技术领域
[0001] 本
发明属于细胞培养技术领域，具体涉及一种NKT细胞培养基及培养方法。
背景技术
[0002] NKT(natural killer T)细胞是一群细胞表面既有T细胞受体TCR，又有NK细胞受体的特殊T细胞亚群。近年来研究显示，NKT细胞作为一类新的免疫调节细胞在抗
肿瘤免疫，克服移植排斥，以及抑制自身免疫
疾病的发生中发挥着至关重要的作用。.NKT细胞的功能异常与多种临床疾病，如：肿瘤的转移，
自身免疫性疾病(糖尿病，系统性红斑狼疮，多发性硬化等)的发生有关。研究还显示，调控NKT细胞的功能可达到对肿瘤以及多种人类疾病的
治疗效果。
[0003] 如今，很多研究在探讨NKT细胞的体外培养，从而为自身免疫性疾病、移植排斥以及多种肿瘤的治疗开辟一条新的途径。常见的NKT细胞体外培养方法是在添加相应细胞因子的培养基中培养
外周血单个核细胞，在细胞因子的刺激下诱导外周血单个核细胞成为NKT细胞。目前，最常用的NKT细胞培养基是添加细胞因子的含有10％胎
牛血清的RPMI1640培养基，但采用此种培养基培养NKT时，NKT细胞的扩增倍数较低，且培养获得的NKT细胞的毒性较差。
发明内容
[0004] 针对
现有技术中的上述不足，本发明提供了一种NKT细胞培养基及培养方法，可有效解决现有的培养基培养NKT时，NKT细胞的扩增倍数较低，且培养获得的NKT细胞的毒性较差的问题。
[0005] 为实现上述目的，本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
[0006] 一种NKT细胞培养基，包括
基础培养基和添加成分，添加成分包括以下组分：人血
白蛋白6-10wt％、IL-21-4μg/mL、IL-151-4μg/mL、大蒜提取液0.1-0.8v/v％、山药提取物0.1-0.5v/v％、猕猴桃汁0.1-0.5v/v％、白术多糖5-15μg/mL和牛膝总皂苷10-20μg/mL。
[0007] 进一步地，添加成分包括以下组分：人血白蛋白8wt％、IL-22μg/mL、IL-152μg/mL、大蒜提取液0.5v/v％、山药提取物0.3v/v％、猕猴桃汁0.2v/v％、白术多糖12μg/mL和牛膝总皂苷15μg/mL。
[0008] 进一步地，大蒜提取液通过以下方法制备得到：取干净大蒜，捣碎，然后加入8-10倍重量
水于60-70℃水浴1-2h，然后过滤，将滤液浓缩至原体积的1/3-1/4倍，最后经0.22μm滤
膜过滤，制得。
[0009] 进一步地，山药提取物通过以下方法制备得到：将山药清洗干净并去皮，切碎，然后加入6-8倍重量的水煮10-20min，过滤，得第一沉淀和第一滤液，向第一沉淀中加入4-6倍重量的水煮10-15min，过滤，得第二沉淀和第二滤液，向第二沉淀中加入3-5倍重量的水煮10-15min，过滤，得第三沉淀和第三滤液，合并三次滤液，然后浓缩至相对
密度为1.05-
1.10，最后
喷雾干燥，制得。
[0010] 猕猴桃汁是将猕猴桃去皮，榨汁，然后过0.22μm滤膜，得猕猴桃汁。
[0011] 进一步地，基础培养基为无血清培养基。
[0012] 采用上述培养基培养NKT细胞的方法，包括：将外周血单个核细胞在培养基中重悬，得到细胞悬液，然后将细胞悬液接种到细胞悬液中进行培养，获得NKT细胞。
[0013] 进一步地，细胞悬液中外周血单个核细胞的密度为1-5×106个/mL。
[0014] 本发明提供的NKT细胞培养基及培养方法，具有以下有益效果：
[0015] 本发明提供的NKT培养基中配方科学合理，通过各组分的协同作用，能够有效促进NKT细胞的诱导扩增，提高培养获得的NKT细胞的毒性，实验结果表明，采用本发明提供的培养基培养NKT，其NKT细胞扩增量均明显高于传统培养基，同时获得的NKT细胞的CD3+、CD56+双阳性表达量以及对K562细胞的毒性效果远远优于传统培养基。
具体实施方式
[0017] 一种NKT细胞培养基，包括基础培养基和添加成分，基础培养基为RPMI1640培养基，添加成分包括以下组分：人血白蛋白6wt％、IL-21μg/mL、IL-151μg/mL、大蒜提取液0.1v/v％、山药提取物0.1v/v％、猕猴桃汁0.1v/v％、白术多糖5μg/mL和牛膝总皂苷10μg/mL。
[0018] 其中，大蒜提取液通过以下方法制备得到：取干净大蒜，捣碎，然后加入8倍重量水于60℃水浴2h，然后过滤，将滤液浓缩至原体积的1/3倍，最后经0.22μm滤膜过滤，制得。
[0019] 山药提取物通过以下方法制备得到：将山药清洗干净并去皮，切碎，然后加入6倍重量的水煮10min，过滤，得第一沉淀和第一滤液，向第一沉淀中加入4倍重量的水煮10min，过滤，得第二沉淀和第二滤液，向第二沉淀中加入3倍重量的水煮10min，过滤，得第三沉淀和第三滤液，合并三次滤液，然后浓缩至相对密度为1.05-1.10，最后喷雾干燥，制得。
[0020] 猕猴桃汁是将猕猴桃去皮，榨汁，然后过0.22μm滤膜，得猕猴桃汁。
[0021] 实施例2
