所述植物在有效允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予从转基因观赏植物移取的插条以抗干燥性、赋予从所述转基因植物移取的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性或者提高从所述转基因植物移取的果实或蔬菜的成熟寿命的条件下生长。
[0035] 本发明的第二十二方面涉及一种方法,所述方法赋予植物以抗病性、增强植物生长、赋予对生物胁迫源的耐受性和抗性、赋予对非生物胁迫的耐受性或调节生化信号传导。该方法包括提供用根据本发明的第十九方面的DNA构建体转化的转基因植物种子;在土壤中种植所述转基因植物种子;以及从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以对所述转基因植物进行赋予抗病性、增强植物生长、赋予对生物胁迫的耐受性或赋予对非生物胁迫的耐受性。
[0036] 本发明的第二十三方面涉及一种方法,该方法赋予从观赏植物移取的插条以抗干燥性、赋予果实或蔬菜以收获后抗病性或收获后抗干燥性或者提高果实或蔬菜成熟寿命。所述方法包括提供用根据本发明的第十九方面的DNA构建体转化的转基因植物种子;在土壤中种植所述转基因植物种子;以及从所述转基因植物种子繁殖转基因植物以允许所述DNA构建体表达所述肽或所述融合多肽以赋予从转基因观赏植物移取的插条以抗干燥性、赋予从所述转基因植物移取的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性或者提高从所述转基因植物移取的果实或蔬菜的成熟寿命。
[0037] 通过提供展现出改善的溶解度、稳定性、抗化学降解性或这些特性的组合的不引发HR/引发弱HR的活性肽,所述肽将为种植者在制备、处理有效量的含有这些不引发HR/引发弱HR的肽的组合物以及向在田地或温室中的植物递送所述组合物时提供更大的灵活性。简化种植者的施用过程将导致更大的依从性,从而导致关于以下中的一者或多者的改善的结果:抗病性、生长增强、对生物胁迫源的耐受性和抗性、对非生物胁迫的耐受性、从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。这些和其他益处在本文中进行描述。

具体实施方式

[0038] 本发明的一个方面涉及具有促进主动植物响应(可以包括或可以不包括超敏响应)的能力的新型肽,所述主动植物响应提供以下属性中的一种或多种:抗病性、生长增强、对生物胁迫源的耐受性和抗性、对非生物胁迫的耐受性、从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。这些植物响应的诱导涉及调节植物生化信号传导。
[0039] 如本文所用,根据以下列表,通过对应于氨基酸惯用名的常规三字母和/或单字母缩写来标识天然存在的氨基酸:丙氨酸(Ala,A)、精氨酸(Arg,R)、天冬酰胺(Asn,N)、天冬氨酸(Asp,D)、半胱氨酸(Cys,C)、谷氨酸(Glu,E)、谷氨酰胺(Gln,Q)、甘氨酸(Gly,G)、组氨酸(His,H)、异亮氨酸(Ile,I)、亮氨酸(Leu,L)、赖氨酸(Lys,K)、甲硫氨酸(Met,M)、苯丙氨酸(Phe,F)、脯氨酸(Pro,P)、丝氨酸(Ser,S)、苏氨酸(Thr,T)、色氨酸(Trp,W)、酪氨酸(Tyr,Y)和缬氨酸(Val,V)。所述缩写在肽领域中是被接受的,并且是由生化术语IUPAC-IUB委员会推荐的。氨基酸的天然存在的变化包括但不限于γ-谷氨酸(g-Glu)和异天冬氨酸(iso-Asp或isoD)。
[0040] 术语“氨基酸”还包括本文提及的任何特定氨基酸的类似物、衍生物和同源物,以及C末端或N末端保护的氨基酸衍生物(例如,用N末端、C末端或侧链保护基团修饰的,包括但不限于乙酰化、甲酰化、甲基化、酰胺化、酯化、PEG化和脂质的加成)。非天然存在的氨基酸是公知的,并且可以使用如下文所述的固相合成将其引入本发明的肽中。此外,术语“氨基酸”包括D-氨基酸和L-氨基酸两者。因此,在本文中通过其名称、三字母或单字母符号标识并且没有明确标识为具有D或L构型的氨基酸应理解为假定具有D或L构型中的任何一种。在一个实施方案中,肽包括所有L-氨基酸。
[0041] 在某些实施方案中,将肽标识为“由所列举的序列组成”,在这种情况下,所述肽仅包含所列举的一个或多个氨基酸序列,而在其N末端或C末端不具有任何外来氨基酸。就所列举的序列为共有序列的形式(其中一个或多个所示X或Xaa残基可以是一种或多种氨基酸中的任何一种)而言,则由这个所列举的序列组成的肽包含多种肽序列。
[0042] 在某些其他实施方案中,将肽标识为“基本上由所列举的序列组成”,在这种情况下,所述肽包含所列举的一个或多个氨基酸序列,任选地在其N末端和/或C末端具有一个或多个外来氨基酸,所述外来氨基酸不会实质性改变以下特性中的一种或多种:(i)所述肽在植物中诱导主动响应的能力,(ii)所述肽在水或水溶液中的溶解度,(iii)在50℃下经历一段时间(例如3周),溶于水或水溶液的所述肽的稳定性,以及(iv)在50℃下经历一段时间(例如3周),在存在包含杀生物剂(例如 GXL)的缓冲水溶液的情况下所述肽对化学降解的抗性。
[0043] 简而言之,可以使用具有至少约80%、至少约82%、至少约84%、至少约86%、至少约88%、至少约90%、至少约92%、至少约94%、至少约96%或至少约98%的初始纯度的肽样品,如下评估肽的稳定性和抗化学降解性。对于水稳定性,将所述肽直接溶解于去离子水中。对于化学降解测试,将所述肽溶解于含有50mM pH缓冲剂和0.25%Proxel GXL的水溶液中。示例性的pH缓冲剂包括但不限于:(i)柠檬酸盐,pH 5.6;(ii)MES,pH 6.0;(iii)MOPS,pH 6.5;(iv)咪唑,pH 7.5;(v)柠檬酸盐,pH 7.2;(vi)EDDS,pH 7.3;(vii)EDTA,pH 8.0;(viii)磷酸钠,pH 8.0;或(ix)TES,pH 8.0。首先将肽以0.5mg/ml的浓度溶解于水溶液中。
将样品在50℃下孵育以允许加速降解。将初始的肽样品取出,用水稀释10倍,并通过反相HPLC分析。简而言之,将20μl所述样品注射至HPLC仪器的溶剂流中,并使用水/乙腈中三乙胺磷酸盐的梯度或水中0.1%TFA/乙腈中0.1%TFA的梯度在C18 HPLC柱(YMC ProPack C18,YMC,日本,或C18 Stablebond,Agilent Technologies,美国)上进行分析,以分离不同的肽种类。通过218nm处的UV吸光度监测洗脱的肽并根据峰下面积对所述肽进行定量。将初始肽样品的峰下面积视为后续运行中相对定量的标准。在规律的时间间隔(例如1、3、7、10和14天)下,如上所述通过HPLC对每个肽样品进行考察和分析。如果需要观察降解(即在肽展现出高度的化学稳定性的情况下),可以将该方案延长几周以观察降解。将后续肽运行的定量表示为原始(第0天)HPLC结果的百分比。
[0044] 至少部分可溶于水或水溶液的肽展现出大于0.1mg/ml,优选至少约1.0mg/ml、至少约2.0mg/ml、至少约3.0mg/ml或至少约4.0mg/ml的溶解度。在某些实施方案中,所述肽在水或水溶液中展现出高溶解度,其溶解度为至少约5.0mg/ml、至少约10.0mg/ml、至少约15.0mg/ml或至少约20mg/ml。
[0045] 经历在50℃下孵育指定时间段,在水或水溶液中稳定的肽展现出原始肽浓度的至少约66%、至少约68%、至少约70%、至少约72%、至少约74%、至少约76%、至少约78%、至少约80%、至少约82%、至少约84%、至少约86%、至少约88%或至少约90%。在某些实施方案中,所述指定时间段为3天、7天、14天、21天、28天、一个月、两个月、三个月或四个月。
[0046] 经历在50℃下孵育指定时间段,抗化学降解的肽展现出原始肽浓度的至少约66%、至少约68%、至少约70%、至少约72%、至少约74%、至少约76%、至少约78%、至少约
80%、至少约82%、至少约84%、至少约86%、至少约88%或至少约90%。在某些实施方案中,所述指定时间段为3天、7天、14天、21天、28天、一个月、两个月、三个月或四个月。
[0047] 可以通过将肽以干粉形式或以溶液形式施用于植物,特别但不排他地施用于植物叶片来测量在将所述肽渗透或施用至植物组织时所述肽引发或不引发超敏响应的特性。施用率包括1-500μg/ml(对于液体溶液)和0.0001%-0.5%(w/w)(对于粉末施用)。溶液形式的肽的示例性施用描述于Wei,Science 257:85-88(1992)中,其通过引用以其整体特此并入。简而言之,可以将肽以500μg/ml的浓度溶解于水溶液中,然后引入到开花前植物的叶片上。可以在中间叶板中用牙签轻轻刺穿叶片(即机械地受伤),然后可以经由无针注射器将肽溶液注入伤口中,以填充叶板。在接下来的48小时内,可以针对程序性细胞死亡的典型病变,即枯萎和褐变,对叶片进行观察并评分。如果植物在48小时内展现出肉眼可见的分布广泛的显著细胞死亡,伴随累及组织的萎蔫和褐变,则认为所述植物是HR阳性的(“HR+”)。如果植物没有展现出肉眼可观察到的可辨萎蔫或组织死亡,则认为所述植物是HR阴性的(“HR-”)。48小时后范围有限的极小褐变或枯萎证实弱HR引发。
[0048] 在某些实施方案中,一个或多个特性的实质性改变旨在意指当将具有一个或多个外来氨基酸的肽与缺乏所述一个或多个外来氨基酸但其他都相同的肽比较时,所列举的特性存在少于20%变化、少于15%变化、少于10%变化或少于5%变化。在某些实施方案中,N末端或C末端处的外来氨基酸数目为在一端或两端最多20个氨基酸、在一端或两端最多15个氨基酸、在一端或两端最多10个氨基酸、在一端或两端最多7个氨基酸、在一端或两端最多5个氨基酸或在一端或两端最多3个氨基酸。此外,就所列举的序列为共有序列的形式(其中一个或多个所示X或Xaa残基可以是一种或多种氨基酸中的任何一种)而言,则在不考虑此类序列中通过其N末端和/或C末端处外来氨基酸的存在而提供的其他变化的情况下,基本上由这个所列举的序列组成的肽包含多种肽序列。
[0049] 在本发明的各个实施方案中,公开的肽可以包含例如在指定肽序列的N末端或C末端处的亲水性氨基酸序列。亲水性氨基酸序列的长度为至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个或至少10个氨基酸,并且所述亲水性氨基酸序列包括有助于与指定肽(即诱导主动植物响应的肽)的氨基酸序列相邻的氨基酸序列的亲水特性的氨基酸残基。在本领域中已经使用了不同的方法来计算氨基酸残基和蛋白质的相对疏水性/亲水性(Kyte等人,“A Simple Method for Displaying the Hydropathic Character of a Protein,”J.Mol.Biol.157:105-32(1982);Eisenberg D“, Three-dimensional Structure of Membrane and Surface Proteins,”Ann.Rev.Biochem.53:595-623(1984);Rose等人,“Hydrogen  Bonding,Hydrophobicity,Packing,and Protein Folding,”Annu.Rev.Biomol.Struct.22:381-415(1993);Kauzmann,“Some Factors in the Interpretation of Protein Denaturation,”Adv.Protein Chem.14:1-63(1959),上述文献通过引用以其整体特此并入)。这些疏水性量表中的任何一种都可用于本发明的目的;然而,Kyte-Doolittle疏水性量表可能是最常提到的量表。这些亲水性量表提供了氨基酸残基的相对疏水性的排名表。例如,有助于亲水性的氨基酸包括Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)和His(H),以及(尽管程度较小)Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)和Trp(W)。例如,聚谷氨酸序列可用于增加蛋白质和其他药物分子的溶解度(Lilie等人,Biological Chemistry 394(8):995-1004(2013);Li等人,Cancer Research 58:2404-
2409(1998),上述文献通过引用以其整体特此并入)。
[0050] 蛋白质或氨基酸序列的“亲水指数”是代表其平均亲水特性或疏水特性的数字。负亲水指数定义了目标氨基酸序列的亲水性。亲水指数与目标氨基酸序列的亲水性成正比;因此,所述指数越负,目标氨基酸序列的亲水性越大。在某些实施方案中,上述添加的亲水性氨基酸序列的亲水指数小于0、-0.4、-0.9、-1.3、-1.6、-3.5、-3.9或-4.5。在某些实施方案中,所得的整个肽的亲水指数将小于0.7、0.3、0.2、0.1或0.0,优选小于-0.1、-0.2、-
0.3、-0.4,更优选小于-0.5、-0.6、-0.7、-0.8、-0.9或-1.0。
[0051] 在本发明的肽中,对于整个肽或添加的亲水性氨基酸序列而言,有助于亲水性亲水指数的氨基酸包括Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、His(H)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)和Trp(W)。其中,Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)或其变体是优选的。示例性的变体包括对于Glu的g-谷氨酸和对于Asp的异天冬氨酸(或isoD)。
[0052] 如本文所用,在本发明的这一方面和其他方面,术语“疏水性氨基酸”旨在指对指定氨基酸序列的亲水指数贡献疏水性的氨基酸。对于整个肽或其特定氨基酸序列而言,有助于疏水性亲水指数的氨基酸包括Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、Cys(C)、Met(M)和Ala(A)。在某些实施方案中,术语“疏水性氨基酸”可以指Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)、Cys(C)、Met(M)和Ala(A)中的任何一个;或者,可选地指Ile(I)、Val(V)、Leu(L)、Phe(F)和Ala(A)中的任何一个。在某些其他实施方案中,术语“疏水性氨基酸”可以指Ile(I)、Val(V)、Leu(L)和Phe(F)中的一个。
