骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品
专利汇可以提供骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了骨骼肌全器官脱细胞基质及其衍生出的医疗产品，以及它们的制备和使用方法。骨骼肌全器官脱细胞基质完整的保留了骨骼肌三维的、平行排列的骨骼肌基底膜超微结构，保留了血管基质网络和肌肉-肌 腱 接头，保留了大量生长因子、透明质酸、 氨 基葡聚糖、层连蛋白等 生物 活性成分 ，高度亲和肌源性干细胞，具有一定的机械强度和韧性，脱细胞彻底、无明显免疫排斥，无伦理道德问题，是迄今为止报道最多优点的骨骼肌再生 支架 和平台。所制备的骨骼肌全器官脱细胞基质，以及其各种衍生出的医疗产品，可用作体外体内构建和再生骨骼肌，适用于修复各个部位、各种范围的骨骼肌缺损，有望解决目前临床上仍十分棘手的、大范围骨骼肌缺损修复和肌肉再生难题。，下面是骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产品专利的具体信息内容。
1.一种骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，主要包括以下步骤：取材对象的选择、原材料的获取和准备、前置处理、脱细胞、消毒保存、体外评估。
2.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述取材对象的选择为，选择血供明显的异种异体骨骼肌；取材范围包括骨骼肌支配血管的上级血管；取材时间为取材部位骨骼肌仍具备有效血液循环时取材。
3.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述原材料的获取和准备，其标准是确保骨骼肌内动静脉系统均得到充分灌注、血液成分被排出而不会在骨骼肌小血管中凝结致微循环阻塞，此外灌注未导致骨骼肌内血管网络破坏。
4.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述前置处理指明确所插管动脉支配的骨骼肌范围、支配动脉有无解剖学变异，插管支配动脉的伴行静脉，清除原材料骨骼肌表面的筋膜、脂肪组织。
5.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述脱细胞步骤包括：将插管血管接入生物反应器，经支配血管按序列分批灌注不同处理液，标准是达到脱细胞要求、保留骨骼肌细胞外基质中80%以上的生物活性成分；其中，所述处理液包括酶处理液和化学药物处理液。
6.根据权利要求5所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述酶处理液选自胰蛋白酶、α-半乳糖苷酶或核酸外切酶/核酸内切酶中的一种或几种；所述化学药物处理液选自离子型、非离子型和两性表面活性剂、螯合剂、高低渗溶液的一种或几种。
7.根据权利要求6所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述核酸外切酶/核酸内切酶为脱氧核糖核酸酶，所述脱氧核糖核酸酶的终浓度为30-50U/ml；所述胰蛋白酶的终浓度为0.01～0.25%；α-半乳糖苷酶的终浓度为10-25U/ml；
所述化学药物处理液选自乙二胺四乙酸、乙二醇双四乙酸、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚、脱氧胆酸的一种或几种，其中所述乙二胺四乙酸或乙二醇双四乙酸的终浓度为0.02～0.5%，所述十二烷基硫酸钠的终浓度为0.01～0.1%，所述聚乙二醇辛基苯基醚的终浓度为0.1～1%，所述脱氧胆酸的终浓度为0.5～2%。
8.根据权利要求7所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述分批灌注的处理液选自胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇双四乙酸、脱氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶、十二烷基硫酸钠、聚乙二醇辛基苯基醚和脱氧胆酸的几种，其中所述胰蛋白酶/乙二胺四乙酸或胰蛋白酶/乙二醇双四乙酸的作用时间为1-3小时，脱氧核糖核酸酶/α-半乳糖苷酶的作用时间为0.4-1小时，十二烷基硫酸钠的作用时间为4-24小时、聚乙二醇辛基苯基醚的作用时间为8-24小时、脱氧胆酸的作用时间4-24小时。
