在曲霉属突变细胞中产生多肽的方法
阅读：622发布：2021-04-12
专利汇可以提供在曲霉属突变细胞中产生多肽的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了产生目的多肽的方法,其包括(a)培养亲代曲霉属细胞的突变株,其中(ⅰ)所述突变株包含第一核酸序列和第二核酸序列,其中第一核酸序列编码所述多肽,第二核酸序列包含对负责至少一种毒素之 生物 合成或分泌的基因中至少一个基因的修饰,(ⅱ)所述突变株与亲代曲霉属细胞相比,在相同培养条件下产生较少量的所述毒素;(b)从所述培养物中分离所述多肽。本发明还提供了曲霉属细胞的突变株,以及获得这些突变细胞的方法。，下面是在曲霉属突变细胞中产生多肽的方法专利的具体信息内容。
1.一种产生目的多肽的方法，该方法包括：
(a)培养亲代曲霉属细胞的突变株，其中(i)该突变株含有编码多肽的第 一核酸序列，和(ii)在相同的培养条件下，突变株比亲代曲霉属细胞产生更少 的至少一种相关毒素；和(b)从培养基中分离多肽。
2.权利要求1的方法，其中突变株产生较少的毒素的原因是修饰了至 少一种负责毒素生物合成或分泌的基因。
3.权利要求1或2的方法，其中突变株在相同的培养条件下产生的所 述毒素至少比亲代细胞少90％。
4.权利要求1-3中的任一方法，其中毒素选自环匹阿尼酸，曲酸，3- 硝基丙酸，大黄素，畸形素，黄曲霉毒素，赭曲霉毒素和黑麦酮酸。
5.以上权利要求中的任一方法，其中突变株在相同的培养条件下与亲 代曲霉属细胞相比，产生较少的环匹阿尼酸和至少一种第二类毒素。
6.权利要求5的方法，其中第二类毒素为曲酸或黄曲霉毒素。
7.权利要求5或6的方法，其中突变株在相同的培养条件下比亲代曲 霉属细胞相比，产生较少的3-硝基丙酸。
8.以上权利要求中的任一方法，其中曲霉属细胞选自以下曲霉属亚组： Eurotium亚组，Chaetosartorya亚组，Sclerocleista亚组，Satoia亚组， Neosartorya亚组，Hemicarpenteles亚组，Petromyces亚组，Emericella亚组 和Fenellia亚组。
9.以上权利要求中的任一方法，其中目的多肽源于曲霉属宿主细胞。
10.权利要求9的方法，其中在相同的培养条件下与由亲代曲霉属宿主 细胞中表达情况相比，目的多肽被曲霉属突变宿主细胞过表达。
11.权利要求1到8中的任一方法，其中目的多肽不源于曲霉属宿主细 胞。
12.以上权利要求中的任一方法，其中多肽选自激素或其前体形式、酶 或其变体或前体形式、抗体或其功能性片段、受体或其功能性片段，以及报 道体。
13.权利要求12的方法，其中酶选自氨基肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽 酶、过氧化氢酶、纤维素酶、壳多糖酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧 核糖核酸酶、酯酶、半乳糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉 酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、虫漆酶、脂肪酶、裂解酶、果胶 酸酯分解酶、甘露聚糖酶、甘露糖苷酶、(链球菌)齿斑葡聚糖酶、氧化酶、 加氧酶、果胶酶、肽链内切酶、肽链外切酶、过氧化物酶、肌醇六磷酸酶、 多聚半乳糖醛酸酶、蛋白酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶以及木聚糖酶。
14.一种用以生产目的异源多肽的毒素缺乏型曲霉属突变宿主细胞，该 突变细胞经过遗传学改造使其在相同的培养条件下与亲代曲霉属细胞相比 产生较少的至少一种毒素。
15.权利要求14的突变细胞，其包含编码目的多肽的第一核酸序列和 含有包含对负责毒素之生物合成或分泌的基因中至少一个基因的修饰的第 二核酸序列。
16.权利要求14或15的突变细胞，其中细胞含有至少两个拷贝的第一 核酸序列。
17.权利要求14到16中的任一突变细胞，其中目的多肽源于突变细胞。
18.权利要求14到16中的任一突变细胞，其中目的多肽不源于突变细 胞。
19.权利要求13到18中的任一突变细胞，其中毒素选自环匹阿尼酸、 曲酸、3-硝基丙酸、大黄素、畸形素、黄曲霉毒素、赭曲霉毒素和黑麦酮酸。
20.权利要求13到19中的任一突变细胞，其中毒素包括第一类毒素， 即环匹阿尼酸和选自曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素的第二类毒素。
21.获得权利要求13到20中任一项所定义的毒素缺乏型曲霉属突变宿 主细胞的方法，该细胞在至少一种目的毒素的产生过程中有缺陷，所述方法 包括(a)诱变亲代细胞，和(b)筛选减少或去除了目的毒素产生的突变细胞。
22.权利要求21的方法，其中诱变为随机诱变。
23.权利要求22的方法，其中诱变是特异的，其目的是修饰参与或在 目的毒素的产生或分泌中所必需的核苷酸序列。
24.权利要求22的方法，该方法包含将含有修饰后的至少一种负责毒 素生物的合成或分泌的基因的核酸序列引入曲霉属宿主细胞，以便在介导与 相应的宿主细胞的天然基因同源重组的条件下使所述基因失活，从而用无活 性的改造基因替换天然基因。
25.权利要求21到24中的任一方法，进一步包括将编码目的多肽的核 酸序列引入亲代曲霉属宿主细胞中。
26.权利要求25的方法，其中目的多肽源于曲霉属细胞。
27.权利要求25的方法，其中目的多肽不源于曲霉属细胞。
28.获得权利要求13到20中任一项所定义的毒素缺乏型曲霉属突变宿 主细胞的方法，该方法包含(a)将编码目的多肽的第一核酸序列和含有修饰后 的至少一种负责至少一种毒素的生物合成或分泌的基因的第二核酸序列引 入曲霉属亲代宿主细胞；和(b)从步骤(a)中鉴别出含有核酸序列的突变株。
29.权利要求28的方法，进一步包括在引入第一和第二核酸序列之前 或之后诱变曲霉属亲代宿主细胞。
30.权利要求29的方法，其中诱变通过一步或多步完成，所述步骤选 自特异性或随机诱变，PCR引发的诱变，位点特异性DNA缺失、插入和/或 取代，基因破坏或基因替换技术和反义技术。
31.编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的核酸序列，基 本如SEQ ID NO：1所示。
32.权利要求31的核酸序列或其活性片段在破坏丝状真菌宿主菌株中 类似基因中的用途。
33.权利要求32的用途，其中丝状真菌宿主菌株选自曲霉属、木霉属、 青霉属和镰孢霉属。
34.由米曲霉菌株获得的分离的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸 合成酶，选自：
(a)氨基酸序列基本为SEQ ID NO：2的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L- 色氨酸合成酶；
(b)(a)的等位基因变体；和
(c)具有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶活性的(a)或(b)的 片段。
35.适宜表达异源多肽的曲霉属突变细胞，其中去除了一个或多个沉默 毒素基因。
36.权利要求35的突变细胞，其中通过不可逆缺失或破坏全部或部分 毒素基因的方法去除了一个或多个毒素基因。
37.权利要求35或36中的任一突变细胞，其中曲霉属细胞选自下列曲 霉属亚组中的一种：Eurotium亚组，Chaetosartorya亚组，Sclerocleista亚组， Satoia亚组，Neosartorya亚组，Hemicarpenteles亚组，Petromyces亚组， Emericella亚组和Fenellia亚组。
38.权利要求35-37中的任一突变细胞，其中的毒素基因编码一种或多 种毒素，所述毒素选自环匹阿尼酸，曲酸，3-硝基丙酸，大黄素，畸形素， 黄曲霉毒素，赭曲霉毒素和黑麦酮酸。
39.权利要求35-38中的任一突变细胞，其中所述毒素基因编码黄曲霉 毒素。
40.权利要求35-39中的任一突变细胞，其中毒素基因源于米曲霉黄曲 霉毒素簇的毒素基因，特别是选自：omtA、aflR、pksA、Nor-1、fas-beta、 fas-alpha、vber-1、avnA、ord-2。
41.权利要求40的突变细胞，其中亲代曲霉属细胞是一种米曲霉，特 别是米曲霉A1560(IFO0417)。
42.权利要求41的突变细胞，其中黄曲霉毒素基因选自omtA和aflR。
发明领域
本发明涉及在毒素缺乏型曲霉属突变细胞中产生目的多肽的方法。本发 明也涉及曲霉属细胞的突变株和获得上述突变细胞的方法。
发明背景
近年来，使用重组宿主细胞表达异源多肽极大地简化了一些具有经济价 值的多肽的大量生产，例如工业中使用的关键酶和二级代谢物，而使用其他 方法会面临诸多困难，例如多肽的产量较低或者只能从其天然来源纯化获 得。现在，已有多种表达系统可供选择，从中选择产生任何给定的多肽，这 些表达系统包括真细菌和真核生物宿主。选择一种合适的表达系统经常不但 取决于宿主细胞在产生足够量的具有预期组成和构造的多肽方面的能力，而 且在很大程度上也取决于目的蛋白的预期用途。
使用某些宿主系统时遇到的一个问题是真菌毒素的产生。一些真菌可用 作宿主细胞来产生目的多肽的一些真菌具有编码参与多种毒素生物合成的 酶的基因。例如，环匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素都是已知的 毒素，这些毒素可以在例如黄曲霉中生成。同样，多种真菌中可以产生单端 孢菌毒素，例如镰孢霉属的一些种如Fusarium venenatum和木霉菌属。有关 不同真菌中毒素生成的较详尽的综述可参见《有毒真菌代谢物手册》(Richard J Cole和Richard H.Cox著，Academic Press，1981)。
在目的多肽的发酵生产过程中产生此类毒素是很不合乎要求的，因为这 些毒素会对操作人员、客户和环境带来健康方面的危害。
其结果是，人们投入了大量的努力以确保在相关生产所使用的条件下， 产生的毒素的量不会达到被认为会影响健康的水平。这主要是通过使用庞大 的分析程序对毒素直接进行分析，并且通过生物检测和/或投放饲养方面的研 究进行。在许多种情况下，每一次批量生产均需进行这些庞大的分析，从而 影响了产品造价和产品投放市场的时间。
环匹阿尼酸(此后也称为“CPA”)是一种弱酸(pKa：3.5)并且在酸性环境 下沉淀。其形成的金属螯合物可以被稀酸解离。CPA是一种剧毒物质，它可 以选择性抑制Ca2+-ATP酶并且比其他毒素更易导致多种器官的退行性改变 和坏死。CPA有α和β两种存在形式，其中β型是α型的前体。CPA产生于 曲霉菌，但也可由其他真菌，例如青霉菌产生。
曲酸(此后也称为“KA”)产生于多种曲霉菌，但也可由其他真菌如青 霉菌产生，甚至也产生于一些细菌中。它是一种弱碱(pKa：7.9；酚基)，并与 多种金属离子形成复合物。KA具有抗微生物活性并对动物有微弱毒性。KA 是多种合成化合物例如杀虫剂、染料等的前体。
3-硝基丙酸(此后也称为“3-NPA”)是一种天然硝基化合物。它产生于多 种真菌，特别是曲霉菌(黄曲霉、温特氏曲霉)和青霉菌(P.Atroventum)。有报 道称在一些细菌中有3-NPA存在。还有报道称在一些植物中发现了3-NPA 及其酯。3-NPA本身是一种有相当毒性的物质，可以导致例如贫血症的发生。 而且，在胃肠道内，3-NPA可以部分地转化为另一有毒的亚硝酸盐化合物。 3-硝基丙酸不可逆地抑制琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸盐裂解酶、延胡索酸酶和 天门冬氨酸酶，从而影响三羧酸循环。
黄曲霉毒素是一种生物活性非常高的二级代谢物，由真菌A.flavus Link ex.Fries和Aspergillus parasiticus Speare产生；参见R.W.Detroy等“黄曲霉 毒素及相关化合物”，《微生物毒素》一书，第6卷(A.Ciegler，S.Kadis和S.J.Ajl 编辑)，Academic，New York，1971，3-178页。主要的黄曲霉毒素包括B1、 B2、G1和G2。这些代谢物，特别是黄曲霉毒素B1，不但对动物和人有毒性， 而且也是所有已知的天然化合物中最具致癌性的物质。
畸形素和赭曲霉素由黑曲霉产生。
通过去除或削弱宿主生物产生毒素的能力，不但可以大大简化受规章限 制的批准程序，同时也可以节省消耗在生产阶段的时间和金钱，因为可以减 少分析程序。
现在，亟需毒素缺乏型曲霉属突变细胞(也就是优选分类为GRAS(一般 认为安全)的安全生物)，这种曲霉属突变细胞适于高效、经济地产生目的多 肽。本发明通过使用毒素缺乏型曲霉属突变宿主细胞产生目的多肽，并且提 供了一种构建这类突变宿主细胞的方法满足了该需要。同样，现在亟需提供 曲霉属突变细胞，其在亲代形式中含有一种或多种毒素基因，这些毒素基因 不被表达，即沉默基因。
发明概述
依照本发明的一方面，本发明提供了一种使用曲霉属突变宿主细胞产生 目的多肽的方法，该方法包括(a)培养亲代曲霉属细胞的突变株，其中(i)突变 株包含第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列编码所述多肽，第 二核酸序列包含对负责至少一种毒素之生物合成或分泌的基因中至少一个 基因的修饰，和(ii)所述突变株与亲代曲霉属细胞相比，在相同培养条件下产 生较少量的所述毒素；和(b)从所述培养物中分离所述多肽。
在本发明一个优选实施方案中，突变曲霉属细胞在相同的培养条件下产 生的毒素比亲代细胞至少少90％。更优选地，突变曲霉属细胞在相同的培养 条件下比亲代曲霉属细胞细胞产生的以下毒素中的一种或几种少：环匹阿尼 酸、曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素。
在本发明另一实施方案中，提供了可供产生异源目的多肽的毒素缺乏型 曲霉属突变宿主细胞，该宿主细胞经过遗传学修饰使其在相同的培养条件下 产生的至少一种毒素少于曲霉属亲代细胞。
本发明中的曲霉属突变细胞选自：米曲霉、棘孢曲霉、构巢曲霉、无花 果曲霉、黄曲霉、臭曲霉、酱油曲霉、米酒曲霉、黑曲霉、日本曲霉、寄生 曲霉和海枣曲霉。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种获得毒素缺乏型曲霉属突变宿 主细胞的方法，该方法包括(a)将编码目的多肽的第一核酸序列和含有修饰后 的至少一种负责至少一种毒素的生物合成或分泌的基因的第二核酸序列引 入曲霉属亲代宿主细胞；和(b)从步骤(a)中鉴别出含有核酸序列的突变株。
本发明另一方面涉及曲霉属突变细胞，所述曲霉属突变细胞适于表达异 源多肽，其中一个或多个沉默毒素基因已经被去除。
在下文的说明书中的详细描述中概述了这些和其它的一些实施方案。
附图简述
图1显示了米曲霉DCAT-S基因的基因组限制性酶切图谱，其中所用的 限制性酶为EcoRI、SalI、BbuI、XhoI和XbaI，使用了1kb 32P标记的来自 含有DCAT-S基因的pJaL499的BglII片段作为探针。
图2显示了破坏质粒p(DCAT-s-pyrG)的构建。
发明详述
定义
对了本申请目的，为了更好的理解本发明而对以下术语进行定义。
术语“载体”表示质粒、粘粒、噬菌体或允许插入、增殖和表达某基因 或编码目的多肽的DNA序列包括其前体形式的其他任何介质。
术语“宿主”表示任何允许表达目的多肽包括其前体形式的任何细胞。
术语“转化”表示使得异源DNA序列由细胞表达的融入方式。
术语“突变”宿主(或菌株)表示经遗传学修饰的菌株，其中既包括转化 体也包括野生型菌株的突变株。
术语“毒素”表示有植物毒性、动物毒性和抗生素活性的真菌代谢物。 术语“真菌毒素”一般定义为在暴露水平下对人类和动物的健康造成潜在负 面影响的二级真菌代谢物。在本文中，术语“毒素”和“真菌毒素”可以互 换使用。
用以描述本发明的突变细胞的术语“毒素缺乏型”表示突变细胞与其亲 代菌株比较有不完整的毒素产生情况，即突变细胞比其亲代细胞产生的至少 一种，优选一种以上毒素的少。
本发明方法的步骤(a)中使用的术语“相同条件”将突变株的毒素产生情 况和亲代细胞的毒素产生情况相关联，并且意在指出在突变株和亲代菌株的 发酵生产过程中使用类似的条件，例如pH值、温度、氧气等。可以在有利 于产生目的多肽的条件下或在有利于产生毒素的条件下，将亲代和突变细胞 产生所研究毒素的情况进行比较。
宿主细胞
本发明提供了可用以表达目的多肽的曲霉属宿主细胞的变体，其中细胞 经过遗传学修饰使其与亲代细胞相比，表达的一种或几种毒素的水平显著降 低。宿主细胞可源于亲代细胞，该细胞可以为野生型细胞。