[0053] 如本文所用,术语“非疏水性氨基酸”旨在意指在以上确定的疏水性量表中的一个量表上为亲水性(或非疏水性)的氨基酸。该术语一般是指对整个肽或添加的亲水性氨基酸序列而言有助于亲水性亲水指数的那些氨基酸。
[0054] 在本发明的一方面,所述肽包括以下的氨基酸序列
[0055] (L/M)-X-X-(L/M)-X-X-L-(L/M)-X-(L/I)-(E/L/F)-X-X-(L/I)-X-X-X-L-(L/F)(SEQ ID NO:1),其中每个X独立地是任何氨基酸。
[0056] 该实施方案中的肽长度小于100个氨基酸、或可选地小于90个氨基酸、小于80个氨基酸、小于70个氨基酸、小于60个氨基酸、或小于约50个氨基酸。在某些实施方案中,所述肽长度为最多50个氨基酸,诸如长度在19与约50个氨基酸之间。
[0057] 在上述实施方案中,其中SEQ ID NO:1的每个X可以是任何氨基酸,在某些实施方案中这些残基在性质上是亲水性的。如上所述,这些亲水性氨基酸包括Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、His(H)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)和Trp(W)。其中,Glu(E)、Pro(P)、Ser(S)、Gln(Q)、Lys(K)、Asp(D)、Thr(T)或其变体是优选的。示例性的变体包括对于Glu的g-谷氨酸和对于Asp的异天冬氨酸(或isoD)。阳离子(带正电荷的)氨基酸(通常为R或K)的数量应限制为2,以避免在施用于植物组织时可能产生的毒性。如PCT申请公开号WO 2016/054310和WO 2016/054342(其通过引用以其整体特此并入)中所述的其他超敏蛋白衍生的生物活性肽的经验已经证明了这些残基,特别是其他亲水性氨基酸(R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G或P)的突变通常不会导致活性丧失。
[0058] 在上述实施方案中,其中SEQ ID NO:1的每个X可以是任何氨基酸,在某些实施方案中这些残基中的一个或多个在性质上是疏水性的。在这些实施方案中,疏水性残基优选为Ala(A)。
[0059] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置5处的X为Glu(E);位置6处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置9处的X选自Glu(E)、Lys(K)和Ala(A);位置12处的X选自Glu(E)和Ala(A);位置13处的X选自Glu(E)和Asp(D);位置15处的X选自Glu(E)和Thr(T);位置16处的X选自Glu(E)和Gln(Q);并且位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。在这些实施方案中,位置11处的残基可以为E;在可选实施方案中,位置11处的残基为L或F(并且不是E);在可选实施方案中,位置11处的残基为F或E(并且不是L);在可选实施方案中,位置11处的残基为F(并且不是L或E)。
[0060] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置5处的X为Glu(E);位置6处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置9处的X选自Glu(E)和Lys(K);位置12处的X为Glu(E);位置13处的X为Glu(E);位置15处的X为Glu(E);位置16处的X选自Glu(E)和Gln(Q);并且位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。在这些实施方案中,位置11处的残基可以为E;在可选实施方案中,位置11处的残基为L或F(并且不是E);在可选实施方案中,位置11处的残基为F或E(并且不是L);在可选实施方案中,位置11处的残基为F(并且不是L或E)。
[0061] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置5处的X为Glu(E);位置6处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置9处的X选自Glu(E)和Lys(K);位置12处的X选自Ala(A)和Glu(E);位置13处的X选自Asp(D)和Glu(E);位置15处的X选自Thr(T)和Glu(E);位置16处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。在这些实施方案中,位置11处的残基可以为E;在可选实施方案中,位置11处的残基为L或F(并且不是E);在可选实施方案中,位置11处的残基为F或E(并且不是L);在可选实施方案中,位置11处的残基为F(并且不是L或E)。
[0062] 根据本发明的第一方面的一组肽具有以下的氨基酸序列:(L/M)-X-X-(L/M)-E-(E/Q)-L-(L/M)-X-(L/I)-(E/L/F)-X-X-(L/I)-X-(E/Q)-X-L-(L/F)(SEQ ID NO:2),其中每个X独立地是任何氨基酸。
[0063] 在上述实施方案中,其中SEQ ID NO:2的每个X可以是任何氨基酸,在某些实施方案中这些残基在性质上是亲水性的。如上所述,这些亲水性氨基酸包括Arg(R)、Lys(K)、Asp(D)、Glu(E)、Gln(Q)、Asn(N)、His(H)、Ser(S)、Thr(T)、Gly(G)、Pro(P)、Tyr(Y)和Trp(W)。其中,Glu(E)、Pro(P)、Ser(S)、Lys(K)、Asp(D)、Thr(T)或其变体是优选的。示例性的变体包括对于Glu的g-谷氨酸和对于Asp的异天冬氨酸(或isoD)。阳离子(带正电荷的)氨基酸(通常为R或K)的数量应限制为2,以避免在施用于植物组织时可能产生的毒性。
[0064] 在上述实施方案中,其中SEQ ID NO:2的每个X可以是任何氨基酸,在某些实施方案中这些残基中的一个或多个在性质上是疏水性的。在这些实施方案中,疏水性残基优选为Ala(A)。
[0065] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置9处的X选自Glu(E)、Lys(K)和Ala(A);位置12处的X选自Glu(E)和Ala(A);位置13处的X选自Glu(E)和Asp(D);位置15处的X选自Glu(E)和Thr(T);位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。在这些实施方案中,位置11处的残基可以为E;在可选实施方案中,位置11处的残基为L或F(并且不是E);在可选实施方案中,位置11处的残基为F或E(并且不是L);在可选实施方案中,位置11处的残基为F(并且不是L或E)。
[0066] 在该实施方案中,分离的肽在溶解于水中时是稳定的;在存在pH缓冲剂和杀生物剂的情况下,在水性条件下是抗化学降解的,如上所述;和/或在水溶液中的溶解度为至少约1.0mg/ml。
[0067] 在某些实施方案中,根据SEQ ID NO:1或2的肽包含N末端处的1至20个(如1至15个)另外的氨基酸、C末端处的1至20个(如1至15个)氨基酸,或同时包含N末端处的1至20个(例如1至15个)另外的氨基酸和C末端处的1至20个(如1至15个)氨基酸。举例来说,根据SEQ ID NO:1或2的肽可以包含N末端处的1至10个另外的氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)、C末端处的1至10个另外的氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸),或同时包含N末端处的1至10个另外的氨基酸和C末端处的1至10个另外的氨基酸,如上所述。因此,此类肽的长度在20个氨基酸至最多59个氨基酸,优选最多50个氨基酸之间变化。在这些各个实施方案中,另外的氨基酸优选为如上所述的亲水性氨基酸,并且更优选为Glu(E)、Pro(P)、Gly(G)、Ser(S)、Gln(Q)、Lys(K)、Asp(D)、Thr(T)、g-谷氨酸或异天冬氨酸(isoD)。在某些实施方案中,所述肽不包含内部Lys(K)或Arg(R)残基。
[0068] 在某些实施方案中,存在N末端处的6个或更多个另外的氨基酸,以及C末端处的3个或更多个另外的氨基酸。所述另外的氨基酸优选为亲水性氨基酸,如上所述。N末端处的6个或更多个氨基酸优选包括以下的氨基酸序列:(S/A/E/G)-(G/S/E)-(E/Q)-(T/E)-(S/E)-(G/E)(SEQ ID NO:84)。C末端处的3个或更多个另外的氨基酸优选包括(G/E)-(D/E)-(Q/E)-(D/E)-(G/E)(SEQ ID NO:85)。在某些实施方案中,C末端处的最后两个氨基酸残基是任选的。
[0069] 在某些实施方案中,存在N末端处的3个或更多个另外的氨基酸,以及C末端处的1个或多个另外的氨基酸。所述另外的氨基酸优选为亲水性氨基酸,如上所述。N末端处的3个或更多个氨基酸优选包括(T/E)-(S/E)-(G/E)的氨基酸序列。C末端处的1个或多个另外的氨基酸优选包括(G/E)。在某些实施方案中,N末端处的另外的氨基酸残基是任选的。
[0070] 在下表1中鉴定了符合SEQ ID NO:1或2的共有结构的示例性的肽:
[0071] 表1:肽P12/P13(SEQ ID NO:1和2)的肽变体
[0072]
[0073]
[0074] 表1中的选择肽包括用斜体印刷指示的溶解度标记,包括SE、SEE和SEEEE(SEQ ID NO:81)以及EE和EEEE(SEQ ID NO:82);或用斜体印刷指示的切割标记,包括C末端R或K。本文还考虑了包括表1所示序列但缺乏这些特定溶解度或切割标记(或具有不同标记)的肽。
[0075] 根据本发明的第一方面的另一组肽具有以下的氨基酸序列:(L/M)-X-X-(L/M)-E-X-L-(L/M)-X-I-F-X-X-I-X-X-X-L-F(SEQ ID NO:3),其中每个X独立地是R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G、P、Y、W或A中的一个。阳离子(带正电荷的)氨基酸(通常为R或K)的数目应限制为2,以避免在施用于植物组织时可能产生的毒性。
[0076] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置6处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置9处的X选自Glu(E)和Lys(K);位置12处的X选自Glu(E)和Ala(A);位置13处的X选自Glu(E)和Asp(D);位置15处的X选自Glu(E)和Thr(T);位置16处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。
[0077] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置6处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置9处的X选自Glu(E)和Lys(K);位置12处的X为Glu(E);位置13处的X为Glu(E);位置15处的X为Glu(E);位置16处的X选自Glu(E)和Gln(Q);并且位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。
[0078] 在某些实施方案中,位置2处的X选自Glu(E)和Ser(S);位置3处的X选自Glu(E)和Pro(P);位置6处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置9处的X选自Glu(E)和Lys(K);位置12处的X选自Ala(A)和Glu(E);位置13处的X选自Asp(D)和Glu(E);位置15处的X选自Thr(T)和Glu(E);位置16处的X选自Glu(E)和Gln(Q);位置17处的X选自Glu(E)和Ser(S)。
[0079] 在某些实施方案中,根据SEQ ID NO:3的肽包含N末端处的1至20个(如1至15个)另外的氨基酸、C末端处的1至20个(如1至15个)氨基酸,或同时包含N末端处的1至20个(例如1至15个)另外的氨基酸和C末端处的1至20个(如1至15个)氨基酸。举例来说,根据SEQ ID NO:3的肽可以包含N末端处的1至10个另外的氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸)、C末端处的1至10个另外的氨基酸(如1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个氨基酸),或同时包含N末端处的1至10个另外的氨基酸和C末端处的1至10个另外的氨基酸,如上所述。因此,此类肽的长度在20个氨基酸至最多59个氨基酸,优选最多50个氨基酸之间变化。在这些各个实施方案中,另外的氨基酸优选为如上所述的亲水性氨基酸,并且更优选为Glu(E)、Pro(P)、Gly(G)、Ser(S)、Gln(Q)、Lys(K)、Asp(D)、Thr(T)、g-谷氨酸或异天冬氨酸(isoD)。在某些实施方案中,所述肽不包含内部Lys(K)或Arg(R)残基。
[0080] 在某些实施方案中,存在N末端处的6个或更多个另外的氨基酸,以及C末端处的3个或更多个另外的氨基酸。所述另外的氨基酸优选为亲水性氨基酸,如上所述。N末端处的6个或更多个氨基酸优选包括以下的氨基酸序列:(S/A/E/G)-(G/S/E)-(E/Q)-(T/E)-(S/E)-(G/E)(SEQ ID NO:84)。C末端处的3个或更多个另外的氨基酸优选包括(G/E)-(D/E)-(Q/E)-(D/E)-(G/E)(SEQ ID NO:85)。在某些实施方案中,C末端处的最后两个氨基酸残基是任选的。
