一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用
阅读：561发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种抗 真菌 基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用，其中所述抗真菌基因为菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述多肽的 氨 基酸序列如SEQ ID NO.2所示；所述重组蛋白含有抗真菌基因，且表达 抗真菌多肽 。本发明的有益效果在于：所述抗真菌基因、多肽、重组蛋白可应用于生产蔬菜、畜禽及 水 产类抗菌药物、 疫苗 或 饲料 添加剂，具有广阔的应用前景；且所述基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用可为进一步研究菲律宾蛤仔免疫防御机制提供 基础 ，并为菲律宾蛤仔的病害防治、遗传选育和饲料添加剂研究奠定基础。，下面是一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用专利的具体信息内容。
1.一种抗真菌基因，其特征在于，所述抗真菌基因为一种菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因，所述基因的cDNA全长核苷酸序列为691 bp，且所述基因的开放阅读框为258 bp，编码85个氨基酸，5’非编码区长46 bp，3’非编码区长387 bp，有多聚腺苷酸尾巴；所述抗真菌Rpmacin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.根据权利要求1所述的一种抗真菌基因，其特征在于，所述抗真菌基因的cDNA全长核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：
cDNA合成：提取菲律宾蛤仔总RNA，经纯化和反转录得cDNA；
生成所述抗真菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出Rpmacin EST基因；采用巢式PCR策略生成所述抗真菌基因的全长cDNA。
3.一种抗真菌多肽，其特征在于，所述多肽的氨基酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.一种抗真菌重组蛋白，其特征在于，所述重组蛋白含有如权利要求1所述的抗真菌基因，且表达了如权利要求3所述的抗真菌多肽。
5.根据权利要求4所述的一种抗真菌重组蛋白的制备方法，其特征在于，所述制备方法包括以下步骤：
（5.1）重组表达载体的获得：将所述菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因连接到原核表达载体，获得重组表达载体；
（5.2）蛋白粗品的获得：将所述重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3) plysS，经诱导表达后获得原核体外重组表达蛋白粗品；
（5.3）蛋白纯化及复性：将原核体外重组表达蛋白粗品经镍柱亲和层析纯化、透析复性，获得所述抗真菌重组蛋白。
6.根据权利要求5所述的一种抗真菌重组蛋白的制备方法，其特征在于，步骤（5.1）中所述原核表达载体为pET30a(+)。
7.根据权利要求1所述的一种抗真菌基因的应用，其特征在于，所述抗真菌基因应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
8.根据权利要求3所述的一种抗真菌多肽的应用，其特征在于，所述抗真菌多肽应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
9.根据权利要求4所述的一种抗真菌重组蛋白的应用，其特征在于，所述抗真菌重组蛋白应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用
技术领域
背景技术
[0002] 抗菌肽（antimicrobial peptides，AMPs）是一类内源性小分子肽类活性物质，直接参与杀死和清除感染的病原微生物，是无脊椎动物先天免疫的重要效应分子，因其可作为传统抗生素的替代物而越来越受到关注。因其是内源性的小分子多肽，AMPs具有无污染、无抗原性、针对性强、热稳定、广谱抗菌等一系列优点，在抗病饲料添加剂研发方面具有重要的应用前景，因而对AMPs的研究已成为最为活跃的领域之一。
