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在缺乏环己缩酚肽的细胞中制备多肽的方法

阅读:931发布:2021-04-09

专利汇可以提供在缺乏环己缩酚肽的细胞中制备多肽的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及制备异源多肽的方法,包括:(a)在有利于该异源多肽产生的条件下,培养亲本丝状 真菌 细胞的突变体,其中(i)该突变细胞含有编码该外源多肽的核酸序列并且(ii)当在相同条件下培养时该突变体比亲本丝状真菌细胞产生较少的环己缩酚肽;和(b)从该培养基中分离该异源多肽。本发明还涉及丝状真菌细胞的突变体和获得该突变细胞的方法。本发明还涉及分离的环己缩酚肽合成酶和编码该环己缩酚肽合成酶的分离的核酸序列。本发明还涉及含有这些核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞,以及制备该环己缩酚肽合成酶的方法。本发明进一步涉及由该环己缩酚肽合成酶产生的环己缩酚肽。,下面是在缺乏环己缩酚肽的细胞中制备多肽的方法专利的具体信息内容。

1.制备异源多肽的方法,包括:
(a)在有利于该异源多肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的 突变体,其中(i)该突变体含有编码该异源多肽的第一核酸序列,而 且(ii)当在相同条件下培养时该突变体比亲本丝状真菌细胞产生较少 的环己缩酚肽;和
(b)从该培养基中分离该异源多肽。
2.权利要求1的方法,其中所述丝状真菌细胞是枝顶孢属、曲霉 属、短梗霉属、隐球酵母属、Filibasidium、镰孢霉属、赤霉属、 腐质霉属、Magnaporthe、毛霉属、毁丝霉属、漆斑菌属、 Neocallimastix、脉孢菌属、拟青霉属、青霉属、Piromyces、 裂褶菌属、Talaromyces、嗜热子囊菌属、梭孢壳属、 Tolypocladium或木霉属细胞。
3.权利要求1的方法,其中所述丝状真菌细胞是镰孢霉属细胞。
4.权利要求3的方法,其中所述镰孢霉属细胞是Fusarium venenatum细胞。
5.权利要求4的方法,其中所述Fusarium venenatum细胞是 Fusarium venenatum ATCC 20334。
6.权利要求4的方法,其中所述Fusarium venenatum细胞是形态 突变体。
7.权利要求6的方法,其中所述Fusarium venenatum细胞是 Fusarium venenatum ATCC 20334的形态突变体。
8.权利要求1-7之任一项的方法,其中所述突变细胞含有第二核 酸序列,其中该核酸序列含有对环己缩酚肽产生所涉及的至少一个基 因的修饰。
9.权利要求8的方法,其中所述基因选自环己缩酚肽合成酶基 因、恩镰孢素合成酶基因和D-羟基异戊酸脱氢酶基因。
10.权利要求8的方法,其中所述基因之一是环己缩酚肽合成酶基 因。
11.权利要求8的方法,其中所述基因之一是恩镰孢素合成酶基 因。
12.权利要求8的方法,其中所述基因之一是D-羟基异戊酸脱氢酶 基因。
13.权利要求1-12之任意一项的方法,其中当在相同条件下培养 时所述突变细胞比亲本丝状真菌细胞产生少至少大约25%的环己缩酚 肽。
14.权利要求1-13之任意一项的方法,其中所述突变细胞不产生 环己缩酚肽。
15.权利要求1-14之任意一项的方法,其中所述丝状真菌细胞含 有至少两个拷贝的所述第一核酸序列。
16.权利要求1-15之任意一项的方法,其中所述异源多肽是激 素、激素变体、酶、受体或其部分、抗体或其部分、或报道分子。
17.权利要求16的方法,其中所述酶是化还原酶、转移酶、 解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。
18.权利要求17的方法,其中所述酶是肽酶、淀粉酶、糖酶、 羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、质酶、环糊精糖基转 移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡 糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪 酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶溶酶、过氧化物酶、肌 醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶或 木聚糖酶。
19.权利要求1-18之任意一项的方法,其中所述突变细胞还含有 对一个或多个第三核酸序列的修饰,其中该修饰降低或消除了该一个 或多个第三核酸序列的表达。
20.权利要求19的方法,其中所述第三核酸序列编码选自下组的 酶:氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁 质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半 乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄 糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化 酶、果胶溶酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、 核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶或木聚糖酶。
21.权利要求19之任意一项的方法,其中所述第三核酸序列编码 蛋白酶。
22.缺少环己缩酚肽的丝状真菌细胞突变体,其含有编码异源多 肽的第一核酸序列,其中在相同条件下培养时所述突变体比该突变细 胞的亲本丝状真菌细胞产生较少的环己缩酚肽。
23.权利要求22的突变细胞,其中该突变细胞含有第二核酸序 列,该序列含有对环己缩酚肽产生所涉及的至少一个基因的修饰。
24.权利要求23的突变细胞,其中所述基因选自环己缩酚肽合成 酶基因、恩镰孢素合成酶基因和D-羟基异戊酸脱氢酶基因。
25.权利要求23的方法,其中所述基因之一是环己缩酚肽合成酶 基因。
26.权利要求23的方法,其中所述基因之一是恩镰孢素合成酶基 因。
27.权利要求23的方法,其中所述基因之一是D-羟基异戊酸脱氢 酶基因。
28.权利要求22-27之任意一项的突变细胞,其中该细胞含有至少 两个拷贝的所述第一核酸序列。
29.获得权利要求22-28之任意一项的突变细胞的方法,包括:
(a)向亲本丝状真菌细胞导入第一核酸序列和第二核酸序列,其 中所述第一核酸序列编码异源多肽,而所述第二核酸序列含有对负责 环己缩酚肽产生的至少一个基因的修饰;和
(b)鉴定从步骤(a)获得的突变体,其中在相同条件下培养时该突 变体比该突变细胞的亲本丝状真菌细胞产生较少的环己缩酚肽。
30.分离的环己缩酚肽合成酶,其选自:
(a)具有与SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽有至少65%一致性的 氨基酸序列的环己缩酚肽合成酶;
(b)由在中等严紧条件下与下列序列杂交的核酸序列编码的环己 缩酚肽合成酶:(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii)SEQ ID NO:1 的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的子序列,或(iv) (i)、(ii)或(iii)的互补链;
(c)(a)或(b)的等位变体;和
(d)(a)、(b)或(c)的具有环己缩酚肽合成酶活性的片段
31.权利要求30的环己缩酚肽合成酶,其具有与SEQ ID NO:2中 所包含的成熟多肽有至少65%一致性的氨基酸序列。
32.权利要求31的环己缩酚肽合成酶,其具有与SEQ ID NO:2中 所包含的成熟多肽有至少70%一致性的氨基酸序列。
33.权利要求32的环己缩酚肽合成酶,其具有与SEQ ID NO:2中 所包含的成熟多肽有至少80%一致性的氨基酸序列。
34.权利要求33的环己缩酚肽合成酶,其具有与SEQ ID NO:2中 所包含的成熟多肽有至少90%一致性的氨基酸序列。
35.权利要求34的环己缩酚肽合成酶,其具有与SEQ ID NO:2中 所包含的成熟多肽有至少95%一致性的氨基酸序列。
36.权利要求30的环己缩酚肽合成酶,其含有SEQ ID NO:2的氨 基酸序列。
37.权利要求30的环己缩酚肽合成酶,其由SEQ ID NO:2的氨基 酸序列或其片段组成。
38.权利要求37的环己缩酚肽合成酶,其由SEQ ID NO:2的氨基 酸序列组成。
39.权利要求38的环己缩酚肽合成酶,其由SEQ ID NO:2中所包 含的成熟多肽组成。
40.权利要求30-39之任意一项的环己缩酚肽合成酶,其获自镰孢 霉属菌株。
41.权利要求40的环己缩酚肽合成酶,其获自Fusarium venenatum菌株。
42.权利要求30的环己缩酚肽合成酶,其由在中等严紧条件下与 下列序列杂交的核酸序列所编码:(i)SEQ ID NO:1的核酸序列, (ii)SEQ ID NO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷 酸的子序列,或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。
43.权利要求42的环己缩酚肽合成酶,其由在中等严紧条件下与 下列序列杂交的核酸序列所编码:(i)SEQ ID NO:1的核酸序列, (ii)SEQ ID NO:1的cDNA序列,或(iii)(i)或(ii)的互补链。
44.权利要求42或43的环己缩酚肽合成酶,其获自镰孢霉属菌 株。
45.权利要求44的环己缩酚肽合成酶,其获自Fusarium venenatum菌株。
46.权利要求30的环己缩酚肽合成酶,其由在高严紧条件下与下 列序列杂交的核酸序列所编码:(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii) SEQ ID NO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的 子序列,或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链。
47.权利要求46的环己缩酚肽合成酶,其由在高严紧条件下与下 列序列杂交的核酸序列所编码:(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii) SEQ ID NO:1的cDNA序列,或(iii)(i)、(ii)或(iii)的互补链。
48.权利要求46或47的环己缩酚肽合成酶,其获自镰孢霉属菌 株。
49.权利要求48的环己缩酚肽合成酶,其获自Fusarium venenatum菌株。
50.权利要求30的环己缩酚肽合成酶,其由大肠杆菌NRRL B- 30068中的质粒pZL-ESA、大肠杆菌NRRL B-30069中的质粒pZL-ESB 以及大肠杆菌NRRL B-30070中的质粒pZL-ESC所包含的核酸序列编 码。
51.权利要求30-50之任意一项的环己缩酚肽合成酶,其具有至少 20%的SEQ ID NO:2的酶活性。
52.与权利要求30-51之任意一项的环己缩酚肽合成酶具有相同酶 活性的环己缩酚肽合成酶。
53.分离的核酸序列,其含有编码权利要求30-52之任意一项的环 己缩酚肽合成酶的核酸序列。
54.分离的核酸序列,其含有在SEQ ID NO:1的成熟环己缩酚肽 合成酶编码序列中具有至少一个突变的核酸序列,其中该突变核酸序 列编码由SEQ ID NO:2中所含成熟多肽组成的环己缩酚肽合成酶。
55.分离的核酸序列,其通过如下步骤产生:(a)在中等严紧条件 下用(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii)SEQ ID NO:1的cDNA序 列,(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的子序列,或(iv) (i)、(ii)或(iii)的互补链杂交DNA;和(b)分离该核酸序 列。
56.权利要求55的分离的核酸序列,其通过如下步骤产生:(a)在 高严紧条件下用(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii)SEQ ID NO:1 的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的至少100个核苷酸的子序列, 或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交DNA;和(b)分离该 核酸序列。
57.核酸结构,其含有与一个或多个指导所述环己缩酚肽合成酶 在适合表达宿主中产生的控制序列可操作地连接的权利要求53之核酸 序列。
58.含有权利要求57的核酸结构的重组表达载体。
59.含有权利要求57的核酸结构的重组宿主细胞。
60.产生突变核酸序列的方法,包括(a)向SEQ ID NO:1的成熟环 己缩酚肽合成酶编码序列中引入至少一个突变,其中该突变核酸序列 编码由SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽组成的环己缩酚肽合成酶; 和(b)回收该突变核酸序列。
61.通过权利要求60的方法产生的突变核酸序列。
62.制备环己缩酚肽合成酶的方法,包括(a)培养含有编码所述 环己缩酚肽合成酶的权利要求61之突变核酸序列的菌株,以产生含有 该环己缩酚肽合成酶的上清液;和(b)回收该环己缩酚肽合成酶。
63.制备权利要求30-52之任意一项的环己缩酚肽合成酶的方法, 包括(a)培养菌株以产生含有该环己缩酚肽合成酶的上清液;和 (b)回收该环己缩酚肽合成酶。
64.制备权利要求30-52之任意一项的环己缩酚肽合成酶的方法, 包括(a)在适于产生该环己缩酚肽合成酶的条件下培养包含如下核酸 结构的宿主细胞,其中所述核酸结构含有编码该环己缩酚肽合成酶的 核酸序列;和(b)回收该环己缩酚肽合成酶。
65.制备环己缩酚肽合成酶的方法,包括(a)在有益于产生该环 己缩酚肽合成酶的条件下培养宿主细胞,其中该宿主细胞含有在SEQ ID NO:1的成熟环己缩酚肽合成酶编码序列中具有至少一个突变的突 变核酸序列,其中该突变核酸序列编码由SEQ ID NO:2中所含成熟多 肽组成的环己缩酚肽合成酶;和(b)回收该环己缩酚肽合成酶。
66.制备环己缩酚肽的方法,包括:
(a)将权利要求30-52之任意一项的环己缩酚肽合成酶与D-2-羟 基异戊酸、支链L-氨基酸、S-腺苷甲硫氨酸和ATP反应;和
(b)从该反应中分离环己缩酚肽。
67.通过权利要求66的方法制备的环己缩酚肽。
68.制备环己缩酚肽合成酶的方法,包括:
(a)在适于产生该环己缩酚肽的条件下培养细胞,其中该细胞含 有编码如下酶或片段的核酸序列:(i)具有与SEQ ID NO:2中所含成 熟多肽有至少65%一致性的氨基酸序列的环己缩酚肽合成酶;(ii)由 在中等严紧条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补链,或SEQ ID NO:1的至少100个核苷酸的子序列杂交的核酸序列所编码的环己缩酚 肽合成酶;(iii)(a)或(b)的等位变体;或(iv)(a)、(b)或(c)的 具有环己缩酚肽合成酶活性的片段;和
(b)从该反应中分离环己缩酚肽。
通过权利要求68的方法制备的环己缩酚肽。