宿主菌株可以是传统上用以表达目的多肽的任何曲霉属宿主细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，用以表达目的多肽的曲霉属宿主细胞 选自下列曲霉属亚组：Eurotium亚组(例如，以局限曲霉为代表)， Chaetosartorya(例如，以淡黄曲霉为代表)，Scleroleista(例如，以华丽曲霉为 代表)，Satoia(例如，以黑曲霉为代表)，Neosartorya(例如，以烟曲霉、鹿色 曲霉为代表)，Hemicarpenteles(例如，以棒曲霉为代表)，Petromyces(例如， 以黄曲霉、白曲霉、稀疏曲霉为代表)，Emericella(例如，以构巢曲霉、杂色 曲霉、赤褐曲霉为代表)和Fenellia(例如，以土生曲霉为代表)。
在本发明一个特别优选的实施方案中，曲霉属宿主细胞选自：米曲霉、 棘孢曲霉、无花果曲霉、黄曲霉、臭曲霉、酱油曲霉、米酒曲霉、黑曲霉、 构巢曲霉和日本曲霉。其中又以米曲霉、黑曲霉、寄生曲霉和海枣曲霉最为 优选。
本发明的宿主细胞的上述实例均依照现在公认的分类法命名。
毒素
毒素，即根据本发明其生产将被减弱或去除，可以是曲霉菌产生的任何 毒素或者是那些由存在于曲霉菌中的基因编码但并不必表达的任何毒素。例 如，已知黄曲霉毒素基因亦存在于米曲霉中，但在此种曲霉中并不表达。虽 然并不表达，但去除黄曲霉毒素通路基因中的基因仍然是有利的。这将在下 文中进一步描述，并在实施例6中详述。
特别地，将被减弱或去除的毒素选自以下物质：环匹阿尼酸(CPA)，例 如其α或β形式，曲酸(KA)，3-硝基丙酸(NPA)，大黄素，畸形素(例如畸形 素A或B)，黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，浅黄霉素，和黑麦酮酸(例如，黑麦 酮酸D)。有关这些毒素的进一步的描述请参阅发明背景中的相应部分，以 及此部分所涉及的《有毒真菌代谢物手册》一书。
本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶(DCAT-S)
本发明也涉及由丝状真菌分离获得的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色 氨酸合成酶，这种酶选自(a)氨基酸序列为SEQ ID NO：2的二甲基烯丙基- 环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶；(b)(a)中所述酶的等位基因变体；和(c)(a)或 (b)的酶的片段，其中所述片段具有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合 成酶活性。
优选地，本发明的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有如 SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者是其等位基因变体。在一个更优选的实 施方案中，本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有与 SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明中的二 甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有SEQ ID NO：2的氨基酸序 列或者其片段，其中所述片段具有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合 成酶活性。SEQ ID NO：2的片段是指在此氨基酸序列的氨基端和/或羧基端 缺失了一个或更多氨基酸的多肽。在一个最优选的实施方案中，二甲基烯丙 基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
优选地，SEQ ID NO：2的片段至少有320个氨基酸残基，而最优选至 少有350个氨基酸残基。
等位基因变体是指占据相同的染色体位点的任何两个或更多的可以相 互替代的基因形式。通过突变可自然产生等位基因变体，并可导致种群中的 表型多样性。基因突变可以是沉默性的(编码的多肽无变化)或者编码改变了 氨基酸序列的多肽。术语“多肽的等位基因变体”是指某基因的等位基因变 体编码的多肽。
SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分序列可以用来设计寡聚核苷酸探 针，或编码本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的核酸 序列，例如SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列可依照本领域已熟知的方 法从其它丝状真菌菌株中识别和克隆编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色 氨酸合成酶的DNA。特别是，依照标准的Southern印记操作法，这类探针 可以用来与有关种属的基因组或cDNA杂交，从而识别并分离相关种属中的 相应基因。这类探针可比全序列短许多，但至少应有15个核苷酸，优选至 少25个，最优选至少40个核苷酸的长度。也可以使用更长的探针。DNA和 RNA探针均可使用。为检测相应基因，一般对探针进行标记(例如，使用32P、 3H、35S、生物素或亲和素标记)。
依照标准的Southern印记操作法，在从低到高的严紧度的条件下进行 (例如，预杂交和杂交反应条件为42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml变形 变性鲑鱼精DNA，低、中、高严紧度分别在25、35或50％的甲酰胺中进行) 的杂交表明，核酸序列与相应于SEQ ID NO：1所示的核酸序列或pJaL499 中所含的多肽编码部分的寡核苷酸探针杂交。
因此，可以从其他丝状真菌菌株制备的基因组、cDNA或重组化学文库 中筛选出与上述探针杂交的编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成 酶的DNA。来自其他丝状真菌菌株的基因组或其他DNA可由琼脂糖或聚丙 烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术制备。文库DNA或分离的DNA可以转移 并固定在硝基纤维素或其他合适的载体物质上。为了识别克隆或与SEQ ID NO：1同源的DNA，在Southern印记中应使用载体物质，其中所述载体物 质最终在2×SSC，0.2％SDS中洗3次，每次30分钟，优选温度至少为50℃， 更优选至少为55℃，更加优选至少为60℃，甚至更优选至少为65℃，甚至 更加优选至少为70℃，和最优选至少为75℃。在这些反应条件下，使用X- 射线胶片检测与寡聚核苷酸探针杂交的分子。
在一个优选的实施方案中，本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L- 色氨酸合成酶来源于曲霉属菌株，更优选地来源于米曲霉，例如具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。
本文所定义的“分离的”二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶 是基本上不含有其他多肽的多肽，例如经SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳)检测至少纯度达约20％，优选至少纯度达约40％，更优选 纯度达约60％，甚至更优选至少纯度达约80％，最优选至少纯度达约90％， 甚至更加最优选至少纯度达约95％。
本发明也涉及由丝状真菌分离获得的编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基- L-色氨酸合成酶的核酸序列，并且在一个优选的实施方案中，此核酸序列来 源于曲霉属例如米曲霉，尤其是SEQ ID NO：1所述的核酸序列。并且在另 一个更为优选的实施方案中，核酸序列为质粒pJaL499中包含的序列。本发 明也包括由于基因密码简并而引起的不同于SEQ ID NO：1的核酸序列。本 发明也涉及SEQ ID NO：1的亚序列或pJaL499中的多肽编码部分，此序列 编码的多肽片段有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶活性。SEQ ID NO：1的亚序列或pJaL499中的多肽编码部分，是除了在5’末端和/或 3’末端缺失了一个或多个核苷酸之外，SEQ ID NO：1所包括的核素序列或 pJaL499中的多肽编码部分。优选地，SEQ ID NO：1的亚序列含有至少870 个核苷酸，更优选地至少960个核苷酸，而最优选地至少含有1050个核苷 酸。
核酸序列可由在分类学上与米曲霉相等同的微生物中获得。
这里描述了用于分离或克隆所述核酸序列的技术。这里使用的术语“分 离的核酸序列”是指其基本上不含有其他核酸序列的核酸序列，例如经琼脂 糖凝胶电泳检测至少纯度达约20％，优选至少纯度达约40％，更优选纯度达 约60％，甚至更加优选至少纯度达约80％，最优选至少纯度达约90％。核酸 序列可以来自于基因组、cDNA、RNA、半合成、合成或以上来源的组合。
对编码本发明的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的核酸序 列进行修饰对合成与多肽基本类似的酶来说可能是必要的。这里的与二甲基 烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶“基本类似的”酶是指此酶的非天然 形式。这些二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶在乙酰改造方法方 面可以不同于由其天然来源所分离出的酶。例如，使用诸如定点诱变的方 法，合成此酶的变体可能是有意义的，其中所述变体在特异活性、热稳定性、 最适pH值或类似性质方面不同。可以在诸如SEQ ID NO：1多肽编码部分 给出的核酸序列的基础上构建同源序列，这些序列包括：例如上述序列的亚 序列，和/或引入了核苷酸取代的序列，所述取代不会造成核酸序列所编码的 多肽的另一氨基酸序列，而是符合用于生产多肽的宿主生物的密码子用途， 或那些引入了核苷酸取代的序列，该取代不会产生不同的氨基酸序列。关于 核苷酸取代的一般性描述，请参见例如Ford等1991年《蛋白质表达和纯化》 第2期：95-107页。
对于熟悉本领域的专业人员来说，显然可以在对分子功能至关重要的区 域外进行上述替换而仍然得到有生物活性的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L- 色氨酸合成酶。使用本领域已知的操作方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱 变(参见，例如Cunningham和Wells，1989年《科学》第224期：1081-1085 页)可以识别出对二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的活性至关重 要的氨基酸残基(其中二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶是由本发 明中分离的核酸序列编码的)，因此这些氨基酸残基优选不被取代。在后一种 诱变技术中，在分子中的每一个带正电荷的残基上引入突变，对得到的突变 分子进行二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶活性的测试，以识别 出对分子活性至关重要的氨基酸残基。使用诸如核磁共振分析、结晶学或光 亲和性标记技术对三维结构进行分析，还可以测定底物和酶之间相互作用的 位点(参见，例如de Vos等，1992年《科学》第255期：306-312页；Smith 等，1992年《分子生物学杂志》第224期：899-904页；Wlodaver等，1992 年《FEBS通信》第309期：59-64页)。
本发明的核酸序列，或其同源序列或其片段的优选用途，是去除或减少 给定宿主细胞中特别是在米曲霉属细胞中二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色 氨酸合成酶的活性，因而可以去除或降低上述细胞中CPA的产生。
本发明还涉及用以表达上述序列的含有SEQ ID NO：1的核酸序列或 pJaL499中多肽编码部分、其亚序列或或同源序列的核酸构建体、重组表达 载体和宿主细胞。构建体和载体可以按照本文的描述构建。宿主细胞可以是 适于表达核苷酸序列的任何细胞，可以是诸如从本文中所述的亲代或突变细 胞中进行选择。
宿主细胞的基因修饰
为了表达显著降低了水平的一种或多种毒素，使用本领域技术人员所熟 知的标准技术对本发明中的宿主细胞进行了基因修饰。将负责产生毒素活性 的基因序列失活或者部分或完全地去除。因此，本发明的曲霉属突变宿主细 胞表达一种或多种毒素的水平降低或检测不到。
在一个特定的实施方案中，对与所选的毒素的形成和分泌有关的各结构 或调节区(例如基因)进行修饰，从而达到将其失活目的。已知有效的技术包 括但并不局限于以下技术：特异性或随机诱变，PCR引发的诱变，位点特异 性DNA缺失、插入和/或取代，基因破坏或基因替换，反义技术，或以上技 术的组合。
可以使用合适的物理或化学诱变因子达到诱变的效果。适宜于本目的的 物理或化学诱变因子包括但并不局限于：紫外辐射，电离辐射(例如γ辐射)， 羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基 甲烷磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠和核苷酸类似物。但使用上述因子时，一般通 过在所选的诱变因子存在下孵育待诱变的细胞，选择那些目标毒素的产生明 显减少的细胞。
通过修饰与给定毒素的产生或分泌过程有关或必需的核苷酸序列，同样 可以减少或去除该毒素在宿主细胞中的产生。例如，核苷酸序列可以编码的 基因产物对于导致毒素产生的通路内具有必要的功能。例如，这样的核苷酸 序列可以是如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或pJaL499中的编码多肽部 分。修饰可以通过在核苷酸序列中引入、取代或去除一个或多个核苷酸或通 过序列转录、翻译中必需的调控元件而完成。例如，可以插入或去除核苷酸 以引入终止密码子、去除起始密码子或改变核苷酸序列的开放读码框。可以 通过本领域已知的定点或随机诱变或PCR引发诱变的方法实现对序列或其 调控元件的修饰或失活。虽然从原则上来说，可以在体内条件下即直接在表 达毒素基因的细胞中完成上述修饰，但目前优选的是如下文描述的那样在体 外进行修饰。
使所选的丝状真菌细胞中目的毒素如CPA失活或减少的方便方法的实 例是基于基因替换、基因缺失或基因破坏技术。例如，在基因破坏方法中， 相应于目的内源型基因或基因片段的核酸序列(例如本发明中的DCAT-3基 因)在体外被诱变产生缺陷型核酸序列，并将此缺陷型核酸序列转化入亲代细 胞中从而产生缺陷型基因。通过同源重组，缺陷型核酸序列取代了内源型基 因或基因片段。一般来说希望缺陷型基因或基因片段同样编码一个标记物， 该标记物可以用于对核酸序列已被修饰或被破坏的转化体进行筛选。
做为另一种选择，可以使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列通过已 确立的反义技术进行基因的修饰或失活。更确切地，可以引入与基因的核酸 序列互补的核苷酸序列减少或去除丝状真菌细胞中此基因的表达，互补核苷 酸序列可以在细胞中转录并能够与细胞中产生的mRNA相杂交。在允许互补 反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译产生的蛋白的量因此减少或消 除。
在诱变或其他修饰毒素通路的基因后，筛选毒素产生减弱或去除的突变 株。如何对毒素进行筛选的方法在以下实施例中给出。另一方面，合适的筛 选分析方法在《有毒真菌代谢物手册》中有述，或者从经常检测诸如食品中 真菌毒素含量的机构处获得。
因此，由于基因修饰，本发明曲霉属突变宿主细胞中毒素的表达水平显 著降低。在一个优选实施方案中，突变宿主细胞中这些毒素的表达水平分别 降低了大于约50％，优选大于约85％，更优选大于约90％，最优选大于约 95％，或甚至更优选大于99％。在另一个优选的实施方案中，本发明曲霉属 突变宿主细胞中的这些毒素在任何组合下均有降低。在一个进一步的具体实 施例中，宿主细胞所表达的产物基本上不含下列毒素的至少一种：环匹阿尼 酸，曲酸，3-硝基丙酸，大黄素，畸形素，黄曲霉毒素，赭曲霉素和黑麦酮 酸。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞所表达的产物基本上不含下列 毒素的至少一种：环匹阿尼酸，更特别地至少不含环匹阿尼酸和曲酸或黄曲 霉毒素，而最优选地至少不含环匹阿尼酸、曲酸和3-硝基丙酸。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是减少或去除了NPA、CPA、曲酸 (KA)或麦芽米曲霉素中的至少一种毒素的产生的米曲霉菌株，优选地为这些 毒素中的至少两种，例如NPA和CPA；NPA和KA；CPA和KA；或NPA、 CPA和KA。而且，除了减少或去除了至少一种所述毒素的产生之外，优选 地，所选的黄曲霉毒素通路的基因也被失活，从而使得所得的突变菌株不能 产生黄曲霉毒素。黄曲霉中的黄曲霉毒素基因已经被充分认识，并可以用来 识别米曲霉中的相应基因，此后可用本领域已知的方法将其失活。