[0003] 研究学者已从原核生物和真核生物中分离得到多种AMPs编码基因，它们在结构和大小上均有较大差异。在不同物种中，不同结构的AMPs构成一个AMP库来共同对抗病原体。海洋无脊椎动物中已报道了多种AMPs的结构和功能，如已从贻贝两个物种Mytilus galloprovincialis和Mytilus edulis中成功分离出4类阳离子半胱氨酸AMPs，它们分别是类防御素多肽MGD-1和MGD-2、myticins、mytilins（含有8个半胱氨酸残基）以及mytimycin。
[0004] Macin也是富含半胱氨酸的阳离子AMPs大家族中的一员，最早从无脊椎动物水蛭中分离而来。在水蛭中它通常表达于免疫相关组织，如在神经元中，Macin蛋白的合成参与免疫反应和中枢神经系统的再生。对水蛭Macin蛋白抗菌机理和作用方式的研究发现，其最初的抗菌步骤为细菌细胞的聚集，随后发生沉淀，最终通过静电作用和疏水作用实现脂肽相互作用。迄今为止，在软体动物中只有少数Macin被报道，如Hyriopsis cumingii和Mytilus galloprovincialis，而海洋双壳类动物Macin功能和抗菌机理的研究尚未深入研究。
[0005] 菲律宾蛤仔（Ruditapes philippinarum）是我国单种产量最高的养殖贝类之一，其作为软体动物门双壳纲最为常见的物种之一，一直是进化、发育、生态毒理等多领域研究的重要研究对象。但是近年来，菲律宾蛤仔养殖大量死亡情况频现，这主要是病原体入侵和环境恶化等因素综合作用的结果，因此，急需对菲律宾蛤仔的免疫分子进行鉴定，进而为其养殖业的疾病控制和健康管理提供依据。
[0006] 针对以上问题，本发明以菲律宾蛤仔为研究对象，提供了一种菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用，为解决当前水产养殖病害严重、抗生素滥用引起的生态破坏和水产食品药物残留等问题提供了一种全新的方法。
发明内容
[0007] 为了弥补现有技术的不足，本发明提供了一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用，为解决当前水产养殖病害严重、抗生素滥用引起的生态破坏和食品药物残留等问题提供了一种全新的方法。
[0008] 本发明提供了一种抗真菌基因，为一种菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因，所述基因的cDNA全长核苷酸序列为691 bp，且所述基因的开放阅读框为258 bp，编码85个氨基酸，5’非编码区长46 bp，3’非编码区长387 bp，有多聚腺苷酸尾巴；所述抗真菌Rpmacin基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
[0009] 进一步，所述抗真菌基因的cDNA全长核苷酸序列的制备方法包括以下步骤：（1.1） cDNA合成：提取菲律宾蛤仔总RNA，经纯化和反转录得cDNA；
（1.2） 生成所述抗真菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出Rpmacin EST基因；采用巢式PCR策略生成所述抗真菌基因的全长cDNA。
（1.2） 生成所述抗真菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出Rpmacin EST基因；采用巢式PCR策略生成所述抗真菌基因的全长cDNA。
[0011] 本发明还提供了一种抗真菌重组蛋白，所述重组蛋白含有所述的抗真菌基因，且表达了所述的抗真菌多肽。
[0012] 本发明还提供了一种抗真菌重组蛋白的制备方法，所述制备方法包括以下步骤：（2.1） 重组表达载体的获得：将所述菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因连接到原核表达载体，获得重组表达载体；
（2.2） 蛋白粗品的获得：将所述重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3) plysS，经诱导表达后获得原核体外重组表达蛋白粗品；
（2.3） 蛋白纯化及复性：将原核体外重组表达蛋白粗品经镍柱亲和层析纯化、透析复性，获得所述抗真菌重组蛋白。