说明书全文

发明领域

本发明涉及在缺乏环己缩酚肽(cyclohexadepsipeptide)的丝 状真菌突变细胞中制备异源多肽的方法。本发明还涉及丝状真菌细胞 的突变体以及获得这些突变细胞的方法。本发明还涉及分离的环己缩 酚肽合成酶和编码该环己缩酚肽合成酶的分离核酸序列。本发明还涉 及含有这些核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞,以及制备该环己 缩酚肽合成酶的方法。本发明进一步涉及由该环己缩酚肽合成酶产生 的环己缩酚肽。

相关领域的描述

缩酚肽(depsipeptide)构成一大类肽相关化合物,这些化合物 来源于通过酰胺键和酯键连接的羟基和基酸。该类化合物的许多成 员具有生物学活性,包括抗生素、生物蛋白质(Shemyakin等, 1969,膜生物学杂志(Journal of Membrane Biology)1:402- 430)。例子包括恩镶孢素、白僵菌素和bassianolide。

恩镰孢素是放线菌和丝状真菌的许多种尤其是镰孢霉属 (Fusarium)菌株产生的具有离子载体性质的环己缩酚肽毒植物素 (phytoxin)。它们由交替的D-2-羟基异戊酸和L-氨基酸或N-甲基- L-氨基酸组成,形成一个18元环结构,而且可以含有不止一种氨基 酸。

恩镰孢素的生物合成由恩镰孢素合成酶催化,该酶是一个大的多 功能酶,具有从恩镰孢素的最初前体装配恩镰孢素的所有必须功能, 这些前体是D-2-羟基异戊酸、支链L-氨基酸(例如缬氨酸、亮氨酸、 异亮氨酸)、S-腺苷甲硫氨酸和ATP(Reper等,1995,欧洲生物化 学杂志(European Journal of Biochemistry)230:119-126)。 前体(D-2-羟基异戊酸和支链L-氨基酸)被活化成硫酯。通过消耗 S-腺苷甲硫氨酸甲基化共价结合的底物氨基酸残基。然后形成肽键并 发生环化反应。

恩镰孢素被推测在产恩镰孢素的镰孢霉感染期间的萎蔫毒性事件 中起作用(Walton,1990,肽抗生素生物化学(Biochemistry of peptide Antibiotics),H.Kleinkauf和H.von Dohren编,W. de Gruytre,柏林,第179-203页),而且恩镰孢素还表现出昆虫致 病性(Grove和Pople,1980,Mycophathologia,70:103-105)。

已从蒸草镰孢(Fusarium scirpi)克隆了恩镰孢素合成酶基因 (esynI)(Haese等,1993,分子微生物学(Molecular Microbiology)7:905-914)。

已经制备了不产生恩镰孢素的燕麦镰孢(Fusarium avenaceum)的恩镰孢素合成酶突变体(Herrmann等,1996,植物- 微生物分子相互作用(Molecular Plant-Microbe Interactons) 9:226-232)。

本发明的一个目的是提供在缺乏环己缩酚肽的丝状真菌突变细胞 中制备异源多肽的方法。

                  发明概述

本发明涉及制备异源多肽的方法,包括:(a)在有利于该异源多 肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的突变体,其中(i)该突变细 胞含有编码该异源多肽的第一核酸序列,而且(ii)当在相同条件下培 养时该突变体比亲本丝状真菌细胞产生较少的环己缩酚肽;和(b)从 该培养基中分离该异源多肽。

本发明还涉及丝状真菌细胞的突变体和获得这些突变细胞的方 法。

本发明还涉及来自Fusarium venenatum的分离的环己缩酚肽合 成酶,和编码该环己缩酚肽合成酶的分离的核酸序列。本发明还涉及 含有这些核酸序列的核酸结构、载体和宿主细胞,以及制备该环己缩 酚肽合成酶的方法。

本发明进一步涉及由该环己缩酚肽合成酶产生的环己缩酚肽。

                  附图简要说明

图1显示了Fusarium venenatum ATCC 20334的环己缩酚肽合成 酶的基因组核酸序列和推导的氨基酸序列(分别是SEQ ID NOS:1和 2)。

图2显示了pΔES-amdS的结构。

                    发明详述

本发明涉及制备异源多肽的方法,包括:(a)在有利于该异源多 肽产生的条件下培养亲本丝状真菌细胞的突变体,其中(i)该突变丝 状真菌细胞含有编码该异源多肽的第一核酸序列,而且(ii)当在相同 条件下培养时该突变体比亲本丝状真菌细胞产生较少的环己缩酚肽; 和(b)从该突变细胞的培养基中分离该异源多肽。

术语“环己缩酚肽”在本文中定义为一个由通过酰胺键和酯键连 接的羟基和氨基酸组成的肽相关化合物家族。

术语“环己缩酚肽的制备”在本文中定义为包括环己缩酚肽产生 所涉及的任何步骤,这些步骤包括但不限于生物合成、生物合成的调 节、运输和分泌。

在一个优选的实施方案中,该环己缩酚肽是恩镰孢素。

术语“恩镰孢素”在本文中是指由3个D-2-羟基异戊酸残基与L- 氨基酸或N-甲基-L-氨基酸交替连接产生的一个18元环结构构成的环 己缩酚肽家族。该恩镰孢素包括但不限于恩镰孢素A、A1、B、B1、 B2、B3、B4、C、D、E和F;和它们的衍生物(Visconte等,1992,农 业和食品化学杂志(Journal of Agricultural and Food Chemistry)40:1076-1082;Tomodo等,1992,抗生素杂志 (Journal of Antibiotics)45:1207-1215),以及含有一种以上 氨基酸的混合类型恩镰孢素(Zocher等,1982,生物化学 (Biochemistry)21:43-48)。

在本发明的方法中,该丝状真菌细胞可以是野生型细胞或其突变 体。而且,该丝状真菌细胞可以是不产生任何能检测到的环己缩酚 肽、但含有编码该环己缩酚肽的基因的细胞。优选地,该丝状真菌细 胞是枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉属 (Aureobasidium)、白僵菌属(Beauveria)、隐球酵母属 (Cryptococcus)、Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、赤 霉属(Gibberella)、腐质霉属(Humicola)、Magnaporthe、毛霉 属(Mucor)、毁丝霉属(Myceliophthora)、漆斑菌属 (Myrothecium)、Neocallimastix、脉孢菌属(Neurospora)、 拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属(Penicillium)、 Piromyces、多孔菌属(Polyporus)、裂褶菌属 (Schizophyllum)、Talaromyces、嗜热子囊菌属 (Thermoascus)、梭孢壳属(Thielavia)、Tolypocladium或 木霉属(Trichoderma)细胞。

在一个优选的实施方案中,该丝状真菌细胞是棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉 (Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)或米曲霉 (Aspergillus oryzae)细胞。

在另一个优选实施方案中,该丝状真菌细胞是Fusarium acuminatum、燕麦镰孢、杆孢状镰孢(Fusarium bactridioides)、Fusarium compactum、Fusarium crookwellense(Fusarium cerealis的同义词)、大刀镰孢 (Fusarium culmorum)、木贼镰孢(Fusarium equiseti)、囊突 镰孢(Fusarium gibbosum)、禾本科镰孢(Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、异孢镰孢 (Fusarium heterosporum)、砖红镰孢(Fusarium lateritium)、串珠镰孢(Fusarium moniliforme)、合欢木镰孢 (Fusarium negundi)、腐镰孢(Fusarium nivale)、尖镰孢 (Fusarium oxysporum)、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、 粉红镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、蒸草镰孢 (Fusarium scirpi)、半裸镰孢(Fusarium semitectum)、腐皮 镰孢(Fusarium solani)、拟分枝孢镰孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、三隔镰孢(Fusarium tricinctum)或Fusarium venenatum细胞。

在另一个优选的实施方案中,该丝状真菌细胞是虱状赤霉 (Gibberella pulicaris)、玉蜀黍赤霉(Gibberella zeae)、 Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、Myrothecium roridin、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、玫烟色拟青霉 (Paeciliomyces fumoso-roseus)、产紫青霉(Penicillium purpurogenum)或硫色多孔菌(Polyporus sulphureus)细胞。

在另一个优选实施方案中,该丝状真菌细胞是Trichoderma harzianum、康宁木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉 (Trichoderma viride)细胞。

在一个更优选的实施方案中,Fusarium venenatum细胞是 Fusarium venenatum A3/5,其最初作为禾本科镰孢ATCC 20334保 藏,最近由Yoder与Christianson(1998,真菌遗传学和生物学 (Fungal Genetics and Biology)23:62-80)和O’Donnell等 (1998,真菌遗传学和生物学23:57-67)重新划分为Fusarium venenatum;以及Fusarium venenatum的分类学等同物,无论其目前 被称为何种种名。在另一个更优选的实施方案中,正如WO 97/26330 中所公开的,Fusarium venenatum细胞是Fusarium venenatum A3/5或Fusarium venenatum ATCC 20334的形态突变体。

该丝状真菌还可以是参与含有(部分)菌丝体的产品的生产,例 如参与从镰孢霉属菌株产生的产品QUORNTM(Mariow Foods有限公 司,英国)的生产的细胞。

在本发明的方法中,该突变细胞含有如下第二核酸序列,该核酸 序列含有对环己缩酚肽产生所涉及的至少一个基因的修饰。可以对丝 状真菌细胞中环己缩酚肽产生所涉及的任意基因进行修饰。在一个优 选的实施方案中,该基因是环己缩酚肽合成酶基因。在一个更优选的 实施方案中,该基因是恩镰孢素合成酶基因。在另一个更优选的实施 方案中,该基因是D-羟基异戊酸脱氢酶基因。D-羟基异戊酸脱氢酶催 化2-异戊酸转化成D-羟基异戊酸(Lee和Zocher,1996,生物化学 和分子生物学杂志(Journal of Biochemistry and Molecular Biology)29:493-499)。在一个甚至更优选的实施方案中,该基因 是具有以下序列的Fusarium venenatum的环己缩酚肽合成酶基因: (a)编码具有与SEQ ID NO:2中所含成熟多肽有至少65%一致性的氨基 酸序列的多肽的核酸序列;(b)与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码区有 至少65%同源性的核酸序列;(c)在中等严紧条件下与(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii)SEQ ID NO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii) 的至少100个核苷酸的子序列(subsequence),或(iv)(i)、(ii) 或(iii)的互补链杂交的核酸序列;(d)(a)、(b)或(c)的等位变 体;或(e)(a)、(b)、(c)或(d)的子序列,其中所述子序列编码 具有环己缩酚肽合成酶活性的多肽片段。在一个最优选的实施方案 中,该基因是具有SEQ ID NO:1的核酸序列的Fusarium venenatum环 己缩酚肽合成酶基因。

缺乏环己缩酚肽的丝状真菌突变细胞可以通过采用本领域熟知的 方法降低或消除上述一或多个基因的表达来构建,这些方法例如插 入、破坏、替代或缺失。待修饰或失活的基因可以是例如编码区或其 活性所必须的部分,或该编码区表达所需要的该基因的调节元件。这 些调节或控制序列的例子可以是启动子序列或其功能性部分,即足以 影响所述核酸序列表达的部分。其它可能进行修饰的控制序列包括但 不限于前导序列、聚腺苷酸化序列、前肽序列、信号肽序列、转录终 止子和转录激活子。