在另一个优选的实施方案中，宿主细胞是减少或去除了一种或几种畸形 素(例如，畸形素A1或B)，一种赭曲霉素(例如，赭曲霉素A)和浅黄霉素生 产的黑曲霉或无花果曲霉，优选地为所述毒素的至少两种，例如畸形素和赭 曲霉素；畸形素和浅黄霉素；赭曲霉素和浅黄霉素；以及畸形素、赭曲霉素 和浅黄霉素的菌株。
在另一个优选的实施方案中，宿主细胞是减少或去除了一种或多种黑麦 酮酸(例如，黑麦酮酸D)或者大黄素(黑麦酮酸D的前体)的产生，优选地为 所述类型毒素的两种的生产同时被减少或去除的棘孢曲霉菌株。
产生多肽的方法
根据本发明的方法，某些目标毒素的量显著减少，然而突变宿主细胞的 特性，即在经遗传修饰的编码目的多肽的基因在细胞中的稳定保持性，细胞 的生产能力和目的细胞的产量基本上被保持。更具体地说，根据本发明的方 法，宿主细胞在产生或分泌一种或多种目的毒素所必需的结构和/或调节区内 经过了遗传修饰，因此去除或减少了所述毒素的产生或分泌。
因此，另一方面，本发明提供了一种在本发明所述的曲霉属突变宿主细 胞中产生多肽或蛋白的方法，其中包括异源型多肽或蛋白，该方法包括将编 码目的多肽的核酸序列引入上述突变宿主细胞中，在合适的生长培养基中培 养突变宿主细胞，以及回收上述目的多肽。
因此，根据本发明的突变宿主细胞必须含有表达目的多肽所必需的结构 和/或调节基因区。这类必需结构和/或调节基因区的本质在很大程度取决于 目的产物和独特的曲霉属宿主菌株。为了对宿主细胞进行转化或转染，本领 域技术人员可以使用标准的重组DNA技术完成本发明的宿主细胞的遗传设 计(参见，例如Sambrook等的文章)。
优选地，应通过本领域已知的方法对宿主细胞进行修饰，以便引入合适 的克隆媒介(即质粒或载体)，克隆媒介中含有编码所需目的多肽的DNA片 段。克隆媒介既可以作为自主复制质粒被引入宿主细胞，也可以整合入染色 体内。更优选地，克隆媒介含有与一个或多个合适的调节区域可操作相连的 一个或多个结构区域。
结构区域是编码目的多肽的核苷酸序列。调节区域包括含有转录和翻译 调控序列的启动子区域，含有终止信号的终止子区域，以及多聚腺苷酸区 域。启动子即在所选宿主细胞中表现转录活性的核苷酸序列，可以来源于编 码胞外或胞内蛋白的基因，优选是来源于编码酶的基因，所述酶例如淀粉 酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶、果 胶酶、角质酶或糖酵解酶。在本发明的方法中，用于引导核酸构建体转录的 合适的启动子的实例是得自编码下列酶的基因的启动子，所述酶是米曲霉 TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、 黑曲霉酸性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂 肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米 曲霉乙酰胺酶(amdS)、尖孢镰孢菌胰岛素样蛋白酶(美国专利第4,288,627)， 以及上述启动子的突变株、截断体和杂合启动子。特别优选的启动子是 NA2-tpi启动子(是源于编码黑曲霉中性α-淀粉酶基因的启动子和源于编码 米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)、葡糖淀粉酶启动子和TAKA 淀粉酶启动子。
克隆媒介也可以含有选择性标记。选择性标记是一个基因，该基因的产 物提供抗生素或病毒抗性，重金属抗性，微生物由原养型向营养缺陷型的转 变以及类似的特性。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可以选自但不局限 于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转 移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷- 5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺嘌呤转移酶)和trpC(氨基苯甲酸盐合成酶)， 以及来源于其他物种的上述选择性标记的等价物。优选用于曲霉属细胞的是 构巢曲霉或米曲霉中的amdS和pyrG基因，和吸水链霉菌中的bar基因。
而且，可以通过共转化实现选择目的，其中以两种载体的混合物转化宿 主细胞而只对一种载体进行选择。
用于分别连接本发明中的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的 操作法，以及将它们插入到合适的含有复制必需信息的克隆媒介的操作均为 本领域技术人员所熟知(参见，例如Sambrook等，1989年；同前)。
使用本领域已知的方法，将突变丝状真菌细胞在适合产生目的多肽的营 养培养基中培养。例如，细胞可以在实验室或工业发酵罐中使用摇动烧瓶培 养、小规模或大规模发酵培养(包括连续、批量、分批加料或固相发酵)的方 式培养在合适的培养基中，培养条件应使异源多肽可被表达和/或被分离。培 养应在含有碳源、氮源和无机盐的合适的营养培养基中进行，使用的方法为 本领域已知的操作方法。合适的培养基可从商业途径获得，也可以依照已经 公开的配方制备而成(例如，美国典型培养物保藏中心的配方)。分泌的多肽 可以直接从培养基中回收获得。
多肽可以使用本领域已知的多肽特异性的方法进行检测。这些检测方法 可包括使用特异性抗体，酶产物的形成，酶底物的消失，或SDS-PAGE。例 如，可以使用酶学分析的方法检测多肽的活性。对于多种酶来说，确定酶活 性的操作法是本领域已知的。
产生的多肽可以通过本领域已知的方法进行分离。例如，从营养培养基 中分离多肽的传统操作包括，但并不局限于：离心、过滤、抽提、喷雾干燥、 挥发或沉淀。分离得到的多肽可以再通过各种本领域已知的操作方法进一步 纯化，这些方法包括，但并不局限于：层析(例如，离子交换层析、亲和层析、 疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)，电泳操作(例如，制备型等电聚焦电 泳)，差示溶解性(例如，硫酸铵沉淀法)或抽提法(参见，例如《蛋白质纯化》 J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCH出版商，纽约，1989)。
产物
所需的最终产物，即由曲霉属突变宿主细胞表达的目的多肽，可以是任 何同源或异源性的蛋白或多肽。
多肽可以是变异丝状真菌细胞的任何异源性多肽。这里的术语“多肽” 并不指某一特定长度的编码产物，而是包含多种多肽、寡肽和蛋白。异源性 多肽也可以是某多肽经工程改造后的突变株。这里术语“异源性多肽”是指 那些并不来源于丝状真菌细胞的多肽。突变丝状真菌细胞可以含有一个或多 个拷贝的编码这种异源性多肽的核酸序列。
在本发明的方法中，突变丝状真菌细胞也可以用来重组产生与细胞天然 存在的多肽。该天然存在的多肽可以通过以下重组的方式得到：例如，将编 码多肽的基因置于不同启动子的控制之下，以增强多肽的表达，通过使用信 号序列而促进目的天然多肽分泌到细胞外，以及增加编码通常由细胞所产生 的多肽的基因的拷贝数而增加肽的产量。在术语“异源性多肽”涉及的范围 内，本发明也包括上述经重组方式产生的同源性多肽，所述范围应使得这类 表达包括使用细胞异源性遗传元件，或使用同源元件但该同源元件经过改造 从而与其在宿主细胞内通常行使的功能有所不同。
在一个更具体的实施方案中，产物是有治疗活性的多肽或蛋白，例如激 素，特别是胰岛素、生长激素、胰高血糖素或促生长素抑制素；白细胞介素， 特别是干扰素；造血生长因子，特别是PDGF(血小板源性生长因子)，EPO(促 红细胞生成素)或TPO(血栓生成素)；蛋白酶，特别是因子VII、因子VIII、 尿激酶、凝乳酶或TPA(组织纤溶酶原激活物)；或者血清白蛋白。
在另一个优选的实施方案中，产物是真菌或细菌源性的酶。优选地，此 酶是一种糖苷酶，例如淀粉酶，特别是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶； 葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶；氨基肽酶；糖酶；羧肽酶；过氧化氢酶；纤维素酶， 特别是内-1，4-β-葡聚糖酶或内-1，3(4)-β-葡聚糖酶；纤维素-1，4-β-纤维二糖 苷酶；壳多糖酶；角质酶；环糊精糖基转移酶；脱氧核糖核酸酶；半乳糖酶； 半乳糖苷酶，特别是α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶；内葡聚糖酶，特别是 内-1，3-β-葡聚糖酶、内-1，3-α-葡聚糖酶、内-1，2-β-葡聚糖酶或内-1，6-β-葡 聚糖酶；葡糖苷酶，特别是α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶；转化酶；虫漆酶； 分解脂肪酶，特别是脂肪酶、酯酶、磷脂酶或溶血磷脂酶；裂解酶或果胶酸 酯分解酶；甘露聚糖酶；甘露糖苷酶；多聚半乳糖醛酸酶；(链球菌)齿斑葡 聚糖酶；氧化酶或氧化还原酶，例如过氧化物酶或多酚氧化酶；加氧酶；胶 质酶，肽链内切酶或肽链外切酶；肌醇六磷酸酶；多聚半乳糖醛酸酶；蛋白 酶；核糖核酸酶；转谷氨酰胺酶；以及木聚糖酶，特别是内-1，4-β-木聚糖酶 或木聚糖-内-1，3-β-木聚糖苷酶。
在另一个优选的实施方案中，产物是一种杂合多肽，例如凝乳酶原和原 胰岛素样蛋白酶。在诸如缺乏显著的蛋白酶活性这样的合适条件下，由宿主 细胞表达的异源性蛋白也可以是一种前体蛋白，例如酶原、杂合蛋白、作为 原序列或前-原序列得到的蛋白，或者任何其他未成熟的形式。
参照以下实施例进一步描述本发明，但不应以任何方式将这些实施例解 释为对所附权利要求书所限定的范围的限制。
去除了沉默毒素基因的曲霉属突变株
在产生黄曲霉毒素的两个种黄曲霉和寄生曲霉中，对黄曲霉毒素的生物 合成途径已经进行了多年的研究。在这两个物种中识别出了许多基因，这些 基因显示出其图谱在一个大的簇内(参见Woloshuk，C.P和Prieto，R，《FEMS 微生物学通信》(1998)160：169-176中的综述)。其中的一些基因已被克隆和 测序，其中包括编码调控通路基因中其他基因表达的aflR基因，以及编码O- 甲基转移酶的omtA基因。
黄曲霉毒素基因存在于米曲霉的基因组中，但在这个物种中并不表达。 虽然黄曲霉毒素并不被表达，但去除一个或更多这样的沉默黄曲霉毒素通路 基因仍然是有利的。去除了黄曲霉毒素基因如aflR和/或omtA的曲霉属突变 株例如米曲霉突变株是有利的，因为这样就不必检测新的突变株中所述黄曲 霉毒素的产生情况。
因此，本发明的一方面涉及适宜表达异源性多肽并且去除了一个或更多 沉默毒素基因的曲霉属突变细胞。
沉默毒素基因已经被“去除”是指正在讨论的基因已被改变或删除，例 如通过本领域已熟知的基因替代或基因破坏技术(参见，例如Miller等，1985 年《分子和细胞生物学》第1714-1721页)，所采用的方式应使得突变细胞中 不含有上述沉默基因。
术语“沉默”毒素基因是指毒素基因不被表达。
可以使用不可逆转的缺失或破坏全部或部分毒素基因的方法去除毒素 基因。
术语“不可逆转的缺失或破坏全部或部分毒素基因”是指所讨论的毒素 基因或者已经被去除，或者已经一定的方式加以改变从而使得上述基因不能 编码毒素且不能自然地回复突变，例如在产生编码毒素的基因期间。
所讨论的曲霉属细胞可以是上文已提及的任何一种，可以选自以下曲霉 属亚组：Eurotium，Chaetosartorya，Sclerocleista，Satoia，Neosartorya， Hemicarpenteles，Petromyces，Emericella和Fenellia。
所讨论的编码一个或更多毒素的毒素基因包括选自以下毒素的毒素：环 匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸、大黄素、畸形素、黄曲霉毒素、赭曲霉素和 黑麦酮酸。
具体考虑的是编码黄曲霉毒素的毒素基因，特别是源于米曲霉黄曲霉毒 素簇的毒素基因，特别是选自以下基因：omtA、aflR、pksA、Nor-1、fas-beta、 fas-alpha、vber-1、avnA、ord-2。
亲代曲霉属细胞可以是米曲霉细胞，特别是米曲霉A1560(IFO 0417)。
实验
材料和方法
1.菌株
米曲霉A1560与IFO 04177一致(见下)。
米曲霉A1560 IFO 4177：来自Institute for Fermentation，Osaka；17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawaku，Osaka，Japan；还参见WO 98/12300。
JaL228：米曲霉菌株，其中用于中性金属蛋白酶—NpI的基因被破坏； 在WO 98/12300中有关于该菌株构建的描述。
BECh 1：在实施例1中有关于该CPA阴性的米曲霉菌株构建的描述。
BECh 2：在实施例1中有关于该CPA阴性和KA阴性的米曲霉菌株构 建的描述。
BECh 3：在实施例1中有关于该CPA阴性和KA阴性的米曲霉菌株构 建的描述。
BZ14：在WO 92/17573中有关于与ToC90和phD450进行共转化的米 曲霉A1560菌株的描述。
JaL250：在实施例6中有关于该米曲霉菌株构建的描述。
保藏：
含有pJaL499质粒的大肠杆菌菌株于1999年1月13日保藏在德国微生 物保藏中心，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，保藏号为DSM 12622。
2.基因
DMAT-S：该基因编码二甲基烯丙基-L-色氨酸合成酶，该酶参与麦角生 物碱的生物合成。
DCAT-S：该基因编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶，该 酶参与环匹阿尼酸(CPA)的生物合成。
pyrG：该基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，该酶参与尿嘧啶核苷的 生物合成。
3.质粒
pAHL：在WO 97/07202中有该质粒的描述。
PCaHj483：在WO 98/00529中有该质粒的描述。
pCaHj493：在实施例2中有该质粒的描述。
pJaL335：在WO 98/12300中有该质粒的描述。
pJaL499：在实施例4中有该质粒的描述。
4.培养基和溶液
用作缓冲液和底物的化学药品均为至少为试剂级的商品。
筛选培养基1(每升)
甘露醇 30g
葡萄糖 10g
琥珀酸 10g
酪蛋白氨基酸 3g
KH2PO4 1g
MgSO4*7H2O 0.3g
FeSO4*7H2O 0.2g
2，6-二氯-4-苯胺 2ppm
琼脂 20g
以14％NH4OH调节最终pH值到5.6。
CoveN
Cove盐溶液 50ml
山梨糖醇 218g
右旋葡萄糖 10g
硝酸钾 2.02g
琼脂 35g
去离子水 1000ml
COVE盐溶液(每升)
KCl 26g
MgSO4 26g
KH2PO4 76g
痕量金属溶液 50ml
CHCl3 2ml
痕量金属溶液(每1升)
Na2B4O7*10H2O 40mg
CuSO4*5H2O 400mg
FeSO4*7H2O 800mg
MnSO4*2H2O 800mg
Na2MoO4*2H2O 800mg
ZnSO4*7H2O 8000mg
Gl-gly
酵母提取物 18g
87％甘油 24ml
Pluronic PE6100 1ml
以自来水补至 1000ml
1/5 MDU-2BP
麦芽糖 9g
MgSO4*7H2O 0.2g
NaCl 0.2g
K2SO4 0.4g
KH2PO4 2.4g
酵母提取物 1.4g
AMG痕量金属 0.1ml
Pluronic PE6100 0.02ml
去离子水补至 1000ml
最终pH值为5.0；
接种前加入1.0ml 50％尿素。
MDU-IB(每1升)
麦芽糖糊精MD0l 45.0g
MgSO4*7H2O 1.0g
NaCl 1.0g
K2SO4 2.0g
KH2PO4 12.0g
酵母提取物 7.0g
AMG痕量金属 0.5ml
Pluronic PE6100 1ml
最终调节pH值到5.0；
接种前加入1.3ml 50％尿素/100ml培养基。
AMG痕量金属溶液(每1升)
FeSO4*7H2O 13.9g
MnSO4*2H2O 8.45g
ZnCl2 6.8g
CuSO4*5H2O 2.5g
NiCl2*6H2O 2.5g
柠檬酸 ＞＝3.0g
痕量金属溶液 1ml
KM2培养基(每1升)
酵母提取物 25g
K2HPO4 10g
MgSO4*7H2O 0.5g
KCl 0.5g
FeSO4 0.01g
葡萄糖 100g