[0081] 在某些实施方案中,存在N末端处的3个或更多个另外的氨基酸,以及C末端处的1个或多个另外的氨基酸。所述另外的氨基酸优选为亲水性氨基酸,如上所述。N末端处的3个或更多个氨基酸优选包括(T/E)-(S/E)-(G/E)的氨基酸序列。C末端处的1个或多个另外的氨基酸优选包括(G/E)。在某些实施方案中,N末端处的另外的氨基酸残基是任选的。
[0082] 在下表2中鉴定了符合SEQ ID NO:3的共有结构的示例性的肽:
[0083] 表2:肽P12/P13(SEQ ID NO:3)的肽变体
[0084]
[0085]
[0086] 表1中的选择肽包括用斜体印刷指示的溶解度标记,包括SE、SEE和SEEEE(SEQ ID NO:81)以及EE和EEEE(SEQ ID NO:82);或用斜体印刷指示的切割标记,包括C末端R或K。本文还考虑了包括表1所示序列但缺乏这些特定溶解度或切割标记(或具有不同标记)的肽。
[0087] 根据本发明的第一方面的另一组肽具有以下的氨基酸序列:T-S-G-(L/M)-S-P-(L/M)-E-Q-L-(L/M)-K-I-F-A-D-I-T-Q-S-L-F(SEQ ID NO:4)。
[0088] 在下表3中鉴定了符合SEQ ID NO:4的共有结构的示例性的肽:
[0089] 表3:肽P12/P13(SEQ ID NO:4)的肽变体
[0090]
[0091] 在某些实施方案中,所述肽包含相对于以下相应的野生型氨基酸序列的一个或多个突变:
[0092] QTGDDSLSGAGQTSGMSPMEQLMKIFADITQSLFGDQDG(SEQ ID NO:5),
[0093] 所述野生型氨基酸序列对应于斯氏泛菌(Pantoea stewartii)的HrpN蛋白的氨基酸残基123-161(所述斯氏泛菌先前是欧文氏菌属的成员,序列详细地描述于Frederick等人,Mol Plant Microbe Interact.14(10):1213-22(2001)中,上述文献通过引用以其整体特此并入)。除了全长382个aa的HrpN蛋白在其N末端和C末端中的一个或两个末端处的截短以外,这一个或多个突变还包括相对于SEQ ID NO:5的一个或多个缺失或取代。在某些实施方案中,相对于包含SEQ ID NO:5的相应野生型氨基酸序列或由其组成的多肽,所述一个或多个突变改善了分离的肽在水溶液中的溶解度、稳定性和/或抗化学降解性。在该实施方案中,分离的肽在溶解于水中时是稳定的;在存在pH缓冲剂和杀生物剂的情况下,在水性条件下是抗化学降解的,如上所述;和/或在水溶液中的溶解度为至少约1.0mg/ml。
[0094] 本发明的分离的肽也可以呈现为融合肽的形式,所述融合肽另外包含经由肽键与本发明的肽偶联的第二氨基酸序列。所述第二氨基酸序列可以是纯化标记,诸如聚组氨酸(His6-)、谷胱甘肽-S-转移酶(GST-)或麦芽糖结合蛋白(MBP-),所述纯化标记有助于纯化但稍后可以去除,即在回收后从肽上切割。可以在纯化标记与所需肽之间引入蛋白酶特异性切割位点或化学特异性切割位点(即,以可切割的接头序列的形式)。蛋白酶特异性切割位点在文献中是公知的,并且包括但不限于肠激酶特异性切割位点(Asp)4-Lys(SEQ ID NO:54),其在赖氨酸后被切割;因子Xa特异性切割位点Ile-(Glu或Asp)-Gly-Arg(SEQ ID NO:55),其在精氨酸后被切割;胰蛋白酶特异性切割位点,其在Lys和Arg之后切割;以及GenenaseTM I特异性切割位点Pro-Gly-Ala-Ala-His-Tyr(SEQ ID NO:56)。化学物质及其特异性切割位点包括但不限于溴化氰(CNBr),其在甲硫氨酸(Met)残基处切割;BNPS粪臭素,其在色氨酸(Trp)残基处切割;甲酸,其在天冬氨酸-脯氨酸(Asp-Pro)肽键处切割;羟胺,其在天冬酰胺-甘氨酸(Asn-Gly)肽键处切割;以及2-硝基-5-硫氰基苯甲酸(NTCB),其在半胱氨酸(Cys)残基处切割(参见Crimmins等人,“Chemical Cleavage of Proteins in Solution,”Curr.Protocol.Protein Sci.,第11章:第11.4节(2005),其通过引用以其整体特此并入)。为了使用这些切割方法中的一种,可能需要通过突变从所需的肽序列中去除不需要的切割位点。例如,所述肽序列可以包含C末端处的精氨酸或赖氨酸残基,并且也可以使任何赖氨酸或精氨酸残基改变为E、D、S、T、A、G、N、Q(优选地)或从肽序列中消除不需要的胰蛋白酶切割位点的任何其他氨基酸。因此,P13-18(SEQ ID NO:24)和P13-19(SEQ ID NO:25)是衍生自P12的突变序列,其中赖氨酸残基突变为谷氨酸或丙氨酸。包括该序列的肽可以通过由赖氨酸或精氨酸残基分隔开的P13-18的串联重复序列的胰蛋白酶介导的切割来产生。胰蛋白酶介导的切割后的残留肽将含有这个切割位点处的赖氨酸或精氨酸残基,这通过例如P13-20(SEQ ID NO:26)、P13-21(SEQ ID NO:27)和P13-22(SEQ ID NO:28)来说明。当设计用胰蛋白酶切割的肽时,应注意在切割位点附近引入带负电荷的残基的溶解度标记。已显示切割位点R或K与带负电荷的氨基酸之间的离子配对降低了胰蛋白酶切割的效率,如通过以下文献所述: 等人,Analytical Chemistry 87:7636-43(2015),上述文献通过引用以其整体特此并入。
[0095] 本发明的分离的肽也可以呈现为融合肽的形式,所述融合肽包含通过接头序列连接在一起的本发明的多个肽序列,所述接头序列可以采用或可以不采用上述类型的可切割氨基酸序列的形式。此类多聚体融合多肽可以包含或可以不包含纯化标记。在一个实施方案中,每个单体序列可以包含通过第一可切割的肽序列与本发明的肽连接的纯化标记;并且几个单体序列可以通过第二可切割的肽序列与相邻的单体序列连接。因此,在多聚体融合多肽表达后,即在宿主细胞中,可以用有效切割第二可切割肽序列的蛋白酶或化学物质处理回收的融合多肽,从而释放含有纯化标记的单个单体肽序列。在亲和纯化后,可以使用有效切割第一可切割肽序列的蛋白酶或化学物质处理回收的单体肽序列,从而从目标肽释放纯化标记。可以使用凝胶过滤和/或HPLC进一步纯化所述目标肽,如下文所述。
[0096] 根据一种方法,可以通过标准的肽合成操作来合成本发明的肽。这些包括可在自动化固相肽合成仪器上进行的FMOC(9-芴基甲氧基羰基)和tBoc(叔丁氧基羰基)合成方案,所述自动化固相肽合成仪器包括但不限于Applied Biosystems 431A、433A合成仪和Peptide Technologies Symphony或大规模Sonata或CEM Liberty自动化固相肽合成仪。也考虑了使用可选肽合成仪器。使用固相合成制备的肽以基本上纯的形式回收。
[0097] 也可以通过使用重组表达系统来制备本发明的肽,然后分离和纯化重组制备的肽。通常,这涉及将编码核酸分子插入与所述分子异源(即通常不存在所述分子)的表达系统中。可以将编码本发明的肽的一种或多种所需的核酸分子插入载体中。将异源核酸分子以相对于启动子以及任何其他5'和3'调节分子的适当有义(5'-3')方向和正确阅读框插入表达系统或载体中。
[0098] 下表4包含在代表性细菌和植物宿主中表达的代表性核苷酸序列:
[0099] 表4
[0100]
[0101] 了解了本文列出的编码的氨基酸序列和所需的转基因生物后,只需常规技能就可以产生另外的密码子优化的DNA序列和RNA序列。
[0102] 本发明的肽或融合多肽通过DNA构建体的表达(包括转录和翻译)可以在表达水平、表达发生的一种或多种组织类型和/或表达的发展阶段方面进行调节。许多异源调节序列(例如,启动子和增强子)可用于控制DNA构建体在植物中的表达。这些包括组成型、诱导型和调控型启动子,以及以组织或时间特异性方式控制表达的启动子和增强子。示例性组成型启动子包括覆盆子E4启动子(美国专利号5,783,393和5,783,394,其各自均通过引用以其整体特此并入)、胭脂合酶(NOS)启动子(Ebert等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)84:5745-5749(1987),其通过引用以其整体特此并入)、章鱼碱合酶(OCS)启动子(其被携带在根癌土壤杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的肿瘤诱导的质粒上)、花椰菜花叶病毒组启动子诸如花椰菜花叶病毒(CaMV)19S启动子(Lawton等人,Plant Mol.Biol.9:315-324(1987),其通过引用以其整体特此并入)和CaMV 35S启动子(Odell等人,Nature 313:810-
812(1985),其通过引用以其整体特此并入)、玄参花叶病毒35S启动子(美国专利号5,378,
619,其通过引用以其整体特此并入)、来自核糖-1,5-二磷酸羧化酶的小亚基
(ssRUBISCO)的光诱导的启动子、Adh启动子(Walker等人,Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)84:
6624-6628(1987),其通过引用以其整体特此并入)、蔗糖合酶启动子(Yang等人,
Proc.Natl.Acad.Sci.(美国)87:4144-4148(1990),其通过引用以其整体特此并入)、R基因复合物启动子(Chandler等人,Plant Cell 1:1175-1183(1989),其通过引用以其整体特此并入)、叶绿素a/b结合蛋白基因启动子、CsVMV启动子(Verdaguer等人,Plant Mol Biol.,
37:1055-1067(1998),其通过引用以其整体特此并入)以及甜瓜肌动蛋白启动子(PCT公开号WO 00/56863,其通过引用以其整体特此并入)。示例性组织特异性启动子包括番茄E4和E8启动子(美国专利号5,859,330,其通过引用以其整体特此并入)和番茄2AII基因启动子(Van Haaren等人,Plant Mol Bio.,21:625-640(1993),其通过引用以其整体特此并入)。
[0103] 在一个优选的实施方案中,DNA构建体的表达受来自基因的调节序列的控制,所述基因的表达与早期种子和/或胚胎发育有关。实际上,在优选的实施方案中,使用的启动子是种子增强的启动子。此类启动子的实例包括来自诸如以下的基因的5'调节区:油菜籽蛋白(Kridl等人,Seed Sci.Res.1:209:219(1991),其通过引用以其整体特此并入)、球蛋白(Belanger和Kriz,Genet.129:863-872(1991)、GenBank登录号L22295,其各自均通过引用以其整体特此并入)、γ玉米醇溶蛋白Z 27(Lopes等人,Mol Gen Genet.247:603-613(1995),其通过引用以其整体特此并入)、L3油质蛋白启动子(美国专利号6,433,252,其通过引用以其整体特此并入)、菜豆球蛋白(Bustos等人,Plant Cell 1(9):839-853(1989),其通过引用以其整体特此并入)、arcelin5(美国申请公开号2003/0046727,其通过引用以其整体特此并入)、大豆7S启动子、7Sa启动子(美国申请公开号2003/0093828,其通过引用以其整体特此并入)、大豆7Sαβ伴大豆球蛋白启动子、7Sα启动子(Beachy等人,EMBO J.4:3047(1985);Schuler等人,Nucleic Acid Res.10(24):8225-8244(1982),其各自均通过引用以其整体特此并入)、大豆胰蛋白酶抑制剂(Riggs等人,Plant Cell 1(6):609-621(1989),其通过引用以其整体特此并入)、ACP(Baerson等人,Plant Mol.Biol.,22(2):255-
267(1993),其通过引用以其整体特此并入)、硬脂酰-ACP去饱和酶(Slocombe等人,Plant Physiol.104(4):167-176(1994),其通过引用以其整体特此并入)、大豆的β-伴大豆球蛋白a'亚基(Chen等人,Proc.Natl.Acad.Sci.83:8560-8564(1986),其通过引用以其整体特此并入)、蚕豆(Vicia faba)USP(美国申请公开号2003/229918,其通过引用以其整体特此并入)和玉米L3油质蛋白启动子(Hong等人,Plant Mol.Biol.,34(3):549-555(1997),其通过引用以其整体特此并入)。
[0104] 可以使用例如亚磷酰胺法和衍生自保护的2'-脱氧核苷的亚磷酰胺构建,经由固相合成来制备编码本发明的肽的核酸分子。为了获得所需的寡核苷酸,将构建块以产物序列所需的顺序与正在增长的寡核苷酸链顺序地偶联。链组装完成后,将产物从固相释放到溶液中,脱保护,收集并通常使用HPLC纯化。固相合成的限制适合于制备长度最多约200nt的寡核苷酸,所述寡核苷酸编码约65个氨基酸或更少氨基酸的肽。可将合成的寡核苷酸的末端设计为包含特异性限制酶切位点,以促进合成的寡核苷酸连接至表达载体中。
[0105] 对于更长的肽,可经由固相合成制备寡核苷酸,然后使用多种技术将合成的寡核苷酸序列连接在一起。制造完整合成基因的重组技术综述于例如以下文献中:Hughes等人,“Chapter Twelve–Gene Synthesis:Methods and Applications,”Methods in Enzymology 498:277-309(2011),上述文献通过引用以其整体特此并入。
[0106] 本发明的合成寡核苷酸包括D和L对映体形式的DNA和RNA,以及它们的衍生物(包括但不限于2'-氟-、2'-氨基、2'O-甲基、5'-碘和5'-溴修饰的多核苷酸)。含有经修饰的核苷酸的核酸(Kubik等人,“Isolation and Characterization of 2'fluoro-,2'amino-,and 2'fluoro-amino-modified RNA Ligands or Human IFN-gamma that Inhibit Receptor Binding,”J.Immunol.159:259-267(1997);Pagratis等人“, Potent 2'-amino,and 2'-fluoro-2'-deoxy-ribonucleotide RNA Inhibitors of Keratinocyte Growth Factor,”Nat.Biotechnol.15:68-73(1997),其各自均通过引用以其整体特此并入)和天然D-核酸的对映体L-核酸(有时称为 Klussmann等人,“Mirror-image RNA that Binds D-adenosine,”Nat.Biotechnol.14:1112-1115(1996)和Williams等人,“Bioactive and  nuclease-resistant L-DNA  Ligand  of  Vasopressin,”