所述基因的修饰或失活可以通过诱变亲本细胞并选择其中该基因 表达被降低或消除的突变细胞来实现。该诱变可以是特异的也可以是 随机的,并可以通过例如使用适合的物理或化学诱变剂、使用适合的 寡核苷酸、或将该DNA序列经过PCR产生的诱变来完成。而且,该诱变 可以通过使用这些诱变剂的任意组合来进行。

适于本目的的物理或化学诱变剂的例子包括紫外(UV)照射、羟 胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、 乙基甲磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠、甲酸和核苷酸类似物。

当使用这些试剂时,诱变典型地通过如下步骤进行:在存在选择 的诱变剂时于适合的条件下孵育待诱变的亲本细胞,并筛选和/或选 择表现出该基因表达降低或不表达的突变细胞。

所述基因的修饰或失活可以通过在所述基因或其转录或翻译所必 需的调节元件中引入、替换或除去一或多个核苷酸来完成。例如,可 以插入或除去核苷酸以导致终止密码子的引入、起始密码子的去除或 可读框的改变。这些修饰或失活可以根据本领域已知的方法通过定点 诱变或PCR产生的诱变进行。尽管原则上该修饰可以体内进行,即直 接在表达待修饰基因的细胞上进行,但优选该修饰在体外进行,如以 下示例说明。

消除或降低所选丝状真菌细胞中环己缩酚肽产生的方便方法的一 个例子基于基因替换、基因缺失或基因破坏技术。例如,在基因破坏 方法中,体外诱变相应于目的内源性基因或基因片段的核酸序列,以 产生缺陷型核酸序列,然后用此缺陷型核酸序列转化亲本细胞以产生 缺陷基因。通过同源重组,该缺陷型核酸序列取代该内源性基因或基 因片段。可以期望,该缺陷基因或基因片段还编码可以用于筛选其中 所述核酸序列已被修饰或破坏的转化体的标记。在一个尤其优选的实 施方案中,用选择标记例如本文所述的选择标记破坏该基因。

作为替代方法,可以通过成熟的反义技术使用与该基因核酸序列 互补的核苷酸序列修饰或失活该基因。更具体地,丝状真菌细胞中的 该基因表达可以通过如下方式降低或消除,该方式是:引入与该基因 核酸序列互补的、可以在该细胞中转录并能够与该细胞中产生的该基 因的mRNA杂交的核苷酸序列。在允许该互补反义核苷酸序列与所述 mRNA杂交的条件下,从而降低或消除翻译的蛋白质的量。

与环己缩酚肽产生所涉及的基因的核酸序列同源或互补的核酸序 列可以从其它产生环己缩酚肽的微生物来源获得。

对于具有与Fusarium venenatum的SEQ ID NO:1核酸序列互补或 同源的核酸序列的恩镰孢素合成酶基因,优选的来源包括其它的镰孢 霉属菌株。一个更优选的来源是蒸草镰孢(Haese等,1993,同 上)。

对于可能与一种丝状真菌细胞的D-羟基异戊酸脱氢酶基因的核酸 序列互补或同源的D-羟基异戊酸脱氢酶基因,优选的来源包括其它镰 孢霉属菌株。对于该D-羟基异戊酸脱氢酶基因,一个更优选的来源是 接骨木镰孢(Lee和Zocher,1996,同上)。而且,该核酸序列可以是 该丝状真菌细胞天然的。

可以采用Visconti等(1992,农业和食品化学杂志40:1076- 1082)的方法,测定由本发明突变丝状真菌细胞产生的环己缩酚肽的 平。具体地,用2.0ml乙酸乙酯对1ml Fusarium venenatum的无细 胞培养液抽提两次。在氮气流下将合并的有机提取物蒸发至干,并重 新溶解在0.5ml己烷中。采用以电子碰撞(EI)方式操作的Hewlett- Packard 6890 GC/Series MSD系统,对1μl样品进行分析。采用DB- 5毛细管柱(30m×0.25mm,0.25μm膜)和以15℃/min速率从120℃加 热至300℃的温度程序,分离注射上柱的样品。例如,恩镰孢素A、 A1、B、B1、B2和B3分别用(M++H)离子的m/z比值682、668、640、 654、626和612来鉴定。

优选地,当在相同条件下培养时,该突变丝状真菌细胞比相应的 亲本丝状真菌细胞产生少至少大约25%、更优选少至少大约50%、甚至 更优选少至少大约75%、最优选少至少大约95%的环己缩酚肽,甚至最 优选该突变丝状真菌细胞不产生环己缩酚肽。可以在有利于目的多肽 产生的条件下,或在有利于环己缩酚肽产生的条件下,就环己缩酚肽 的产量比较该亲本和突变细胞。

在本发明的另一个方面,该突变丝状真菌细胞另外可以含有对一 个或多个第三核酸序列的修饰,其中所述第三核酸序列编码对于目的 异源多肽的产生、回收和/或应用有害的蛋白质。该修饰降低或消除 了该一个或多个第三核酸序列的表达,导致在相同条件下培养时可以 比未修饰此第三核酸序列的突变细胞产生更多的异源多肽的突变细 胞。该第三核酸序列可能编码任何蛋白质或酶。例如,该酶可以是氨 肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、 质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷 酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷 酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果 胶溶酶、过氧化物酶、磷脂酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白 酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转移酶(transglutaminase)或木聚糖 酶。该第三核酸序列优选编码蛋白酶例如氨肽酶、羧肽酶或内切蛋白 酶。

采用本领域已知的方法在适合目的异源多肽产生的营养培养基中 培养该突变丝状真菌细胞。例如,该细胞可以在适合的培养基中以及 允许该异源多肽表达和/或分离的条件下,通过摇瓶培养、小规模或 大规模发酵(包括连续、批式、补料分批或固态发酵),在实验室或 工业发酵罐中进行培养。该培养在含有源和氮源以及无机盐的适合 营养培养基中,采用本领域已知的程序进行。适合的培养基可以从供 应商处获得,或可以根据公开的组成(例如美国典型培养物保藏中心 目录中的组成)制备。该分泌的异源多肽可以直接从培养基回收。

可以采用本领域已知的特异针对该异源多肽的方法检测该多肽。 这些检测方法可以包括特异性抗体的使用、酶产物的形成、酶底物的 消失或SDS-PAGE。例如,可以使用酶分析以确定该异源多肽的活 性。对于许多酶,测定酶活性的方法是本领域已知的。

所获得的异源多肽可以通过本领域已知的方法分离。例如,该多 肽可以从该营养培养基中通过常规程序分离,这些程序包括但不限于 离心、过滤、提取、喷雾干燥、蒸发或沉淀。然后可以通过本领域已 知的多种方法对该多肽作进一步纯化,这些方法包括但不限于层析 (例如离子交换层析、亲和层析、疏水层析、层析聚焦和大小排阻层 析)、电泳方法(例如制备型等电聚焦)、溶解度差异(例如硫酸铵 沉淀)或提取(见例如蛋白质纯化(Protein Purification),J.-C. Janson和Lars Ryden编,VCH Publishers,纽约,1989)。

该多肽可以是与该突变丝状真菌细胞异源的任何多肽。术语“多 肽”在本文中并不是指特定长度的编码产物,因而包括肽、寡肽和蛋 白质。术语“异源多肽”在本文中定义为该真菌细胞的非天然的多 肽、或是经修饰改变了天然序列的天然蛋白质、或是通过重组DNA技 术对该真菌细胞的操作导致的其表达在数量上发生改变的天然蛋白 质。该突变真菌细胞可以含有一或多个拷贝的编码该多肽的核酸序 列。在一个优选实施方案中,该异源多肽是细胞外分泌的多肽。

优选地,该异源多肽是激素、激素变体、酶、受体或其部分、抗 体或其部分、或报道分子。在一个更优选的实施方案中,该异源多肽 是氧化还原酶、转移酶、水解酶、裂合酶、异构酶或连接酶。在一个 甚至更优选的实施方案中,该异源多肽是氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧 肽酶、过氧化氢酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移 酶、脱氧核糖核酸酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖 淀粉酶、α-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、 甘露糖苷酶、mutanase、氧化酶、果胶溶酶、过氧化物酶、磷脂 酶、肌醇六磷酸酶、多酚氧化酶、蛋白酶、核糖核酸酶、谷氨酰胺转 移酶或木聚糖酶。

编码可以在丝状真菌细胞中表达的异源多肽的核酸序列可以获自 任何原核生物、真核生物或其它来源。对于本发明来说,本文所用与 一个指定来源相连的术语“获自”意味着,该多肽由该来源产生或由 插入了该来源的基因的细胞产生。

在本发明的方法中,该突变丝状真菌细胞还可以用于该细胞的天 然多肽的重组产生。该天然多肽可以这样重组产生,例如通过将编码 该天然多肽的基因置于一个不同的启动子控制下以增强该多肽的表 达,通过信号序列的使用促进目的天然多肽向细胞外运输,以及增加 编码该细胞正常产生之多肽的基因的拷贝数。本发明在术语“异源多 肽”的范围内还包括这些重组产生的同源多肽,只要这些表达涉及到 使用非天然属于该细胞的遗传元件,或使用经过操作以宿主细胞中正 常不存在的方式起作用的天然元件。

用于分离或克隆编码异源多肽的核酸序列的技术是本领域已知 的,包括从基因组DNA中分离、从cDNA制备或它们的组合。从该基因 组DNA克隆该核酸序列可以通过例如采用熟知的聚合酶链式反应 (PCR)来实现。见,例如Innis等,1990,PCR操作:方法和应用的 指导(PCR Protocols:A Guide to Methods and Application),Academic Press,纽约。该克隆程序可能涉及:切 割和分离含有编码该多肽的核酸序列的目的核酸片段,将该片段插入 载体分子中,并将该重组载体掺入突变真菌细胞中,在此突变细胞中 将复制多个拷贝或克隆的该核酸序列。该核酸分子可以是基因组、 cDNA、RNA、半合成、合成来源的,或是它们的任意组合。

在本发明的方法中,异源多肽还可以包括在该多肽或其片段的N- 端或C-端融合了另一个多肽的融合或杂合多肽。融合多肽可以通过编 码一个多肽的核酸序列(或其部分)与编码另一个多肽的核酸序列 (或其部分)的融合来产生。制备融合多肽的技术是本领域已知 的,包括连接编码这些多肽的编码序列,以使它们符合阅读框并且该 融合多肽的表达处于相同的启动子和终止子的控制之下。该杂合多肽 可以含有从至少两个不同多肽获得的部分或完整多肽序列的组合,其 中一或多个多肽对于该突变丝状真菌细胞而言可能是异源的。

可以通过各种方式操作编码目的异源多肽的分离核酸序列,以便 该多肽表达。表达应理解为包括该多肽产生所涉及到的任何步骤,包 括但不限于转录、转录后加工、翻译、翻译后加工和分泌。在该核酸 序列插入载体之前对其进行操作可能是所希望的或必须的,这取决于 所述表达载体。利用克隆方法修饰核酸序列的技术是本领域所熟知 的。

“核酸结构”在本文中定义为这样一种核酸分子,该分子可以是 单链的也可以是双链的,可以是从天然存在的基因分离的,也可以是 经修饰而含有以天然所不存在的方式联合和并置在一起的核酸片段。 当核酸结构含有表达编码序列所要求的所有控制序列时,术语核酸结 构与术语表达盒同义。术语“编码序列”在本文中定义为可以被转录 成mRNA并翻译成多肽的序列。编码序列的边界一般由mRNA 5’端恰好 位于可读框上游的ATG起始密码子,和mRNA 3’端恰好位于可读框下游 的转录终止子序列来确定。编码序列可以包括但不限于基因组、 cDNA、RNA、半合成、合成、重组序列或它们的任意组合。

术语“控制序列”在本文中定义为包括所有对异源多肽的表达必 需或有利的成分。每一个控制序列对于编码该多肽的核酸序列而言均 可以是自身的或外来的。这些控制序列包括但不限于前导序列、聚腺 苷酸化序列、前肽序列、启动子、信号肽序列和转录终止子。作为最 低限度,该控制序列包括启动子以及转录和翻译的终止信号。为了引 入特定限制性位点以便于这些控制序列与编码异源多肽的核酸序列的 编码区连接,可以提供带接头的控制序列。术语“可操作地连接”在 本文中定义这样一种构型,在该构型中控制序列被置于一个相对于该 DNA序列的编码序列合适的位置以致该控制序列可以指导异源多肽的 产生。

