本发明提供一种大蹼铃蟾多肽及其制备方法和在制药中的应用，属于生物医 学领域。

自从抗生素发明以来，人类在控制和治疗微生物感染疾病中取得了较大的成 就，但随着药物的持续使用，目前微生物抗药性已成为临床微生物感染疾病治疗 的重大问题，以至于某些病原细菌已没有临床治疗的一线药物。万古霉素抗性的 葡萄球菌、肠球菌以及其他革兰氏阴性感染疾病目前均是世界范围内的临床难 题。三类主要引起脑膜炎的细菌在临床上也出现了强的抗药性，抗青霉素、氯霉 素脑膜炎双球菌，肺炎球菌，对抗新头孢菌素抗生素的肺炎球菌也广泛出现。因 此新一类抗生素的研制已成为当务之急和国际上的热点。与目前广泛使用的抗生 素相比，多肽抗生素具有很多优点：如在最小作用浓度时，快速而广谱的杀灭微 生物(包括目前临床抗药菌)，对真菌也有抑制作用，抗性菌株生成性小，对局 部感染和全身感染都有效。由此看来，在目前不少病原菌对已有抗生素逐渐产生 耐药性，而新的抗生素发现又极为困难的情况下，多肽类物质正成为新一类抗生 素，其研制目前受到广泛重视。

肿瘤也是危害人类健康的另一类主要疾病，而且治疗药物匮乏，目前在化疗 中所使用的药物，如阿霉素，环磷酰胺等等均具有较大的人体毒性，副作用非常 大，因而肿瘤治疗药物的开发是药物研制的热点。

艾滋病(AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(HIV)引起的破坏肌体免疫系统的致 死疾病。这一被称为“二十世纪瘟疫”的病魔，已蔓延到世界的每个角落，众多 的发展中国家正在遭受它的危害。据WHO最新公布的材料，AIDS流行的国家和地 区达170多个，全球感染HIV者已达4400多万人，已有1400万人死亡，据专家 估计，我国目前实际HIV感染人数超过50万人。由于目前尚无可预防的有效疫 苗，抗HIV药物成为防治AIDS的有效手段。另一方面，目前发现HIV病毒易变 异及对许多药物会产生耐药性，造成治疗上的巨大困难，从传统药物和天然资源 中寻找新的抗AIDS药物和先导化合物的研究，是当前国内外新药研制中的重要 研究方面和非常活跃的领域。

两栖类动物的皮肤和内脏具有广泛的药理活性和临床疗效，很多两栖类动物 在中国属于传统中药和民族药物而广泛应用，如中华蟾蜍(Bufo gargarizans)， 大蹼铃蟾(Bombina maxima)等。已报道药理活性有广谱抗微生物作用、抗肿瘤、 局部麻醉、镇痛、免疫调节、心血管系统作用等。从这些传统药物中寻找特定药 理活性的单体化合物是中药现代化的重要内容之一。在国外，两栖类皮肤特定药 理活性单体化合物的寻找已是新药发明的热点，据文献报道从爪蟾(Xenopus laevis)皮肤分泌液获得的抗菌肽Magainin具广谱抗微生物作用，同时具有抗 肿瘤活性；国外学者也已报道从东方铃蟾(Bombina orientalis)和花铃蟾(Bombina variegata)中分离出若干具广谱抗微生物活性的多肽类物质，如Bombinin和 BLP-like多肽。由于抗菌肽作为新一代抗菌药物的诱人前景，肽类抗生素已引起 世界的广泛关注，如Magainin制药公司宣布，他们生产的爪蟾皮肤抗菌肽 Magainin类似物MSI-78用于治疗926例糖尿病患者因多种细菌感染而引起足部 溃疡的III期临床结果表明，MSI-78与ofloxacin有同样的效果，但产生更小的 副作用。Intrabiotics公司生产的抗菌肽IB-367已获准用于治疗癌症病人因多 种细菌感染而引起的口腔溃疡一期临床试验。动物实验研究表明，天蚕抗菌肽和 蜂毒抗菌肽的部分序列杂合而成的含12-18氨基酸残基的多肽对绿脓假单胞菌 引起的兔眼感染有良好的治疗作用。在国外，抗菌肽已开始用于抗肿瘤和抗带外 壳病毒的研究和治疗，但未见详细的报道。最近，一种两栖类核酸酶对HIV的选 择性抑制作用更引起了人们对两栖类活性物质的注意。