Proc.Natl.Acad.Sci.USA 94:11285-11290(1997),其各自均通过引用以其整体特此并入)以及非天然碱基用于增强生物稳定性。另外,可以将糖-磷酸骨架用肽骨架替代,形成肽核酸(PNA),可以使用其他天然或非天然糖(例如2'-脱氧核糖),或者可以使用硫代磷酸酯或二硫代磷酸酯代替磷酸二酯键。还考虑了使用核酸(LNA)。这些核酸分子可用于多种目的,包括以裸露的寡核苷酸的形式施用于植物或植物种子,或用于编码寡核苷酸的体外翻译以供产生本发明的肽。
[0107] 一旦选择了合适的表达载体,就可以使用本领域中标准的克隆程序将所需的核酸序列克隆到载体中,如通过以下文献所述:Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Springs Laboratory,冷泉港,纽约(1989)或Cohen和Boyer的美国专利号4,237,224,这些文献通过引用以其整体特此并入。然后将载体引入到合适的宿主中。
[0108] 可以使用多种宿主载体系统来重组表达本发明的肽。首先,载体系统必须与所使用的宿主兼容。宿主载体系统包括但不限于以下项:用噬菌体DNA、质粒DNA或粘粒DNA转化的细菌;微生物诸如含酵母载体的酵母;病毒(例如痘病毒、腺病毒等)感染的哺乳动物细胞系统;病毒(例如杆状病毒)感染的昆虫细胞系统;和土壤杆菌属(Agrobacterium)感染的植物细胞。这些载体的表达元件的强度和特异性不同。取决于所使用的宿主载体系统,可以使用许多合适的转录和翻译元件中的任何一种来执行本发明的这一方面和其他方面。
[0109] 可以通过几种方法获得纯化的肽。所述肽是通过常规技术优选以纯化形式(优选至少约80%或85%纯、更优选至少约90%或95%纯)产生的。取决于是否使重组宿主细胞将肽分泌到生长培养基中(参见Bauer等人的美国专利号6,596,509,其通过引用以其整体特此并入),所述肽可以通过离心(以从含有分泌的肽的上清液分离细胞组分)然后对上清液进行连续的硫酸铵沉淀来分离和纯化。使含有所述肽的级分在适当大小的葡聚糖或聚丙烯酰胺柱中进行凝胶过滤,以使所述肽与其他蛋白质分离。如果需要的话,可以通过HPLC进一步纯化肽级分。
[0110] 可选地,如果没有分泌目标肽,则可以使用标准分离和纯化方案将目标肽从重组细胞分离出来。这包括破坏细胞(例如,通过超声处理、冷冻、弗氏压碎器(French press)等),然后从细胞碎片回收所述肽。可以使用上述离心、沉淀和纯化程序来实现纯化。如上所述使用纯化标记可以简化此过程。
[0111] 在某些实施方案中,不需要纯化。在不进行纯化的情况下,则可在离心去除细胞碎片后回收无细胞的裂解物。所得的无细胞裂解物可以加热处理足够长的时间量(例如在100℃下加热处理10min)以使回收级分中的任何天然蛋白酶失活。如果需要的话,可以将杀生物剂、蛋白酶抑制剂和非离子表面活性剂中的一种或多种引入到这种无细胞制剂中(参见Wei的美国申请公开号20100043095,其通过引用以其整体特此并入)。
[0112] 一旦回收本发明的肽,它们就可以用于制备组合物,所述组合物包含载体和选自由以下组成的组的一种或多种添加剂:杀菌剂或杀生物剂、蛋白酶抑制剂、非离子表面活性剂、肥料除草剂杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂生物接种剂、植物调节剂及其混合物。
[0113] 在某些实施方案中,所述组合物包含大于约1nM的肽、大于约10nM的肽、大于约20nM的肽、大于约30nM的肽、大于约40nM的肽、大于约50nM的肽、大于约60nM的肽、大于约
70nM的肽、大于约80nM的肽、大于约90nM的肽、大于约100nM的肽、大于约150nM的肽、大于约
200nM的肽、或大于约250nM的肽。在某些实施方案中,所述组合物包含少于约1nM的肽。例如,某些肽可以以少于约2ng/ml、少于约1.75ng/ml、少于约1.5ng/ml、少于约1.25ng/ml、少于约1.0ng/ml、少于约0.75ng/ml、少于约0.5ng/ml、少于约0.25ng/ml、或甚至少于约
0.1ng/ml的浓度存在。
[0114] 合适的载体包括水、任选含有一种或多种共溶剂的水溶液、浆料和固体载体粒子。示例性的固体载体包括矿物土(诸如酸盐、硅胶、滑石、高岭土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白石、硅藻土、硫酸硫酸镁、氧化镁、研磨的合成材料),和蔬菜起源的产品(诸如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉、纤维素粉、淀粉和淀粉衍生物)以及其他单糖、二糖和多糖。
[0115] 合适的肥料包括但不限于硫酸铵、磷酸铵、硝酸铵、尿素及其组合。
[0116] 合适的杀虫剂包括但不限于:新烟碱种类的成员,诸如吡虫啉、噻虫胺和噻虫嗪;有机磷酸酯种类的成员,诸如毒死蜱和拉硫磷;拟除虫菊酯种类的成员,诸如苄氯菊酯;
其他天然杀虫剂,诸如尼古丁、去甲烟碱和除虫菊酯;氨基甲酸酯种类的成员,诸如涕灭威、呋喃丹和西维因;大环内酯种类的成员,诸如各种阿巴克丁(abamectin)、阿维菌素(avermectin)和伊维菌素产品;二酰胺种类的成员,诸如氯虫酰胺、氰虫酰胺和氟虫双酰胺;几丁质合成抑制剂,特别是苯甲酰脲种类的那些,诸如氯芬奴隆和二氟苯隆;及其任何组合,包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种杀虫剂的组合。另外的杀虫剂列于杀有害生物剂常用名称简表(Compendium of Pesticide Common Names)中,所述杀有害生物剂常用名称简表是由Alan Wood操作的数据库并以电子形式提供于alanwood.net互联网网站上。
[0117] 合适的杀真菌剂包括但不限于嗜球果伞素种类的成员,诸如嘧菌酯、唑菌胺酯、肟菌酯、啶氧菌酯和氟嘧菌酯;三唑种类的成员,诸如种菌唑、叶菌唑、戊唑醇、灭菌唑、氟醚唑、苯醚甲环唑、粉唑醇、丙环唑和丙硫菌唑;琥珀酸脱氢酶抑制剂种类的成员,诸如萎锈灵、氟唑菌酰胺、啶酰菌胺、氟唑环菌胺和苯丙烯氟菌唑(Syngenta的SolatenolTM);苯基酰胺种类的成员,诸如甲霜灵、精甲霜灵、苯霜灵和oxadiyxl;苯基吡咯种类的成员,诸如咯菌腈;邻苯二甲酰亚胺种类的成员,诸如克菌丹;二硫代氨基甲酸酯种类的成员,诸如代森锰锌和福美双;苯并咪唑种类的成员,诸如噻菌灵;杀真菌植物刺激剂,诸如活化酯;无机杀真菌剂,诸如化合物(尤其是氢氧化铜)和元素硫;及其任何组合,包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种杀真菌剂的组合。另外的杀真菌剂列于杀有害生物剂常用名称简表(Compendium of Pesticide Common Names)中,所述杀有害生物剂常用名称简表是由Alan Wood操作的数据库并以电子形式提供于alanwood.net互联网网站上。
[0118] 合适的杀线虫剂包括但不限于氨基甲酸酯种类的化学物质,诸如涕灭威、涕灭砜威、草氨酰、呋喃丹和cleothocarb;以及有机磷酸酯种类的化学物质,诸如虫线磷、灭线磷、苯线磷、丰索磷、特丁磷、氯唑磷和ebufos。另外的杀线虫剂列于杀有害生物剂常用名称简表(Compendium of Pesticide Common Names)中,所述杀有害生物剂常用名称简表是由Alan Wood操作的数据库并以电子形式提供于alanwood.net互联网网站上。
[0119] 合适的杀细菌剂包括但不限于基于双氯酚和苄醇半缩甲(来自ICI的 或来自Thor Chemie的 RS和来自Rohm&Haas的 MK)以及异噻唑啉酮衍生
物诸如烷基异噻唑啉酮和苯并异噻唑啉酮(来自Thor Chemie的 MBS;来自ICI的
GXL)的杀细菌剂。另外的杀细菌剂列于杀有害生物剂常用名称简表(Compendium of Pesticide Common Names)中,所述杀有害生物剂常用名称简表是由Alan Wood操作的数据库并以电子形式提供于alanwood.net互联网网站上。
[0120] 合适的接种剂包括但不限于慢生根瘤菌属物种(Bradyrhizobium spp.)(特别是大豆慢生根瘤菌(Bradyrhizobium japonicum,BASF  产品))、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、坚硬芽孢杆菌(Bacillus firmus)、短小芽孢杆菌(Bacillus pumilis)、利迪链霉菌(Streptomyces lydicus)、木霉属物种(Trichoderma spp.)、巴斯德氏菌属物种(Pasteuria spp.)、根瘤菌细胞的其他培养物(BASF  和
)及其任何组合,包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种接种剂的
组合。接种剂如下文所述在性质上可以是重组的,以促进本发明的多肽的表达和任选的分泌。可选地,这些接种剂可以是不能表达/分泌本发明的多肽的其他可商购形式。
[0121] 植物调节剂是刺激或抑制植物生化信号传导的天然或合成的化学物质。这些通常但并非唯一地被细胞表面上的受体所识别,从而在细胞中引起一系列反应。合适的植物调节剂包括但不限于乙烯利;乙烯;水杨酸;乙酰水杨酸;茉莉酸;茉莉酸甲酯;二氢茉莉酮酸甲酯;几丁质;壳聚糖;脱落酸;任何生长素化合物或抑制剂,包括但不限于(4-氯苯氧基)乙酸、(2,4-二氯苯氧基)乙酸和2,3,5-三碘苯甲酸;任何细胞分裂素,包括但不限于激动素和玉米素;赤霉素;芸苔素内酯;及其任何组合,包括两种或更多种、三种或更多种或四种或更多种调节剂的组合。
[0122] 其他合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、涂层剂和研磨剂。这些材料可用于促进根据本发明的组合物的施用。另外,所述组合物可以与其他常规种子配制品和处理材料(包括粘土和多糖)一起施用于植物种子。
[0123] 用于植物种子处理的组合物或系统包括:本发明的一种或多种肽,优选但不唯一地是P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种与一种或多种杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、其他接种剂或其他植物调节剂(包括多种杀虫剂或多种杀线虫剂、多种杀真菌剂、多种其他接种剂或多种植物调节剂的组合)的组合。用于这些组合处理的合适的杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、接种剂和植物调节剂包括上文鉴定的那些。这些组合物在种子处理时以单一组合物的形式存在。相比之下,用于种子处理的系统可以涉及多种处理,例如,在一种处理中使用含有所述肽的组合物以及在单独的处理中使用含有所述一种或多种杀虫剂、杀线虫剂、杀真菌剂、植物调节剂和/或杀细菌剂的组合物。在后一个实施方案中,这两种处理都大约在同一时间进行,即在种植之前或大约在种植时进行。
[0124] 一个这种实例包括本发明的一种或多种肽(包括(但不限于)P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种)与可从Bayer Crop Science得到的PonchoTM(噻虫胺)、可从Bayer Crop Science得到的PonchoTM VOTiVO(噻虫胺和坚硬芽孢杆菌生物杀线虫剂)和可从Bayer Crop Science得到的GauchoTM(吡虫啉)的组合。
[0125] 另一个实例包括本发明的一种或多种肽(包括(但不限于)P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种)与可从Syngenta得到的CruiserTM(噻虫嗪)、可从Syngenta得到的CruiserMaxxTM(噻虫嗪、精甲霜灵和咯菌腈(fludioxynil))、可从Syngenta得到的Cruiser ExtremeTM(噻虫嗪、精甲霜灵、咯菌腈和嘧菌酯)、可从Syngenta得到的AvictaTM(噻虫嗪和阿巴克丁)以及可从Syngenta得到的AvictaTM Complete(噻虫嗪、阿巴克丁和含有Pasteuria nishizawae(Pn1生物接种剂)的Clariva CompleteTM)和可从Syngenta得到的Avicta CompleteTM Corn(噻虫嗪、精甲霜灵、咯菌腈、嘧菌酯、噻菌灵和阿巴克丁)的组合。
[0126] 另一个实例包括本发明的一种或多种肽(包括(但不限于)P12、P13-12、P13-14、P13-20、P13-3、P13-4、P13-5、P13-7、P13-s14和P13-s15(SEQ ID NO:5、18、20、26、9、10、11、13、83和84)中的一种)与可从BASF得到的Vault Liquid plus Integral(慢生根瘤菌属物种和枯草芽孢杆菌菌株MBI 600接种剂)、可从BASF得到的Vault NP(大豆慢生根瘤菌接种剂)以及可从BASF得到的Subtilex NG(枯草芽孢杆菌生物接种剂)的组合。
[0127] 作为使用肽或组合物将本发明的肽施用于植物的可选方案,还考虑了使用重组宿主细胞将所述肽递送至植物或植物种子或者植物种子在土壤中所种植的场所(以及成熟植物生长的场所)。因此,本发明的另一个方面包括一种重组宿主细胞,其包括含有与编码本发明的肽或融合多肽的核酸分子可操作地偶联的启动子有效核酸分子的转基因,其中所述重组宿主细胞是微生物,所述微生物赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的植物以第一种益处,并且所述肽或融合多肽赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的所述植物以第二种益处。
[0128] “宿主细胞”是在宿主细胞的基因组中或在从宿主细胞的基因组自主复制的染色体外载体中含有主题重组核酸的细胞。宿主细胞可以是任何细胞类型。