该控制序列可以是适合的启动子序列,即丝状真菌细胞识别的用 于所述核酸序列表达的核酸序列。该启动子序列含有介导所述异源多 肽表达的转录控制序列。该启动子可以是在所述丝状真菌细胞中表现 出转录活性的任何核酸序列,包括突变启动子、截短启动子和杂合启 动子,并且该启动子可以从编码与该细胞同源或异源的细胞外或细胞 内多肽的基因获得。

在本发明方法中用于指导核酸结构转录的适合启动子的例子是从 编码如下蛋白质的基因获得的启动子:米曲霉TAKA淀粉酶、 Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、黑曲 霉酸稳定的α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、 Rhizomucor miehei脂肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异 构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米曲霉乙酰胺酶(amdS)和尖镰孢胰蛋白 酶样蛋白酶(美国专利4,288,627),以及它们的突变的、截短的和 杂合的启动子。尤其优选的启动子是NA2-tpi启动子(来自编码黑曲 霉中性α-淀粉酶和米曲霉丙糖磷酸异构酶的基因启动子的杂合 物)、葡糖淀粉酶启动子和TAKA淀粉酶启动子。

该控制序列还可以是适合的转录终止子序列,即由丝状真菌细胞 识别以终止转录的序列。该终止子序列可操作地与编码该异源多肽的 核酸序列的3’端连接。任何在该丝状真菌细胞中起作用的终止子均可 以用于本发明。

优选的终止子获自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、 构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶、黑曲霉α-葡糖苷酶和尖镰孢胰蛋白 酶样蛋白酶的基因。

该控制序列还可以是适合的前导序列,即对于该丝状真菌细胞中 的翻译重要的mRNA非翻译区。该前导序列可操作地与编码所述异源多 肽的核酸序列的5’端连接。任何在该丝状真菌细胞中起作用的前导序 列均可用于本发明。

优选的前导序列获自编码米曲霉TAKA淀粉酶和构巢曲霉丙糖磷酸 异构酶的基因。

该控制序列还可以是聚腺苷酸化序列,即与所述核酸序列3’末端 可操作地连接的,并在转录时被丝状真菌细胞作为向转录的mRNA添加 聚腺苷酸残基(polyadenosine residues)的信号而识别的序列。 任何在该丝状真菌细胞中起作用的聚腺苷酸化序列均可用于本发明。

优选的聚腺苷酸化序列获自编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉葡 糖淀粉酶、构巢曲霉邻氨基苯甲酸合成酶和黑曲霉α-葡糖苷酶的基 因。

该控制序列还可以是编码与该异源多肽氨基末端连接的氨基酸序 列,并指导该编码的多肽进入细胞分泌途径的信号肽编码区。所述核 酸序列的编码序列的5’端本身可含有在翻译阅读框中天然与编码分泌 多肽的编码区片段连接的信号肽编码区。或者,该编码序列的5’端可 含有对该编码序列而言外源的信号肽编码区。在编码序列天然不含有 信号肽编码区的时候,可能需要此外源信号肽编码区。或者,为了增 强所述多肽的分泌,可以简单地用该外源信号肽编码区替代天然信号 肽编码区。该信号肽编码区可以获自曲霉属的葡糖淀粉酶或淀粉酶基 因,或Rhizomucor属的脂肪酶或蛋白酶基因。然而,任何指导该表 达的异源多肽进入丝状真菌细胞的分泌途径的信号肽编码区均可用于 本发明。

有效的信号肽编码区是从编码米曲霉TAKA淀粉酶、黑曲霉中性 淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和Humicola lanuginosa纤维素酶的基因获得的信号肽编码区。

该控制序列还可以是编码位于多肽氨基末端的氨基酸序列的前肽 编码区。所获得的多肽被称为酶原(proenzyme)或多肽原(或有时 叫酶原(zymogen))。多肽原通常是无活性的,并能通过前肽的催 化切割或自身催化切割从多肽原转化成成熟的活性多肽。前肽编码区 可从编码Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶和Myceliophthora thermophila漆酶(WO 95/33836)的基因获得。

当多肽的氨基末端同时存在信号肽和前肽区时,前肽区紧邻该多 肽的氨基末端,而信号肽区紧邻前肽区的氨基末端。

该核酸结构还可以含有编码一或多个有利于指导该异源多肽表达 的因子的一或多个核酸序列,例如转录激活因子(如反式作用因 子)、陪伴分子和加工蛋白酶。任何在丝状真菌细胞中起作用的因子 均可以用于本发明。编码一或多个这些因子的核酸并不一定与编码该 异源多肽的核酸序列串联

也可期望加入允许相对于所述丝状真菌细胞的生长而调节该异源 多肽表达的调节序列。调节系统的例子是那些使该基因表达响应化学 或物理刺激而打开或关闭的调节系统,这些刺激包括调节化合物的存 在。TAKAα-淀粉酶启动子、黑曲霉葡糖淀粉酶启动子和米曲霉葡糖 淀粉酶启动子可以用作调节序列。调节序列的其它例子是那些允许基 因扩增的序列,例如在重金属存在时扩增的金属硫蛋白基因。在这些 情况下,编码该异源多肽的核酸序列将与该调节序列可操作地连接。

可以将上述的各种核酸和控制序列连接起来以产生如下重组表达 载体,该载体可以包括一或多个方便的限制性位点以允许编码该外源 多肽的核酸序列在这些位置的插入或替代。或者,可以通过将编码该 异源多肽的核酸序列或含有该序列的核酸结构插入合适的表达载体中 来实现该核酸序列的表达。在构建表达载体时,将所述编码序列置于 该载体中以使该编码序列可操作地与用于表达和可能用于分泌的适合 控制序列连接。

该重组表达载体可以是任何能够方便地用于重组DNA程序并能够 实现编码该异源多肽的核酸序列的表达的载体(例如质粒或病毒)。 载体的选择典型地将取决于载体与该载体将要导入的丝状真菌细胞之 间的相容性。该载体可以是线性或闭合环状质粒。该载体可以是自主 复制型载体,即以染色体外实体形式存在而且其复制独立于染色体复 制的载体,例如质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。该 载体可以含有任何用于保证自我复制的序列。或者,该载体可以是当 导入该丝状真菌细胞时整合至基因组中并与其所整合的染色体一起复 制的载体。该载体系统可以是单个载体或质粒,或一起含有待导入该 丝状真菌细胞基因组的全部DNA的两个或多个载体或质粒,也可以是 转座子。

该载体优选含有一个或多个允许方便地对转化的丝状真菌细胞进 行筛选的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重 金属抗性、相对营养缺陷型的原养型等的基因。用于丝状真菌宿主细 胞的选择标记可以包括但不限于amdS(乙酰胺酶)、argB(氨酸 氨甲酰基转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转移酶 (phosphinothricin acetyltransferase))、hygB(潮霉素磷酸 转移酶)、niaD(硝酸还原酶)、pyrG(乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧 酶)、sC(硫酸腺苷酰转移酶(sulfate adenyltransferase))、 trpC(邻氨基苯甲酸合成酶),以及它们的等同物。优选在丝状真菌 细胞中使用的是构巢曲霉或米曲霉的amdS和pyrG基因以及吸水链霉 菌(Streptomyces hygroscopicus)的bar基因。

该载体优选包含允许该载体稳定整合至丝状真菌细胞基因组中或 允许该载体在该细胞中独立于该细胞基因组而自主复制的一个或多个 元件。

“导入”意味着将含有所述核酸序列的载体导入丝状真菌细胞中 以致该载体作为染色体整合体或自我复制的染色体外载体而存在。整 合一般被认为是有利的,因为这样更有可能在细胞中稳定地保持该核 酸序列。该载体在染色体中的整合可以通过同源重组、非同源重组或 转座来实现。

以本质上已知的方式,向丝状真菌细胞导入表达载体可能涉及到 由原生质体形成、原生质体转化和细胞壁再生组成的过程。适用于转 化曲霉属宿主细胞的方法描述于EP 238023和Yelton等,1984,美 国国家科学院院刊(Proceeding of the National Academy of Sciences USA)81:1470-1474。转化镰孢霉属的适合方法描述于 Malardier等,1989,基因(Gene)78:147-156或WO 96/00787。

为了整合至丝状真菌细胞的基因组中,该载体可以依赖于编码该 异源多肽的核酸序列或任何其它载体元件使该载体通过同源或非同源 重组稳定整合至基因组中。或者,该载体可以含有用于指导载体通过 同源重组整合至该丝状真茵细胞基因组中的额外核酸序列。这些额外 核酸序列使得载体可以在一或多条染色体的一个或多个精确位置整合 至基因组中。为了增加在精确位置整合的可能性,整合元件应优选含 有足够数目的与相应靶序列高度同源以增强同源重组可能性的核酸, 如100-1,500碱基对,优选400-1,500碱基对,最优选800-1,500 碱基对。这些整合元件可以是任何与该丝状真菌细胞基因组中的靶序 列同源的序列。而且,这些整合元件可以是非编码或编码核酸序列。 另一方面,该载体可以通过非同源重组至细胞的基因组中。

对于自主复制,该载体可以进一步含有使得该载体可以在所讨论 的丝状真菌细胞中进行自主复制的复制起点。

应当理解,对于获得该突变丝状真菌细胞,本发明的方法并不限 于某个特定顺序。在构建用于产生异源多肽的细胞的过程中可以在任 何步骤将环已缩酚肽产生所涉及的基因的修饰导入亲本细胞中。优选 在编码异源多肽的基因导入之前,采用本发明的方法制备缺少环己缩 酚肽的丝状真菌突变体。

用于将本文所描述的元件连接起来以构建重组表达载体的方法是 本领域技术人员所熟知的(见例如J.Sambrook,E.F.Fritsch和T. Maniatus,1989,分子克隆:实验室手册(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),第2版,Cold Spring Harbor,纽约)。

本发明还涉及获得缺少环己缩酚肽的丝状真菌突变细胞的方法, 其包括(a)向亲本丝状真菌细胞导入第一核酸序列和第二核酸序列, 其中所述第一核酸序列含有对环己缩酚肽产生所涉及的至少一个基因 的修饰,而所述第二核酸序列编码异源多肽;和(b)鉴定从步骤(a)获 得的含有该修饰核酸序列的突变体,其中在相同条件下培养时该突变 细胞比该突变细胞的亲本丝状真菌细胞产生较少的环己缩酚肽。

本发明还涉及用于产生异源多肽的缺少环己缩酚肽的丝状真菌细 胞突变体,其包含含有对环己缩酚肽产生所涉及的至少一个基因的修 饰的第一核酸序列以及编码所述异源多肽的第二核酸序列,其中在相 同条件下培养时该突变体比该突变细胞的亲本丝状真菌细胞产生较少 的环己缩酚肽。

本发明还涉及分离的环己缩酚肽合成酶。术语“环己缩酚肽合成 酶活性”在本文中定义为催化从D-2-羟基异戊酸、支链L-氨基酸(例 如缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)、S-腺苷甲硫氨酸和ATP产生环己缩 酚肽的合成酶活性。对于本发明,环己缩酚肽合成酶活性根据Zocher 等(1982,生物化学(Biochemistry)21:43-48)的方法通过测定环 己缩酚肽的产量来确定。具体地,在100ul总体积中将该环己缩酚肽 合成酶与1mM缬氨酸、0.2mM S-腺苷甲硫氨酸、0.2mM D-2-羟基异戊 酸、4mM ATP和4mM Mg(OAc)2,于50mM MOPS pH7.0中37℃孵育10分 钟。基于Visconti等(1992,同上)的方法按本文所述测定环己缩 酚肽的量。1个单位的环己缩酚肽合成酶活性定义为在37℃,pH7.0 的情况下每分钟产生1.0μmol的环己缩酚肽。

在第一个实施方案中,本发明涉及这样的具有环己缩酚肽合成酶 活性的分离环己缩酚肽合成酶,该酶具有与SEQ ID NO:2中所含成熟 多肽有至少大约65%、优选至少大约70%、更优选至少大约80%、甚至 更优选至少大约90%、最优选至少大约95%、甚至最优选至少大约97% 一致程度的氨基酸序列(下文称作“同源环己缩酚肽合成酶”)。在 一个优选的实施方案中,该同源环己缩酚肽合成酶的氨基酸序列与 SEQ ID NO:2中所含成熟多肽相差5个氨基酸,优选4个氨基酸,更优 选3个氨基酸,甚至更优选2个氨基酸,最优选1个氨基酸。对于本发 明,两个氨基酸序列之间的一致程度通过Clustal方法(Higgins, 1989,CABIOS 5:151-153),采用LASERGENETM MEGALIGNTM软件以及 同一性表和下列多序列比对参数来确定:断缺区罚分为10,断缺区长 度罚分为10。两两比对参数是:Ktuple=1、断缺区罚分=3、窗口=5 以及对角线(diagonals)=5。