（2.2） 蛋白粗品的获得：将所述重组表达载体转化至大肠杆菌BL21(DE3) plysS，经诱导表达后获得原核体外重组表达蛋白粗品；
（2.3） 蛋白纯化及复性：将原核体外重组表达蛋白粗品经镍柱亲和层析纯化、透析复性，获得所述抗真菌重组蛋白。
[0013] 进一步，步骤（2.1）中所述原核表达载体为pET30a(+)。
[0014] 本发明还提供了一种抗真菌基因的应用，即所述抗真菌基因应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
[0015] 本发明还提供了一种抗真菌多肽的应用，即所述抗真菌多肽应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
[0016] 本发明还提供了一种抗真菌重组蛋白的应用，即所述抗真菌重组蛋白应用于制备抗菌药物、疫苗或饲料添加剂领域。
[0017] 本发明提供的一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法和应用具有以下优势：①本发明提供了一种可应用于贝类饲料添加剂、抗病药物、疫苗开发的抗真菌基因、多肽、重组蛋白及其制备方法；
②本发明所述的一种抗真菌基因的cDNA全长为691 bp，开放阅读框编码85个氨基酸，推测蛋白分子量大小为9.48 kDa，理论等电点为5.18；以此构建的原核重组表达载体pET30a(+)-Rpmacin，转化到大肠杆菌表达菌株DE3中可以获得稳定表达Rpmacin重组蛋白的菌株，经表达、纯化、复性后获得了具有生物活性的重组蛋白，并在体外验证了其生物学功能，鉴定所述重组蛋白具有良好的抗真菌活性。
②本发明所述的一种抗真菌基因的cDNA全长为691 bp，开放阅读框编码85个氨基酸，推测蛋白分子量大小为9.48 kDa，理论等电点为5.18；以此构建的原核重组表达载体pET30a(+)-Rpmacin，转化到大肠杆菌表达菌株DE3中可以获得稳定表达Rpmacin重组蛋白的菌株，经表达、纯化、复性后获得了具有生物活性的重组蛋白，并在体外验证了其生物学功能，鉴定所述重组蛋白具有良好的抗真菌活性。
[0018] ③本发明提供的一种抗真菌基因、多肽、重组蛋白可应用于生产蔬菜、畜禽及水产类抗菌药物、疫苗或饲料添加剂，具有广阔的应用前景。
[0020] 图1为本发明的实施例1中一种抗真菌基因由CDS区翻译获得氨基酸和其它物种Macin蛋白的序列比对结果图；图2为本发明的实施例2中一种抗真菌重组蛋白诱导表达、纯化、Western Blot检测结果图；其中Line1和Line 2代表IPTG诱导表达的重组蛋白，Line3代表纯化后的重组蛋白，Line4代表重组蛋白的Western Blot检测结果；
图3为本发明的实施例3中一种抗真菌重组蛋白对酵母菌的杀菌动力学曲线图；
图4为本发明的实施例3中一种抗真菌重组蛋白的酵母菌结合活性的ELISA结果；
图5为本发明的实施例3中未采用和采用一种真菌重组蛋白孵育后的酵母菌SEM图像；
其中A为未采用本发明的一种抗真菌重组蛋白孵育后的酵母菌SEM图像，B为采用本发明的一种抗真菌重组蛋白孵育后的酵母菌SEM图像。
图3为本发明的实施例3中一种抗真菌重组蛋白对酵母菌的杀菌动力学曲线图；
图4为本发明的实施例3中一种抗真菌重组蛋白的酵母菌结合活性的ELISA结果；
图5为本发明的实施例3中未采用和采用一种真菌重组蛋白孵育后的酵母菌SEM图像；
其中A为未采用本发明的一种抗真菌重组蛋白孵育后的酵母菌SEM图像，B为采用本发明的一种抗真菌重组蛋白孵育后的酵母菌SEM图像。
具体实施方式
[0021] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0022] 实施例1一种抗真菌基因（菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因）cDNA全长核苷酸序列的制备方法，包括以下步骤：
（1） cDNA合成
①提取菲律宾蛤仔总RNA：采用Trizol试剂法(Invitrogen公司)提取菲律宾蛤仔血细胞总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳确定总RNA完整性，Nanodrop2000检测总RNA浓度；
②总RNA纯化：总RNA经RQ1 DNA酶(Promega，USA)处理以去除DNA污染，完成RNA纯化；
③反转录获得cDNA：25 μL反转录反应体系包含2 μg总RNA、200 UM-MLV以及0.5 μM oligo dT引物，在42℃下反应1 h逆转录合成cDNA，随后95 ℃下5 min使酶失活。