[0129] 在各个实施方案中,提供了包含主题重组核酸的宿主细胞。所述宿主细胞可以是任何细胞类型,但是优选为微生物,例如细菌或真菌(诸如非丝状真菌或丝状真菌)宿主细胞。
[0130] 在某些实施方案中,所述微生物是有益微生物,其赋予在存在所述微生物的情况下生长的植物以益处。重组有益微生物也赋予在存在所述微生物的情况下生长的植物以益处,但是由于存在重组多核苷酸,重组有益微生物还表达肽或融合多肽,所述肽或融合多肽赋予在存在所述重组微生物的情况下生长的植物以第二种益处。
[0131] 术语“丝状真菌”是指真菌亚(subdivision Eumycotina)的所有丝状形式(参见Alexopoulos,C.J.,INTRODUCTORY MYCOLOGY,Wiley,纽约(1962),其通过引用以其整体特此并入)。这些真菌的特征是营养菌丝体,其细胞壁由几丁质、葡聚糖和其他复合多糖组成。本发明的丝状真菌在形态、生理和遗传上与酵母不同。丝状真菌的营养生长是通过菌丝延长而实现的,并且分解代谢是专性需氧的。
[0132] 在某些实施方案中,所述有益微生物是细菌。
[0133] 有益微生物执行许多有用的活动,这综述于以下文献中:Glick,“Plant Growth-Promoting Bacteria:Mechanisms and Applications,”Scientifica,Article ID963401(2012),上述文献通过引用以其整体特此并入。有益微生物可以为植物提供营养。这可以通过固氮过程以氨基酸和其他含氮化合物的形式出现。有益微生物还可以从土壤中无法得到的矿床释放出磷酸盐并使其可利用。例如,细菌可以合成载体,所述铁载体结合并溶解无法得到的铁矿床。这些铁-铁载体复合物可以被植物吸收。微生物可以产生植物信号传导激素的类似物,所述类似物刺激生长并减少胁迫信号传导。最后,有益微生物可以通过去除包括铁在内的资源以及合成抗生素化合物来与病原生物竞争。有益微生物可能会表现出其他行为,而不限于上文列出的行为。有益生物分类为附生植物的(生活在植物组织表面上或附近)或内生植物的(生活在植物组织内)。
[0134] 合适的有益细菌包括但不限于假单胞菌属(例如,荧光假单胞菌(P.fluorescens)、金色假单胞菌(P.aureofaciens)、绿针假单胞菌(P.chlororaphis)、青枯假单胞菌(P.solanacearum)和丁香假单胞菌(P.syringae))、鞘氨醇单胞菌属
(Sphingomonas)(例如,叶际鞘氨醇单胞菌(S.phyllosphaerae)、玫瑰黄鞘氨醇单胞菌(S.roseiflava)、瓜类鞘氨醇单胞菌(S.melonis)、S.azotifigens和苹果鞘氨醇单胞菌(S.mali))(还参见Innerebner等人“, Protection of Arabidopsis thaliana Against Leaf-Pathogenic Pseudomonas syringae by Sphingomonas Strains in a Controlled Model System,”Appl.Environ.Microbiol.77:3202-3210(2011),其通过引用以其整体特此并入)、芽孢杆菌属(Bacillus)(坚硬芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、胶质芽孢杆菌(B.mucilaginous)、短小芽胞杆菌(B.pumilus)、枯草芽孢杆菌和解淀粉枯草芽孢杆菌变种(B.subtilis var.amyloliquefaciens))、链霉菌属(Streptomyces)(例如,灰绿链霉菌(S.griseoviridis)和利迪链霉菌(S.lydicus))、根瘤菌(Rhizobium)(例如,苜蓿根瘤菌(R.meliloti)、三叶草根瘤菌(R.trifolii)、豆科根瘤菌(R.leguminosarum)、菜豆根瘤菌(R.phaseolin)、固氮根瘤菌(R.lupine)和大豆根瘤菌(R.japonicum))、弗兰克氏菌属(Frankia)(例如,桤木弗兰克氏菌(F.alni))和固氮螺菌属(Azospirillum)(例如,巴西固氮螺菌(A.brasilense)和生脂固氮螺菌(A.lipoferum))。
[0135] 另外的有益细菌包括但不限于放射形土壤杆菌(Agrobacterium radiobacter)、圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum)、洋葱伯克霍尔德菌(Burkholderia cepacia)、食酸戴尔福特菌(Delfitia acidovorans)、浸麻芽孢杆菌(Paenobacillus macerans)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)和嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophilia)。
[0136] 在某些实施方案中,有益微生物可以是丝状真菌宿主细胞。在一些实施方案中,宿主细胞可以是具有用于生产蛋白质的使用历史的具有GRAS状态(即,根据FDA,公认为安全)的菌株的细胞。
[0137] 在一些实施方案中,有益的真菌微生物可以是黑曲霉(Aspergillus niger)的菌株的,所述黑曲霉的菌株包括ATCC 22342、ATCC 44733、ATCC 14331、ATCC 11490、NRRL 3112以及由其衍生的菌株。在某些实施方案中,有益真菌微生物可以是木霉属的菌株(例如哈茨木霉(T.harzianum)、绿色木霉(T.viride)、康氏木霉(T.koningi)、里氏木霉(T.reesei)和钩状木霉(T.hamatum)),所述木霉属的菌株包括RL-P37的功能等同物(Sheir-Neiss等人(1984)Appl.Microbiol.Biotechnology 20:46-53,其通过引用以其整体特此并入)。其他有用的有益真菌微生物包括但不限于NRRL 15709、ATCC 13631、ATCC 
26921(QM 9414)ATCC 32098、ATCC 32086和ATCC 56765(RUT-30)。在一些实施方案中,有益真菌微生物可以是非丝状真菌酵母的菌株,包括但不限于红酵母属(Rhodotorula)的菌株(例如,禾本红酵母(R.graminis)WP1和粘质红酵母(R.mucilaginosa))(参见美国专利号8,
728,781和Xin等人“, Characterization of Three Endophytic,Indole-3-Acetic Acid-Producing Yeasts Occurring in Populus Trees,”Mycol.Res.113:973-980(2009),这些文献通过引用以其整体特此并入)。
[0138] 在某些实施方案中,重组微生物是附生植物的。这种微生物非寄生地生活在宿主植物组织的表面上,包括但不限于在叶片表面或根附近。
[0139] 在其他实施方案中,重组微生物是内生植物的。这种微生物在其生命周期的至少一部分非寄生地生活在植物组织中,包括但不限于叶、根和茎内。
[0140] 本领域技术人员可以使用现有的质粒系统来创建肽表达系统。一项值得注意的准则是,应很好地控制肽表达的调节。植物检测到的高肽浓度可能会触发强烈的免疫应答,这伴随超敏响应的广泛细胞死亡特征。相比之下,较低的肽表达水平应刺激免疫力,同时使细胞死亡最小化。通过谨慎选择分泌序列可以进一步平衡这种作用。可以使用以下文献中描述的表达菌株和工具完成肽在荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)中的表达:Retallack等人“, Reliable protein production in a Pseudomonas fluorescens expression system,”Protein Expression and Purification 81:157-65(2012),所述文献通过引用以其整体特此并入。可以通过载体利用枯草杆菌蛋白酶(aprE)启动子系统来完成肽在枯草芽孢杆菌中的表达。这可以任选地使用信号肽来增强以指导肽在微生物外部的分泌。这些功能在可从Clontech得到的“枯草芽孢杆菌分泌蛋白表达系统”(Bacillus Subtilis Secretory Protein Expression System)手册中实现。已使用质粒展示了蛋白质在链霉菌属中的表达,如通过以下文献所述:Fernandez-Abalos等人,
“Posttranslational processing of the xylanase Xys1L from Streptomyces halstedii JM8 is carried out by secreted serine proteases,”Microbiology149:
1623-32(2003),其通过引用以其整体特此并入。本领域技术人员可以产生另外的肽表达系统。
[0141] 重组有益微生物的使用带来的益处取决于微生物的类型和由此表达的植物肽。在某些实施方案中,重组有益微生物带来的益处是为植物提供营养,产生刺激生长或减少胁迫信号传导的植物激素类似物或者与病原生物竞争。在某些实施方案中,肽或融合多肽带来的益处是改善的抗病性、生长增强、对生物胁迫源的耐受性和抗性、对非生物胁迫的耐受性、从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。可以组合使用多个不同的重组宿主细胞。
[0142] 一旦培育出工程化微生物,例如在发酵设备中,就可以将工程化微生物回收,然后提供于干燥的组合物或液体组合物或悬浮液中。对于液体组合物或悬浮液,可以将微生物混合在水或缓冲溶液中,并以喷雾处理的形式施用于植物或植物生长的场所。可选地,可以在种植种子之前将溶液用于种子处理。对于干燥的组合物,可以将微生物在有或没有惰性载体粒子的情况下干燥,并且可以将干燥的组合物施用于种子、将要种植种子或植物正在生长的场所或者直接施用于植物。
[0143] 菌落形成单位(c.f.u.)用于定量微生物。当1c.f.u.的微生物扩散到与生物相容的固体营养琼脂上并对应于一种健康的能复制的细胞时,它产生单个菌落。在干粉配制品中,微生物的浓度可以超过每克物质5 x 1010cfu。干配制品的合适浓度包括>1011、>5 x 1010、>1010、>109、>108、107或>106cfu/g。同样地,可以将微生物以液体悬浮液的形式提供。液体配制品的合适浓度包括>1010、>109、>108、>107、>106、>105cfu/ml。
[0144] 合适的载体包括水、任选含有一种或多种共溶剂的水溶液、浆料和固体载体粒子。示例性的固体载体包括矿物土(诸如硅酸盐、硅胶、滑石、高岭土、石灰石、石灰、白垩、红玄武土、黄土、粘土、白云石、硅藻土、硫酸钙、硫酸镁、氧化镁、研磨的合成材料),和蔬菜起源的产品(诸如谷物粉、树皮粉、木粉和坚果壳粉、纤维素粉、淀粉和淀粉衍生物)以及其他单糖、二糖和多糖。示例性的水溶液包括具有pH 6-8、更优选6.5至7.5的水溶液,所述水溶液含有与该范围匹配的缓冲剂。合适的缓冲剂包括但不限于柠檬酸盐、磷酸盐、碳酸盐和HEPES。然而,一些微生物可以持续以孢子形式存在,这种形式更能抵抗极端的热和pH以及延长的储存。与该孢子状态相容的示例性水溶液包括具有pH 3-8、更优选4.0-7.5的水溶液,所述水溶液含有与该范围匹配的缓冲剂。除上述缓冲剂外,合适的缓冲剂包括但不限于乙酸盐、谷氨酸盐和天冬氨酸。溶液可任选地补充有蛋白质的酶促消化物、酵母提取物和矿物营养(包括但不限于镁和铁)。
[0145] 其他合适的添加剂包括缓冲剂、润湿剂、涂层剂和研磨剂。这些材料可用于促进根据本发明的组合物的施用。
[0146] 对于液体组合物或悬浮液,可以将微生物混合在水或缓冲溶液中,并以喷雾或浸泡处理的方式施用于植物种子、植物或植物生长的场所。可选地,可以在所述场所种植种子之前、在所述场所种植种子之后、在所述场所种植一种或多种籽苗之前、在所述场所种植一种或多种籽苗之后施用溶液,或者在植物正在所述场所生长时将溶液施用于所述场所。
[0147] 对于干燥的组合物,可以将微生物在有或没有惰性载体粒子的情况下干燥,并且可以将干燥的组合物施用于种子、将要种植种子或植物正在生长的场所或者直接施用于植物。
[0148] 如下所述,重组有益微生物可用于赋予在存在所述重组有益微生物的情况下生长的植物以多种益处。这些使用涉及将重组有益微生物直接施用于植物种子、直接施用于植物上或者经由施用于将要种植种子或植物正在生长的场所而间接施用于植物上。在这些实施方案中,所述场所可以包括人工或天然土壤、聚合物生长培养基或水培生长培养基。土壤可以存在于多种环境中的任何一种中,所述多种环境包括露地、部分覆盖地、温室等。
[0149] 本发明进一步涉及赋予植物以抗病性、增强植物生长、实现有害生物防治、赋予植物以生物或非生物胁迫耐受性和/或调节植物生化信号传导的方法。根据一个实施方案,这些方法涉及将有效量的本发明的分离的肽或融合多肽、本发明的重组宿主细胞或本发明的组合物施用于植物或植物种子或者植物正在生长或预期生长的场所。作为这种施用的结果,肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物与植物或植物种子的细胞接触,并在植物或从植物种子生长的植物中诱导抗病性、生长增强、对生物胁迫的耐受性、对非生物胁迫的耐受性或改变的生化信号传导。根据可选实施方案,可以将本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物施用于植物,使得从此类植物回收的种子本身能够赋予植物以抗病性、增强植物生长、实现昆虫防治、赋予对生物胁迫或非生物胁迫的耐受性、和/或调节生化信号传导、调节成熟。