优选地,本发明环己缩酚肽合成酶含有SEQ ID NO:2的氨基酸序 列或其等位变体;或其具有环己缩酚肽合成酶活性的片段。在一个更 优选的实施方案中,本发明环己缩酚肽合成酶含有SEQ ID NO:2的氨 基酸序列。在另一个优选的实施方案中,本发明环己缩酚肽合成酶含 有SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽,或其等位变体;或其具有环己 缩酚肽合成酶活性的片段。在另一个优选实施方案中,本发明环己缩 酚肽合成酶含有SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽。在另一个优选实 施方案中,本发明环己缩酚肽合成酶由SEQ ID NO:2的氨基酸序列, 或其等位变体;或其具有环己缩酚肽合成酶活性的片段构成。在另一 个优选实施方案中,本发明环己缩酚肽合成酶由SEQ ID NO:2的氨基 酸序列构成。在另一个优选实施方案中,该环己缩酚肽合成酶由SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽,或其等位变体;或其具有环己缩酚肽 合成酶活性的片段构成。在另一个优选实施方案中,该环己缩酚肽合 成酶由SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽构成。

SEQ ID NO:2的片段是指从该氨基酸序列的氨基和/或羧基端缺失 了一或多个氨基酸的多肽。优选地,片段含有至少2854个氨基酸残 基,更优选含有至少2954个氨基酸残基,最优选含有至少3054个氨 基酸残基。

等位变体是指占据相同染色体座位的一个基因的两种或多种可替 代形式中的任意一种。等位变异通过突变自然发生,并可导致种群内 的多态现象。基因突变可以是沉默的(在编码的多肽中没有变化), 也可编码具有改变的氨基酸序列的多肽。多肽的等位变体是由基因的 等位变体编码的多肽。

同源环己缩酚肽合成酶的氨基酸序列与SEQ ID NO:2或其成熟多 肽的氨基酸序列的差别可以是一个或多个氨基酸残基的插入或缺失和 /或一个或多个氨基酸残基被不同氨基酸残基替代。优选地,氨基酸 的改变在性质上是较小的,即是不显著影响该蛋白质的折叠和/或活 性的保守氨基酸替换;小的缺失,典型的是1到约30个氨基酸的缺 失;小的氨基或羧基末端突出,如氨基末端的甲硫氨酸残基;不超过 约20-25个残基的小接头肽;或通过改变净电荷或其它功能便于纯化 的小突出,如聚组氨酸序列、抗原表位或结合域。

保守替代的例子是在以下各组内部的替代:碱性氨基酸(精氨 酸、赖氨酸和组氨酸),酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸),极性氨 基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺),疏水性氨基酸(亮氨酸、异亮氨酸和 缬氨酸),芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)和小氨基酸 (甘氨酸、丙氨酸、丝氨酸、苏氨酸和甲硫氨酸)。通常不改变比活 性的氨基酸替代是本领域已知的,并描述于例如H.Neurath和R.L. Hill,1979,蛋白质(The Proteins),Academic Press,纽约。 最常发生的交换是Ala/Ser,Val/Ile,Asp/Glu,Thr/Ser, Ala/Gly,Ala/Thr,Ser/Asn,Ala/Val,Ser/Gly,Tyr/Phe, Ala/Pro,Lys/Arg,Asp/Asn,Leu/Ile,Leu/Val,Ala/Glu如 Asp/Gly,以及它们的反向交换。

在第二个实施方案中,本发明涉及在低严紧条件,更优选中等严 紧条件,甚至更优选高严紧条件,最优选极高严紧条件下和在相同条 件下与下列序列杂交的核酸探针杂交的核酸序列所编码的分离环己缩 酚肽合成酶:(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii)SEQ ID NO:1的 cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的子序列,或(iv)(i)、 (ii)或(iii)的互补链(J.Sambrook,E.F.Fritsch,和T. Maniatus,1989,分子克隆实验室手册,第二版,Cold Spring Harbor,纽约)。SEQ ID NO:1的子序列可以是至少100个核苷酸, 优选至少200个核苷酸。而且,该子序列可编码具有环己缩酚肽合成 酶活性的多肽片段。该环己缩酚肽合成酶还可以是具有环己缩酚肽合 成酶活性的等位变体或片段。

根据本领域熟知的方法,可使用SEQ ID NO:1的核酸序列或其子 序列,以及SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段,设计核酸探针以从 不同属或种的株系鉴定和克隆编码环己缩酚肽合成酶的DNA。具体 地,该探针可用于与感兴趣的属或种的基因组或cDNA杂交,随后进行 标准Southern印迹程序,以鉴定和分离其中的相应基因。该探针可 比完整序列短得多,但应长至少15个,优选至少25个,更优选至少35 个核苷酸。也可使用更长的探针。既可使用DNA探针,也可使用RNA探 针。为了检测相应基因,典型地对该探针进行标记(例如用32P、3H、 35S、生物素或抗生物素蛋白进行标记)。该探针包括在本发明的范围 之内。

因此,可筛选从这些其它生物制备的基因组DNA或cDNA文库,以 获得与上述探针杂交并编码环己缩酚肽合成酶的DNA。这些其它生物 的基因组或其它DNA可通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳或其它分离 技术分离。来自文库的DNA或该分离的DNA可被转移并固定在硝酸纤维 素或其它适当的载体材料上。为了鉴定与SEQ ID NO:1或其子序列同 源的克隆或DNA,将该载体材料用于Southern印迹。对于本发明,杂 交是指该核酸序列与如下核酸探针在低到极高的严紧条件下杂交,所 述核酸探针相应于(i)SEQ ID NO:1的核酸序列,(ii)SEQ ID NO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的子序列,或(iv) (i)、(ii)或(iii)的互补链。在这些条件下与该核酸探针杂交 的分子用X光胶片检测。

在一个优选实施方案中,该核酸探针是编码SEQ ID NO:2之环己 缩酚肽合成酶的核酸序列或其子序列。在另一个优选实施方案中,该 核酸探针是SEQ ID NO:1。在另一个优选实施方案中,该核酸探针是 SEQ ID NO:1中所包含的成熟多肽编码区。在另一个优选实施方案 中,该核酸探针是大肠杆菌(Escherichia coli)NRRL B-30068中 的质粒pZL-ESA、大肠杆菌NRRL B-30069中的质粒pZL-ESB以及大肠 杆菌NRRL B-30070中的质粒pZL-ESC所包含的所述核酸序列,其中这 些核酸序列编码SEQ ID NO:2的环己缩酚肽合成酶。在另一个优选实 施方案中,该核酸探针是大肠杆菌NRRL B-30068中的质粒pZL-ESA、 大肠杆菌NRRL B-30069中的质粒pZL-ESB以及大肠杆菌NRRL B- 30070中的质粒pZL-ESC所包含的编码SEQ ID NO:2之成熟环己缩酚肽 合成酶的核酸序列。

对于长至少100个核苷酸的长探针,低到极高严紧条件定义为在5 ×SSPE、0.3%SDS、200μg/ml剪切的变性鲑精DNA和或者25%甲酰胺 (对于极低和低严紧条件)或者35%甲酰胺(对于中等和中高严紧条 件)或者50%甲酰胺(对于高和极高严紧条件)中于45℃进行预杂交 和杂交,然后进行标准Southern印迹程序。

对于长至少100个核苷酸的长探针,载体材料最后用2×SSC、 0.2%SDS,优选至少在45℃(极低严紧条件),更优选至少在50℃ (低严紧条件),更优选至少在55℃(中等严紧条件),更优选至少 在60℃(中高严紧条件),甚至更优选至少在65℃(高严紧条件), 最优选至少在70℃(极高严紧条件)洗涤三次,每次15分钟。

对于长约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针,严紧条件定义为 在低于计算的Tm值5℃-10℃的温度下于0.9M NaCl、0.09M  Tris-HCl pH7.6、6mM EDTA、0.5%NP-40、1×Denhardt’s溶液、1mM 焦磷酸钠、1mM磷酸二氢钠(sodium monobasic phosphate)、0.1 mM ATP和0.2mg酵母RNA/ml中进行预杂交、杂交和杂交后洗涤,其 中所述Tm值为使用Bolton和McCarthy(1962,美国国家科学院院刊 48:1390)的计算方法计算的Tm值,然后进行标准Southern印迹程 序。

对于长约15个核苷酸到约70个核苷酸的短探针,载体材料在低于 计算的Tm值5℃-10℃的温度下用6×SCC加0.1%SDS洗涤一次,时间 15分钟,用6×SSC洗涤两次,每次15分钟。

在第三个实施方案中,本发明涉及与具有SEQ ID NO.2之氨基酸 序列的环己缩酚肽合成酶或其成熟多肽具有免疫化学同一性或部分免 疫化学同一性的分离的多肽。该免疫化学性质通过使用熟知的乌赫特 朗尼氏双向免疫扩散(Ouchterlony double immunodiffusion)程 序进行免疫交叉反应同一性试验来确定。具体地,根据Harboe和 Ingild在N.H.Axelsen,J.Kr11和B.Weeks编著的定量免疫电泳 手册(A Manual of Quantitative Immunoelectrophoresis), Blackwell Scientific Publications,1973,第23章,或 Johnstone和Thorpe,实用免疫化学(Immunochemistry in Practice),Blackwell Scientific Publications,1982(更具 体的见第27-31页)中描述的程序,通过免疫兔(或其它啮齿类动 物)制备含有如下多克隆抗体的抗血清,该多克隆抗体可以与具有 SEQ ID NO:2之氨基酸序列的多肽或其成熟多肽的表位发生免疫反应 或结合。具有免疫化学同一性的多肽是当使用特定免疫化学技术时以 相同方式和该抗血清反应的多肽,所述相同方式例如沉淀物的完全融 合、相同的沉淀物形态和/或相同的电泳迁移率。对免疫化学同一性 的进一步解释由Axelsen,Bock,和Krll描述于N.H.Axelsen,J. Krll和B.Weeks编著的定量免疫电泳手册,Blackwell Scientific Publications,1973,第10章。具有部分免疫化学同 一性的多肽是当使用特定免疫化学技术时以部分相同方式与该抗血清 反应的多肽,所述部分相同方式例如沉淀物的部分融合、部分相同的 沉淀物形态和/或部分相同的电泳迁移率。对部分免疫化学同一性的 进一步解释由Bock和Axelsen描述于N.H.Axelsen,J.Kr1l和B. Weeks编著,定量免疫电泳手册,Blackwell Scientific Publications,1973,第11章。

所述抗体也可以是单克隆抗体。单克隆抗体可根据例如E. Harlow和D.Lane编著的抗体实验手册(Antibodies,A Laboratory Manual)(1988,冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Press),冷泉港,纽约)中的方法制备和使用。

本发明的分离环己缩酚肽合成酶具有至少20%,优选至少40%,优 选至少60%,甚至更优选至少80%,甚至更优选至少90%,最优选至少 100%的SEQ ID NO.2之成熟多肽的环己缩酚肽合成酶活性。

在一个优选实施方案中,本发明的环己缩酚肽合成酶获自 Fusarium venenatum菌株,更优选获自Fusarium venenatum ATCC 20334或其突变株,例如具有SEQ ID NO:2的氨基酸序列的多肽。

本文所定义的“分离的”环己缩酚肽合成酶是基本上不含有其它 多肽的多肽,例如通过SDS-PAGE确定的,其具有至少约20%的纯度, 优选至少约40%的纯度,更优选约60%的纯度,甚至更优选约80%的纯 度,最优选约90%的纯度,甚至最优选约95%的纯度。