柠檬酸 ＞＝3.0g
最终调节pH值到6.0；
若用于固体培养板，则用20g/L琼脂固化KMZ培养基。
加入300μl/L Triton X-100作为克隆生长限制制剂。
Nakamura培养基(每1升)
蔗糖 50g
蛋白胨 20g
KH2PO4 5g
CaHPO4 2.5g
MgSO4 2.5g
最终调节pH值到6.4。
5.检测分析
A.使用HP毛细管电泳法检测CPA的操作
为进行毛细管电泳(CE)分析，首先通过固相提取法在一个Supelclean LC-18 SPE管(预装3ml来自Supelco的柱，目录号为5-7012，用2ml甲醇 和2ml Milli-Q水进行调节)中制备1ml等分试样。使用抽吸多支管(suction manifold)迫使液体通过柱子。使用3ml Milli-Q水冲洗后，用3ml甲醇洗脱 样品。洗脱物不需进一步处理可直接用于CE分析。偶尔会出现沉淀，但通 过离心法去除。
使用惠普光电二极管阵列CE-仪器(3D-CE)进行CE分析。以34mbar 的静水压用10秒的时间将样品注入。使用30℃下的50mm的毛细管(有效长 度为56cm)，该毛细管用0.1M NaOH处理1分钟，接着用100mM硼酸盐 /NaOH pH9.1处理5分钟。将电压设定为17KV。始终收集紫外光谱以确定 峰值，但同样过程在280nm下进行。以商购的环匹阿尼酸作为标准物(Sigma Co.出产，St.Louis MO，USA，目录号C1530，最低纯度98％)。此方法的 灵敏度下限约为1ppm。
B.使用薄层层析法(TLC)检测CPA的操作
1.平板培养的分析
在Filtenborg O.，Frisvad J.C.和Svendsen JA.所著的“纯净培养基中对 产生霉菌的细胞内真菌毒素的简易筛选方法”(参见《应用和环境微生物学》 一书1983年45：581-585页)中，对琼脂平板的分析作了描述。
2.液体培养物的分析
在TLC平板(Merck Silica Gel 60)两对边各上上清液样品10μl。等分试 样的环匹阿尼酸(Sigma，C1530)用体积比为1∶2的甲醇∶氯仿混合液稀释成 50ppm、25ppm、5ppm和2.5ppm的标准溶液。首先，平板在CAP溶液(体 积比为氯仿∶丙酮∶丙-2-醇＝85∶15∶20)中展开15分钟，干燥，翻转，另一半在 TEF(体积比为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝5∶4∶1)中继续展开15分钟。
另一种方法是将平板在EMA溶液(体积比为乙酸乙酯∶甲醇∶25％氢氧化 铵＝16∶8∶2)中和TEF溶液中按上述方法各展开15分钟。
将平板在通风橱中彻底干燥(1小时)，然后喷洒上Ehrlich试剂(将2g 4- 二甲氨基苯甲醛溶解在85ml 96％乙醇中，随后再加入15ml 37％的盐酸)。
在CAP体系(一种中性体系)中，CPA看上去是蓝紫色的蘑菇形小斑点， 有典型的低迁移率；而酸性TEF体系在上样点和展开剂前沿之间产生典型的 延长形污迹。在EMA体系中(碱/碱体系)，环匹阿尼酸聚集成为密集的小斑 点。
对平板直接的视觉观察，浓度大于等于2.5ppm的CPA看上去为紫色区 域形涂污或斑点(依赖于展开体系的不同)。在台式平台扫描仪上对TLC平板 进行扫描，然后在合适的图像加工程序中增强电子图像(在这种情况下使用的 是Paint Shop Pro 4)，可以使灵敏度增加5倍到10倍。
该分析的总灵敏度(不提取)约为0.5-1ppm CPA；使用提取物增加灵敏度 至少10倍。
C.使用毛细管电泳法检测曲酸的操作
制备1-3ml等分试样用于在一个Supelclean LC-18 SPE管(预装3ml Supelco柱，目录号为5-7012)通过固相提取法进行毛细管电泳(CE)分析，用 甲醇、10mM硼酸盐/NaOH、4M KCl pH9.1进行调理。使用抽吸多支管迫使 流体通过柱子。使用3ml 10mM硼酸盐/NaOH、4M KCl pH9.1和0.3ml 10mM 硼酸盐/NaOHpH9.1冲洗后，用7.5ml 10mM硼酸盐/NaOH pH9.1洗脱样品。 洗脱物不需进一步处理可直接用于CE分析，根据上述对于环匹阿尼酸的操 作进行。偶尔会出现沉淀，但可以通过离心法去除。此方法的灵敏度下限约 为6ppm。
D.使用薄层层析法检测曲酸的操作
按上述对于CPA的方法，在TLC平板两对边上各上等分试样，并使用 与CPA相同的溶液体系展开。干燥后的平板喷洒上1％FeCl3的0.1M HCl溶 液。样品中的曲酸的存在通过红色斑点显示出来，且与作为对照而施用的纯 曲酸产生的红色斑点的强度相比较。该检测的灵敏度下限约为50ppm。
E.使用毛细管电泳法检测3-硝基丙酸(3-NPA)的操作
用于毛细管电泳(CE)分析的样品是否需要经过纯化取决于样品的传导 性。如果传导性低于10mS，样品通过在Varian SAX阴离子交换器(Varian Instruments，Palo Alto CA)进行离子交换并使用0.1M KCl作为洗脱缓冲液纯 化。如果传导性高于100mS，样品需使用2-丁醇提取液提取，其中用酸化/ 高盐处理样品使其沉淀，并再溶于pH 7.0 10mM Tris/HCl中，用6毫升丁醇 提取2ml样品。
使用HP-CE仪器的二极管阵列检测，于30℃使用未包被二氧化硅的50 微米毛细柱(有效长度为56cm)，调节缓冲液为25mM硼酸盐/磷酸盐pH 7.6。以静态水压用20秒的时间将样品注入。设定电压为30KV。该方法的 灵敏度下限为6ppm。
F.使用薄层层析法检测3-硝基丙酸(3-NPA)的操作
在TLC平板上用发酵液点样，并使用用于CPA相同的方法展开。按照 W.Maiak和R.J.Bose在“分离米瑟毒苷和检测脂肪族硝基化合物的层析方 法”(《植物化学》1974年13：1005-1010页)中所述的方法，在其上喷洒上 重氮化的对-硝基苯胺。斑点相对于对照物的强度和位置是3-NPA浓度的量 度。TLC平板上的检测水平为25-50ppm。
另一种方法是，在100μl样品中加入50μl 1M NaOH和70μl重氮化 的对-硝基苯胺，通过分光光度法对3-NPA进行分析。检测水平为5-10ppm。
实施例1
A.米曲霉Bz 14的CPA阴性菌株的构建
冻干的米曲霉Bz 14菌株芽孢经过最适剂量的γ-射线的照射，剂量范围 在1000Gy到1250Gy，然后将这些芽孢以25-50个菌落/9cm平板的密度铺板 在筛选培养基1的平板上。产生环匹阿尼酸的菌落由于有红色不溶性CPA- Fe复合物存在而在筛选培养基1上形成红色反面(菌落的底面)。
从照射后的芽孢中筛选出了大约50,000个菌落并且分离出了154个CPA 缺陷型菌落，这些菌落的特点是有奶油色/白色的外观。在再次分离后，64 个菌株在筛选培养基1的平板上仍然保持非红色外观。使用TLC-plug(平板) 分析法，在52个菌株中未检测到CPA。然后将这些菌株在MDU-1B培养基 中在毒素诱导(34℃，250转/分，培养5天)的摇瓶发酵培养条件下进行培养。 使用TLC进行检测，36个菌株的上清液中不存在可检测水平的CPA。
B.来自米曲霉JaL228的CPA阴性菌株-BECh 1的构建
冻干的JaL228芽孢经过γ-射线照射，并且以上述方法筛选。待确定的无 CPA的分离株在毒素诱导条件下(34℃，250转/分，培养5天)在摇瓶中的 MDU-1B培养基上生长，使用TLC方法检测上清液中的CPA。检测可以在 上清液中直接进行或在上清液提取物中进行。
若使用提取方法，用10ml 0.1M的HCl酸化50ml总样品。然后将该混 合物与70ml甲醇/氯仿(1∶2)混合后剧烈振摇3-5分钟。分相后(约3小时)，将 底层相(大约25ml)转移到一个300ml的烧杯中使氯仿挥发。剩余物再溶于5ml 氯仿中并转移到一个25ml的烧杯中使氯仿挥发。残余物溶于100μl氯仿中。
在TLC平板(20cm×20cm)两对边上各上10μl样品上清液或氯仿提取 物，并按前一章所述的分析方法进行处理。
包括BECh在内的3个分离株不产生CPA。
C.CPA阴性和KA阴性菌株，BECh2和BECh3的构建
将BECh1生长在CoveN的斜面培养基中。在0.01％的Tween中悬起芽 孢至密度为3-5×106，并进行短波紫外辐射(254nm，杀菌灯)。在下面的筛选 中使用紫外剂量辐射的芽孢，该剂量使得1-5％存活。
辐射后的芽孢在KM2培养基中稀释到约0.7个芽孢/100μl，取100μl接 种到96孔微量滴定板的每一个孔中。在34℃的湿箱中静止培养培养物5-7 天。向每孔中加入40μl溶于0.1M HCl中的1％FeCl3作为生长指示剂。
出现强烈的红色代表产生了曲酸(KA)；没有颜色代表菌落不能产生曲 酸。
作为可供选择的另一方法，芽孢铺板于固化的KM2培养基上(在有 Triton x-100下限制性生长)并在成熟菌落出现时将平板用0.1M HCl中的 1％FeCl3浸没。在菌落周围没有红色区域代表推定的不产生曲酸。
从约7000个微量滴定培养板培养物中分离了132个推定不含KA的菌 落，即与FeCl3不发生颜色反应的菌落。然而当在初级KM2筛选琼脂板上测 试时，没有一个菌落被确定为KA阴性。
随后，对固态培养基上和静止液态KM2培养基(30℃)中的阴性菌落再在 KA诱导条件下在液体培养基中进行检测，KA阴性突变株的数目降到11个。 当在摇瓶中检测这些菌株的时候，其中的8个菌株产生KA。剩余的3个菌 株在其上清液上直接进行的分析中不产生颜色反应且用TLC检测时也没有 盐酸反应。正如所料想的一样，当生长在同时平行培养基中时，对照菌株 BECh1会产生KA。分离株中的一个表现出异常的形态。剩余的两个分离株 在MDU-1B中延长培养后对CPA和KA产生情况进行再测试。结果是CPA 和KA均未检测得到。这两个菌株命名为BECh2和BECh3。
D.已为CPA阴性和KA阴性的3-NPA阴性米曲霉菌株的构建
BECh2和BECh3菌株各自按上述方法进行紫外诱变。辐射后的芽孢在 96孔微量滴定板中稀释到约0.7个活芽孢/100μl Nakamura培养基。在30℃ 的湿箱中培养5-7天。
孔中生长的发酵肉汤样品或者转移到新的微孔板中并使用分光光度法 分析，或者应用于TLC平板中。3-NPA阴性的菌株在摇瓶中用Nakanura培 养基再培养并对3-NPA产生情况进行分析。仍为3-NPA阴性的菌株依照实 施例2中的方法用pCaHj493进行转化，如实施例3所述对转化体进行处理。
实施例2
米曲霉菌株JAL228和BECh1中脂肪酶的表达
A.质粒pCaHj493的构建
用BamHI和SalI消化脂肪酶质粒pAHL(WO 97/07202)，分离获得916bp 的编码脂肪酶的片段。
按WO 98/00529中所述，pCaHj 483用BamHI和XhoI进行消化，将 6757bp的载体片段与脂肪酶片段相连。连接混合物用于转化大肠杆菌DH5 α细胞，分离得到含有所需质粒的转化体。此质粒命名为pCaHj493。
B.将pCaHj493转化入JaL228和BECh-1菌株中
按EP-A-0531372中所述，用在乙酰胺进行筛选的方法将pCaHj493转 化入米曲霉菌株JaL228和BECh1。转化体经过两次芽孢再分离。在摇瓶和 微量滴定板培养物中栓测每个转化体第二次再分离的芽孢的脂肪酶产生情 况。
实施例3
A.CPA阴性和CPA阳性米曲霉菌株中脂肪酶的产生
检测摇瓶培养物中按实施例2所述方法制备的18个JaL228转化体和30 个BECh1转化体的脂肪酶的产生情况。
用10ml 0.1％的Tween溶液收获转化体的Cove N斜面培养物，芽孢悬 液用作100mlGl-Gly培养基中的接种物并置于500ml的双挡板摇瓶中。将培 养基在旋转摇动器上在250转/分，34℃下培养24小时。然后将10ml Gl-Gly 培养物转移到500ml摇瓶中的100ml1/5MDU-2BP中并在34℃，250转/分下 继续培养。
50小时后取出样品，通过Miracloth过滤并在4000×g下离心。用简单 放射免疫扩散的方法(见Scand.J.Immuno.Vol.17，suppl.10，41-56页，(1983) “免疫沉淀凝胶技术技术手册”，N.HAxelsen编辑，Blackwell Scientific Publications，1983)检测上清液中脂肪酶的浓度(以LU/ml表示)。
30个CPA阴性BECh1转化体的脂肪酶产量等于或高于18个JaL228 CPA阳性转化体的产量。下表2给出了分布的概况图。
B.CPA阴性和CPA阳性米曲霉菌株中木聚糖酶的产生
使用不可检测到CPA产生的10个菌株(实施例1A中制备)和3个可检测 到CPA的菌株进行有关木聚糖酶产生的评价。结果总结在下表1中。第2 列表示以真菌木聚糖酶单位(FXU)的形式表示的摇瓶培养物中木聚糖酶含 量，检测方法是通过简单放射免疫扩散的方法(见Scand.J.Immuno.Vol.17， suppl.10，41-56页，(1983)“免疫沉淀凝胶技术手册”，N.H.Axelsen编辑， Blackwell Scientific Publications)。
结果显示CPA阴性的菌株可以产生与CPA阳性菌株可比的木聚糖酶 量。
表1 菌株 FXU CPA/ppm 2-5 3-34 4-2 5-1 5-2 7-1 7-2 9-5 10-4 12-2 1-1 1-3 3-1 360 440 550 250 475 530 475 370 300 365 600 650 635 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 2-3 20 7
＜2＝低于检测限
C.CPA阴性和KA阴性菌株中脂肪酶的产生
按照实施例2所述的方法用质粒pCaHj493对两个无CPA和KA的米曲 霉菌株BECh2和BECh3进行转化。分离转化体的芽孢两次。按照实施例2 所述，检测来自每个菌株的第二次再分离得到的芽孢的脂肪酶产生情况。
表2显示了来自这两个菌株的脂肪酶产量的概率分布情况。与米曲霉菌 株BECh1和JaL228的产量相比，结果表明并没有潜在的表达退化现象发 生。
从与用于脂肪酶生产培养物相同的芽孢悬液中，对用于CPA生产的 MDU1B摇瓶进行接种，并按上述方法培养5天。依照5B2部分进行DPA分 析。BECh1菌株无一产生CPA而18株JaL228菌株中的17株产生高于25ppm 的CPA，大多数菌株的CPA产量在100ppm以上。
表2 菌株 N 中值 LU/ml 平均值 LU/ml 最小值 LU/ml 最大值 LU/ml 标准偏差 LU/ml BECh2 50 3101 3203 350 6329 1490 BECh3 47 2619 2662 203 5455 1057 JaL228 18 1890 2330 635 4664 1361 BEChl 30 3025 2733 876 4097 879
实施例4
米曲霉DCAT-S基因的识别和基因组克隆
A.米曲霉二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶(DCAT-S)基 因的识别
cDNA克隆(pJaL499)含有SEQ ID NO：1中所示的DNA序列，由于该 序列与麦角菌的二甲基烯丙基色氨酸合成酶(DMAT-S)同源而被认为参与了 CPA的生物合成。米曲霉cDNA克隆的测序显示其长度为1393个碱基对(SEQ ID NO：1)并编码含473个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)，该多肽与麦角菌 的DMAT-S有42.1％相同。
米曲霉DCAT-S多肽参与了由环乙酰乙酰基-L-色氨酸和二甲基烯丙基 焦磷酸盐合成β-CPA的过程(见Nethling D.C.和R.M.McGrath，《Can.J. Microbiol.》(1977)23：856-872页)。
制备了JaL228和BECh1菌株的染色体DNA。该DNA经过BglII、NcoI、 XhoI和SpeI的消化并通过Southern印记法进行分析，使用1kb的32P标记 的来源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作为探针。Southern 印记分析表明产生CPA的JaL228菌株有1个DCAT-S基因，而在BEChl 中DCAT-S基因已经从染色体中缺失。
B.DCAT-S基因的基因组克隆
使用以下限制酶作出米曲霉DCAT-S基因的基因组限制酶图谱： EcoRI、SalI、BbuI、XhoI和XbaI，使用1kb的32P标记的来源于pJaL499 并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作为探针(图1)。此图表明其只有一 个拷贝的DCAT-S基因。
JaL228的基因组DNA或者用Tsp509I进行部分消化，或者在0.7％的琼 脂糖凝胶上进行。纯化大小在7到10kb之间的片段。