我国对两栖类药物的应用有悠久的历史，但对其活性成分和药理性质的研究 主要集中于生物碱等有机小分子，对其皮肤活性肽类物质的研究还较少。大蹼铃 蟾(Bombina maxima)主要分布于我国的云南、四川省，是我国的特色资源动物之 一，也是特色的民族民间药物。

发明人将本发明的大蹼铃蟾多肽全序列结构经蛋白质数据库进行搜寻比较， 未发现有任何相同多肽。也未发现关于两栖类多肽同时具有抗菌、抗肿瘤、抗病 毒活性的报道。

本发明的目的是基于上述现有技术基础，提供一种具有广谱抗微生物(包括革 兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌、真菌)，抗肿瘤和抗HIV活性的大蹼铃蟾多肽 及其制备方法和在制药中的应用。，

为了实现本发明的目的，本发明提供了如下技术方案：

大蹼铃蟾多肽，是我们首次从两栖类动物大蹼铃蟾皮肤分泌物中分离得到的 一种单链多肽，分子量2698.4，等电点10.0，多肽全序列一级结构为：苏氨酸- 异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨酸-甘氨酸-亮氨 酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙氨酸-丙氨酸-赖 氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸-苏氨酸(NH2- TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH)。

大蹼铃蟾多肽制备的方法，是将活体大蹼铃蟾用水清洗干净，置于带盖的玻 璃容器中，滴加无水乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟， 可见大量的泡沫状物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm， 20分钟)、冷冻干燥后，经DEAE-Sephadex A-50离子交换后，收取所得峰I经 Sephadex G-50凝胶过滤后取峰IV，峰IV再经CM-Sephadex C-25离子交换，取 第三步柱层析分离出的峰II，再经高效液相色谱(HPLC)反相C18柱分离纯化， 取第四步HPLC反相C18柱层析分离出的峰I即可。然后用HPLC方法鉴定其纯度， 分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry， FAB-MS)，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基酸序列结构。

大蹼铃蟾多肽作为制备广谱抗微生物药、抗肿瘤药、抗艾滋病药中的应用。

下面用本发明的大蹼铃蟾多肽的药理实验结果来说明本发明的药效作用和有 益效果：

1，大蹼铃蟾多肽抑制细菌生长的作用：

抗菌活性检测，采用杯碟法，培养基为普通琼脂培养基。分别注入加热融化 的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝固后，另取培养 基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其在底层上均匀摊 布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈钢杯6个。第一 个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采用二倍稀释法加 入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作为最小抑菌浓度 (minimal inhibitory concentration，MIC)。细菌菌株来源于昆明医学院第一 附属医院，此试验重复四次，取平均值，结果如表1。

表1，大蹼铃蟾多肽抑制细菌生长的作用：     菌株     最小抑菌浓度(μg/ml) 粗样品    大蹼铃蟾多肽     大肠杆菌ATCC25922     (Escherichia coli ATCC25922)     金黄色葡萄球菌ATCC2592     (Staphylococcus auneus ATCC2592)     绿脓杆菌CMCCB10104     (Pseudomonas aeruginosa CMCCB10104)     巨大芽胞杆菌     (Bacillus megaterium)     痢疾杆菌     (Bacillus dysenteriae)     肺炎球菌     (Klebsiella pneumoniae)   150       0.45   75        3.1   75        11.2   150       0.45   37.5      0.45   150       3.1

由表1可见，大蹼铃蟾多肽第一步DEAE-Sephadex A-50离子交换粗品及纯 化大蹼铃蟾多肽均具有显著的抑制细菌(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌) 生长的作用，而且与文献报道的其他来源抗菌多肽相比，大蹼铃蟾多肽的抗菌活 性平均高10-50倍。 表2，大蹼铃蟾多肽抑制真菌生长的作用：     菌株 最小抑菌浓度(μg/ml) 粗样品    大蹼铃蟾多肽   白色念珠菌ATCC2002   (Candida albicans ATCC2002)   黄曲霉IFFI4015   (Aspergillus flavus sp IFFI4015)   青霉IFFI2001   (Penicillium sp IFFI2001)   微小毛霉   (Mucor pusillus)   酵母：   啤酒酵母   (Sacharomyces cerervisiae)   25        3.1   75        4.2   ＞300     50   50        5.8   80        6.4