9.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述消毒保存中的消毒方法选自全灌注系统预灭菌、全程使用灭菌液体灌注、制备后消毒液灌注，或辐射灭菌的一种或几种；所述消毒保存中的保存技术选自水化保存或干燥体保存。
10.根据权利要求1所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述体外评估包括：检测骨骼肌全器官脱细胞基质的组织学、超微结构，检测残留核酸、内毒素含量和残留核酸链的长度，测定生物负载以及残留脱细胞化合物含量，检测骨骼肌基底膜特异性成分的存在，测定促干细胞粘附、增殖和分化成分的含量。
11.根据权利要求10所述的骨骼肌全器官脱细胞基质的制备方法，其特征在于，所述骨骼肌基底膜特异成分包括IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白，所述促干细胞粘附、增殖和分化成分包括透明质酸、糖胺聚糖、硫酸类肝素和生长因子。
12.一种骨骼肌全器官脱细胞基质，是一种骨骼肌再生支架，其特征在于，A.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留了骨骼肌复杂的、具有启动功能的三维平行排列、周期性的肌内膜管超微结构，该超微结构特别利于肌源性干细胞定向迁移、延伸和融合，也能引导新生肌管的方向；和
B.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留了骨骼肌完整的血管基质网络，包括终末动脉、静脉和毛细血管系统；和
C.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有用于维持肌源性干细胞活性的生物信号的生物活性成分，所述生物活性成分包括骨骼肌基底膜特异成分，以及促干细胞粘附、增殖和分化成分；和
D.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有肌肉-肌腱接头结构，以直接传导力学；和E.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有其来源骨骼肌30%以上的机械强度，以及90%以上的韧性和弹性；和
F.所述骨骼肌全器官脱细胞基质保留有神经通路，以达到较其他材料更容易实现新生骨骼肌的再神经化；和
G.所述骨骼肌全器官脱细胞基质脱细胞彻底，其DNA含量低于50ng/mg干重，残留DNA链长度为200-500bp，不携带真菌、病毒在内的生物负载；灭菌彻底，内毒素含量<15Eu/mg干重，植入后无免疫排斥反应、不传播疾病，可异体异种移植。
13.由权利要求12所述的骨骼肌全器官脱细胞基质或权利要求1-11中任一所述的制备方法制备的骨骼肌全器官脱细胞基质制备的衍生医疗产品。
骨骼肌全器官脱细胞基质、制备方法及其衍生出的医疗产
品
技术领域
发明内容
0.5～2%。
图1为猪下腹直肌的支配血管解剖和取材范围示例图;
图2为原始骨骼肌以及由该块肌肉制备的骨骼肌示意图;
图3为骨骼肌WOACM结构完整，保留有血管网络的示例图;
图4为天然骨骼肌和骨骼肌WOACM的横断面、沿长轴面的扫描电镜图;
图5为骨骼肌WOACM的可见保留的毛细血管网络的横断面扫描电镜图;
图6为天然骨骼肌和骨骼肌WOACM横断面的HE染色、基底膜蛋白免疫组化染色（200X）示例图;
图7为天然骨骼肌和骨骼肌WOACM沿长轴面的HE染色、基底膜蛋白免疫组化染色（200X）示例图。
具体实施方式
近年来越来越多的研究显示，特定组织的ECM均拥有该组织独特的成分和结构，同样骨骼肌ECM也具备骨骼肌特异性的成分和结构①高IV型胶原含量，主要存在于骨骼肌基底膜中，利于成肌细胞粘附、迁移和激活；②复杂的、具有启动功能的三维超微结构，包括平行排列的肌内膜管结构、残存的神经和血管通路，可促进成肌细胞的调整和融合，并刺激神经血管生长；③富含生长因子、透明质酸、层粘连蛋白、硫酸肝素、硫酸蛋白聚糖等，生物相容性极佳；④降解产物具有强有力的促肌肉干细胞的有丝分裂和趋化作用，且这些降解产物形成的微环境，对维持肌细胞和卫星细胞的活力非常重要。因此，骨骼肌ECM应较其他材料更适合于重建骨骼肌，骨骼肌ECM修复骨骼肌缺损时也应具有更好的诱导再生效果。 [0019] 制备骨骼肌ECM一直是组织工程和再生医学领域的难题。通常认为骨骼肌结构致密，组织间有多重结缔组织分隔，脱细胞液体于其中难以弥散，故迄今仅有大鼠四肢小块骨骼肌ECM和猪骨骼肌薄片的ECM制备成功的报道，但这些骨骼肌ECM不能用于修复临床上的大范围骨骼肌缺损。2008年国际顶级医学期刊《Nature Medicine》首先报道了一项革命性技术，灌注法脱细胞制备整器官的细胞外基质用于构建相应的组织工程器官。