本发明的环己缩酚肽合成酶可以从任何属的微生物获得。

本发明的环己缩酚肽合成酶可以是细菌环己缩酚肽合成酶。例 如,该环己缩酚肽合成酶可是革兰氏阳性细菌的环己缩酚肽合成酶, 如芽孢杆菌属(Bacillus)的环己缩酚肽合成酶,如Bacillus alkalophilus、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、短芽孢杆菌(Bacillus brevis)、环状芽 孢杆菌(Bacillus circulans)、凝结芽孢杆菌(Bacillus coagulans)、灿烂芽孢杆菌(Bacillus lautus)、迟缓芽孢杆菌 (Bacillus lentus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、嗜热 脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)、枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)或苏金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的环己缩酚肽合成酶;或链霉菌属 (Streptomyces)的环己缩酚肽合成酶,如浅青紫链霉菌 (Streptomyces lividans)或鼠灰链霉菌(Streptomyces murinus)的环己缩酚肽合成酶;或革兰氏阴性细菌的环己缩酚肽合 成酶,如大肠杆菌或假单胞菌属(Pseudomonas)的环己缩酚肽合成 酶。

本发明的环己缩酚肽合成酶可以是真菌的环己缩酚肽合成酶,更 优选酵母的环己缩酚肽合成酶,如假丝酵母属(Candida)、克鲁维 酵母属(Kluyveromyces)、毕赤酵母属(Pichia)、酵母属 (Saccharomyces)、裂殖酵母属(Schizosaccharomyces)或 Yarrowia的环己缩酚肽合成酶;或更优选丝状真菌的环己缩酚肽合 成酶如枝顶孢属(Acremonium)、曲霉属(Aspergillus)、短梗霉 属(Aureobasidium)、隐球酵母属(Cryptococcus)、 Filibasidium、镰孢霉属(Fusarium)、腐质霉属(Humicola)、 Magnaporthe、毛霉属(Mucor)、毁丝霉属 (Myceliophthora)、Neocallimastix、脉孢菌属 (Neurospora)、拟青霉属(Paecilomyces)、青霉属 (Penicillium)、Piromyces、裂褶菌属(Schizophyllum)、 Talaromyces、嗜热子囊菌属(Thermoascus)、梭孢壳属 (Thielavia)、Tolypocladium或木霉属(Trichoderma)的环己 缩酚肽合成酶。

在一个优选实施方案中,该环己缩酚肽合成酶是卡尔酵母 (Saccharomyces carlsbergensis)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、糖化酵母(Saccharomyces diastaticus)、 Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母(Saccharomyces kluyveri)、诺地酵母(Saccharomyces norbensis)或 Saccharomyces oviformis的环己缩酚肽合成酶。

在另一个优选实施方案中,该环己缩酚肽合成酶是棘孢曲霉 (Aspergillus aculeatus)、泡盛曲霉(Aspergillus awamori)、臭曲霉(Aspergillus foetidus)、日本曲霉 (Aspergillus japonicus)、构巢曲霉(Aspergillus nidulans)、黑曲霉(Aspergillus niger)、米曲霉 (Aspergillus oryzae)、Humicola insolens、Humicola lanuginosa、米黑毛霉(Mucor miehei)、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌(Neurospora crassa)、产紫青霉 (Penicillium purpurogenum)、Trichoderma harzianum、康宁 木霉(Trichoderma koningii)、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉 (Trichoderma viride)的环己缩酚肽合成酶。

在另一个优选实施方案中,该环己缩酚肽合成酶是杆孢状镶孢 (Fusarium bactridioides)、Fusarium cerealis、Fusarium crookwellense、大刀镰孢(Fusarium culmorum)、禾本科镰孢 (Fusarium graminearum)、禾赤镰孢(Fusarium graminum)、 异孢镰孢(Fusarium heterosporum)、合欢木镰孢(Fusarium negundi)、尖镰孢、多枝镰孢(Fusarium reticulatum)、粉红 镰孢(Fusarium roseum)、接骨木镰孢(Fusarium sambucinum)、肤色镰孢(Fusarium sarcochroum)、拟分枝孢镰 孢(Fusarium sporotrichioides)、Fusarium sulphureum、 Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides或Fusarium venenatum的环己缩酚肽合成酶。

本发明还涉及编码本发明环己缩酚肽的分离的核酸所述序列。在 一个优选的实施方案中,该核酸序列是SEQ ID NO:1中所示的核酸序 列。在另一个更优选的实施方案中,该核酸序列是大肠杆菌NRRL B- 30068中的质粒pZL-ESA、大肠杆菌NRRL B-30069中的质粒pZL-ESB 以及大肠杆菌NRRL B-30070中的质粒pZL-ESC所包含的序列。在另一 个更优选的实施方案中,该核酸序列是大肠杆菌NRRL B-30068中的 质粒pZL-ESA、大肠杆菌NRRL B-30069中的质粒pZL-ESB以及大肠杆 菌NRRL B-30070中的质粒pZL-ESC所包含的编码该成熟多肽的序列。 在另一个优选实施方案中,该核酸序列是SEQ ID NO:1中所包含的成 熟多肽编码区。本发明还包括编码具有SEQ ID NO:2之氨基酸序列的 多肽或其成熟多肽的核酸序列,由于遗传密码的简并性该核酸序列不 同于SEQ ID NO:1。本发明还涉及编码具有环己缩酚肽合成酶活性的 SEQ ID NO:2片段的SEQ ID NO:1子序列。

SEQ ID NO:1的子序列是指SEQ ID NO:1所包含的核酸序列,只 是已从5’和/或3’端缺失了一个或多个核苷酸。优选地,子序列含有 至少8562个核苷酸,更优选至少8862个核苷酸,最优选至少9162个 核苷酸。

本发明还涉及在SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列中含有至少一 个突变的突变核酸序列,其中该突变核酸序列编码由SEQ ID NO:2中 所包含的成熟多肽组成的多肽。

正如本文所描述的,用于分离或克隆编码环己缩酚肽合成酶的核 酸序列的技术可以包括从基因组DNA分离,从cDNA制备,或它们的组 合。从该基因组DNA克隆本发明的核酸序列可以通过例如采用PCR来实 现,或者可以使用其它核酸扩增程序如连接酶链式反应(LCR)、连 接的激活转录(ligated activated transcription,LAT)和基于 核酸序列的扩增(nucleic acid sequence-based amplification, NASBA)。该核酸序列可以从镰孢霉属株系或另一个或相关的生物克 隆,因此,可以是例如该核酸序列多肽编码区的等位变体或种的变 体。该核序列可以是基因组、cDNA、RNA、半合成、合成来源的,或 它们的任意组合。

本文所用术语“分离的核酸序列”是指基本没有其它核酸序列的 核酸序列,例如通过琼脂糖电泳确定的,其具有至少约20%的纯度, 优选至少约40%的纯度,更优选至少约60%的纯度,甚至更优选至少约 80%的纯度,最优选至少约90%的纯度。

本发明还涉及与SEQ ID NO:1中所含成熟多肽编码区具有至少约 65%,优选约70%,优选约80%,更优选约90%,甚至更优选约95%,最 优选约97%的同源性程度并编码活性多肽的核酸序列。对于本发明, 两个核酸序列之间的同源性程度通过Wilbur-Lipman方法(Wilbur和 Lipman,1983,美国国家科学院院刊80:726-730)采用 LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR,Inc.,Madison,WI)并 使用同一性表和下列多序列比对参数进行确定:断缺区罚分10,断缺 区长度罚分10。两两比对参数为Ktuple=3,断缺区罚分=3,窗口 =20。

对于合成与本发明环己缩酚肽合成酶基本类似的多肽而言,修饰 编码该环己缩酚肽合成酶的核酸序列可能是必需的。术语与该环己缩 酚肽合成酶“基本类似”是指该酶的非天然存在形式。这些多肽可以 以某种被改造的方式与从其天然来源分离的环己缩酚肽合成酶不同, 如具有不同的比活性、热稳定性或最适pH等的该环己缩酚肽合成酶的 变体。该变体序列可以基于作为SEQ ID NO:1的多肽编码部分如其子 序列的核酸序列,和/或通过导入不产生该核酸序列所编码多肽的另 一种氨基酸序列、但又符合用于生产所述酶的宿主生物的密码子选择 的核苷酸替代,或者通过导入可能产生不同氨基酸序列的核苷酸替代 来构建。对于核苷酸替代的一般描述,见例如Ford等1991,蛋白表 达和纯化(Protein Expression and Purification)2:95-107。

本领域技术人员将明了,这些替代可在对于该分子功能关键的区 域之外进行,并仍导致活性多肽。对于本发明分离核酸序列所编码的 环己缩酚肽合成酶的活性必需的、并因此优选不进行替代的氨基酸残 基可根据本领域已知的方法例如定点诱变或丙氨酸扫描诱变 (alanine-scanning mutagenesis)(见例如Cunningham和Wells, 1989,科学(Science)244:1081-1085)来鉴定。在后面的这个技术 中,在该分子的每一个带正电荷的残基处引入突变,并检测所获突变 分子的环己缩酚肽合成酶活性以鉴定对该分子活性关键的氨基酸残 基。也可通过分析用例核磁共振分析、晶体学或光亲和标记等技术 所测定的三维结构来确定底物-酶相互作用的位点(见例如de Vos 等,1992,科学255:306-312;Smith等,1992,分子生物学杂志 (Journal of Molecular Biology)224:899-904;Wlodaver等, 1992,FEBS Letters 309:59-64)。

本发明还涉及编码本发明环己缩酚肽合成酶的如下分离核酸序 列,这些序列可在本文所定义的低严紧条件下,更优选中等严紧条件 下,甚至更优选高严紧条件下,最优选极高严紧条件下与在相同条件 下和如下序列杂交的核酸探针杂交:(i)SEQ ID NO:1的核酸序 列,(ii)SEQ ID NO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的子序 列,或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链;或本文所定义的 这些分离核酸序列的等位变体(Sambrook等,1989,见上)。

本发明还涉及通过如下步骤制备的分离核酸序列:(a)在低、中 等、高或极高的严紧条件下用(i)SEQ ID NO:1的核酸序列, (ii)SEQ ID NO:1的cDNA序列,(iii)(i)或(ii)的子序列, 或(iv)(i)、(ii)或(iii)的互补链杂交DNA;和(b)分离该 核酸序列。所述子序列优选是至少100个核苷酸的序列,例如编码具 有环己缩酚肽合成酶活性的多肽片段的序列。

本发明还涉及制备突变核酸序列的方法,该方法包括向SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列或其子序列中引入至少一个突变,其中所述 突变核酸序列编码由SEQ ID NO:2中所包含的成熟多肽组成的多肽或 其具有环己缩酚肽合成酶活性的片段。

可采用本发明领域已知的任何方法通过定点诱变实现向所述核酸 序列引入突变,以将一个核苷酸更换成另一个核苷酸。利用带有目的 插入片段的超螺旋双链DNA载体和含有期望突变的两个合成引物的方 法是尤其有用的。这两个寡核苷酸引物每个均与载体的相反链互补, 在温度循环过程中依靠Pfu DNA聚合酶进行延伸。通过引物的掺入, 产生含有交错切口的突变质粒。在温度循环之后,用对甲基化和半甲 基化DNA特异的DpnI处理产物,以消化亲本DNA模板和筛选含有突变 的合成DNA。还可使用其它本领域已知的方法。

本发明还涉及含有SEQ ID NO:1的核酸序列或其子序列或同源序 列(homologue)、用于表达该序列的核酸结构、重组表达载体和宿 主细胞。这些结构和载体可以按本文所述方法构建。所述宿主细胞可 以是任何适合该核酸序列表达的细胞。

所述宿主细胞可以是真核生物,例如哺乳动物细胞、昆虫细胞、 植物细胞或真菌细胞。有用的哺乳动物细胞包括中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞、Hela细胞、幼年仓鼠肾(BHK)细胞、COS细胞或任何 可获得的例如从美国典型培养物保藏中心获得的许多其它永生化细胞 系。

在一个优选的实施方案中,所述宿主细胞是真菌细胞。在一个更 优选的实施方案中,该真菌细胞是酵母细胞或丝状真菌细胞。

在一个甚至更优选的实施方案中,该酵母宿主细胞是假丝酵母属 (Candida)、汉逊酵母属(Hansenula)、克鲁维酵母属、毕赤酵 母属、酵母属、裂殖酵母属或Yarrowia属细胞。

在一个最优选的实施方案中,该酵母宿主细胞是卡尔酵母、酿酒 酵母、糖化酵母、Saccharomyces douglasii、克鲁弗酵母、诺地酵 母或Saccharomyces oviformis细胞。在另一个最优选的实施方案 中,该酵母宿主细胞是乳酸克鲁维酵母(Kluyveromyces lactis) 细胞。在另一个最优选的实施方案中,该酵母宿主细胞是Yarrowia lipolytica细胞。