[0150] 在这些实施方案中,还可以选择施用本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物的植物或植物种子或场所。例如,对于已知含有高线虫含量的田地,可以如本文所述通过施用本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物选择性地处理要在此类田地中生长的植物或植物种子或者所述田地(场所);而对于含有低线虫含量的田地中生长的植物或植物种子,则无需进行这种处理。类似地,对于灌溉减少的田地,可以如本文所述通过施用本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物选择性地处理要在此类田地中生长的植物或植物种子或者所述田地(场所);而对于在灌溉充足的田地中生长的植物或植物种子,则无需进行这种处理。同样地,对于容易泛洪的田地,可以通过施用如本文所述的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物选择性地处理要在此类田地中生长的植物或植物种子或者所述田地(地点);而对于不易泛洪的田地中生长的植物或植物种子,则无需进行这种处理。作为这种选择的又一个实例,对于在生长季节的某些时间容易受到昆虫侵袭的田地,可以如本文所述通过施用本发明的肽、容和多肽、重组宿主细胞或组合物选择性地处理要在此类田地中生长的植物或植物种子或者所述田地(场所);而同一片田地在生长季节的无效时间可以不进行处理或者不容易受到这种攻击的其他田地可以不进行处理。当实施本文所述的每种使用方法(即赋予植物以抗病性、增强植物生长、实现有害生物(包括昆虫和线虫)防治、赋予植物以生物胁迫或非生物胁迫耐受性和/或调节植物生化信号传导)时,可以进行这样的选择步骤。
[0151] 作为将分离的肽、融合多肽、重组宿主细胞或含有它们的组合物施用于植物或植物种子以赋予植物以抗病性、实现植物生长、防治昆虫、赋予植物或从种子生长的植物以胁迫抗性和/或调节的生化信号传导的可选方案,可以使用转基因植物或植物种子。当使用转基因植物时,这涉及提供用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物,以及在有效允许该DNA分子赋予植物以抗病性、增强植物生长、防治昆虫、赋予对生物胁迫或非生物胁迫的耐受性和/或调节生化信号传导的条件下使植物生长。可选地,可以提供用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物种子并将其种植在土壤中。然后在有效允许该DNA分子表达所述肽从而赋予转基因植物以抗病性、增强植物生长、防治昆虫、赋予对生物胁迫或非生物胁迫的耐受性和/或调节生化信号传导的条件下从种植的种子繁殖植物。这种转基因方法可以与重组宿主细胞或者分离的肽或组合物的局部施用组合使用。
[0152] 本发明进一步涉及改善从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的方法。这些方法涉及将有效量的根据本发明的分离的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物施用于植物或植物正在生长的场所。作为这种施用的结果,所述肽与植物或植物种子的细胞接触并诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。可选地,可以将有效量的本发明的分离的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物或根据本发明的组合物施用于收获的果实或蔬菜。作为这种施用的结果,肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物与收获的果实或蔬菜的细胞接触,并诱导处理的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或处理的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
[0153] 作为将分离的肽、融合多肽、重组宿主细胞或含有它们的组合物施用于植物或植物种子以诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的可选方案,可以使用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时,这涉及提供用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物,并在有效允许该DNA分子诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从转基因植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从转基因植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的条件下使植物生长。可选地,可以提供用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物种子并将其种植在土壤中。然后在有效允许该DNA分子表达所述肽从而诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从转基因植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从转基因植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的条件下,从种植的种子繁殖植物。
[0154] 在这些实施方案中,还可以选择转基因植物或植物种子用于执行本发明。例如,对于已知含有高线虫含量的田地,转基因植物或植物种子可以在此类田地中选择性地生长;而非转基因植物或植物种子可以在含有低线虫含量的田地中生长。类似地,对于灌溉减少的田地,转基因植物或植物种子可以在此类田地中选择性地生长;而非转基因植物或植物种子可以在灌溉充足的田地中生长。同样地,对于容易发生泛洪的田地,转基因植物或植物种子可以在此类田地中生长;而非转基因植物或植物种子可以在不容易泛洪的田地中生长。作为这种选择的又一个实例,对于在生长季节的某些时间容易受到昆虫侵袭的田地,转基因植物或植物种子可以在此类田地中选择性地生长;而非转基因植物或植物种子可以在不容易受到这种昆虫侵袭的田地中生长。当实施本文所述的每种使用方法(即赋予植物以抗病性、增强植物生长、实现有害生物(包括昆虫和线虫)防治、赋予植物以生物胁迫或非生物胁迫耐受性和/或调节植物生化信号传导)时,可以进行这样的选择步骤。
[0155] 本发明进一步涉及改善从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的方法。这些方法涉及将有效量的根据本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物施用于植物或植物正在生长的场所。作为这种施用的结果,肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物与植物或植物种子的细胞接触,并诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。可选地,可以将有效量的根据本发明的分离的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物施用于收获的果实或蔬菜。作为这种施用的结果,肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物与收获的果实或蔬菜的细胞接触,并诱导处理的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或处理的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
[0156] 在这些实施方案中,也可以选择被施用本发明的分离的肽或组合物的植物、插条、果实、蔬菜或场所。例如,对于正在远距离运输或长时间储存的收获的插条或果实或蔬菜,则可以如本文所述通过施用本发明的分离的肽或组合物选择性地处理这些收获的插条或果实或蔬菜;而在当地运输并且旨在消费而不长时间储存的收获的插条或果实或蔬菜可以被排除在这种处理之外。
[0157] 作为将分离的肽、融合多肽、重组宿主细胞或含有它们的组合物施用于植物或植物种子以诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的可选方案,可以使用转基因植物或植物种子。当利用转基因植物时,这涉及提供用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物,并在有效允许该DNA分子诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从转基因植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从转基因植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的条件下使植物生长。可选地,可以提供用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物种子并将其种植在土壤中。然后在有效允许该DNA分子表达所述肽从而诱导从观赏植物移取的插条的抗干燥性、从转基因植物收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或从转基因植物收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命的条件下,从种植的种子繁殖植物。
[0158] 在这些实施方案中,还可以选择转基因植物或植物种子用于执行本发明。例如,当已知收获的插条或果实或蔬菜旨在于收获后远距离运输或长期储存时,可以选择转基因植物或植物种子进行生长;而当已知收获的插条或果实或蔬菜旨在当地运输和/或消费而不长期储存时,可以选择非转基因植物或植物种子进行生长。
[0159] 合适的植物包括双子叶植物和单子叶植物,所述双子叶植物和单子叶植物包括天然或基因修饰形式的农业、造林、观赏和园艺植物。示例性植物包括但不限于苜蓿、苹果、杏、芦笋、牛油果、香蕉、大麦、豆类、山毛榉(水青冈属物种(Fagus spec.))、秋海棠、桦木、黑莓、蓝莓、卷心菜、樟脑、卡诺拉、胡萝卜、蓖麻、樱桃、肉桂、柑橘、可可豆、咖啡、玉米、花、黄瓜、葫芦、桉树、冷杉、亚麻、饲料甜菜、倒挂金钟、大蒜、老鹳草、葡萄、落花生、大麻、蛇麻草、唐棣属植物、芥菜(里蕻(Brassica juncea))、黄麻、小扁豆、生菜、亚麻籽、瓜、芥(mustard)、油桃、橡树、燕麦、油棕、油菜(oil-seed rape)、橄榄、洋葱、红辣椒、豌豆、桃、梨、天竺葵、胡椒、矮牵牛、松树(松属物种(Pinus spec.))、李子、白杨(杨属物种(Populus spec.))、仁果、马铃薯、油菜(rape)、覆盆子、稻、橡胶树、黑麦、高粱、大豆、菠菜、云杉、南瓜、草莓、甜菜、甘蔗、向日葵、茶、柚木、烟草、番茄、黑小麦、草皮、西瓜、小麦和柳树(柳属物种(Salix spec.))、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、紫罗兰(Saintpaulia)、一品红、菊花、康乃馨和百日草。
[0160] 对于修饰的生化信号传导,这包括某些植物生化途径的增强和某些其他植物生化途径的减弱两者。可以根据本发明改变的生化信号传导途径包括基因表达和蛋白质产生、代谢产物的产生以及信号传导分子/次级代谢产物的产生。示例性生化信号传导途径及其修饰包括但不限于诱导一氧化氮产生、过氧化物产生和其他次级代谢产物;乙烯信号传导途径的激动剂和诱导响应乙烯的基因表达(参见Dong等人,Plant Phys.136:3628-3638(2004);Li等人,Planta 239:831-46(2014);Chang等人,PLoS One 10,e0125498(2015),其各自均通过引用以其整体特此并入);水杨酸信号传导途径的激动剂和诱导响应水杨酸的基因表达(参见Dong等人,Plant J.20:207-215(1999),其通过引用以其整体特此并入);脱落酸途径的激动剂和诱导响应脱落酸的基因表达(参见Dong等人,Planta 221:313-327(2005),其通过引用以其整体特此并入);赤霉素信号传导途径的激动剂和诱导响应赤霉素的基因表达(参见Li等人,Planta 239:831-46(2014),其通过引用以其整体特此并入);茉莉酸信号传导的拮抗剂和抑制响应茉莉酸的基因的表达(参见Dong等人,Plant Phys.136:3628-3638(2004),其通过引用以其整体特此并入);诱导蛋白酶抑制剂表达(参见Laluk和Mengiste,Plant J.68:480-494(2011);Xia等人,Chin.Sci.Bull 56:2351-2358(2011),其各自均通过引用以其整体特此并入);诱导植物组织中活性氧物质产生;诱导免疫有关肽和抗微生物肽产生,所述免疫有关肽和抗微生物肽诸如但不限于过氧化物酶、超氧化物歧化酶、几丁质酶和β-1,3-葡聚糖酶(Wang等人,J.Agric.Food Chem.59:12527-12533(2011),其通过引用以其整体特此并入);以及诱导膨胀素基因表达和产生(参见Li等人,Planta 
239:831-46(2014),其通过引用以其整体特此并入)。
[0161] 关于抗病性,可能无法赋予对于感染的绝对免疫力,但会降低疾病的严重程度并延迟症状发展。病变数、病变大小和真菌病原体的孢子形成的程度均降低。这种赋予抗病性的方法具有治疗先前无法治疗的疾病、系统性地治疗可能因成本而无法单独治疗的疾病以及避免使用传染性病原体(agent)或对环境有害的物质的潜力。
[0162] 根据本发明的赋予植物以病原体抗性的方法可用于赋予对包括病毒、细菌和真菌在内的多种病原体的抗性。通过本发明的方法可以实现尤其对以下病毒的抗性:烟草花叶病毒和番茄花叶病毒。根据本发明还可以赋予植物尤其对以下细菌的抗性:病原性假单胞菌属物种、病原性欧文氏菌属物种、病原性黄单胞菌属物种和病原性罗尔斯通氏菌属物种。通过使用本发明的方法,可使植物尤其对以下真菌具有抗性:镰刀菌属物种(Fusarium spp.)和疫霉属物种(Phytophthora spp.)。