2，大蹼铃蟾多肽抑制真菌生长的作用：

抗真菌活性检测，采用杯碟法。培养基为改良沙保氏(Sabousand)培养基，分 别注入加热融化的培养基20ml于平皿中作为底层，使其在皿底内均匀摊布，凝 固后，另取培养基适量加热融化后，分别在每皿中加入5ml菌悬液，摇匀，使其 在底层上均匀摊布，作为菌层。冷却后，在平皿中等距离均匀放入已消毒的不锈 钢杯6个。第一个钢杯加入0.3mg/ml浓度的待测化合物溶液0.1ml，其余钢杯采 用二倍稀释法加入样品液，37℃培养，观察抑菌圈大小。抑菌圈10mm以上的作 为最小抑菌浓度(minimal inhibitory concentration，MIC)。真菌株来源于云 南大学微生物研究所，此试验重复三次，取平均值，结果如表2。

由表2可见，除抑制细菌生长外，大蹼铃蟾多肽第一步DEAE-Sephadex A-50 离子交换粗品及纯化大蹼铃蟾多肽均具有显著的抑制真菌生长的作用，而且与其 他来源抗菌多肽相比，抗真菌活性平均也高10-50倍。

3，大蹼铃蟾多肽抑制肿瘤细胞生长的作用：

在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍 比稀释，共六个稀释度，每个稀释度设3个重复孔，每孔100μl，同时设置正常 细胞对照。每孔滴加3×105/ml的C8166细胞或Molt-4细胞100μl。置37℃，5％ CO2培养箱内培养。72小时(C8166)或48小时(Molt-4)用MTT方法测定待测 化合物对细胞的毒性作用。EC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓 度。

4，大蹼铃蟾多肽对HIV-1诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用

在96孔平底细胞培养板上，将待测化合物用完全培养基进行5倍或2倍倍 比稀释，共6个稀释度，每孔100μl，同时设置正常细胞对照，HIV感染细胞对 照。每实验孔滴加3×104个C8166细胞和200 TCID50的HIV-1mB，即感染复数为 0.007，每孔的总体积为200μl。置37℃，5％CO2培养箱内培养。感染后第3天 观察待测化合物对合胞体形成的影响。在100倍的倒置显微镜下，选取5个不重 叠的视野，计数HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成的合胞体数。EC50为抑制合胞体 形成达50％时的药物浓度。CC50是对50％宿主细胞产生细胞毒作用时的药物浓 度，治疗指数(TI)为CC50/EC50的比值

表3大蹼铃蟾多肽抑制肿瘤细胞生长的作用： 化合物     EC50(μg/ml)   C8166    Molt 4 大蹼铃蟾多肽粗品 大蹼铃蟾多肽(批号1) 大蹼铃蟾多肽(批号2) 大蹼铃蟾多肽(批号3)     89      78     19.8    24.5     24.4    37.3     29.5    20.9

目前临床上所用大部分抗生素类药物不具有抑制肿瘤细胞作用。由表3可见， 除抑制微生物生长外，大蹼铃蟾多肽粗品及纯化大蹼铃蟾多肽均具有显著的体外 抑制人肿瘤细胞生长的作用。 表4大蹼铃蟾多肽对HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的抑制作用： 化合物                 EC50      CC50    TI                      (μg/ml)  (μg/ml) 大蹼铃蟾多肽粗品       12.5      89      7 大蹼铃蟾多肽(批号1)    3.1       19.8    7 大蹼铃蟾多肽(批号2)    2.4       24.4    10 大蹼铃蟾多肽(批号3)    4.0       29.5    8

从表4可见，与文献报道的其他来源抗菌多肽和目前目前临床上所用抗生素 类药物不同，大蹼铃蟾多肽粗品及不同批号的纯化大蹼铃蟾多肽均有显著的体外 抑制HIV-1IIIB诱导C8166细胞形成合胞体的作用。

从上述实验结果可得出本发明大蹼铃蟾多肽的有益效果在于：

大蹼铃蟾多肽粗品及不同批号的纯化大蹼铃蟾多肽均有显著的抑制细菌和真 菌生长的作用(包括革兰氏阳性细菌，革兰氏阴性细菌，真菌；MIC在0.5-10μg/ml 范围内)。而且与文献报道的其他来源抗菌多肽相比，大蹼铃蟾多肽的抗菌活性 平均高10-50倍。与文献报道的其他来源抗菌多肽和目前目前临床上所用抗生 素类药物不同，大蹼铃蟾多肽具有显著地抑制肿瘤细胞生长的作用，对C8166， Molt-4肿瘤细胞的抑制率EC50平均分别为24.6μg/ml，27.6μg/ml；另一方面， 大蹼铃蟾多肽具显著的抗艾滋病病毒活性，多肽浓度达到3.0μg/ml时，大蹼铃 蟾多肽对病毒复制抑制率达50％。因此，本发明的大蹼铃蟾多肽是一种首次从我 国特色药用生物资源中自己研制的具有抗微生物，抗肿瘤，抗艾滋病病毒的生物 活性多肽。