美国学者Ott HC等应用此法制备出大鼠心脏的全器官脱细胞基质，接种干细胞体外构建8天后成功获得一人工心脏，其泵血功能达到正常成年大鼠心脏的2%，16周胎鼠心脏的25%。受到此项技术启发，人们先后获得了肝、肾、肺等脏器的全器官脱细胞基质，相关文章均发表在《Science》、《Hepatology》等顶级期刊。与此同时，国际知名的组织工程中心也一直在开展骨骼肌WOACM的制备工作，因为从理论上来说，骨骼肌WOACM较目前国内外已报道的各种骨骼肌再生平台，包括无机生物材料如可溶性磷酸盐玻璃纤维支架等、生物可降解合成高分子材料如聚羟基乙酸、聚乳酸以及和各类酯单体共聚物如聚乳酸-乙醇酸等，天然可降解生物材料如壳聚糖、胶原、SIS和UBM等，具有许多无可比拟的优势：
A.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌复杂的、具有启动功能的三维平行排列、周期性的肌内膜(基底膜)管结构，这样的超微结构目前尚不能人工模仿，特别利于肌源性干细胞定向迁移、延伸和融合，也能引导新生肌管的方向；
B.骨骼肌WOACM保留有生物活性成分(维持肌源性干细胞活性的生物信号)：包括骨骼肌基底膜特异成分（IV型胶原、层连蛋白、纤连蛋白）、促干细胞粘附、增殖和分化成分（透明质酸、糖胺聚糖、硫酸类肝素和生长因子如bFGF、TGF-β1、IGF、VEGF等）； C.骨骼肌WOACM保留了骨骼肌完整的血管基质网络，包括终末动脉、静脉和毛细血管系统；用于系统性接种干细胞可确保干细胞均匀分布到整个基质内并且所有接种的细胞在血管周围150-200μm内，能良好存活；此外，血管基质网络若能连通至受体的循环系统则可为干细胞持续提供营养；
D.骨骼肌WOACM保留了主要供应血管的基质，有机会再生出新的大直径供应血管来支配新生骨骼肌成为全功能骨骼肌；
E.骨骼肌WOACM保留了肌肉-肌腱接头结构，可直接传导力学；
F.骨骼肌WOACM具有一定的机械强度和韧性；
G.骨骼肌ECM较其他材料更容易实现新生骨骼肌的再神经化。研究显示，轻度骨骼肌损伤机体实现自我修复时，超过95%的神经-肌肉接头还是再生于基底膜和肌内膜上的原位(卫星细胞龛)，而骨骼肌WOACM保留了肌卫星细胞龛的成分和结构。
本发明的骨骼肌WOACM的制备方法适用于制备所有生物、各个部位的骨骼肌WOACM，如人体、猪、狗的腹直肌、背阔肌。以下将以猪腹壁下腹直肌为例进行详细说明。以下实施例中所提到的所有具体参数，仅用于举例说明，本领域技术人员可由下述公开的内容得到多种简单变化的方案，这些简单变换的方案也在本发明的保护范围内。
25μg/ml、10μg/ml、5μg/ml)的骨骼肌WOACM、SIS、UBM、PLGA对骨骼肌成肌细胞、MJK/PJK的促增殖作用，结果发现骨骼肌WOACM具有最佳的促干细胞增殖作用，且在浓度50μg/ml时即达到最佳作用。
种5×10 骨骼肌成肌细胞至1×1cm骨骼肌WOACM薄片、SIS、UBM、PLGA支架表面，使用全培养液（DMEM+10%胎牛血清）培养7天后改用诱导培养液（DMEM+10%马血清）培养3天，比较骨骼肌成肌细胞的分化和肌生成，检测骨骼肌调节因子的表达（MyoD,Myogenin,MRF4,Myf5），激光共聚焦显微镜检测新生肌管的量、尺寸和有序性。结果发现在骨骼肌WOACM表面成肌细胞最容易形成新生肌管，且新生肌管排列最为有序。
附表、附图说明
0.02%Trypsin/0.05%EGTA 动脉1.75h+静脉0.25h
去离子水，2X PBS 动脉，各0.5h
0.01%SDS 动脉11h+静脉1h
去离子水 动脉，0.5h
0.5%Triton X-100 动脉11h+静脉1h
去离子水 动脉，24h
0.1%PAA/4%ETOH 动脉，2h
去离子水 动脉，0.5h
DNase/α-半乳糖苷酶 动脉，0.5h
去离子水 动脉，72h
0.02%Trypsin/0.05%EGTA 动脉1.75h+静脉0.25h
去离子水，2X PBS 动脉，各0.5h
0.5%Deoxycholic acid 动脉11h+静脉1h
去离子水 动脉，0.5h
0.5%Triton X-100 动脉20h+静脉4h
去离子水 动脉，0.5h
0.5%Deoxycholic acid 动脉5.5h+静脉0.5h
去离子水 动脉，24h
0.1%PAA/4%ETOH 动脉，2h
去离子水 动脉，0.5h
DNase/α-半乳糖苷酶 动脉，0.5h
去离子水 动脉，12h
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