按照生产商(Stragtagene)提供的操作手册将纯化的DNA克隆入 Lambda ZAP II中。体内切下并再环化Lambda载体中所含的任何克隆插入 体，并按照生产商提供的指南构建含有插入克隆的用作DNA文库的嗜菌粒。 采用菌落杂交的方法，使用1kb的32P标记的来源于pJaL499并含有DCAT- S基因的BglII DNA片段作为探针来筛选编码DCAT-S基因的克隆，此方法 在标准的方法教科书中有概述(例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis 编辑(1989)“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
实施例5
通过基因破坏方法破坏米曲霉二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合 成酶(DCAT-S)产生米曲霉CPA阴性菌株
使用米曲霉pyrG基因作为筛选标记，在米曲霉pyrG-菌株中用一步基因 替换方法破坏DCAT-S基因(B.L.Miller等，《分子和细胞生物学》(1985)5： 1714-1721页，和G.May，《丝状真菌应用分子遗传学》，1-25页；J.R.Kinghorn 和G.Turner编辑；Blakie Academic and Professional，1992)。
A.DCAT-S基因破坏质粒的构建
质粒pJaL499经过SacII消化并用Klenow多聚酶进行处理形成钝端，按 生产商(Boehringer Mannheim)提供的指南用细菌碱性磷酸酶去除5’磷酸酯 基，然后用苯酚提取并沉淀。
按WO 98/12300所述，质粒pJaL335经过HindIII消化以获得含有米曲 霉pyrG基因的3.5kb片段，用Klenow多聚酶片段处理以形成钝端，通过凝 胶电泳进行分离并纯化。在转化入大肠杆菌后，用mini-plasmid preparation 的限制酶消化，鉴定含有合适质粒的菌落。图2总结了DCAT-S破坏质粒 (pDCAT-S-pyrG)的构建过程。
B.PyrG-米曲霉菌株JaL250的分离
筛选对5-氟-乳清酸有抗性的米曲霉菌株JaL228以识别自然产生的pyrG 突变株。一个命名为JaL250的菌株被鉴定为PyrG-。该突变株为尿嘧啶核苷 依赖性的，因此其可以用野生型的pyrG基因进行转化并通过在缺乏尿嘧啶 核苷下生长的能力来筛选转化体。
C.米曲霉DCAT-S-菌株的构建
按照Christensen等在《生物技术》(1988)6：1419-1422所述方法，将质 粒pDCAT-S-pyrG的4.9kb的NotI-EcoRI片段经过凝胶纯化，并用于转化米 曲霉菌株JaL250。然后通过其在缺乏尿嘧啶核苷下的生长能力来筛选转化 体。再分离两次后，按照实施例1所述的方法依其产生CPA的能力筛选转化 体。
为了确定DCAT-S基因已经被破坏，从不产生CPA的转化体制备染色 体DNA。制得的DNA经过EcoRI的消化并用于Southern印记分析，使用 1kb的32P标记的来源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作 为探针。通过基于6.3kb的野生型EcoRI带迁移到基于9.8kb的EcoRI带， 识别出带有DCAT-S基因破坏的转化体。
实施例6
BECh1和BECh2缺少黄曲霉毒素生物合成通路簇中的两个基因的确定
找到了米曲霉IFO4177和其许多衍生物中的黄曲霉毒素生物合成通路 簇中存在的aflR和omtA黄曲霉毒素基因。通过PCR的方法从基因组DNA 中分离得到米曲霉IFO4177中aflR的同源序列，引物为5956(5’- GGATCCAGGGCTCCCTGGAG-3’)(SEQ ID NO：3)和5955(5’- CCTGACCAGCCAGATCTCCT-3’)(SEQ ID NO：4)。获得了一种0.9kb的 PCR片段并克隆入Invitrogen公司的pCR2载体中。使用M13正向(-40)和反 向引物对所得质粒pToC280进行测序，从而确定克隆的该片段的同一性。 omtA的同源序列也通过PCR的方法从基因组IFO4177 DNA中分离得到， 引物为6120(5’-AGTGAGAGAACTCCCTCCTC-3’)(SEQ ID NO：5)和 6121(5’-CCATATCTTCTCAGTCTCCA-3’)(SEQ ID NO：6)。获得了一种 1.2kb的片段并克隆入Invitrogen公司的pCR2载体中，对所得的质粒pToC276 进行测序，使用M13正向(-40)和反向引物以确认所克隆的片段的同一性。
aflR和omtA的克隆片段作为32P标记的探针用于杂交试验中。 IFO4177、pJaL228、BECh1和BECh2的基因组DNA均经过限制酶EcoRI 消化，产生的片段在0.7％的琼脂糖凝胶中分离。将DNA印记到膜上并在严 紧的条件下与两个32P标记的探针分别杂交(方法见J.Sambrook，E.F.Fritsch， 和T.Maniatis编辑(1989)“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。印记表明对来自IFO4177 和JaL228的两种探针均为阳性杂交信号，而含有BECh1和BECh2 DNA的 泳道没有可见的条带。使用omtA探针可见IFO4177和JaL228泳道上有约 3.8kb的片段，使用aflR探针可见约为0.5和4.3kb的两个带。
结果为，米曲霉IFO4177中含有至少两个来自黄曲霉毒素生物合成通路 的基因，即aflR和omtA基因。在黄曲霉和寄生曲霉中分离得到的基因约为 32kb(Woloshuk，C.P.和Prieto，R，《FEMS微生物学通信》(1998)160：169-176 页)。在IFO4177的衍生物BECh1和BECh2中均不存在这些基因。
这里所述并要求保护的本发明并不局限于这里公开的特定实施方案的 范围，因为这些实施方案是用来对本发明的几个方面进行说明。任何相当的 实施方案也应包括在本专利所涉及的范围内。事实上，通过前述描述，对于 本领域的普通技术人员来说，在本文所示出并描述之外的本发明的各种修饰 是显而易见的。这些修饰也落在所附权利要求书的范围内。
这里引用了各类参考文献，将其公开内容的全文引入作为参考。
使用某些宿主系统时遇到的一个问题是真菌毒素的产生。一些真菌可用 作宿主细胞来产生目的多肽的一些真菌具有编码参与多种毒素生物合成的 酶的基因。例如，环匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素都是已知的 毒素，这些毒素可以在例如黄曲霉中生成。同样，多种真菌中可以产生单端 孢菌毒素，例如镰孢霉属的一些种如Fusarium venenatum和木霉菌属。有关 不同真菌中毒素生成的较详尽的综述可参见《有毒真菌代谢物手册》(Richard J Cole和Richard H.Cox著，Academic Press，1981)。
在目的多肽的发酵生产过程中产生此类毒素是很不合乎要求的，因为这 些毒素会对操作人员、客户和环境带来健康方面的危害。
其结果是，人们投入了大量的努力以确保在相关生产所使用的条件下， 产生的毒素的量不会达到被认为会影响健康的水平。这主要是通过使用庞大 的分析程序对毒素直接进行分析，并且通过生物检测和/或投放饲养方面的研 究进行。在许多种情况下，每一次批量生产均需进行这些庞大的分析，从而 影响了产品造价和产品投放市场的时间。
环匹阿尼酸(此后也称为“CPA”)是一种弱酸(pKa：3.5)并且在酸性环境 下沉淀。其形成的金属螯合物可以被稀酸解离。CPA是一种剧毒物质，它可 以选择性抑制Ca2+-ATP酶并且比其他毒素更易导致多种器官的退行性改变 和坏死。CPA有α和β两种存在形式，其中β型是α型的前体。CPA产生于 曲霉菌，但也可由其他真菌，例如青霉菌产生。
曲酸(此后也称为“KA”)产生于多种曲霉菌，但也可由其他真菌如青 霉菌产生，甚至也产生于一些细菌中。它是一种弱碱(pKa：7.9；酚基)，并与 多种金属离子形成复合物。KA具有抗微生物活性并对动物有微弱毒性。KA 是多种合成化合物例如杀虫剂、染料等的前体。
3-硝基丙酸(此后也称为“3-NPA”)是一种天然硝基化合物。它产生于多 种真菌，特别是曲霉菌(黄曲霉、温特氏曲霉)和青霉菌(P.Atroventum)。有报 道称在一些细菌中有3-NPA存在。还有报道称在一些植物中发现了3-NPA 及其酯。3-NPA本身是一种有相当毒性的物质，可以导致例如贫血症的发生。 而且，在胃肠道内，3-NPA可以部分地转化为另一有毒的亚硝酸盐化合物。 3-硝基丙酸不可逆地抑制琥珀酸脱氢酶、异柠檬酸盐裂解酶、延胡索酸酶和 天门冬氨酸酶，从而影响三羧酸循环。
黄曲霉毒素是一种生物活性非常高的二级代谢物，由真菌A.flavus Link ex.Fries和Aspergillus parasiticus Speare产生；参见R.W.Detroy等“黄曲霉 毒素及相关化合物”，《微生物毒素》一书，第6卷(A.Ciegler，S.Kadis和S.J.Ajl 编辑)，Academic，New York，1971，3-178页。主要的黄曲霉毒素包括B1、 B2、G1和G2。这些代谢物，特别是黄曲霉毒素B1，不但对动物和人有毒性， 而且也是所有已知的天然化合物中最具致癌性的物质。
畸形素和赭曲霉素由黑曲霉产生。
通过去除或削弱宿主生物产生毒素的能力，不但可以大大简化受规章限 制的批准程序，同时也可以节省消耗在生产阶段的时间和金钱，因为可以减 少分析程序。
现在，亟需毒素缺乏型曲霉属突变细胞(也就是优选分类为GRAS(一般 认为安全)的安全生物)，这种曲霉属突变细胞适于高效、经济地产生目的多 肽。本发明通过使用毒素缺乏型曲霉属突变宿主细胞产生目的多肽，并且提 供了一种构建这类突变宿主细胞的方法满足了该需要。同样，现在亟需提供 曲霉属突变细胞，其在亲代形式中含有一种或多种毒素基因，这些毒素基因 不被表达，即沉默基因。
发明概述
依照本发明的一方面，本发明提供了一种使用曲霉属突变宿主细胞产生 目的多肽的方法，该方法包括(a)培养亲代曲霉属细胞的突变株，其中(i)突变 株包含第一核酸序列和第二核酸序列，其中第一核酸序列编码所述多肽，第 二核酸序列包含对负责至少一种毒素之生物合成或分泌的基因中至少一个 基因的修饰，和(ii)所述突变株与亲代曲霉属细胞相比，在相同培养条件下产 生较少量的所述毒素；和(b)从所述培养物中分离所述多肽。
在本发明一个优选实施方案中，突变曲霉属细胞在相同的培养条件下产 生的毒素比亲代细胞至少少90％。更优选地，突变曲霉属细胞在相同的培养 条件下比亲代曲霉属细胞细胞产生的以下毒素中的一种或几种少：环匹阿尼 酸、曲酸、3-硝基丙酸和黄曲霉毒素。
在本发明另一实施方案中，提供了可供产生异源目的多肽的毒素缺乏型 曲霉属突变宿主细胞，该宿主细胞经过遗传学修饰使其在相同的培养条件下 产生的至少一种毒素少于曲霉属亲代细胞。
本发明中的曲霉属突变细胞选自：米曲霉、棘孢曲霉、构巢曲霉、无花 果曲霉、黄曲霉、臭曲霉、酱油曲霉、米酒曲霉、黑曲霉、日本曲霉、寄生 曲霉和海枣曲霉。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种获得毒素缺乏型曲霉属突变宿 主细胞的方法，该方法包括(a)将编码目的多肽的第一核酸序列和含有修饰后 的至少一种负责至少一种毒素的生物合成或分泌的基因的第二核酸序列引 入曲霉属亲代宿主细胞；和(b)从步骤(a)中鉴别出含有核酸序列的突变株。
本发明另一方面涉及曲霉属突变细胞，所述曲霉属突变细胞适于表达异 源多肽，其中一个或多个沉默毒素基因已经被去除。
在下文的说明书中的详细描述中概述了这些和其它的一些实施方案。
附图简述
图1显示了米曲霉DCAT-S基因的基因组限制性酶切图谱，其中所用的 限制性酶为EcoRI、SalI、BbuI、XhoI和XbaI，使用了1kb 32P标记的来自 含有DCAT-S基因的pJaL499的BglII片段作为探针。
图2显示了破坏质粒p(DCAT-s-pyrG)的构建。
发明详述
定义
对了本申请目的，为了更好的理解本发明而对以下术语进行定义。
术语“载体”表示质粒、粘粒、噬菌体或允许插入、增殖和表达某基因 或编码目的多肽的DNA序列包括其前体形式的其他任何介质。
术语“宿主”表示任何允许表达目的多肽包括其前体形式的任何细胞。
术语“转化”表示使得异源DNA序列由细胞表达的融入方式。
术语“突变”宿主(或菌株)表示经遗传学修饰的菌株，其中既包括转化 体也包括野生型菌株的突变株。
术语“毒素”表示有植物毒性、动物毒性和抗生素活性的真菌代谢物。 术语“真菌毒素”一般定义为在暴露水平下对人类和动物的健康造成潜在负 面影响的二级真菌代谢物。在本文中，术语“毒素”和“真菌毒素”可以互 换使用。
用以描述本发明的突变细胞的术语“毒素缺乏型”表示突变细胞与其亲 代菌株比较有不完整的毒素产生情况，即突变细胞比其亲代细胞产生的至少 一种，优选一种以上毒素的少。
本发明方法的步骤(a)中使用的术语“相同条件”将突变株的毒素产生情 况和亲代细胞的毒素产生情况相关联，并且意在指出在突变株和亲代菌株的 发酵生产过程中使用类似的条件，例如pH值、温度、氧气等。可以在有利 于产生目的多肽的条件下或在有利于产生毒素的条件下，将亲代和突变细胞 产生所研究毒素的情况进行比较。
宿主细胞
本发明提供了可用以表达目的多肽的曲霉属宿主细胞的变体，其中细胞 经过遗传学修饰使其与亲代细胞相比，表达的一种或几种毒素的水平显著降 低。宿主细胞可源于亲代细胞，该细胞可以为野生型细胞。
宿主菌株可以是传统上用以表达目的多肽的任何曲霉属宿主细胞。
在本发明一个优选的实施方案中，用以表达目的多肽的曲霉属宿主细胞 选自下列曲霉属亚组：Eurotium亚组(例如，以局限曲霉为代表)， Chaetosartorya(例如，以淡黄曲霉为代表)，Scleroleista(例如，以华丽曲霉为 代表)，Satoia(例如，以黑曲霉为代表)，Neosartorya(例如，以烟曲霉、鹿色 曲霉为代表)，Hemicarpenteles(例如，以棒曲霉为代表)，Petromyces(例如， 以黄曲霉、白曲霉、稀疏曲霉为代表)，Emericella(例如，以构巢曲霉、杂色 曲霉、赤褐曲霉为代表)和Fenellia(例如，以土生曲霉为代表)。
在本发明一个特别优选的实施方案中，曲霉属宿主细胞选自：米曲霉、 棘孢曲霉、无花果曲霉、黄曲霉、臭曲霉、酱油曲霉、米酒曲霉、黑曲霉、 构巢曲霉和日本曲霉。其中又以米曲霉、黑曲霉、寄生曲霉和海枣曲霉最为 优选。
本发明的宿主细胞的上述实例均依照现在公认的分类法命名。
毒素
毒素，即根据本发明其生产将被减弱或去除，可以是曲霉菌产生的任何 毒素或者是那些由存在于曲霉菌中的基因编码但并不必表达的任何毒素。例 如，已知黄曲霉毒素基因亦存在于米曲霉中，但在此种曲霉中并不表达。虽 然并不表达，但去除黄曲霉毒素通路基因中的基因仍然是有利的。这将在下 文中进一步描述，并在实施例6中详述。
特别地，将被减弱或去除的毒素选自以下物质：环匹阿尼酸(CPA)，例 如其α或β形式，曲酸(KA)，3-硝基丙酸(NPA)，大黄素，畸形素(例如畸形 素A或B)，黄曲霉毒素，赭曲霉毒素，浅黄霉素，和黑麦酮酸(例如，黑麦 酮酸D)。有关这些毒素的进一步的描述请参阅发明背景中的相应部分，以 及此部分所涉及的《有毒真菌代谢物手册》一书。
本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶(DCAT-S)
本发明也涉及由丝状真菌分离获得的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色 氨酸合成酶，这种酶选自(a)氨基酸序列为SEQ ID NO：2的二甲基烯丙基- 环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶；(b)(a)中所述酶的等位基因变体；和(c)(a)或 (b)的酶的片段，其中所述片段具有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合 成酶活性。
优选地，本发明的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有如 SEQ ID NO：2的氨基酸序列，或者是其等位基因变体。在一个更优选的实 施方案中，本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有与 SEQ ID NO：2的氨基酸序列。在另一个优选的实施方案中，本发明中的二 甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶含有SEQ ID NO：2的氨基酸序 列或者其片段，其中所述片段具有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合 成酶活性。SEQ ID NO：2的片段是指在此氨基酸序列的氨基端和/或羧基端 缺失了一个或更多氨基酸的多肽。在一个最优选的实施方案中，二甲基烯丙 基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶具有SEQ ID NO：2的氨基酸序列。
优选地，SEQ ID NO：2的片段至少有320个氨基酸残基，而最优选至 少有350个氨基酸残基。