[0163] 关于本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物用于增强植物生长的用途,可以实现多种形式的植物生长增强或促进。这可以早在植物从种子开始生长时进行,或者在植物生命的较后期进行。例如,根据本发明的植物生长包括更高的产量、增加的植物活力、增加的籽苗(即发芽后)的活力、增加的植物重量、增加的生物量、增加的每株植物的花的数量、更高的籽粒和/或果实产量、增加的所产生种子的量、增加的种子发芽百分比、提高的发芽速度、增加的植物大小、降低的植物高度(对于小麦)、更大的生物量、更多和更大的果实、更早的果实着色、更早的芽、果实和植物成熟、更多的分蘖或侧枝、更大的叶片、延迟的叶片衰老、增加的枝条生长、增加的根生长、改变的根/枝条分配、增加的蛋白质含量、增加的油含量、增加的碳水化合物含量、增加的色素含量、增加的叶绿素含量、增加的总光合作用、提高的光合作用效率、减少的呼吸(更低的O2使用)、对于减少产量的处理的补偿、增加的茎的持久性(和对茎倒伏的抗性)、增加的根的持久性(和对根倒伏的抗性)、弱光条件下更好的植物生长及其组合。作为结果,本发明为种植者提供了显著的经济效益。例如,早期发芽和早期成熟允许农作物在短生长季节原本会使其在该地点无法生长的地区生长。种子发芽百分比的提高导致提高的农作物植株密度和更有效的种子利用。更高的产量,增加的大小以及提高的生物量产生允许来自给定地块的更大创收。
[0164] 关于本发明的肽或组合物用于防治有害生物(包括但不限于作为生物胁迫源的昆虫和线虫)的用途,这种有害生物防治包括防止有害生物与已经施用本发明的肽或组合物的植物接触、防止通过摄食损伤对植物的直接损害、使有害生物离开此类植物、杀死此类植物附近的有害生物、干扰此类植物上的昆虫幼虫摄食、防止有害生物在宿主植物上定居、防止定居昆虫释放植物毒素、干扰在宿主植物上产卵等。本发明还防止随后由有害生物感染引起的对植物的疾病损害。
[0165] 本发明有效抵抗多种昆虫(生物胁迫源)。欧洲玉米螟是玉米(马牙种玉米和甜玉米)的主要有害生物,但也以包括绿豆、黄荚种菜豆和青豆以及食用大豆、胡椒、马铃薯和番茄以及许多杂草物种在内的200多种植物物种为食。损害多种蔬菜农作物的另外的昆虫幼虫摄食性有害生物包括以下有害生物:甜菜夜蛾、粉纹夜蛾、美洲棉铃虫、秋夜蛾、小菜蛾、白菜根蛆、葱蛆、种蝇、泡菜虫(瓜虫)、胡椒实蝇和番茄蠹蛾。总的来说,这组昆虫有害生物代表了全世界蔬菜生产中经济上最重要的一组有害生物。本发明还有效抵抗线虫,线虫是另一种经济上重要的生物胁迫源。大豆胞囊线虫(Soybean Cyst Nematode,Heterodera glycines)是大豆的主要有害生物。肾形线虫(肾形轮线虫(Rotylenchulus reniformis))是棉花的主要有害生物,它可以寄生另外的农作物物种,尤其是大豆和玉米。另外的线虫有害生物包括根结线虫属(Meloidogyne)的根结线虫(特别是在棉花、小麦和大麦中)、异皮线虫属(Heterodera)的谷物胞囊线虫(特别是在大豆、小麦和大麦中)、短体线虫属(Pratylenchus)的根病变线虫、粒线虫属(Anguina)的种子瘿线虫(特别是在小麦、大麦和黑麦中)以及茎线虫属(Ditylenchus)的茎线虫。其他生物胁迫源包括蛛形类、杂草及其组合。
[0166] 关于本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物用于赋予植物以非生物胁迫抗性的用途,这种非生物胁迫包括对植物生理和发育有不利影响的任何环境因素。这种环境胁迫的实例包括与气候有关的胁迫(例如,干旱、洪水、霜冻、低温、高温、强光和光线不足)、空气污染胁迫(例如,二氧化碳、一氧化碳、二氧化硫、NOx、碳氢化合物、臭氧、紫外线辐射、酸雨)、化学物质(例如,杀虫剂、杀真菌剂、除草剂、重金属)、营养胁迫(例如,肥料、微量营养素、大量营养素(特别是钾、氮衍生物和磷衍生物)的过剩或不足)和改善的对伤口的愈合响应。本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物的使用赋予植物对此类形式的环境胁迫的抗性。
[0167] 本发明的另一方面涉及本发明的肽作为安全剂与一种或多种活性剂组合(即,以一种组合物或单独的组合物的形式)用于防治水体中水生杂草的用途,如Mann的美国公开号20150218099中所述,该文献通过引用以其整体特此并入。
[0168] 本发明的又一方面涉及本发明的肽作为植物增强剂以组合物的形式用于施用于在水灌溉减少的条件下生长的植物的用途,所述组合物还包含至少一种抗氧化剂和至少一种辐射管控剂以及任选至少一种植物生长调节剂,如Rees等人的美国公开号20130116119中所述,该文献通过引用以其整体特此并入。
[0169] 当处理植物的全部或部分(包括叶、茎、根、繁殖体(例如,插条)、果实等)时,可以通过多种程序进行涉及施用肽、融合多肽或组合物的本发明的方法。这可以(但不必)涉及将肽渗透到植物中。合适的施用方法包括高压或低压喷雾、注射以及在接近进行肽施用时的叶片磨损。当处理植物种子时,根据本发明的施用实施方案,可以通过低压或高压喷雾、包被、浸渍(例如,浸泡)或注射来施用超敏响应引发剂肽或融合多肽。本领域技术人员可以设想其他合适的施用程序,只要它们能够使超敏响应引发剂融合多肽或蛋白质与植物或植物种子的细胞接触即可。一旦用本发明的肽或组合物处理过,就可以将种子种植在天然或人工土壤中,并使用常规程序栽培以产生植物。在已从根据本发明处理的种子繁殖出植物后,可以用本发明的肽或组合物的一次或多次施用来处理植物,以赋予植物以抗病性、增强植物生长、防治植物上的昆虫、赋予生物胁迫或非生物胁迫耐受性、改善移取的插条的抗干燥性、赋予收获的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性和/或收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
[0170] 在将肽以重组宿主细胞的形式施用的情况下,可以将这些微生物以包括此类有益微生物的悬浮液的水溶液形式施用,然后如上文所述通过喷雾、包被或浸渍将所述水溶液施用于植物。当处理植物种子时,根据本发明的施用实施方案,可以通过低压或高压喷雾、包被、浸渍(例如,浸泡)或注射来施用微生物。本领域技术人员可以设想其他合适的施用程序,只要它们能够使有益微生物与植物或植物种子的细胞接触即可。根据本发明的施用实施方案,可以将有益微生物以干性形式施用于植物或植物种子。举例来说,可以使用细菌或真菌产品诸如可从Chemtura得到的 HB和可从BioWorks得到的T-22TM HC来完成微生物的干性施用。一旦用本发明的微生物处理过,就可以将种子种植在天然或人工土壤中,并使用常规程序栽培以产生植物。在已从根据本发明处理的种子繁殖出植物后,可以用本发明的重组宿主细胞或本发明的肽、融合多肽或组合物的一次或多次施用来处理植物,以赋予植物以抗病性、增强植物生长、防治植物上的昆虫、赋予生物胁迫或非生物胁迫耐受性、改善移取的插条的抗干燥性、赋予收获的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性和/或收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
[0171] 可以将本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物单独地或与其他物质混合地施用于根据本发明的植物或植物种子。可选地,可以将肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物单独地施用于植物,而其他物质是在不同时间施用。
[0172] 在涉及使用转基因植物和转基因种子的本发明的可选实施方案中,不需要将本发明的肽局部施用于植物或种子。而是根据本领域熟知的程序产生用编码本发明的肽的DNA分子转化的转基因植物。可以通过使用微量移液器机械地转移重组DNA将适合于在植物中表达的载体(即,含有在植物中可操作的翻译和转录控制序列)直接显微注射到植物细胞中(Crossway,Mol.Gen.Genetics,202:179-85(1985),其通过引用以其整体特此并入)。也可以使用聚乙二醇将遗传物质转移到植物细胞中(Krens等人,Nature,296:72-74(1982),其通过引用以其整体特此并入)。
[0173] 用编码本发明的肽的基因转化植物细胞的另一种方法是宿主细胞的粒子轰击(也称为基因枪转化)。这可以通过几种方法中的一种来完成。第一种方法涉及将惰性或生物活性粒子推进细胞。该技术公开于Sanford等人的美国专利号4,945,050、5,036,006和5,100,792中,所述专利通过引用特此并入。通常,该程序涉及在惰性或生物活性粒子有效渗透细胞外表面并掺入细胞内部中的条件下,将惰性或生物活性粒子推进细胞。当使用惰性粒子时,可通过用含有异源DNA的载体包被粒子将所述载体引入细胞中。可选地,靶细胞可以被载体包围,使得通过粒子的伴流将载体带入细胞中。也可以将生物活性粒子(例如,含有载体和异源DNA的干燥细菌细胞)推进植物细胞中。
[0174] 又一种引入方法是原生质体与其他实体(小细胞、细胞、溶酶体或其他可融的脂质贴面体)的融合(Fraley等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,79:1859-63(1982),其通过引用以其整体特此并入)。也可以通过电穿孔将DNA分子引入植物细胞中(Fromm等人,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:5824(1985),其通过引用以其整体特此并入)。在该技术中,在存在含有表达盒的质粒的情况下将植物原生质体电穿孔。高场强的电脉冲可逆地渗透化处理生物膜,从而允许引入质粒。电穿孔的植物原生质体重塑细胞壁,分裂并再生。
[0175] 将DNA分子引入植物细胞中的另一种方法是用预先用所述基因转化的根癌土壤杆菌或发根土壤杆菌(A.rhizogenes)感染植物细胞。在本领域已知的合适条件下,使转化的植物细胞生长以形成枝条或根,并进一步发育成植物。通常,该程序涉及用细菌悬浮液接种植物组织,以及在25℃-28℃下将组织在无抗生素的再生培养基上孵育48至72小时。土壤杆菌属是革兰氏阴性科根瘤菌科(Rhizobiaceae)的代表性属。其物种导致冠瘿病(根癌土壤杆菌)和毛根病(发根土壤杆菌)。诱导冠瘿肿瘤和毛根中的植物细胞产生仅被细菌分解代谢的称为冠瘿碱的氨基酸衍生物。导致冠瘿碱表达的细菌基因是嵌合表达盒的控制元件的方便来源。另外,测定冠瘿碱的存在可用于鉴定转化的组织。可以借助根癌土壤杆菌的Ti质粒或发根土壤杆菌的Ri质粒将异源基因序列引入合适的植物细胞中。在通过土壤杆菌属感染后Ti或Ri质粒被传播到植物细胞,并被稳定地整合到植物基因组中(J.Schell,Science,237:1176-83(1987),其通过引用以其整体特此并入)。
[0176] 转化后,转化的植物细胞必须再生。从培养的原生质体的植物再生描述于以下文献中:Evans等人,Handbook of Plant Cell Cultures,第1卷:(MacMillan Publishing Co.,纽约,1983);和Nasil I.R.(编辑),Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants,Acad.Press,Orlando,第1卷,1984,和第Ill卷(1986),这些文献通过引用以其整体特此并入。
[0177] 已知实际上所有植物都可以从培养的细胞或组织再生。再生的手段因植物的物种而不同,但是通常首先提供转化的原生质体的悬浮液或含有转化的外植体的陪替氏平皿(petri plate)。形成愈伤组织,并且可从愈伤组织诱导枝条并随后生根。可选地,可以在愈伤组织中诱导胚胎形成。这些胚胎以自然胚胎的形式发芽形成植物。培养基将通常含有各种氨基酸和激素,诸如生长素和细胞分裂素。向培养基中添加谷氨酸和脯氨酸也是有利的,尤其是对于诸如玉米和苜蓿的物种。有效的再生将取决于培养基、基因型和培养的历史。如果控制这三个变量,则再生通常是可再现和可重复的。
[0178] 将表达盒稳定地掺入转基因植物中后,可以通过有性杂交将其转移至其他植物。可以使用多种标准育种技术中的任何一种,这取决于要杂交的物种。
[0179] 一旦产生了这种类型的转基因植物,就可以根据常规程序在存在编码超敏响应引发剂的基因的情况下栽培植物本身,从而导致抗病性、增强的植物生长、防治植物上的昆虫、非生物胁迫或生物胁迫耐受性、改善的移取的插条的抗干燥性、收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
[0180] 可选地,从转基因植物回收转基因种子。然后可以将这些种子种植在土壤中,并使用常规程序进行栽培以产生转基因植物。在有效赋予植物以抗病性、增强植物生长、防治昆虫、赋予非生物胁迫或生物胁迫耐受性、改善移取的插条的抗干燥性、赋予收获的果实或蔬菜以收获后抗病性或抗干燥性和/或赋予收获的果实或蔬菜以提高的果实或蔬菜成熟寿命的条件下,从种植的转基因种子繁殖转基因植物。
[0181] 当根据本发明使用转基因植物和植物种子时,它们还可以用与用于处理植物和种子的相同的物质进行处理,所述植物和种子施用了本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物。这些其他物质(包括本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物)可以通过上述程序(包括高压或低压喷雾、注射、包被和浸渍)施用于转基因植物和植物种子。类似地,从转基因植物种子繁殖出植物后,可以用本发明的肽、融合多肽、重组宿主细胞或组合物的一次或多次施用来处理植物,以赋予抗病性、增强生长、防治昆虫、非生物胁迫或生物胁迫耐受性、移取的插条的抗干燥性、收获的果实或蔬菜的收获后抗病性或抗干燥性和/或收获的果实或蔬菜的提高的果实或蔬菜成熟寿命。
[0182] 此类转基因植物也可以用常规植物处理剂处理,所述常规植物处理剂是例如杀菌剂或杀生物剂、蛋白酶抑制剂、非离子表面活性剂、肥料、除草剂、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、生物接种剂、植物调节剂及其混合物,如上所述。
[0183] 实施例
[0184] 提供以下实施例以说明本发明的实施方案,但绝不旨在限制本发明的范围。
[0185] 实施例1-诱导对烟草花叶病毒的抗性
[0186] 在烟草中测试了肽诱导对烟草花叶病毒(TMV)的抗性。简而言之,每组(样品和对照)选择三株6-8周龄的烟草植物。覆盖植物最底部的叶片,并用水(未经处理的对照-UTC)、肽或Proact(阳性对照)的溶液喷洒植物。施用喷雾直至叶片被完全润湿,这通过从叶片上滴下的液体来指示。然后将植物干燥并去除叶覆盖物。