（1） cDNA合成
①提取菲律宾蛤仔总RNA：采用Trizol试剂法(Invitrogen公司)提取菲律宾蛤仔血细胞总RNA，1.2%琼脂糖凝胶电泳确定总RNA完整性，Nanodrop2000检测总RNA浓度；
②总RNA纯化：总RNA经RQ1 DNA酶(Promega，USA)处理以去除DNA污染，完成RNA纯化；
③反转录获得cDNA：25 μL反转录反应体系包含2 μg总RNA、200 UM-MLV以及0.5 μM oligo dT引物，在42℃下反应1 h逆转录合成cDNA，随后95 ℃下5 min使酶失活。
[0023] （2） 生成抗真菌基因的全长cDNA：设计引物，利用PCR方法构建基因文库；对所述基因文库进行大规模EST测序，鉴定出Rpmacin EST基因；采用巢式PCR策略生成全长cDNA (P1和P2，表1)，具体步骤如下：①第一轮PCR：首先在94 ℃下预变性5 min，随后进行35个循环，每个循环经历94 ℃变性30 s、60 ℃退火30 s、72 ℃延伸1分钟，最后72 ℃后延伸10 min；
②第二轮PCR：以1 μL第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，以P2和dT为引物，反应程序与第一轮PCR一致；
③PCR扩增产物回收：使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像系统照相并观察结果并按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物回收；
④连接：将回收的PCR扩增产物连接到PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态trans5α，选取单克隆进行测序；
⑤序列分析：在NCBI网站经Blast分析后确定所获得的序列即为Rpmacin基因cDNA序列全长，由CDS区翻译获得氨基酸序列并进行生物信息学分析，多序列比对结果如图1所示。
②第二轮PCR：以1 μL第一轮PCR产物为模板进行第二轮PCR，以P2和dT为引物，反应程序与第一轮PCR一致；
③PCR扩增产物回收：使用1.5％的琼脂糖凝胶电泳后，使用凝胶成像系统照相并观察结果并按照琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒说明书进行PCR扩增产物回收；
④连接：将回收的PCR扩增产物连接到PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态trans5α，选取单克隆进行测序；
⑤序列分析：在NCBI网站经Blast分析后确定所获得的序列即为Rpmacin基因cDNA序列全长，由CDS区翻译获得氨基酸序列并进行生物信息学分析，多序列比对结果如图1所示。
[0024] 表 1 引物列表引物 序列 (5’-3’) 引物信息
P1 GAGTTAGGATACAATACTGGCACA 3’ RACE primer
P2 CAACAAAGTGGGACAGAAGCA 3’ RACE primer
实施例2
一种抗真菌重组蛋白（菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin重组蛋白）的制备方法，包括以下步骤：
（1） 重组表达载体的获得
①连接T载体：在菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因cDNA序列中编码成熟肽段的序列片段两端设计引物，并在上游引物添加BamHI酶切位点、下游引物添加HindШ酶切位点，之后进行PCR扩增，获得PCR产物2，将PCR产物2经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，连接进入PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态trans 5α后选取单克隆进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性；
②构建重组表达载体：对测序确定的菌株提取质粒，经BamHI和HindШ双酶切后回收目的片段，以T4连接酶再次连接进入原核表达载体pET30a(+)，获得重组表达载体pET30a(+)-Rpmacin，将其转化大肠杆菌感受态trans 5α，挑选单克隆菌进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性。