等位基因变体是指占据相同的染色体位点的任何两个或更多的可以相 互替代的基因形式。通过突变可自然产生等位基因变体，并可导致种群中的 表型多样性。基因突变可以是沉默性的(编码的多肽无变化)或者编码改变了 氨基酸序列的多肽。术语“多肽的等位基因变体”是指某基因的等位基因变 体编码的多肽。
SEQ ID NO：2的氨基酸序列或其部分序列可以用来设计寡聚核苷酸探 针，或编码本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的核酸 序列，例如SEQ ID NO：1的核酸序列或其亚序列可依照本领域已熟知的方 法从其它丝状真菌菌株中识别和克隆编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色 氨酸合成酶的DNA。特别是，依照标准的Southern印记操作法，这类探针 可以用来与有关种属的基因组或cDNA杂交，从而识别并分离相关种属中的 相应基因。这类探针可比全序列短许多，但至少应有15个核苷酸，优选至 少25个，最优选至少40个核苷酸的长度。也可以使用更长的探针。DNA和 RNA探针均可使用。为检测相应基因，一般对探针进行标记(例如，使用32P、 3H、35S、生物素或亲和素标记)。
依照标准的Southern印记操作法，在从低到高的严紧度的条件下进行 (例如，预杂交和杂交反应条件为42℃，5×SSPE，0.3％SDS，200μg/ml变形 变性鲑鱼精DNA，低、中、高严紧度分别在25、35或50％的甲酰胺中进行) 的杂交表明，核酸序列与相应于SEQ ID NO：1所示的核酸序列或pJaL499 中所含的多肽编码部分的寡核苷酸探针杂交。
因此，可以从其他丝状真菌菌株制备的基因组、cDNA或重组化学文库 中筛选出与上述探针杂交的编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成 酶的DNA。来自其他丝状真菌菌株的基因组或其他DNA可由琼脂糖或聚丙 烯酰胺凝胶电泳，或其他分离技术制备。文库DNA或分离的DNA可以转移 并固定在硝基纤维素或其他合适的载体物质上。为了识别克隆或与SEQ ID NO：1同源的DNA，在Southern印记中应使用载体物质，其中所述载体物 质最终在2×SSC，0.2％SDS中洗3次，每次30分钟，优选温度至少为50℃， 更优选至少为55℃，更加优选至少为60℃，甚至更优选至少为65℃，甚至 更加优选至少为70℃，和最优选至少为75℃。在这些反应条件下，使用X- 射线胶片检测与寡聚核苷酸探针杂交的分子。
在一个优选的实施方案中，本发明中的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L- 色氨酸合成酶来源于曲霉属菌株，更优选地来源于米曲霉，例如具有SEQ ID NO：2氨基酸序列的多肽。
本文所定义的“分离的”二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶 是基本上不含有其他多肽的多肽，例如经SDS-PAGE(十二烷基磺酸钠-聚丙 烯酰胺凝胶电泳)检测至少纯度达约20％，优选至少纯度达约40％，更优选 纯度达约60％，甚至更优选至少纯度达约80％，最优选至少纯度达约90％， 甚至更加最优选至少纯度达约95％。
本发明也涉及由丝状真菌分离获得的编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基- L-色氨酸合成酶的核酸序列，并且在一个优选的实施方案中，此核酸序列来 源于曲霉属例如米曲霉，尤其是SEQ ID NO：1所述的核酸序列。并且在另 一个更为优选的实施方案中，核酸序列为质粒pJaL499中包含的序列。本发 明也包括由于基因密码简并而引起的不同于SEQ ID NO：1的核酸序列。本 发明也涉及SEQ ID NO：1的亚序列或pJaL499中的多肽编码部分，此序列 编码的多肽片段有二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶活性。SEQ ID NO：1的亚序列或pJaL499中的多肽编码部分，是除了在5’末端和/或 3’末端缺失了一个或多个核苷酸之外，SEQ ID NO：1所包括的核素序列或 pJaL499中的多肽编码部分。优选地，SEQ ID NO：1的亚序列含有至少870 个核苷酸，更优选地至少960个核苷酸，而最优选地至少含有1050个核苷 酸。
核酸序列可由在分类学上与米曲霉相等同的微生物中获得。
这里描述了用于分离或克隆所述核酸序列的技术。这里使用的术语“分 离的核酸序列”是指其基本上不含有其他核酸序列的核酸序列，例如经琼脂 糖凝胶电泳检测至少纯度达约20％，优选至少纯度达约40％，更优选纯度达 约60％，甚至更加优选至少纯度达约80％，最优选至少纯度达约90％。核酸 序列可以来自于基因组、cDNA、RNA、半合成、合成或以上来源的组合。
对编码本发明的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的核酸序 列进行修饰对合成与多肽基本类似的酶来说可能是必要的。这里的与二甲基 烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶“基本类似的”酶是指此酶的非天然 形式。这些二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶在乙酰改造方法方 面可以不同于由其天然来源所分离出的酶。例如，使用诸如定点诱变的方 法，合成此酶的变体可能是有意义的，其中所述变体在特异活性、热稳定性、 最适pH值或类似性质方面不同。可以在诸如SEQ ID NO：1多肽编码部分 给出的核酸序列的基础上构建同源序列，这些序列包括：例如上述序列的亚 序列，和/或引入了核苷酸取代的序列，所述取代不会造成核酸序列所编码的 多肽的另一氨基酸序列，而是符合用于生产多肽的宿主生物的密码子用途， 或那些引入了核苷酸取代的序列，该取代不会产生不同的氨基酸序列。关于 核苷酸取代的一般性描述，请参见例如Ford等1991年《蛋白质表达和纯化》 第2期：95-107页。
对于熟悉本领域的专业人员来说，显然可以在对分子功能至关重要的区 域外进行上述替换而仍然得到有生物活性的二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L- 色氨酸合成酶。使用本领域已知的操作方法，例如定点诱变或丙氨酸扫描诱 变(参见，例如Cunningham和Wells，1989年《科学》第224期：1081-1085 页)可以识别出对二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶的活性至关重 要的氨基酸残基(其中二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶是由本发 明中分离的核酸序列编码的)，因此这些氨基酸残基优选不被取代。在后一种 诱变技术中，在分子中的每一个带正电荷的残基上引入突变，对得到的突变 分子进行二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶活性的测试，以识别 出对分子活性至关重要的氨基酸残基。使用诸如核磁共振分析、结晶学或光 亲和性标记技术对三维结构进行分析，还可以测定底物和酶之间相互作用的 位点(参见，例如de Vos等，1992年《科学》第255期：306-312页；Smith 等，1992年《分子生物学杂志》第224期：899-904页；Wlodaver等，1992 年《FEBS通信》第309期：59-64页)。
本发明的核酸序列，或其同源序列或其片段的优选用途，是去除或减少 给定宿主细胞中特别是在米曲霉属细胞中二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色 氨酸合成酶的活性，因而可以去除或降低上述细胞中CPA的产生。
本发明还涉及用以表达上述序列的含有SEQ ID NO：1的核酸序列或 pJaL499中多肽编码部分、其亚序列或或同源序列的核酸构建体、重组表达 载体和宿主细胞。构建体和载体可以按照本文的描述构建。宿主细胞可以是 适于表达核苷酸序列的任何细胞，可以是诸如从本文中所述的亲代或突变细 胞中进行选择。
宿主细胞的基因修饰
为了表达显著降低了水平的一种或多种毒素，使用本领域技术人员所熟 知的标准技术对本发明中的宿主细胞进行了基因修饰。将负责产生毒素活性 的基因序列失活或者部分或完全地去除。因此，本发明的曲霉属突变宿主细 胞表达一种或多种毒素的水平降低或检测不到。
在一个特定的实施方案中，对与所选的毒素的形成和分泌有关的各结构 或调节区(例如基因)进行修饰，从而达到将其失活目的。已知有效的技术包 括但并不局限于以下技术：特异性或随机诱变，PCR引发的诱变，位点特异 性DNA缺失、插入和/或取代，基因破坏或基因替换，反义技术，或以上技 术的组合。
可以使用合适的物理或化学诱变因子达到诱变的效果。适宜于本目的的 物理或化学诱变因子包括但并不局限于：紫外辐射，电离辐射(例如γ辐射)， 羟胺、N-甲基-N’-硝基-N-亚硝基胍(MNNG)、O-甲基羟胺、亚硝酸、乙基 甲烷磺酸(EMS)、亚硫酸氢钠和核苷酸类似物。但使用上述因子时，一般通 过在所选的诱变因子存在下孵育待诱变的细胞，选择那些目标毒素的产生明 显减少的细胞。
通过修饰与给定毒素的产生或分泌过程有关或必需的核苷酸序列，同样 可以减少或去除该毒素在宿主细胞中的产生。例如，核苷酸序列可以编码的 基因产物对于导致毒素产生的通路内具有必要的功能。例如，这样的核苷酸 序列可以是如SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列或pJaL499中的编码多肽部 分。修饰可以通过在核苷酸序列中引入、取代或去除一个或多个核苷酸或通 过序列转录、翻译中必需的调控元件而完成。例如，可以插入或去除核苷酸 以引入终止密码子、去除起始密码子或改变核苷酸序列的开放读码框。可以 通过本领域已知的定点或随机诱变或PCR引发诱变的方法实现对序列或其 调控元件的修饰或失活。虽然从原则上来说，可以在体内条件下即直接在表 达毒素基因的细胞中完成上述修饰，但目前优选的是如下文描述的那样在体 外进行修饰。
使所选的丝状真菌细胞中目的毒素如CPA失活或减少的方便方法的实 例是基于基因替换、基因缺失或基因破坏技术。例如，在基因破坏方法中， 相应于目的内源型基因或基因片段的核酸序列(例如本发明中的DCAT-3基 因)在体外被诱变产生缺陷型核酸序列，并将此缺陷型核酸序列转化入亲代细 胞中从而产生缺陷型基因。通过同源重组，缺陷型核酸序列取代了内源型基 因或基因片段。一般来说希望缺陷型基因或基因片段同样编码一个标记物， 该标记物可以用于对核酸序列已被修饰或被破坏的转化体进行筛选。
做为另一种选择，可以使用与基因的核酸序列互补的核苷酸序列通过已 确立的反义技术进行基因的修饰或失活。更确切地，可以引入与基因的核酸 序列互补的核苷酸序列减少或去除丝状真菌细胞中此基因的表达，互补核苷 酸序列可以在细胞中转录并能够与细胞中产生的mRNA相杂交。在允许互补 反义核苷酸序列与mRNA杂交的条件下，翻译产生的蛋白的量因此减少或消 除。
在诱变或其他修饰毒素通路的基因后，筛选毒素产生减弱或去除的突变 株。如何对毒素进行筛选的方法在以下实施例中给出。另一方面，合适的筛 选分析方法在《有毒真菌代谢物手册》中有述，或者从经常检测诸如食品中 真菌毒素含量的机构处获得。
因此，由于基因修饰，本发明曲霉属突变宿主细胞中毒素的表达水平显 著降低。在一个优选实施方案中，突变宿主细胞中这些毒素的表达水平分别 降低了大于约50％，优选大于约85％，更优选大于约90％，最优选大于约 95％，或甚至更优选大于99％。在另一个优选的实施方案中，本发明曲霉属 突变宿主细胞中的这些毒素在任何组合下均有降低。在一个进一步的具体实 施例中，宿主细胞所表达的产物基本上不含下列毒素的至少一种：环匹阿尼 酸，曲酸，3-硝基丙酸，大黄素，畸形素，黄曲霉毒素，赭曲霉素和黑麦酮 酸。在一个特别优选的实施方案中，宿主细胞所表达的产物基本上不含下列 毒素的至少一种：环匹阿尼酸，更特别地至少不含环匹阿尼酸和曲酸或黄曲 霉毒素，而最优选地至少不含环匹阿尼酸、曲酸和3-硝基丙酸。
在一个优选的实施方案中，宿主细胞是减少或去除了NPA、CPA、曲酸 (KA)或麦芽米曲霉素中的至少一种毒素的产生的米曲霉菌株，优选地为这些 毒素中的至少两种，例如NPA和CPA；NPA和KA；CPA和KA；或NPA、 CPA和KA。而且，除了减少或去除了至少一种所述毒素的产生之外，优选 地，所选的黄曲霉毒素通路的基因也被失活，从而使得所得的突变菌株不能 产生黄曲霉毒素。黄曲霉中的黄曲霉毒素基因已经被充分认识，并可以用来 识别米曲霉中的相应基因，此后可用本领域已知的方法将其失活。
在另一个优选的实施方案中，宿主细胞是减少或去除了一种或几种畸形 素(例如，畸形素A1或B)，一种赭曲霉素(例如，赭曲霉素A)和浅黄霉素生 产的黑曲霉或无花果曲霉，优选地为所述毒素的至少两种，例如畸形素和赭 曲霉素；畸形素和浅黄霉素；赭曲霉素和浅黄霉素；以及畸形素、赭曲霉素 和浅黄霉素的菌株。
在另一个优选的实施方案中，宿主细胞是减少或去除了一种或多种黑麦 酮酸(例如，黑麦酮酸D)或者大黄素(黑麦酮酸D的前体)的产生，优选地为 所述类型毒素的两种的生产同时被减少或去除的棘孢曲霉菌株。
产生多肽的方法
根据本发明的方法，某些目标毒素的量显著减少，然而突变宿主细胞的 特性，即在经遗传修饰的编码目的多肽的基因在细胞中的稳定保持性，细胞 的生产能力和目的细胞的产量基本上被保持。更具体地说，根据本发明的方 法，宿主细胞在产生或分泌一种或多种目的毒素所必需的结构和/或调节区内 经过了遗传修饰，因此去除或减少了所述毒素的产生或分泌。
因此，另一方面，本发明提供了一种在本发明所述的曲霉属突变宿主细 胞中产生多肽或蛋白的方法，其中包括异源型多肽或蛋白，该方法包括将编 码目的多肽的核酸序列引入上述突变宿主细胞中，在合适的生长培养基中培 养突变宿主细胞，以及回收上述目的多肽。
因此，根据本发明的突变宿主细胞必须含有表达目的多肽所必需的结构 和/或调节基因区。这类必需结构和/或调节基因区的本质在很大程度取决于 目的产物和独特的曲霉属宿主菌株。为了对宿主细胞进行转化或转染，本领 域技术人员可以使用标准的重组DNA技术完成本发明的宿主细胞的遗传设 计(参见，例如Sambrook等的文章)。
优选地，应通过本领域已知的方法对宿主细胞进行修饰，以便引入合适 的克隆媒介(即质粒或载体)，克隆媒介中含有编码所需目的多肽的DNA片 段。克隆媒介既可以作为自主复制质粒被引入宿主细胞，也可以整合入染色 体内。更优选地，克隆媒介含有与一个或多个合适的调节区域可操作相连的 一个或多个结构区域。
结构区域是编码目的多肽的核苷酸序列。调节区域包括含有转录和翻译 调控序列的启动子区域，含有终止信号的终止子区域，以及多聚腺苷酸区 域。启动子即在所选宿主细胞中表现转录活性的核苷酸序列，可以来源于编 码胞外或胞内蛋白的基因，优选是来源于编码酶的基因，所述酶例如淀粉 酶、葡糖淀粉酶、蛋白酶、脂肪酶、纤维素酶、木聚糖酶、氧化还原酶、果 胶酶、角质酶或糖酵解酶。在本发明的方法中，用于引导核酸构建体转录的 合适的启动子的实例是得自编码下列酶的基因的启动子，所述酶是米曲霉 TAKA淀粉酶、Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶、黑曲霉中性α-淀粉酶、 黑曲霉酸性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉葡糖淀粉酶(glaA)、曼赫根毛霉脂 肪酶、米曲霉碱性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸异构酶、构巢曲霉乙酰胺酶、米 曲霉乙酰胺酶(amdS)、尖孢镰孢菌胰岛素样蛋白酶(美国专利第4,288,627)， 以及上述启动子的突变株、截断体和杂合启动子。特别优选的启动子是 NA2-tpi启动子(是源于编码黑曲霉中性α-淀粉酶基因的启动子和源于编码 米曲霉丙糖磷酸异构酶基因的启动子的杂合体)、葡糖淀粉酶启动子和TAKA 淀粉酶启动子。
克隆媒介也可以含有选择性标记。选择性标记是一个基因，该基因的产 物提供抗生素或病毒抗性，重金属抗性，微生物由原养型向营养缺陷型的转 变以及类似的特性。用于丝状真菌宿主细胞的选择性标记可以选自但不局限 于：amdS(乙酰胺酶)、argB(鸟氨酸氨基甲酰转移酶)、bar(膦丝菌素乙酰基转 移酶)、hygB(潮霉素磷酸转移酶)、niaD(硝酸盐还原酶)、pyrG(乳清酸核苷- 5’-磷酸脱羧酶)、sC(硫酸盐腺嘌呤转移酶)和trpC(氨基苯甲酸盐合成酶)， 以及来源于其他物种的上述选择性标记的等价物。优选用于曲霉属细胞的是 构巢曲霉或米曲霉中的amdS和pyrG基因，和吸水链霉菌中的bar基因。
而且，可以通过共转化实现选择目的，其中以两种载体的混合物转化宿 主细胞而只对一种载体进行选择。
用于分别连接本发明中的DNA构建体、启动子、终止子和其他元件的 操作法，以及将它们插入到合适的含有复制必需信息的克隆媒介的操作均为 本领域技术人员所熟知(参见，例如Sambrook等，1989年；同前)。