下面结合附图用实施例来进一步说明本发明的实质性内容，但本发明的内容 并不局限于此。

图1为本发明大蹼铃蟾多肽的DEAE-Sephadex A-50离子交换层析图。

图2为本发明大蹼铃蟾多肽的Sephadex G-50凝胶过滤层析图。

图3为本发明大蹼铃蟾多肽的CM-Sephadex C-25离子交换层析图。

图4为本发明大蹼铃蟾多肽的HPLC反相C18柱层析图。

实施例：

1，制备大蹼铃蟾多肽：

活体大蹼铃蟾用水清洗干净，将大蹼铃蟾置于带盖的玻璃容器中，滴加无水 乙醚(1升体积容积加1毫升无水乙醚)，密闭容器3-5分钟，可见大量的泡沫状 物质从大蹼铃蟾皮肤分泌出来，收集分泌物，离心(10000rpm，20分钟)、冷冻 干燥、低温保存。第一步：DEAE Sephadex A-50离子交换，按上述方法获得原材 料大蹼铃蟾分泌物冻干粉，冻干粉溶解于0.05M Tris-HCl，含10mM EDTA，pH7.3 的缓冲液，装于3.5KDa透析袋，于同样缓冲液透析12小时；DEAE Sephadex A-50(Pharmacia产品)阴离子交换柱(500mm长，26mm直径)经0.05M Tris-HCl，

含10mM EDTA，pH7.3缓冲液平衡，已透析好的样品上柱，经两个柱体积同 样缓冲液冲洗至穿透峰被完全洗脱，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱，收集 穿透峰I。

第二步，Sephadex G-50凝胶过滤：第一步得到的活性成分穿透峰I冻干， 溶解于0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液，上样于Sephadex G-50(Pharmacia 产品)凝胶过滤柱(1000mm长，26mm直径)，用同样缓冲液洗脱，收集峰IV。

第三步，CM Sephadex C-25离子交换：凝胶过滤得到的活性成分峰IV上样 品于经0.1M Na2HPO4-NaH2PO4，pH6.0缓冲液平衡的CM SephadexC-25(Pharmacia 产品)阳离子交换柱(300mm长，26m直径)，再用含NaCl的缓冲液进行梯度洗脱， 收集峰II。

第四步，反相高压液相层析(RP-HPLC)：CM Sephadex C-25离子交换得到 的活性成分峰II以水(含0.1％三氟乙酸)：乙晴(含0.1％三氟乙酸)构成的洗脱 系统进行梯度洗脱，收集HPLC反相C18柱层析峰I(箭头标记)即为大蹼铃蟾多肽。

2，分子量测定采用快原子轰击质谱法(Fast atom bombardment mass spectrometry，FAB-MS)，以甘油∶间硝基苄醇∶二甲亚砜(1∶1∶1，V∶V∶V，体 积比)为底物，Cs+作为轰击粒子，电流为1μA，发射电压为25Kv。

3，纯化大蹼铃蟾多肽用高效液相色谱HPLC方法鉴定其纯度，分子量测定采 用快原子轰击质谱法，等电聚焦电泳测定等电点，用自动氨基酸测序仪测定氨基 酸序列结构。

通过上述方法制备的大蹼铃蟾多肽，是我们首次从中国两栖类动物大蹼铃蟾 皮肤分泌物中分离得到的一种单链多肽，分子量2698.4，等电点10.0，全序列 结构为：苏氨酸-异亮氨酸-苏氨酸-苏氨酸-赖氨酸-赖氨酸-亮氨酸-丝氨 酸-甘氨酸-亮氨酸-赖氨酸-苏氨酸-丙氨酸-亮氨酸-赖氨酸-甘氨酸-丙 氨酸-丙氨酸-赖氨酸-谷氨酸-亮氨酸-丙氨酸-丝氨酸-苏氨酸-酪氨酸- 苏氨酸(NH2-TITTKKLSGLKTALKGAAKELASTYT-COOH)。作为制备抗微生物感染、 抗肿瘤、抗艾滋病药物。