在另一个甚至更优选的实施方案中,该丝状真菌宿主细胞是枝顶 孢属、曲霉属、镰孢霉属、腐质霉属、毛霉属、毁丝霉属、脉孢菌 属、青霉属、梭孢壳属、Tolypocladium或木霉属的细胞。

在一个最优选的实施方案中,该丝状真菌宿主细胞是泡盛曲霉、 臭曲霉、日本曲霉、构巢曲霉、黑曲霉、米曲霉细胞、杆孢状镰孢、 Fusarium crookwellense(Fusarium cerealis的同义词)、大刀 镰孢、禾本科镰孢、禾赤镰孢、异孢镰孢、合欢木镰孢、尖镰孢、多 枝镰孢、粉红镰孢、接骨木镰孢、肤色镰孢、腐皮镰孢、拟分枝孢镰 孢、Fusarium sulphureum、Fusarium torulosum、Fusarium trichothecioides、Fusarium venenatum(例如Fusarium venenatum(Nirenberg sp.nov.))、Humicola insolens、 Humicola lanuginosa、米黑毛霉、Myceliophthora thermophila、粗糙脉孢菌、产紫青霉、Thielavia terrestris、 Trichoderma harzianum、康宁木霉、Trichoderma longibrachiatum、Trichoderma reesei或绿色木霉的细胞。

以本质上已知的方式,真菌细胞可以通过涉及原生质体形成、原 生质体转化和细胞壁再生的方法来转化。曲霉属和镰孢霉属宿主细胞 转化的适当程序描述于本文。转化酵母的程序可以描述于Becker和 Guarente,Abelson,J.N.和Simon,M.I.编,酵母遗传学和分子 生物学指南(Guide to Yeast Genetics and Molecular Biology),酶学方法(Methods in Enzymology),第194卷,第 182-187页,Academic Press,Inc.,纽约;Ito等,1983,细菌学 杂志(Journal of Bacteriology)153:163;和Hinnen等, 1978,美国国家科学院院刊75:1920。

本发明还涉及制备本发明环己缩酚肽合成酶的方法,其包括 (a)培养其野生型形式能产生该环己缩酚肽合成酶的株系,以产生 包含该环己缩酚肽合成酶的上清液;和(b)回收该环己缩酚肽合成 酶。优选地,该株系是镰孢霉属的,而且更优选Fusarium venenatum。

本发明还涉及制备本发明环己缩酚肽合成酶的方法,其包括 (a)在有益于产生该环己缩酚肽合成酶的条件下培养宿主细胞;和 (b)回收该环己缩酚肽合成酶。

在本发明的这些制备方法中,细胞按本文所述采用本领域已知的 方法在适于产生该环己缩酚肽合成酶的营养培养基中培养。该环己缩 酚肽合成酶可以采用本领域已知的特异针对该酶的方法进行检测(见 例如Visconti等,1992,同上)。所获环己缩酚肽合成酶可以按本 文所述通过本领域已知的方法进行回收和纯化。

本发明还涉及制备环己缩酚肽的方法和由本发明环己缩酚肽合成 酶产生的环己缩酚肽。环己缩酚肽的制备可以利用所述分离的合成酶 或通过发酵含有编码该合成酶的基因的细胞来实现(见例如,Madry 等,1993,欧洲应用微生物学和生物技术杂志(European Journal of Applied Microbiology and Biotechnology)17:75-79)。所 述细胞可以是野生型细胞或是重组细胞。该环己缩酚肽可以按任何本 领域已知的方法进行分离和纯化。见例如美国专利5,656,464; Visconti等,1992,同上。

在一个优选的实施方案中,所述用于制备环己缩酚肽的方法包 括:(a)将本发明的环己缩酚肽合成酶与D-2-羟基异戊酸、支链L-氨 基酸、S-腺苷甲硫氨酸和ATP反应;和(b)从该反应中分离此环己缩 酚肽。

在另一个优选的实施方案中,所述用于制备环己缩酚肽的方法包 括:(a)在适于产生该环己缩酚肽的条件下培养细胞,其中该细胞含 有编码如下酶或片段的核酸序列:(i)具有与SEQ ID NO:2中所含成 熟多肽有至少65%一致性的氨基酸序列的环己缩酚肽合成酶;(ii)由 在中等严紧条件下与SEQ ID NO:1的核酸序列或其互补链,或SEQ ID NO:1的至少100个核苷酸的子序列杂交的核酸序列编码的环己缩酚肽 合成酶;(iii)(a)或(b)的等位变体;或(iv)(a)、(b)或(c)的具 有环己缩酚肽合成酶活性的片段;和(b)从该反应中分离环己缩酚 肽。

本发明进一步由以下实施例进行描述,这些实施例不应被理解为 对本发明范围的限制。

                    实施例 菌株

Fusarium venenatum株ATCC 20334用作这些实验的基因组DNA来 源。采用λZipLox克隆系统(Life Teehnologies,Gaithersburg, MD)构建基因组DNA文库,并且采用大肠杆菌Y1090ZL作为重组噬菌 体铺板和纯化的宿主,采用大肠杆菌DH10Bzip用于重组pZL1衍生物 的切割。Fusarium torulosum R-5690(镰孢霉属研究中心,Penn State University,State College,PA)和黑曲霉Bo-1(Novo Nordisk A/S,Bagsvaerd,丹麦)用作杂交实验的对照DNA来源。 tri5缺失的Fusarium venenatum株LyMC1A(WO 96/60137)用作转化 实验的受体。大肠杆菌TOP10(Invitrogen公司,Carlsbad,CA)和 大肠杆菌DH5α株(Gibco-BRL Life Technologies,Bethesda, MD)用于载体构建和常规质粒增殖。 培养基

RA孢子形成培养基每升由50g琥珀酸(二钠盐)、20ml 50× Vogels盐、12.1g NaNO3和1g蔗糖组成。

50×Vogels盐每升由125g柠檬酸钠、250g KH2PO4、10g MgSO4·7H2O、5g CaCl2·2H2O(预先溶解在20ml水中)和5ml 200×Vogels痕量元素。(每种成分在加入下一成分之前均完全溶 解)。过滤除菌。

200×Vogels痕量元素每100ml由5g柠檬酸·1H2O、5g ZnSO4·7H2O、1g Fe(NH4)2(SO4)2·6H2O、0.25g CuSO4·5H2O、0.05g MnSO4·1H2O、0.05g H3BO3和0.05g Na2MoO4·2H2O组成。

氟乙酰胺琼脂(FA)每升由12g乙酸钠、2g氯化钠、0.25g MgSO4、3g KH2PO4、0.3g尿素、2g氟乙酰胺、1ml Vogels盐和15g 纯净琼脂(pH6.1)组成。

Cove培养基每升由342.3g蔗糖、20ml 50×Cove盐溶液、10ml 1M乙酰胺、10ml 1.5M CsCl和25g纯净琼脂组成。

50×Cove盐溶液每升由26g KCl、26g MgSO4·7H2O、76g KH2PO4和 50ml 20×Cove痕量元素组成。  

20×Cove痕量元素每升由0.04g Na2B4O7·10H2O、0.4g CuSO4·5H2O、1.2g FeSO4·7H2O、0.7g MnSO4·H2O、0.8g Na2MoO2·2H2O和 10g ZnSO4·7H2O组成。 实施例1:Fusarium venenatum、Fusarium torulosum和黑曲霉的 基因组DNA提取

Fusarium venenatum、Fusarium torulosum和黑曲霉均在25ml YEG培养基中150rpm、28℃生长24-36小时,该YEG培养基每升由5g酵 母提取物和20g葡萄糖组成。然后通过Miracloth(Calbiochem,La Jolla,CA)过滤回收菌丝体,用25ml l0mM Tris-1mM EDTA(TE) 缓冲液洗涤一次。从该菌丝体排除多余的缓冲液,然后将其在液氮中 冷冻。在电动咖啡磨中将此冷冻菌丝体研成细粉,并将每种粉末加至 一次性塑料离心管内的20ml TE缓冲液和5ml 20%w/v十二烷基硫酸 钠(SDS)中。温和颠倒缓和物几次以确保混匀,然后用等体积酚∶氯 仿∶异戊醇(25∶24∶1 v/v/v)抽提两次。加入乙酸钠(3M溶液)至 终浓度为0.3M,之后用2.5倍体积的乙醇沉淀核酸。该离心管于 15,000×g离心30分钟,空气干燥沉淀30分钟,之后将其重悬在0.5ml TE缓冲液中。加入无DNA酶的核糖核酸酶A至浓度为100ug/ml,将混 合物在37℃孵育30分钟。然后加入蛋白酶K(200ug/ml),将混合物 在37℃再孵育1小时。最后,根据标准程序用酚∶氯仿∶异戊醇 (25∶24∶1 v/v/v)抽提该混合物两次,之后用乙酸钠和乙醇沉淀 DNA。真空干燥该DNA沉淀,然后重悬在TE缓冲液中,并贮存在4℃。 实施例2:杂交实验

采用Southern杂交测试实施例1所述的基因组DNA制品是否存在环 己缩酚肽合成酶基因序列。用BamHI或BamHI加上XbaI消化该DNA的等 分试样,然后通过琼脂糖凝胶电泳分离。根据Dayis等(1980,高级 细菌遗传学,遗传工程手册(Advanced Bacterial Genetics,A Manual for Genetic Engineering),Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)的方法,将凝胶中的DNA印迹至 Hybond N+TM滤膜(Amersham公司,Arlington Heights,IL)上, 并用放射性标记的编码Fusarium torulosum esyn1基因5’部分(获 自Dr.Thomas Hohn,USDA,Peoria,IL)的片段,按本文所述在 低、中和高严紧杂交条件下于45℃进行探测。来自于Fusarium torulosum的该环己缩酚肽合成酶特异性探针片段通过切口平移 (Sambrook等,1989,分子克隆:实验室手册,Cold Spring Harbor Press,Cold Spring Harbor,NY)用α[32P]dCTP (Amersham公司,Arlington Heights,IL)进行放射性标记,通过 加入NaOH至终浓度为0.1M使其变性,然后以大约1×106cpm/ml的活 性将其加入杂交缓冲液中。杂交后,滤膜在含有0.1%SDS的0.2× SSPE中于45℃洗涤一次,接着在0.2×SSPE(无SDS)中于相同温度 洗涤两次。在纸巾上干燥该滤膜15分钟,然后将其包在Saran-wrapTM 中,于-70℃加增感屏(Kodak,Rochester,NY)对X光胶片曝光过 夜。

Southern杂交分析显示,用该Fusarium torulosum esynl探针 仅在低和中等严紧条件下能够在Fusarium venenatum基因组中检测 到环己缩酚肽合成酶特异性DNA序列。来自Fusarium torulosum的阳 性对照DNA在所有条件下均给出强杂交信号,而来自黑曲霉的阴性对 照DNA在检测的所有条件下均不能发生杂交。这些结果提示, Fusarium venenatum含有与Fusarium torulosum恩镰孢素合成酶基 因同源的基因组DNA序列。 实施例3:基因组DNA文库的构建和筛选

根据厂家说明(Life Technologies,Gaithersburg,MD)在λ ZipLox中构建Fusarium venenatum的基因组文库。用Tsp509I部分 消化Fusarium venenatum基因组DNA,并在1%琼脂糖凝胶上进行大小 分离。切下大小范围在3-7kb的迁移DNA片段,并采用Prep-a-Gene试 剂(BioRad,Hercules,CA)从该琼脂糖凝胶条中洗脱该DNA片段。 将该洗脱DNA片段与经EcoRI切割和脱磷酸化的λZipLox载体臂 (Life Technologies,Gaithersburg,MD)连接在一起,并采用 商业包装提取物(Stratagene,La Jolla,CA)包装该连接混合 物。在大肠杆菌Y1090ZL细胞中铺板并扩增该包装DNA文库。

通过噬菌斑杂交(Dayis等,1980,同上),使用Fusarium torulosum esyn1基因的放射性标记探针片段,在实施例2所描述的 低严紧条件下筛选来自上述文库的大约50,000个噬菌斑。在大肠杆菌 Y1090ZL细胞中两次纯化给出杂交信号的噬菌斑,之后从λZipLox载 体切出单个克隆作为pZL1衍生物(D’Alessio等,1992,Focus 14:7)。采用同源Fusarium venenatum探针在高严紧条件下进行染 色体“步移”以获得邻近的DNA序列。