使用本领域已知的方法，将突变丝状真菌细胞在适合产生目的多肽的营 养培养基中培养。例如，细胞可以在实验室或工业发酵罐中使用摇动烧瓶培 养、小规模或大规模发酵培养(包括连续、批量、分批加料或固相发酵)的方 式培养在合适的培养基中，培养条件应使异源多肽可被表达和/或被分离。培 养应在含有碳源、氮源和无机盐的合适的营养培养基中进行，使用的方法为 本领域已知的操作方法。合适的培养基可从商业途径获得，也可以依照已经 公开的配方制备而成(例如，美国典型培养物保藏中心的配方)。分泌的多肽 可以直接从培养基中回收获得。
多肽可以使用本领域已知的多肽特异性的方法进行检测。这些检测方法 可包括使用特异性抗体，酶产物的形成，酶底物的消失，或SDS-PAGE。例 如，可以使用酶学分析的方法检测多肽的活性。对于多种酶来说，确定酶活 性的操作法是本领域已知的。
产生的多肽可以通过本领域已知的方法进行分离。例如，从营养培养基 中分离多肽的传统操作包括，但并不局限于：离心、过滤、抽提、喷雾干燥、 挥发或沉淀。分离得到的多肽可以再通过各种本领域已知的操作方法进一步 纯化，这些方法包括，但并不局限于：层析(例如，离子交换层析、亲和层析、 疏水层析、层析聚焦和大小排阻层析)，电泳操作(例如，制备型等电聚焦电 泳)，差示溶解性(例如，硫酸铵沉淀法)或抽提法(参见，例如《蛋白质纯化》 J.-C.Janson和Lars Ryden，编辑，VCH出版商，纽约，1989)。
产物
所需的最终产物，即由曲霉属突变宿主细胞表达的目的多肽，可以是任 何同源或异源性的蛋白或多肽。
多肽可以是变异丝状真菌细胞的任何异源性多肽。这里的术语“多肽” 并不指某一特定长度的编码产物，而是包含多种多肽、寡肽和蛋白。异源性 多肽也可以是某多肽经工程改造后的突变株。这里术语“异源性多肽”是指 那些并不来源于丝状真菌细胞的多肽。突变丝状真菌细胞可以含有一个或多 个拷贝的编码这种异源性多肽的核酸序列。
在本发明的方法中，突变丝状真菌细胞也可以用来重组产生与细胞天然 存在的多肽。该天然存在的多肽可以通过以下重组的方式得到：例如，将编 码多肽的基因置于不同启动子的控制之下，以增强多肽的表达，通过使用信 号序列而促进目的天然多肽分泌到细胞外，以及增加编码通常由细胞所产生 的多肽的基因的拷贝数而增加肽的产量。在术语“异源性多肽”涉及的范围 内，本发明也包括上述经重组方式产生的同源性多肽，所述范围应使得这类 表达包括使用细胞异源性遗传元件，或使用同源元件但该同源元件经过改造 从而与其在宿主细胞内通常行使的功能有所不同。
在一个更具体的实施方案中，产物是有治疗活性的多肽或蛋白，例如激 素，特别是胰岛素、生长激素、胰高血糖素或促生长素抑制素；白细胞介素， 特别是干扰素；造血生长因子，特别是PDGF(血小板源性生长因子)，EPO(促 红细胞生成素)或TPO(血栓生成素)；蛋白酶，特别是因子VII、因子VIII、 尿激酶、凝乳酶或TPA(组织纤溶酶原激活物)；或者血清白蛋白。
在另一个优选的实施方案中，产物是真菌或细菌源性的酶。优选地，此 酶是一种糖苷酶，例如淀粉酶，特别是α-淀粉酶、β-淀粉酶或葡糖淀粉酶； 葡聚糖1，4-α-葡糖苷酶；氨基肽酶；糖酶；羧肽酶；过氧化氢酶；纤维素酶， 特别是内-1，4-β-葡聚糖酶或内-1，3(4)-β-葡聚糖酶；纤维素-1，4-β-纤维二糖 苷酶；壳多糖酶；角质酶；环糊精糖基转移酶；脱氧核糖核酸酶；半乳糖酶； 半乳糖苷酶，特别是α-半乳糖苷酶或β-半乳糖苷酶；内葡聚糖酶，特别是 内-1，3-β-葡聚糖酶、内-1，3-α-葡聚糖酶、内-1，2-β-葡聚糖酶或内-1，6-β-葡 聚糖酶；葡糖苷酶，特别是α-葡糖苷酶或β-葡糖苷酶；转化酶；虫漆酶； 分解脂肪酶，特别是脂肪酶、酯酶、磷脂酶或溶血磷脂酶；裂解酶或果胶酸 酯分解酶；甘露聚糖酶；甘露糖苷酶；多聚半乳糖醛酸酶；(链球菌)齿斑葡 聚糖酶；氧化酶或氧化还原酶，例如过氧化物酶或多酚氧化酶；加氧酶；胶 质酶，肽链内切酶或肽链外切酶；肌醇六磷酸酶；多聚半乳糖醛酸酶；蛋白 酶；核糖核酸酶；转谷氨酰胺酶；以及木聚糖酶，特别是内-1，4-β-木聚糖酶 或木聚糖-内-1，3-β-木聚糖苷酶。
在另一个优选的实施方案中，产物是一种杂合多肽，例如凝乳酶原和原 胰岛素样蛋白酶。在诸如缺乏显著的蛋白酶活性这样的合适条件下，由宿主 细胞表达的异源性蛋白也可以是一种前体蛋白，例如酶原、杂合蛋白、作为 原序列或前-原序列得到的蛋白，或者任何其他未成熟的形式。
参照以下实施例进一步描述本发明，但不应以任何方式将这些实施例解 释为对所附权利要求书所限定的范围的限制。
去除了沉默毒素基因的曲霉属突变株
在产生黄曲霉毒素的两个种黄曲霉和寄生曲霉中，对黄曲霉毒素的生物 合成途径已经进行了多年的研究。在这两个物种中识别出了许多基因，这些 基因显示出其图谱在一个大的簇内(参见Woloshuk，C.P和Prieto，R，《FEMS 微生物学通信》(1998)160：169-176中的综述)。其中的一些基因已被克隆和 测序，其中包括编码调控通路基因中其他基因表达的aflR基因，以及编码O- 甲基转移酶的omtA基因。
黄曲霉毒素基因存在于米曲霉的基因组中，但在这个物种中并不表达。 虽然黄曲霉毒素并不被表达，但去除一个或更多这样的沉默黄曲霉毒素通路 基因仍然是有利的。去除了黄曲霉毒素基因如aflR和/或omtA的曲霉属突变 株例如米曲霉突变株是有利的，因为这样就不必检测新的突变株中所述黄曲 霉毒素的产生情况。
因此，本发明的一方面涉及适宜表达异源性多肽并且去除了一个或更多 沉默毒素基因的曲霉属突变细胞。
沉默毒素基因已经被“去除”是指正在讨论的基因已被改变或删除，例 如通过本领域已熟知的基因替代或基因破坏技术(参见，例如Miller等，1985 年《分子和细胞生物学》第1714-1721页)，所采用的方式应使得突变细胞中 不含有上述沉默基因。
术语“沉默”毒素基因是指毒素基因不被表达。
可以使用不可逆转的缺失或破坏全部或部分毒素基因的方法去除毒素 基因。
术语“不可逆转的缺失或破坏全部或部分毒素基因”是指所讨论的毒素 基因或者已经被去除，或者已经一定的方式加以改变从而使得上述基因不能 编码毒素且不能自然地回复突变，例如在产生编码毒素的基因期间。
所讨论的曲霉属细胞可以是上文已提及的任何一种，可以选自以下曲霉 属亚组：Eurotium，Chaetosartorya，Sclerocleista，Satoia，Neosartorya， Hemicarpenteles，Petromyces，Emericella和Fenellia。
所讨论的编码一个或更多毒素的毒素基因包括选自以下毒素的毒素：环 匹阿尼酸、曲酸、3-硝基丙酸、大黄素、畸形素、黄曲霉毒素、赭曲霉素和 黑麦酮酸。
具体考虑的是编码黄曲霉毒素的毒素基因，特别是源于米曲霉黄曲霉毒 素簇的毒素基因，特别是选自以下基因：omtA、aflR、pksA、Nor-1、fas-beta、 fas-alpha、vber-1、avnA、ord-2。
亲代曲霉属细胞可以是米曲霉细胞，特别是米曲霉A1560(IFO 0417)。
实验
材料和方法
1.菌株
米曲霉A1560与IFO 04177一致(见下)。
米曲霉A1560 IFO 4177：来自Institute for Fermentation，Osaka；17-25 Juso Hammachi 2-Chome Yodogawaku，Osaka，Japan；还参见WO 98/12300。
JaL228：米曲霉菌株，其中用于中性金属蛋白酶—NpI的基因被破坏； 在WO 98/12300中有关于该菌株构建的描述。
BECh 1：在实施例1中有关于该CPA阴性的米曲霉菌株构建的描述。
BECh 2：在实施例1中有关于该CPA阴性和KA阴性的米曲霉菌株构 建的描述。
BECh 3：在实施例1中有关于该CPA阴性和KA阴性的米曲霉菌株构 建的描述。
BZ14：在WO 92/17573中有关于与ToC90和phD450进行共转化的米 曲霉A1560菌株的描述。
JaL250：在实施例6中有关于该米曲霉菌株构建的描述。
保藏：
含有pJaL499质粒的大肠杆菌菌株于1999年1月13日保藏在德国微生 物保藏中心，Mascheroder Weg 1b，D-38124 Braunschweig，保藏号为DSM 12622。
2.基因
DMAT-S：该基因编码二甲基烯丙基-L-色氨酸合成酶，该酶参与麦角生 物碱的生物合成。
DCAT-S：该基因编码二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶，该 酶参与环匹阿尼酸(CPA)的生物合成。
pyrG：该基因编码乳清酸核苷-5’-磷酸脱羧酶，该酶参与尿嘧啶核苷的 生物合成。
3.质粒
pAHL：在WO 97/07202中有该质粒的描述。
PCaHj483：在WO 98/00529中有该质粒的描述。
pCaHj493：在实施例2中有该质粒的描述。
pJaL335：在WO 98/12300中有该质粒的描述。
pJaL499：在实施例4中有该质粒的描述。
4.培养基和溶液
用作缓冲液和底物的化学药品均为至少为试剂级的商品。
筛选培养基1(每升)
甘露醇 30g
葡萄糖 10g
琥珀酸 10g
酪蛋白氨基酸 3g
KH2PO4 1g
MgSO4*7H2O 0.3g
FeSO4*7H2O 0.2g
2，6-二氯-4-苯胺 2ppm
琼脂 20g
以14％NH4OH调节最终pH值到5.6。
CoveN
Cove盐溶液 50ml
山梨糖醇 218g
右旋葡萄糖 10g
硝酸钾 2.02g
琼脂 35g
去离子水 1000ml
COVE盐溶液(每升)
KCl 26g
MgSO4 26g
KH2PO4 76g
痕量金属溶液 50ml
CHCl3 2ml
痕量金属溶液(每1升)
Na2B4O7*10H2O 40mg
CuSO4*5H2O 400mg
FeSO4*7H2O 800mg
MnSO4*2H2O 800mg
Na2MoO4*2H2O 800mg
ZnSO4*7H2O 8000mg
Gl-gly
酵母提取物 18g
87％甘油 24ml
Pluronic PE6100 1ml
以自来水补至 1000ml
1/5 MDU-2BP
麦芽糖 9g
MgSO4*7H2O 0.2g
NaCl 0.2g
K2SO4 0.4g
KH2PO4 2.4g
酵母提取物 1.4g
AMG痕量金属 0.1ml
Pluronic PE6100 0.02ml
去离子水补至 1000ml
最终pH值为5.0；
接种前加入1.0ml 50％尿素。
MDU-IB(每1升)
麦芽糖糊精MD0l 45.0g
MgSO4*7H2O 1.0g
NaCl 1.0g
K2SO4 2.0g
KH2PO4 12.0g
酵母提取物 7.0g
AMG痕量金属 0.5ml
Pluronic PE6100 1ml
最终调节pH值到5.0；
接种前加入1.3ml 50％尿素/100ml培养基。
AMG痕量金属溶液(每1升)
FeSO4*7H2O 13.9g
MnSO4*2H2O 8.45g
ZnCl2 6.8g
CuSO4*5H2O 2.5g
NiCl2*6H2O 2.5g
柠檬酸 ＞＝3.0g
痕量金属溶液 1ml
KM2培养基(每1升)
酵母提取物 25g
K2HPO4 10g
MgSO4*7H2O 0.5g
KCl 0.5g
FeSO4 0.01g
葡萄糖 100g
柠檬酸 ＞＝3.0g
最终调节pH值到6.0；
若用于固体培养板，则用20g/L琼脂固化KMZ培养基。
加入300μl/L Triton X-100作为克隆生长限制制剂。
Nakamura培养基(每1升)
蔗糖 50g
蛋白胨 20g
KH2PO4 5g
CaHPO4 2.5g
MgSO4 2.5g
最终调节pH值到6.4。
5.检测分析
A.使用HP毛细管电泳法检测CPA的操作
为进行毛细管电泳(CE)分析，首先通过固相提取法在一个Supelclean LC-18 SPE管(预装3ml来自Supelco的柱，目录号为5-7012，用2ml甲醇 和2ml Milli-Q水进行调节)中制备1ml等分试样。使用抽吸多支管(suction manifold)迫使液体通过柱子。使用3ml Milli-Q水冲洗后，用3ml甲醇洗脱 样品。洗脱物不需进一步处理可直接用于CE分析。偶尔会出现沉淀，但通 过离心法去除。
使用惠普光电二极管阵列CE-仪器(3D-CE)进行CE分析。以34mbar 的静水压用10秒的时间将样品注入。使用30℃下的50mm的毛细管(有效长 度为56cm)，该毛细管用0.1M NaOH处理1分钟，接着用100mM硼酸盐 /NaOH pH9.1处理5分钟。将电压设定为17KV。始终收集紫外光谱以确定 峰值，但同样过程在280nm下进行。以商购的环匹阿尼酸作为标准物(Sigma Co.出产，St.Louis MO，USA，目录号C1530，最低纯度98％)。此方法的 灵敏度下限约为1ppm。
B.使用薄层层析法(TLC)检测CPA的操作
1.平板培养的分析
在Filtenborg O.，Frisvad J.C.和Svendsen JA.所著的“纯净培养基中对 产生霉菌的细胞内真菌毒素的简易筛选方法”(参见《应用和环境微生物学》 一书1983年45：581-585页)中，对琼脂平板的分析作了描述。
2.液体培养物的分析
在TLC平板(Merck Silica Gel 60)两对边各上上清液样品10μl。等分试 样的环匹阿尼酸(Sigma，C1530)用体积比为1∶2的甲醇∶氯仿混合液稀释成 50ppm、25ppm、5ppm和2.5ppm的标准溶液。首先，平板在CAP溶液(体 积比为氯仿∶丙酮∶丙-2-醇＝85∶15∶20)中展开15分钟，干燥，翻转，另一半在 TEF(体积比为甲苯∶乙酸乙酯∶甲酸＝5∶4∶1)中继续展开15分钟。
另一种方法是将平板在EMA溶液(体积比为乙酸乙酯∶甲醇∶25％氢氧化 铵＝16∶8∶2)中和TEF溶液中按上述方法各展开15分钟。
将平板在通风橱中彻底干燥(1小时)，然后喷洒上Ehrlich试剂(将2g 4- 二甲氨基苯甲醛溶解在85ml 96％乙醇中，随后再加入15ml 37％的盐酸)。
在CAP体系(一种中性体系)中，CPA看上去是蓝紫色的蘑菇形小斑点， 有典型的低迁移率；而酸性TEF体系在上样点和展开剂前沿之间产生典型的 延长形污迹。在EMA体系中(碱/碱体系)，环匹阿尼酸聚集成为密集的小斑 点。
对平板直接的视觉观察，浓度大于等于2.5ppm的CPA看上去为紫色区 域形涂污或斑点(依赖于展开体系的不同)。在台式平台扫描仪上对TLC平板 进行扫描，然后在合适的图像加工程序中增强电子图像(在这种情况下使用的 是Paint Shop Pro 4)，可以使灵敏度增加5倍到10倍。
该分析的总灵敏度(不提取)约为0.5-1ppm CPA；使用提取物增加灵敏度 至少10倍。
C.使用毛细管电泳法检测曲酸的操作
制备1-3ml等分试样用于在一个Supelclean LC-18 SPE管(预装3ml Supelco柱，目录号为5-7012)通过固相提取法进行毛细管电泳(CE)分析，用 甲醇、10mM硼酸盐/NaOH、4M KCl pH9.1进行调理。使用抽吸多支管迫使 流体通过柱子。使用3ml 10mM硼酸盐/NaOH、4M KCl pH9.1和0.3ml 10mM 硼酸盐/NaOHpH9.1冲洗后，用7.5ml 10mM硼酸盐/NaOH pH9.1洗脱样品。 洗脱物不需进一步处理可直接用于CE分析，根据上述对于环匹阿尼酸的操 作进行。偶尔会出现沉淀，但可以通过离心法去除。此方法的灵敏度下限约 为6ppm。
D.使用薄层层析法检测曲酸的操作
按上述对于CPA的方法，在TLC平板两对边上各上等分试样，并使用 与CPA相同的溶液体系展开。干燥后的平板喷洒上1％FeCl3的0.1M HCl溶 液。样品中的曲酸的存在通过红色斑点显示出来，且与作为对照而施用的纯 曲酸产生的红色斑点的强度相比较。该检测的灵敏度下限约为50ppm。
E.使用毛细管电泳法检测3-硝基丙酸(3-NPA)的操作
用于毛细管电泳(CE)分析的样品是否需要经过纯化取决于样品的传导 性。如果传导性低于10mS，样品通过在Varian SAX阴离子交换器(Varian Instruments，Palo Alto CA)进行离子交换并使用0.1M KCl作为洗脱缓冲液纯 化。如果传导性高于100mS，样品需使用2-丁醇提取液提取，其中用酸化/ 高盐处理样品使其沉淀，并再溶于pH 7.0 10mM Tris/HCl中，用6毫升丁醇 提取2ml样品。
使用HP-CE仪器的二极管阵列检测，于30℃使用未包被二氧化硅的50 微米毛细柱(有效长度为56cm)，调节缓冲液为25mM硼酸盐/磷酸盐pH 7.6。以静态水压用20秒的时间将样品注入。设定电压为30KV。该方法的 灵敏度下限为6ppm。
F.使用薄层层析法检测3-硝基丙酸(3-NPA)的操作
在TLC平板上用发酵液点样，并使用用于CPA相同的方法展开。按照 W.Maiak和R.J.Bose在“分离米瑟毒苷和检测脂肪族硝基化合物的层析方 法”(《植物化学》1974年13：1005-1010页)中所述的方法，在其上喷洒上 重氮化的对-硝基苯胺。斑点相对于对照物的强度和位置是3-NPA浓度的量 度。TLC平板上的检测水平为25-50ppm。