[0187] 处理后三天,随后将先前覆盖的叶片和在植物对侧的叶片轻轻撒上硅藻土,并施用20ul的1.7μg/ml纯化烟草花叶病毒溶液。然后通过在叶片表面上轻轻摩擦溶液和硅藻土将TMV溶液散布在叶表面上。接种后两分钟,用水将硅藻土从叶片上冲洗掉。TMV接种后3天,根据观察到的TMV病变数对叶片进行评分。还对叶片进行了超敏响应迹象的评分,所述超敏响应的迹象包括累及叶片的泛黄和萎蔫。
[0188] 表5中所述的有效性是指经处理的植物与UTC植物上TMV病变的降低%。覆盖叶片上的TMV的降低指示植物中的系统性免疫应答,而未覆盖的叶片上的TMV的降低指示局部应答。星号指示从T检验得出的P值<0.05。
[0189] 表5:TMV抗性的总结
[0190]
[0191] 实施例2-玉米的抗旱性
[0192] 在玉米中评估了肽处理降低干旱胁迫的有效性。在3.5英寸的盆中填充阳光1号土壤(SunGro Horticulture),用20-10-20混合物施肥。将土壤浸泡并沥干过夜。将种子(玉米或大豆,人工检查以确保种子大小均匀)种植在1英寸的深度处以发芽。使植物在大于>70℉的16小时光照日和>65℉的8小时暗夜的条件下在温室中生长。在干旱条件之前,这些植物供水充足。
[0193] 当植物达到V1阶段时,将植物剔除以达到一致的高度(去除异常大和异常小的植物)。然后将植物随机分配为对照组(无肽喷雾)或处理组(含有肽的喷雾),并测量高度。将肽制成蒸馏水+0.01%吐温20中的0.2μg/ml或2μg/ml溶液,并从喷雾瓶以细雾的形式施用,直至溶液从叶片滴落。肽溶液干燥后,将植物以随机化完全区组设计再次随机化。在肽处理后启动了干旱胁迫。这是通过将水位保持在最大水容量(将容量确定为填满饱和土壤的盆的重量减去加水前的填满的盆的重量)的25%至50%来引起的。
[0194] 2-3周后,干旱测试阶段结束。此时,再次测量植物高度,并将生长速率计算为该高度与先前记录的高度之间的差。收获植物的地上部分并称重以获得鲜重。还将地上部分在70℃烘箱中干燥72小时以获得干重。将所有计算结果与匹配的未处理对照植物进行比较。
[0195] 干旱测试程序是在玉米中使用P12、P13-10、P13-11、P13-12、P13-14、P13-4和P13-15(SEQ ID NO:5、16、17、18、20、10和21)的处理进行的。结果显示于表6中。星号指示根据P值的统计显著性(*:P<0.1和**:P<0.05)
[0196] 表6:抗旱性的总结
[0197]
[0198] 实施例3-大豆的抗旱性
[0199] 在玉米中评估了肽处理降低干旱胁迫的有效性。将3.5英寸的盆装满阳光1号土壤(SunGro Horticulture),用20-10-20混合物施肥。将土壤浸泡并沥干过夜。将种子(大豆,人工检查以确保种子大小均匀)种植在半英寸的深度处以发芽。使植物在大于>70℉的16小时光照日和>65℉的8小时暗夜的条件下在温室中生长。在干旱条件之前,这些植物供水充足。
[0200] 当植物达到生长阶段时,在第一个三叶展开时,将植物剔除以达到一致的高度(去除异常大和异常小的植物)。然后将植物随机分配为对照组(无肽喷雾)或处理组(含有肽的喷雾),并测量高度。将肽制成蒸馏水+0.04%吐温20中的0.2μg/ml或2μg/ml溶液,并从喷雾瓶以细雾的形式施用,直至溶液从叶片滴落。肽溶液干燥后,将植物以随机化完全区组设计再次随机化。在肽处理后启动了周期性干旱胁迫。在收获前,使植物经受至少三个干旱胁迫的干旱周期(3-5天断水和1天用饱和量的水灌溉)。
[0201] 2-3周后,干旱测试阶段结束。此时,再次测量植物高度,并将生长速率计算为该高度与先前记录的高度之间的差。收获植物的地上部分并称重以获得鲜重。还将地上部分在70℃烘箱中干燥72小时以获得干重。将所有计算结果与匹配的未处理对照植物进行比较。
[0202] 干旱测试程序是在大豆中使用P12-2、P13-4、P13-5、P13-7、P13-3、P13-14、P13-2和P13-15(SEQ ID NO:6、10、11、13、9、20、8和21)的处理进行的。结果显示于表7中。星号指示根据P值的统计显著性(*:P<0.1和**:P<0.05)
[0203] 表7:抗旱性的总结
[0204]
[0205] 这些结果证实较小的共有序列提供了诱导主动植物响应的肽,其中在SEQ ID NO:1-3中的任何一个的N末端处的三个另外的残基和在SEQ ID NO:1-3中的任何一个的C末端处的一个另外的氨基酸残基对于抗干旱活性是足够的。
[0206] 实施例4-种子经包被的玉米的抗旱性
[0207] 使用种子处理策略在玉米中评估了肽处理在降低干旱胁迫的影响方面的有效性。该策略主要借鉴了实施例2,不同之处在于种子用肽配制品包被而不是叶面喷雾施用。
[0208] 首先使用网筛将种子筛选为均匀大小(21-23/64英寸)。然后根据制造商的建议,TM在Hege 11液体种子处理机(Wintersteiger)中将种子用肽、Unicoat 种衣聚合物和最小体积的水的混合物进行包被。将种子用以下中的一种来包被:(i)0.12μg肽/种子,(ii)1.05μg肽/种子或(iii)不包含肽的‘模拟物’处理。每个种子的肽量假定在种子包被室中将所述肽完全转移至种子表面。不考虑包被过程中的损失。
[0209] 在3.5英寸的盆中填充阳光1号混合物(SunGro Horticulture)(每盆约0.2L),用14-14-14N,P,K Osmocote(Everris)施肥,并使用土壤搅拌机M-5混合20分钟。将种子种植在0.5英寸的深度处以发芽。立即将盆通过浸没来灌溉,然后在大约一个小时后将其沥干。
对于每个处理组,种植24个重复的种子。使植物在约75℉的16小时光照日和约65℉的8小时暗夜的条件下在温室中生长。在干旱条件之前,这些植物供水充足。
[0210] 种植后三天,使用完全区组设计将植物随机化,并使其经受周期性干旱胁迫。通过断水2-3天,直至大多数植物处于中等至严重水分胁迫之下来施加干旱胁迫。所述胁迫的严重程度由盆的重量和视觉确定叶片卷曲来决定。一旦达到干旱胁迫,将盆浇水至完全饱和。将完全饱和(100%盆容量)定义为填满水饱和的土壤的盆的重量减去加水前填满的盆的重量。干旱胁迫施加了总共18天。
[0211] 在实验结束时(干旱胁迫开始后18天),随后收获植物以获得鲜重和干重。在土壤表面附近切下单株植物并立即称重(鲜重)。然后将植物放入带标签的棕色纸袋中,并在70℃烘箱中干燥72小时。然后获得干重。
[0212] 对收集的数据进行以下计算:将从肽处理的种子生长的植物在收获时的鲜重和收获时的干重表示为相对于“模拟物”处理的植物的变化%。结果显示于下表8中。
[0213] 表8:玉米种子处理后的抗旱性总结
[0214]
[0215] 表8:玉米种子处理后的抗旱性总结
[0216] P13-30 36 1.05 2.73 8.68**P13-33 39 1.05 2.59 -1.28
P13-35 41 0.12 5.68** 2.45
P13-36 42 0.12 5.93** 10.60**
P13-36 42 1.05 7.95** 12.38**
P13-37 43 1.05 5.53** 7.67**
P13-39 61 1.05 3.10 5.09**
P13-40 62 1.05 0.76 5.86*
P13-43 65 0.12 -0.75 6.2*
P13-43 65 1.05 6.73** 5.04
P13-44 66 0.12 2.73 7.76**
P13-44 66 1.05 3.44 9.15**
P13-45 67 0.12 6.05* 8.54**
P13-47 69 1.05 -1.34 -3.42
P13-48 70 1.05 -1.83 -1.65
P13-49 71 0.12 0.79 -4.24
P13-50 72 0.12 0.49 -3.95
P13-51 73 1.05 0.64 -4.70
P13-52 74 1.05 4.49** -5.08*
P13-53 75 0.12 0.48 -2.19
P13-54 76 0.12 -1.38 -4.51*
P13-55 77 0.12 0.81 -3.84
P13-56 78 0.12 0.44 1.91
P13-57 79 1.05 -0.68 1.90
P13-58 80 0.12 2.83 -4.07
[0217] 通过上述结果以及我们关于其他超敏蛋白衍生的生物活性肽的经验(如PCT申请公开号WO 2016/054310和WO 2016/054342中所述,这些文献通过引用以其整体特此并入)来提供上文在具体实施方式中所述的共有序列和优选实施方案的开发的信息。简而言之,我们先前的结果指示,疏水性氨基酸的身份和位置对于活性最为关键。疏水性残基的突变往往降低或消除活性。一般而言,以下突变是良好耐受的:M突变为L,和I到L与L到I(以及在一些情况下到V和F)之间的突变。
[0218] 一些结果支持以下结论:甲硫氨酸氨基酸可以被亮氨酸残基替代,包括p13-5(SEQ ID NO:11)、p13-7(SEQ ID NO:13)、p13-23(SEQ ID NO:29)和p13-35(SEQ ID NO:41)。这些取代通过消除甲硫氨酸氧化而增加了肽的稳定性。p13-30(SEQ ID NO:36)的阳性结果表明,两个异亮氨酸残基可以突变为亮氨酸。然而,p13-33(SEQ ID NO:39)的阴性结果表明,两个苯丙氨酸残基均不应该突变。使用p13-52(SEQ ID NO:74)得到的干重的阳性结果表明,当存在另外的序列时,SEQ ID NO:1中的位置11处的苯丙氨酸对于抗旱活性是非必要的。所有其他疏水性残基似乎都是必需的。
[0219] 相比之下,亲水性氨基酸的身份对于肽活性往往不太重要。根据我们的经验,这些残基的突变,特别是突变至其他亲水性氨基酸(R、K、D、E、Q、N、H、S、T、G、P)以及A,通常不会导致活性损失。实施例2和本实施例(上述)中的实验结果支持对取代亲水性残基的灵活性方面的看法。特别地,P13-7(SEQ ID NO:13)、P13-26(SEQ ID NO:32)、P13-28(SEQ ID NO:34)、p13-35(SEQ ID NO:41)和p13-37(SEQ ID NO:43)显示,所述序列内的所有亲水性氨基酸可以在保存活性的情况下安全地突变为谷氨酸。此外,用亲水性残基取代谷氨酸出人意料地允许较短的活性序列;p13-35(SEQ ID NO:41)仅有19个氨基酸,这是玉米中提供干旱耐受性的最短序列。相比之下,如果使用与野生型更相似的序列,则较长的序列提供活性,所述较长的序列是例如p13-12(SEQ ID NO:18)、p13-20(SEQ ID NO:26)或p13-23(SEQ ID NO:29)。在一些情况下,添加到共有序列(SEQ ID 1、2或3)的N末端和/或C末端的谷氨酸残基也支持玉米干旱耐受性,例如P13-5(SEQ ID NO:11)、P13-26(SEQ ID NO:32)和P13-36(SEQ ID NO:42)。因此,取决于内部亲水性残基或N末端和C末端延伸的身份,核心共有序列(SEQ ID 1、2或3)足以赋予玉米以干旱耐受性。共有序列(至少5个残基)内的谷氨酸赋予干旱耐受性活性。可选地,将至少4个谷氨酸残基的组合添加至N末端和/或C末端也赋予干旱耐受性活性。另外,在N末端添加至少6个残基和在C末端添加至少4个残基在玉米中提供活性。
[0220] 实施例5-种子经处理的大豆的抗旱性
[0221] 使用种子处理策略在大豆中评估了肽处理在降低干旱胁迫方面的有效性。该策略主要借鉴了实施例3和实施例4。
[0222] 首先使用网筛将种子筛选为均匀大小(14-17目)。然后根据制造商的建议,在Hege 11液体种子处理机(Wintersteiger)中将种子用肽和UnicoatTM种衣聚合物的混合物进行包被。一般而言,将种子用以下中的一种来包被:(i)0.12μg肽/种子,(ii)1.05μg肽/种子,或(iii)不包含肽的“模拟物”处理。
[0223] 在3.5英寸的盆中填充阳光1号混合物(SunGro Horticulture)(每盆约0.2L),用14-14-14N,P,K Osmocote(Everris)施肥,并使用土壤搅拌机M-5混合20分钟。将种子种植在0.5英寸的深度处以发芽。立即将盆通过浸没来灌溉,然后在大约一个小时后将其沥干。
对于每个处理组,种植24个重复的种子。使植物在约75℉的16小时光照日和约65℉的8小时暗夜的条件下在温室中生长。在干旱条件之前,这些植物供水充足。
[0224] 发芽后七天,测量植物的高度。这被确定为土壤表面与枝条顶端分生组织(芽)之间的距离。使用完全区组设计将植物随机化,并使其经受周期性干旱胁迫。通过断水3-4天,直至大多数植物处于中等至严重的水分胁迫之下,来施加干旱胁迫。胁迫的严重程度由盆的重量和视觉确定叶片中膨压损失(下垂)来决定。一旦达到干旱胁迫,将盆浇水至完全饱和。将完全饱和(100%盆容量)定义为填满水饱和的土壤的盆的重量减去加水前填满的盆的重量。干旱胁迫施加了总共18天。
[0225] 在实验结束时(干旱胁迫开始后18天),随后收获土壤以上的植物以获得鲜重和干重。在土壤表面附近切下单株植物并立即称重(鲜重)。然后将植物放入带标签的棕色纸袋中,并在70℃烘箱中干燥72小时。然后获得干重。对收集的数据进行以下计算:将肽处理的植物在收获时的鲜重和收获时的干重表示为相对于“模拟物”处理的植物的变化%。结果呈现于下表9中。
[0226] 表9:大豆种子处理后的抗旱性总结
[0227]
[0228] 在大豆的种子经处理的干旱研究中,选择的几种肽产生了显著结果:p13-17(SEQ ID NO:23)、p13-28(SEQ ID NO:34)、p13-30(SEQ ID NO:36)、p13-40(SEQ ID NO:62)和p13-44(SEQ ID NO:66)。
[0229] 在已经如此描述了本发明的基本概念后,对于本领域的技术人员来说将清楚的是,前述详细的公开仅旨在通过示例的方式提供,而并非限制性的。尽管本文没有明确说明,但是本领域技术人员将想到并计划各种改变、改进和修改。这些改变、改进和修改旨在由此提出并且在本发明的精神和范围内。另外,因此,处理元件或序列的陈述顺序或数字、字母或其他名称的使用并不旨在将所要求保护的过程限制为任何顺序,权利要求中可能指定的顺序除外。因此,本发明仅受所附权利要求及其等同物限制。
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