P1 GAGTTAGGATACAATACTGGCACA 3’ RACE primer
P2 CAACAAAGTGGGACAGAAGCA 3’ RACE primer
实施例2
一种抗真菌重组蛋白（菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin重组蛋白）的制备方法，包括以下步骤：
（1） 重组表达载体的获得
①连接T载体：在菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin基因cDNA序列中编码成熟肽段的序列片段两端设计引物，并在上游引物添加BamHI酶切位点、下游引物添加HindШ酶切位点，之后进行PCR扩增，获得PCR产物2，将PCR产物2经琼脂糖凝胶电泳后纯化回收，连接进入PMD19T载体中，转化大肠杆菌感受态trans 5α后选取单克隆进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性；
②构建重组表达载体：对测序确定的菌株提取质粒，经BamHI和HindШ双酶切后回收目的片段，以T4连接酶再次连接进入原核表达载体pET30a(+)，获得重组表达载体pET30a(+)-Rpmacin，将其转化大肠杆菌感受态trans 5α，挑选单克隆菌进行菌落PCR验证并测序确定序列的正确性。
[0025] （2） 蛋白粗品的获得：①转化表达菌株：对测序确定的菌株提取重组质粒，重组质粒转化表达菌株BL21（DE3）(购自Invitrogen公司)，过夜培养，挑选阳性单克隆进行菌落PCR验证，筛选得到阳性转化表达菌株，终浓度30%甘油保种于-80 ℃。
[0026] ②诱导表达浓度确定：取3个阳性转化表达菌株，摇菌过夜，第二天按照1%的比例接种含卡那霉素的LB培养基4管，每管10 mL，在37 ℃下，200 rpm培养3 h至OD 600为0.6-0.8，对其中3管分别添加IPTG至终浓度为0.1 mM，0.5 mM和1 mM，另外1管作为未诱导对照。
继续在37℃下以200 rpm摇菌诱导5h，分别吸取1mL菌液8000rpm离心10min弃上清收菌，加灭菌水40 μL重悬后添加10 μL 5 × SDS-PAGE上样缓冲液（+β-巯基乙醇），开水煮样10 min，SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色液染色20 min后脱色液脱色至背景干净，观察分析是否表达并确定诱导条件。IPTG 诱导浓度为0.1 mM时的诱导结果如图2的Lane 1-2所示，确定诱导浓度为IPTG 诱导浓度为0.1 mM。
继续在37℃下以200 rpm摇菌诱导5h，分别吸取1mL菌液8000rpm离心10min弃上清收菌，加灭菌水40 μL重悬后添加10 μL 5 × SDS-PAGE上样缓冲液（+β-巯基乙醇），开水煮样10 min，SDS-PAGE电泳，考马斯蓝染色液染色20 min后脱色液脱色至背景干净，观察分析是否表达并确定诱导条件。IPTG 诱导浓度为0.1 mM时的诱导结果如图2的Lane 1-2所示，确定诱导浓度为IPTG 诱导浓度为0.1 mM。
[0027] ③诱导表达：取3个阳性转化表达菌株，摇菌过夜，第二天按照1%的比例接种含卡那霉素的LB培养基200 mL，在37℃下，200 rpm培养3 h至OD 600为0.6-0.8，添加IPTG至终浓度为0.1 mM，继续在37℃下以200 rpm摇菌诱导5h，8000 rpm离心10 min弃上清收菌，用Buffer Ⅰ冲洗并重悬，转移至50 mL离心管中，体积为20 mL，暂存于4℃。将菌液超声破碎20 min左右直至液体澄清。破碎后的菌液在4℃下以10000 rpm的转速离心10 min收取上清，即为蛋白粗品。
[0028] （3） 蛋白纯化及复性①镍柱亲和层析纯化：采用传统过镍柱的方法进行蛋白纯化。0.2 M硫酸镍挂柱1-2 h，之后分别用50 ml超纯水和50 ml BufferⅠ过柱。含有蛋白粗品的上清液孵育20 min后缓慢过柱，以50 ml BufferⅠ平衡后用杂蛋白洗脱液过柱以去除杂蛋白，之后用洗脱液洗脱His标签蛋白，经SDS-PAGE检测后，含有目的蛋白的洗脱液于4℃暂存。
[0029] ②透析复性：将洗脱液加入透析袋中，分别用含有梯度尿素的复性液透析去除尿素，最后用只含Tris的复性液透析，以液氮速冻复性蛋白后保存于-80 ℃。SDS-PAGE电泳分析并用BCA试剂盒检测纯化蛋白浓度。蛋白纯化结果如图2的Lane 3所示。