[0022] 一种NKT细胞培养基，包括基础培养基和添加成分，基础培养基为RPMI1640培养基，添加成分包括以下组分：人血白蛋白10wt％、IL-24μg/mL、IL-154μg/mL、大蒜提取液0.8v/v％、山药提取物0.5v/v％、猕猴桃汁0.5v/v％、白术多糖15μg/mL和牛膝总皂苷20μg/mL。
[0023] 其中，大蒜提取液通过以下方法制备得到：取干净大蒜，捣碎，然后加入10倍重量水于70℃水浴1h，然后过滤，将滤液浓缩至原体积的1/4倍，最后经0.22μm滤膜过滤，制得。
[0024] 山药提取物通过以下方法制备得到：将山药清洗干净并去皮，切碎，然后加入8倍重量的水煮20min，过滤，得第一沉淀和第一滤液，向第一沉淀中加入6倍重量的水煮15min，过滤，得第二沉淀和第二滤液，向第二沉淀中加入5倍重量的水煮15min，过滤，得第三沉淀和第三滤液，合并三次滤液，然后浓缩至相对密度为1.05-1.10，最后喷雾干燥，制得。
[0025] 猕猴桃汁是将猕猴桃去皮，榨汁，然后过0.22μm滤膜，得猕猴桃汁。
[0026] 实施例3
[0027] 一种NKT细胞培养基，包括基础培养基和添加成分，基础培养基为RPMI1640培养基，添加成分包括以下组分：人血白蛋白8wt％、IL-22μg/mL、IL-152μg/mL、大蒜提取液0.5v/v％、山药提取物0.3v/v％、猕猴桃汁0.2v/v％、白术多糖12μg/mL和牛膝总皂苷15μg/mL。
[0028] 其中，大蒜提取液通过以下方法制备得到：取干净大蒜，捣碎，然后加入8倍重量水于70℃水浴2h，然后过滤，将滤液浓缩至原体积的1/4倍，最后经0.22μm滤膜过滤，制得。
[0029] 山药提取物通过以下方法制备得到：将山药清洗干净并去皮，切碎，然后加入8倍重量的水煮15min，过滤，得第一沉淀和第一滤液，向第一沉淀中加入5倍重量的水煮10min，过滤，得第二沉淀和第二滤液，向第二沉淀中加入4倍重量的水煮10min，过滤，得第三沉淀和第三滤液，合并三次滤液，然后浓缩至相对密度为1.05-1.10，最后喷雾干燥，制得。
[0030] 猕猴桃汁是将猕猴桃去皮，榨汁，然后过0.22μm滤膜，得猕猴桃汁。
[0031] 对比例1
[0032] NKT细胞培养基为含有10％胎牛血清的RPMI1640培养基。
[0033] 对比例2
[0034] 对比例2与实施例3相比，缺少大蒜提取液和山药提取物，其余与实施例3相同。
[0035] 对比例3
[0036] 对比例3与实施例3相比，缺少白术多糖和牛膝总皂苷，其余与实施例3相同。
[0037] 对比例4
[0038] 对比例4与实施例3相比，缺少大蒜提取液、山药提取物、白术多糖和牛膝总皂苷，其余与实施例3相同。
[0039] 试验例
[0040] 1、获取外周血单个核细胞(PBMC)
[0041] (1)
抽取外周血，将生理盐水和外周血按体积比为1：1混合，得到外周血稀释液；
[0042] (2)按照淋巴细胞分离液与外周血稀释液体积比为1：2比例把外周血稀释液缓慢沿管壁加入淋巴细胞分离液上方，然后800g离心30min；
[0043] (3)离心结束后，从下到上分为4层，分别为粒细胞层与红细胞层、淋巴细胞分离液层、PBMC层和
血浆层，用吸管吸取PBMC层到另一离心管中，加入生理盐水清洗，400g离心5min；
[0044] (4)离心结束后，弃上清，剩余的细胞沉淀即为PBMC，用RPMI1640培养基重悬细胞沉淀，并对细胞进行计数。
[0045] 2、NKT细胞的培养
[0046] 根据上述计数结果，平均分成7个离心管，每管1×107个/mL，加入RPMI1640培养基进行重悬，300g离心5min，然后分别用实施例1-3和对比例1-4按1×106个/mL的密度进行重悬接种，然后进行培养，培养条件为37℃、5％CO2。
[0047] 每天观察并记录细胞生长状态，每隔2-3天对细胞进行计数，培养2周，然后对细胞进行流式检测(CD3、CD56)以及毒性实验(K562)。
[0048] 实施例1-3和对比例1-4培养基培养NKT细胞，其细胞数最多时的数量以及培养两周后获得的CD3+、CD56+表达量结果见表1。
[0049] 表1细胞数量及CD3+、CD56+表达量
[0050]
[0051] 通过表1可知，实施例1-3能够扩增得到更多的NKT细胞，明显高于对比例，对比例2-4明显比对比例1细胞数目多，但比实施例1-3要少，说明在本发明提供的培养基组分下才能有效诱导扩增NKT细胞。
[0052] 实施例1-3培养得到的NKT细胞的CD3+、CD56+双阳性表达量明显比对比例1-4要高，但对比例2-4又明显比对比例1要高，再次证明本发明提供的培养基有利于NKT细胞的诱导扩增。
[0053] 毒性结果显示，实施例1-3提供的培养基培养得到的NKT细胞对K562的毒性明显要高于对比例1-4，尤其是实施例3，效果最佳，最高达59％，而对比例2-4毒性效果要高于对比例1，对比例1的毒性效果为32％.说明本发明提供的培养基有利于提高NKT细胞的毒性效果，进而提高培养获得的NKT细胞的疾病治疗效果。
[0054] 综上所述，本发明提供的NKT培养基中配方科学合理，通过各组分的协同作用，能够有效促进NKT细胞的诱导扩增，提高培养获得的NKT细胞的毒性。