对4个与Fusarium torulosum esyn1基因探针强杂交的噬菌斑进 行鉴定,之后从λZipLox载体切出每一个潜在克隆作为pZL1衍生物 (D’Alessio等,1992,同上)。采用标准方法通过在大肠杆菌 DH10B中传代从这些克隆分离质粒DNA。通过琼脂糖凝胶确定克隆的 插入片段的大小。最大的插入片段含有大约3kb的DNA片段。该克隆命 名为大肠杆菌DH10B pZL-ESA。 实施例4:Fusarium venenatum环己缩酚肽合成酶基因的克隆和分析

采用染料终止化学(dye-terminator chemistry)和Applied Biosystems 377XL型自动DNA测序仪,对该大约3kb DNA片段的DNA进 行测序。使用转座子插入策略产生连续序列(引物岛转座试剂盒, Perkin-Elmer/Applied Biosystems公司,Foster City,CA)。以 6.9的平均冗余度对该完整克隆区进行测序。

核苷酸测序显示,该3kb片段含有一个编码至少900个氨基酸的可 读框。然而,该片段(命名为片段A,pZL-ESA)并不编码完整基因 产物。因此,采用含有片段A3’部分(约1kb HindIII片段)的探针 重新筛选该文库。之后通过限制酶切作图对几个克隆进行鉴定和分 析。第二次获得的这些克隆中最大的含有一大约4.6kb的基因组DNA 插入片段(命名为片段B,pZL-ESB)。该克隆命名为大肠杆菌DH10B pZL-ESB。

片段B的核苷酸序列检测使片段A的可读框由第777位氨基酸延伸 至2311位氨基酸。然而,该序列并未到达该可读框的终止密码子,因 此有必要分离第三个基因组片段。该第三个基因组克隆通过使用来源 于片段B的PCR扩增探针重新筛选该基因组文库来分离。以下显示了用 于扩增用来筛选该文库的586bp探针片段的两个PCR引物。 5’-dAATTGATTCGCTTGAAAGTCGAT-3’(SEQ ID NO:3) 5’-dCTTGAGAGTTACGTTGGTCTTGAAC-3’(SEQ ID NO:4)。

扩增反应(100ul)含有以下成分:0.2ug pZL-ESB DNA, 48.4pmol正向引物,48.4pmol反向引物,dATP、dCTP、dGTP和dTTP 各1mM,1×Taq聚合酶缓冲液,和2.5U的Taq聚合酶(Perkin-Elmer公 司,Branchburg,NJ)。该反应在Ericomp Twin Block System Easy Cycler中进行,程序为:95℃5分钟,1个循环,之后30个循 环,每个循环为95℃1分钟,55℃1分钟和72℃2分钟。

在琼脂糖凝胶上电泳该反应物,获得586bp的预期产物。该反应 物在制备型凝胶上电泳,切下含有目的产物的凝胶条,并采用 Qiaquick凝胶提取试剂盒(Qiagen,Chatsworth,CA)从该凝胶中 分离DNA。

7个用该探针鉴定的克隆中,最大的(片段C,pZL-ESC)含有一 个5.5kb的插入片段。之后的DNA序列分析揭示了,片段C编码从第 1617位至3129位的氨基酸、一个潜在的终止密码子以及1553bp的3’侧 翼DNA。该克隆命名为大肠杆菌DH10B pZL-ESC。从这三个重叠克隆 (片段A、B和C)组装成所述环己缩酚肽合成酶的完整DNA序列。转座 子插入策略允许以高冗余度进行快速测序。

图1显示了该完整DNA序列和推导的氨基酸序列。以6.9的平均冗 余度确定该环己缩酚肽合成酶基因的DNA序列(SEQ ID NO:1)。该 环己缩酚肽合成酶基因含有一个无内含子的9387bp长可读框,其编码 一个3129个氨基酸的多肽(MW=346,852)。

该环己缩酚肽合成酶基因产物的推导氨基酸序列(SEQ ID NO:2)与蒸草镰孢的恩镰孢素合成酶(Haese等,1993,分子微生物 学(Mol.Microbiol.)7:905-914;列于EMBL数据库中索取号为 Z18755的DNA序列)享有大约59%的一致性。通过Clustal方法 (Higgins,1989,CABIOS 5:151-153),使用LASERGENETM MEGALIGNTM软件(DNASTAR公司,Madison,WI)以及同一性表和下列 多序列比对参数来确定一致性百分数:断缺区罚分为10,断缺区长度 罚分为10。两两比对参数是:Ktuple=1、断缺区罚分=3、窗口=5, 对角线=5。 实施例5:pΔES-amdS的构建

图2显示了dps1缺失的载体pΔES-amdS1和pΔES-amdS2的构建。 简单地说,通过StuI和NruI限制性内切酶消化从质粒pZL-ESA(称为 片段A)除去含有dps1编码区一部分的0.2kb DNA片段。这两个酶均 产生平端DNA片段。用小小肠碱性磷酸酶(Boehringer-Mannheim Biochemicals,Indianapolis,IN)处理该消化的pESA载体以防止 自连。最后,通过用SmaI和PmeI消化pJRoy47(WO 99/60137)获得编 码构巢曲霉amdS基因(以及来源于米曲霉pyrG基因的侧翼重复序 列)的3.2kb片段。然后,将该amdS片段与以上描述的pZL-ESA载体 片段连接,产生缺失质粒pΔES-amdSl和pΔES-amdS2(两者仅在 amdS基因片段的方向上不同)。 实施例6:Fusarium venenatum LyMC1A的转化和dps1基因缺失的预 筛选

用SpeI消化质粒pΔES-amdS1,之后切出该5.7kb的缺失片段 (含有Fusarium venenatum dps1基因的部分以及取代0.2kb dps1 编码区的构巢曲霉amdS基因和重复序列),纯化后用于转化实验。根 据Royer,1995,Bio/Technology 13:1479-1483的方法,进行 Fusarium venenatum LyMC1A原生质体的制备和转化。

用该5.7kb SpeIΔES-amdS1片段转化Fusarium venenatum LyMC1A原生质体,并在COVE平板上筛选。获得15个转化体,并进行 单孢纯化。使用Qiagen DNeasy Plant mini试剂盒(Qiagen, Chatsworth,CA)(其中将厂家说明书中所推荐的10分钟裂解孵育时 间改为2小时),从用SpeIΔES-amdS1片段所产生的经单孢纯化的转 化体和Fusarium venenatum LyMC1A提取DNA。每种DNA一至两微克 用XhoI或SpeI消化7个小时(30pl反应物中10U/μgDNA)。该消化物 在1%琼脂糖凝胶上TAE缓冲液中电泳,之后在0.4N NaOH中将该DNA转 移至Hybond N+上。UV交联该印迹,并按下述进行探测。

采用Prime-It标记试剂盒(Stratagene,La Jolla,CA)和α [32P]-dCTP制备探针。标记后,使用G 50 TE Midi柱(5’to 3’, Boulder,CO)将该探针与未掺入的标记物分离。

在Rapid Hyb缓冲液(Amersham,Arlingron Heights,IL)中 于65℃对印迹进行45分钟预杂交。向该Rapid Hyb溶液中加入变性的 探针,并在65℃杂交过夜。杂交后,于室温在2×SSC中洗涤该印迹一 次,5分钟,之后于65℃在0.2×SSC、0.1%SDS中洗涤该印迹两次, 每次5分钟。将该洗涤过的印迹于室温在2×SSC中洗涤5分钟。

对XhoI和SpeI消化的基因组DNA的Southern印迹进行两次探测。 首先,用pΔES-amdS1的800bp NsiI/SpeI片段进行探测。当用该 800bp NsiI/SpeI片段检测时,15个转化体中4个具有由于基因取代 所预期的5.2kb条带(XhoI消化的DNA)和5.7kb条带(SpeI消化的 DNA)。其它转化体大多数产生2.2kb条带(XhoI消化的DNA)或 2.7kb(SpeI消化的DNA)野生型条带,以及其它条带,这极可能是 由该转化DNA的异位整合引起的。

其次,用HindIII线性化的pDSY176探测该相同的Southern印 迹,pDSY176为含有dps1编码区的0.2kb StuI/NruI部分的质粒。 pDSY176的构建如下:用StuI/NruI消化pZL-ESA,通过制备型电泳分 离该0.2kb片段。根据厂家说明书将该分离片段克隆至pZERO-Blunt (Invitrogen公司,Carlsbad,CA),产生pDSY176。采用该第二探 针(pDSY176)进行的杂交分析证实,4个推测的缺失株(Fusarium venenatumΔES 4、6、8和10)均不含已经缺失的该dps1基因0.2kb 区。 实施例7:amdS基因的去除

将两个已验证缺失的转化体,ΔES4A和ΔES8A,于2升冯巴赫瓶 内的500ml RA培养基中形成孢子。用从Cove平板上切下的12个菌丝 孢塞接种,并在24℃以150rpm孵育53小时。这段时间之后,在 Sorval GS3转子中以7,000rpm离心30分钟,通过无菌Miracloth (Calbiochem,San Diego,CA)收获孢子,之后用无菌水洗涤3 次。将新鲜收获的孢子以每个FA平板104、105和106接种(每个浓度接 种5个平板)。将生长在这些平板上的菌落挑至FA和Cove平板上。

在FA平板(主要来自以105和106个孢子/平板接种的平板)上获得 大量菌落,这些菌落传代培养时在FA上生长良好但在Cove上仅有稀疏 生长。32个ΔES4A衍生菌落(命名为Fusarium venenatum WTY700- 3-4)和128个ΔES8A衍生菌落(命名为Fusarium venenatum WTY700-3-8)均有amdS负表型。

采用Qiagen DNeasy Plant Mini Kit(将厂家说明书中所推荐 的10分钟裂解孵育时间改为2小时),从5个Fusarium venenatum WTY700-3-4(WTY700-3-4a至4e)分离株和10个Fusarium venenatum WTY700-3-8株(WTY700-3-8a至8j)以及LyMC1A、Δ ES4A和ΔES8A提取DNA。每种DNA 1微克用XhoI和SpeI(50μl反应体 系中20U/μg DNA)消化过夜。将该消化物浓缩至10μl,并在1%琼脂 糖凝胶上于TBE中电泳。根据厂家说明书将DNA转移至Hybond N+膜 上,然后用实施例6所述探针进行探测。

从这些株系提取的基因组DNA的杂交分析(采用ΔES-amdS1的 800bp NsiI-SpeI片段和HindIII消化的pDSY176(其含有dps1可读 框的200bp StuI-NruI部分)作为探针)揭示,没有一个WTY700-3-4 分离株丢失amdS基因,但50%(5/10)的Fusarium venenatum WTY700-3-8分离株表现出符合去除amdS基因的条带图。因此,杂交 分析证实了,Fusarium venenatum WTY700-3-8a、b、c、d和e缺失 了dps1可读框的200bp StuI/NruI部分。正如对缺失所预期的,采用 上述pDSY176探针在亲本Fusarium venenatum LyMC1A中观察到杂交 信号,而在5个Fusarium venenatum WTY700-3-8a-e株中均无此信 号。

                生物材料的保藏

如下生物材料已根据布达佩斯条约保藏在农业研究机构保藏中心 (NRRL),Peoria,Illinois,并给予了如下保藏号:

保藏物                      保藏号    保藏日期

大肠杆菌DH10B(pZL-ESA)  NRRL B-30068 1998年10月27日

大肠杆菌DH10B(pZL-ESB)  NRRL B-30069 1998年10月27日

大肠杆菌DH10B(pZL-ESC)  NRRL B-30070 1998年10月27日

这些菌株在如下条件下保藏,即确保在本专利申请未决期间由专 利和商标局局长依照37 C.F.R. §1.14和35 U.S.C. §122授权的人可 获得该培养物。该保藏物代表该保藏菌株基本上纯的培养物。如果本 主题申请的等同申请或其派生申请所提交给的国家该外国专利法要 求,可以获得该保藏物。但是,应当理解,可获得保藏物并不构成损 失政府法令所授予的专利权利而实施本主题发明的许可

本文描述和要求保护的本发明的范围并不被本文公开的具体实施 方案限制,因为这些实施方案旨在用作本发明几个方面的举例说明。 任何等同的实施方案都包括在本发明的范围中。实际上,从前面的描 述来看,除了本文给出和描述的之外的本发明各种修改将为本领域技 术人员所明了。这些修改也包括在所附权利要求的范围内。在冲突的 情况下,包括定义在内的本公开将优先。

                  发明背景

本文引用了各种参考文献,它们的公开以参考文献的方式完整地 并入本文。

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