另一种方法是，在100μl样品中加入50μl 1M NaOH和70μl重氮化 的对-硝基苯胺，通过分光光度法对3-NPA进行分析。检测水平为5-10ppm。
实施例1
A.米曲霉Bz 14的CPA阴性菌株的构建
冻干的米曲霉Bz 14菌株芽孢经过最适剂量的γ-射线的照射，剂量范围 在1000Gy到1250Gy，然后将这些芽孢以25-50个菌落/9cm平板的密度铺板 在筛选培养基1的平板上。产生环匹阿尼酸的菌落由于有红色不溶性CPA- Fe复合物存在而在筛选培养基1上形成红色反面(菌落的底面)。
从照射后的芽孢中筛选出了大约50,000个菌落并且分离出了154个CPA 缺陷型菌落，这些菌落的特点是有奶油色/白色的外观。在再次分离后，64 个菌株在筛选培养基1的平板上仍然保持非红色外观。使用TLC-plug(平板) 分析法，在52个菌株中未检测到CPA。然后将这些菌株在MDU-1B培养基 中在毒素诱导(34℃，250转/分，培养5天)的摇瓶发酵培养条件下进行培养。 使用TLC进行检测，36个菌株的上清液中不存在可检测水平的CPA。
B.来自米曲霉JaL228的CPA阴性菌株-BECh 1的构建
冻干的JaL228芽孢经过γ-射线照射，并且以上述方法筛选。待确定的无 CPA的分离株在毒素诱导条件下(34℃，250转/分，培养5天)在摇瓶中的 MDU-1B培养基上生长，使用TLC方法检测上清液中的CPA。检测可以在 上清液中直接进行或在上清液提取物中进行。
若使用提取方法，用10ml 0.1M的HCl酸化50ml总样品。然后将该混 合物与70ml甲醇/氯仿(1∶2)混合后剧烈振摇3-5分钟。分相后(约3小时)，将 底层相(大约25ml)转移到一个300ml的烧杯中使氯仿挥发。剩余物再溶于5ml 氯仿中并转移到一个25ml的烧杯中使氯仿挥发。残余物溶于100μl氯仿中。
在TLC平板(20cm×20cm)两对边上各上10μl样品上清液或氯仿提取 物，并按前一章所述的分析方法进行处理。
包括BECh在内的3个分离株不产生CPA。
C.CPA阴性和KA阴性菌株，BECh2和BECh3的构建
将BECh1生长在CoveN的斜面培养基中。在0.01％的Tween中悬起芽 孢至密度为3-5×106，并进行短波紫外辐射(254nm，杀菌灯)。在下面的筛选 中使用紫外剂量辐射的芽孢，该剂量使得1-5％存活。
辐射后的芽孢在KM2培养基中稀释到约0.7个芽孢/100μl，取100μl接 种到96孔微量滴定板的每一个孔中。在34℃的湿箱中静止培养培养物5-7 天。向每孔中加入40μl溶于0.1M HCl中的1％FeCl3作为生长指示剂。
出现强烈的红色代表产生了曲酸(KA)；没有颜色代表菌落不能产生曲 酸。
作为可供选择的另一方法，芽孢铺板于固化的KM2培养基上(在有 Triton x-100下限制性生长)并在成熟菌落出现时将平板用0.1M HCl中的 1％FeCl3浸没。在菌落周围没有红色区域代表推定的不产生曲酸。
从约7000个微量滴定培养板培养物中分离了132个推定不含KA的菌 落，即与FeCl3不发生颜色反应的菌落。然而当在初级KM2筛选琼脂板上测 试时，没有一个菌落被确定为KA阴性。
随后，对固态培养基上和静止液态KM2培养基(30℃)中的阴性菌落再在 KA诱导条件下在液体培养基中进行检测，KA阴性突变株的数目降到11个。 当在摇瓶中检测这些菌株的时候，其中的8个菌株产生KA。剩余的3个菌 株在其上清液上直接进行的分析中不产生颜色反应且用TLC检测时也没有 盐酸反应。正如所料想的一样，当生长在同时平行培养基中时，对照菌株 BECh1会产生KA。分离株中的一个表现出异常的形态。剩余的两个分离株 在MDU-1B中延长培养后对CPA和KA产生情况进行再测试。结果是CPA 和KA均未检测得到。这两个菌株命名为BECh2和BECh3。
D.已为CPA阴性和KA阴性的3-NPA阴性米曲霉菌株的构建
BECh2和BECh3菌株各自按上述方法进行紫外诱变。辐射后的芽孢在 96孔微量滴定板中稀释到约0.7个活芽孢/100μl Nakamura培养基。在30℃ 的湿箱中培养5-7天。
孔中生长的发酵肉汤样品或者转移到新的微孔板中并使用分光光度法 分析，或者应用于TLC平板中。3-NPA阴性的菌株在摇瓶中用Nakanura培 养基再培养并对3-NPA产生情况进行分析。仍为3-NPA阴性的菌株依照实 施例2中的方法用pCaHj493进行转化，如实施例3所述对转化体进行处理。
实施例2
米曲霉菌株JAL228和BECh1中脂肪酶的表达
A.质粒pCaHj493的构建
用BamHI和SalI消化脂肪酶质粒pAHL(WO 97/07202)，分离获得916bp 的编码脂肪酶的片段。
按WO 98/00529中所述，pCaHj 483用BamHI和XhoI进行消化，将 6757bp的载体片段与脂肪酶片段相连。连接混合物用于转化大肠杆菌DH5 α细胞，分离得到含有所需质粒的转化体。此质粒命名为pCaHj493。
B.将pCaHj493转化入JaL228和BECh-1菌株中
按EP-A-0531372中所述，用在乙酰胺进行筛选的方法将pCaHj493转 化入米曲霉菌株JaL228和BECh1。转化体经过两次芽孢再分离。在摇瓶和 微量滴定板培养物中栓测每个转化体第二次再分离的芽孢的脂肪酶产生情 况。
实施例3
A.CPA阴性和CPA阳性米曲霉菌株中脂肪酶的产生
检测摇瓶培养物中按实施例2所述方法制备的18个JaL228转化体和30 个BECh1转化体的脂肪酶的产生情况。
用10ml 0.1％的Tween溶液收获转化体的Cove N斜面培养物，芽孢悬 液用作100mlGl-Gly培养基中的接种物并置于500ml的双挡板摇瓶中。将培 养基在旋转摇动器上在250转/分，34℃下培养24小时。然后将10ml Gl-Gly 培养物转移到500ml摇瓶中的100ml1/5MDU-2BP中并在34℃，250转/分下 继续培养。
50小时后取出样品，通过Miracloth过滤并在4000×g下离心。用简单 放射免疫扩散的方法(见Scand.J.Immuno.Vol.17，suppl.10，41-56页，(1983) “免疫沉淀凝胶技术技术手册”，N.HAxelsen编辑，Blackwell Scientific Publications，1983)检测上清液中脂肪酶的浓度(以LU/ml表示)。
30个CPA阴性BECh1转化体的脂肪酶产量等于或高于18个JaL228 CPA阳性转化体的产量。下表2给出了分布的概况图。
B.CPA阴性和CPA阳性米曲霉菌株中木聚糖酶的产生
使用不可检测到CPA产生的10个菌株(实施例1A中制备)和3个可检测 到CPA的菌株进行有关木聚糖酶产生的评价。结果总结在下表1中。第2 列表示以真菌木聚糖酶单位(FXU)的形式表示的摇瓶培养物中木聚糖酶含 量，检测方法是通过简单放射免疫扩散的方法(见Scand.J.Immuno.Vol.17， suppl.10，41-56页，(1983)“免疫沉淀凝胶技术手册”，N.H.Axelsen编辑， Blackwell Scientific Publications)。
结果显示CPA阴性的菌株可以产生与CPA阳性菌株可比的木聚糖酶 量。
表1 菌株 FXU CPA/ppm 2-5 3-34 4-2 5-1 5-2 7-1 7-2 9-5 10-4 12-2 1-1 1-3 3-1 360 440 550 250 475 530 475 370 300 365 600 650 635 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 ＜2 2-3 20 7
＜2＝低于检测限
C.CPA阴性和KA阴性菌株中脂肪酶的产生
按照实施例2所述的方法用质粒pCaHj493对两个无CPA和KA的米曲 霉菌株BECh2和BECh3进行转化。分离转化体的芽孢两次。按照实施例2 所述，检测来自每个菌株的第二次再分离得到的芽孢的脂肪酶产生情况。
表2显示了来自这两个菌株的脂肪酶产量的概率分布情况。与米曲霉菌 株BECh1和JaL228的产量相比，结果表明并没有潜在的表达退化现象发 生。
从与用于脂肪酶生产培养物相同的芽孢悬液中，对用于CPA生产的 MDU1B摇瓶进行接种，并按上述方法培养5天。依照5B2部分进行DPA分 析。BECh1菌株无一产生CPA而18株JaL228菌株中的17株产生高于25ppm 的CPA，大多数菌株的CPA产量在100ppm以上。
表2 菌株 N 中值 LU/ml 平均值 LU/ml 最小值 LU/ml 最大值 LU/ml 标准偏差 LU/ml BECh2 50 3101 3203 350 6329 1490 BECh3 47 2619 2662 203 5455 1057 JaL228 18 1890 2330 635 4664 1361 BEChl 30 3025 2733 876 4097 879
实施例4
米曲霉DCAT-S基因的识别和基因组克隆
A.米曲霉二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合成酶(DCAT-S)基 因的识别
cDNA克隆(pJaL499)含有SEQ ID NO：1中所示的DNA序列，由于该 序列与麦角菌的二甲基烯丙基色氨酸合成酶(DMAT-S)同源而被认为参与了 CPA的生物合成。米曲霉cDNA克隆的测序显示其长度为1393个碱基对(SEQ ID NO：1)并编码含473个氨基酸的多肽(SEQ ID NO：2)，该多肽与麦角菌 的DMAT-S有42.1％相同。
米曲霉DCAT-S多肽参与了由环乙酰乙酰基-L-色氨酸和二甲基烯丙基 焦磷酸盐合成β-CPA的过程(见Nethling D.C.和R.M.McGrath，《Can.J. Microbiol.》(1977)23：856-872页)。
制备了JaL228和BECh1菌株的染色体DNA。该DNA经过BglII、NcoI、 XhoI和SpeI的消化并通过Southern印记法进行分析，使用1kb的32P标记 的来源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作为探针。Southern 印记分析表明产生CPA的JaL228菌株有1个DCAT-S基因，而在BEChl 中DCAT-S基因已经从染色体中缺失。
B.DCAT-S基因的基因组克隆
使用以下限制酶作出米曲霉DCAT-S基因的基因组限制酶图谱： EcoRI、SalI、BbuI、XhoI和XbaI，使用1kb的32P标记的来源于pJaL499 并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作为探针(图1)。此图表明其只有一 个拷贝的DCAT-S基因。
JaL228的基因组DNA或者用Tsp509I进行部分消化，或者在0.7％的琼 脂糖凝胶上进行。纯化大小在7到10kb之间的片段。
按照生产商(Stragtagene)提供的操作手册将纯化的DNA克隆入 Lambda ZAP II中。体内切下并再环化Lambda载体中所含的任何克隆插入 体，并按照生产商提供的指南构建含有插入克隆的用作DNA文库的嗜菌粒。 采用菌落杂交的方法，使用1kb的32P标记的来源于pJaL499并含有DCAT- S基因的BglII DNA片段作为探针来筛选编码DCAT-S基因的克隆，此方法 在标准的方法教科书中有概述(例如，J.Sambrook，E.F.Fritsch和T.Maniatis 编辑(1989)“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。
实施例5
通过基因破坏方法破坏米曲霉二甲基烯丙基-环乙酰乙酰基-L-色氨酸合 成酶(DCAT-S)产生米曲霉CPA阴性菌株
使用米曲霉pyrG基因作为筛选标记，在米曲霉pyrG-菌株中用一步基因 替换方法破坏DCAT-S基因(B.L.Miller等，《分子和细胞生物学》(1985)5： 1714-1721页，和G.May，《丝状真菌应用分子遗传学》，1-25页；J.R.Kinghorn 和G.Turner编辑；Blakie Academic and Professional，1992)。
A.DCAT-S基因破坏质粒的构建
质粒pJaL499经过SacII消化并用Klenow多聚酶进行处理形成钝端，按 生产商(Boehringer Mannheim)提供的指南用细菌碱性磷酸酶去除5’磷酸酯 基，然后用苯酚提取并沉淀。
按WO 98/12300所述，质粒pJaL335经过HindIII消化以获得含有米曲 霉pyrG基因的3.5kb片段，用Klenow多聚酶片段处理以形成钝端，通过凝 胶电泳进行分离并纯化。在转化入大肠杆菌后，用mini-plasmid preparation 的限制酶消化，鉴定含有合适质粒的菌落。图2总结了DCAT-S破坏质粒 (pDCAT-S-pyrG)的构建过程。
B.PyrG-米曲霉菌株JaL250的分离
筛选对5-氟-乳清酸有抗性的米曲霉菌株JaL228以识别自然产生的pyrG 突变株。一个命名为JaL250的菌株被鉴定为PyrG-。该突变株为尿嘧啶核苷 依赖性的，因此其可以用野生型的pyrG基因进行转化并通过在缺乏尿嘧啶 核苷下生长的能力来筛选转化体。
C.米曲霉DCAT-S-菌株的构建
按照Christensen等在《生物技术》(1988)6：1419-1422所述方法，将质 粒pDCAT-S-pyrG的4.9kb的NotI-EcoRI片段经过凝胶纯化，并用于转化米 曲霉菌株JaL250。然后通过其在缺乏尿嘧啶核苷下的生长能力来筛选转化 体。再分离两次后，按照实施例1所述的方法依其产生CPA的能力筛选转化 体。
为了确定DCAT-S基因已经被破坏，从不产生CPA的转化体制备染色 体DNA。制得的DNA经过EcoRI的消化并用于Southern印记分析，使用 1kb的32P标记的来源于pJaL499并含有DCAT-S基因的BglII DNA片段作 为探针。通过基于6.3kb的野生型EcoRI带迁移到基于9.8kb的EcoRI带， 识别出带有DCAT-S基因破坏的转化体。
实施例6
BECh1和BECh2缺少黄曲霉毒素生物合成通路簇中的两个基因的确定
找到了米曲霉IFO4177和其许多衍生物中的黄曲霉毒素生物合成通路 簇中存在的aflR和omtA黄曲霉毒素基因。通过PCR的方法从基因组DNA 中分离得到米曲霉IFO4177中aflR的同源序列，引物为5956(5’- GGATCCAGGGCTCCCTGGAG-3’)(SEQ ID NO：3)和5955(5’- CCTGACCAGCCAGATCTCCT-3’)(SEQ ID NO：4)。获得了一种0.9kb的 PCR片段并克隆入Invitrogen公司的pCR2载体中。使用M13正向(-40)和反 向引物对所得质粒pToC280进行测序，从而确定克隆的该片段的同一性。 omtA的同源序列也通过PCR的方法从基因组IFO4177 DNA中分离得到， 引物为6120(5’-AGTGAGAGAACTCCCTCCTC-3’)(SEQ ID NO：5)和 6121(5’-CCATATCTTCTCAGTCTCCA-3’)(SEQ ID NO：6)。获得了一种 1.2kb的片段并克隆入Invitrogen公司的pCR2载体中，对所得的质粒pToC276 进行测序，使用M13正向(-40)和反向引物以确认所克隆的片段的同一性。
aflR和omtA的克隆片段作为32P标记的探针用于杂交试验中。 IFO4177、pJaL228、BECh1和BECh2的基因组DNA均经过限制酶EcoRI 消化，产生的片段在0.7％的琼脂糖凝胶中分离。将DNA印记到膜上并在严 紧的条件下与两个32P标记的探针分别杂交(方法见J.Sambrook，E.F.Fritsch， 和T.Maniatis编辑(1989)“分子克隆：实验室手册”，第2版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York)。印记表明对来自IFO4177 和JaL228的两种探针均为阳性杂交信号，而含有BECh1和BECh2 DNA的 泳道没有可见的条带。使用omtA探针可见IFO4177和JaL228泳道上有约 3.8kb的片段，使用aflR探针可见约为0.5和4.3kb的两个带。
结果为，米曲霉IFO4177中含有至少两个来自黄曲霉毒素生物合成通路 的基因，即aflR和omtA基因。在黄曲霉和寄生曲霉中分离得到的基因约为 32kb(Woloshuk，C.P.和Prieto，R，《FEMS微生物学通信》(1998)160：169-176 页)。在IFO4177的衍生物BECh1和BECh2中均不存在这些基因。
这里所述并要求保护的本发明并不局限于这里公开的特定实施方案的 范围，因为这些实施方案是用来对本发明的几个方面进行说明。任何相当的 实施方案也应包括在本专利所涉及的范围内。事实上，通过前述描述，对于 本领域的普通技术人员来说，在本文所示出并描述之外的本发明的各种修饰 是显而易见的。这些修饰也落在所附权利要求书的范围内。
这里引用了各类参考文献，将其公开内容的全文引入作为参考。
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