[0030] （4） 抗体制备和Western-blot检测复性蛋白经超纯水透析去除Tris后冷冻干燥用于免疫6周龄小鼠。100μg Rpmacin与完全弗氏佐剂混合乳化进行小鼠腹腔注射，两周后100μg Rpmacin与不完全弗氏佐剂混合乳化接种小鼠。第三和第四次为尾静脉注射，间隔一周，每次注射量50 μg。最后一次注射后7天牺牲小鼠收集抗血清。
[0031] 蛋白样品进行SDS-PAGE电泳并切割合适大小，备好大小适宜的滤纸和硝酸纤维素膜，电转液浸湿上述物品后，蛋白转移槽内从负极到正极按顺序摆放：海绵，三层滤纸，蛋白胶，硝酸纤维素膜，三层滤纸，海绵。每放入一层需以镊子赶走气泡。合上胶板放入转膜槽中，加入电转液，转膜槽置于冰盒中，200 mA电流转膜2 h；封闭：将膜置于一洁净小盒中，用5%的脱脂牛奶在摇床上轻摇2 h进行封闭；一抗孵育：TBST洗膜2次，每次5 min，按1：3000加入抗血清，摇床上孵育2 h；二抗孵育（兔抗鼠 IgG-HRP 抗体）：TBST洗膜3次，每次5 min，按
1：5000加入二抗，摇床上孵育2 h；显色：TBST洗膜3次，每次5 min，滴加ECL显色液，于显色仪中显色并保存照片。Western-blot检测结果如图2的Lane 4所示。
1：5000加入二抗，摇床上孵育2 h；显色：TBST洗膜3次，每次5 min，滴加ECL显色液，于显色仪中显色并保存照片。Western-blot检测结果如图2的Lane 4所示。
[0032] 实施例3一种真菌重组蛋白（菲律宾蛤仔抗真菌Rpmacin重组蛋白）的活性检测，具体包括以下几个方面：
（1）杀菌动力学
培养基培养酵母直至指数生长期，进行杀菌动力学检测。离心收获酵母后，用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤3次后重悬，在37 ℃下以1×MIC浓度的Rpmacin重组蛋白孵育2×107个酵母细胞，对照组以PBS替换Rpmacin重组蛋白，分别在孵育后第0、10、30、60、160、400、1000 min进行检测，以菌落形成单位（CFU）表示存活酵母数，并根据活菌数的对数绘制随时间变化的杀菌动力学曲线图。实验进行了3次重复。
（1）杀菌动力学
培养基培养酵母直至指数生长期，进行杀菌动力学检测。离心收获酵母后，用PBS缓冲液（pH 7.4）洗涤3次后重悬，在37 ℃下以1×MIC浓度的Rpmacin重组蛋白孵育2×107个酵母细胞，对照组以PBS替换Rpmacin重组蛋白，分别在孵育后第0、10、30、60、160、400、1000 min进行检测，以菌落形成单位（CFU）表示存活酵母数，并根据活菌数的对数绘制随时间变化的杀菌动力学曲线图。实验进行了3次重复。
[0033] 结果如图3所示，与对照组相比，当酵母与Rpmacin重组蛋白以1×MIC的浓度孵育后，70%以上的酵母菌在60 min内被杀死，当孵育进行400 min，杀菌比例达到85%以上。
[0034] （2）真菌结合实验采用ELISA法检测rRpmacin的真菌（酵母菌）结合能力。96孔板中接种酵母菌后在4°C下培养过夜进行包被，用以PBS配制的3%BSA在37°C下孵育1 h进行封闭，PBST清洗3次。添加浓度为0、1.5、3、6、12 μg/mL的Rpmacin重组蛋白溶液后在18℃下孵育3小时。随后依次以Rpmacin一抗（1:1000）和羊抗鼠Ig二抗（1:5000）孵育（Southern Biotech，美国）。最后加入pNPP基质溶液，室温避光孵育，在405 nm处测定吸光度。以100 μL重碳酸盐缓冲液替换Rpmacin重组蛋白溶液作为对照，每组实验设置3个平行。
[0035] 结果如图4所示，与对照组相比，Rpmacin重组蛋白在体外可以直接与酵母菌成剂量依赖性结合。
[0036] （3）扫描电镜观察在培养基中培养酵母菌，在室温下用1×MIC浓度的Rpmacin重组蛋白处理60 min，并固定在盖玻片上。用以0.1M磷酸钠缓冲液配制的2.5%戊二醛（w/v）固定30分钟，随后以梯度乙醇脱水。对样品进行临界点干燥、镀金后，用扫描电镜（SEM，Hitachi S-4800，日本）观察酵母菌表面形态变化，结果如图5所示。
[0037] 图中，对照组酵母菌圆润光滑，表面无明显破裂；而与Rpmacin重组蛋白孵育后，细胞发生皱缩，细胞表面明显变粗糙并出现破裂，即Rpmacin重组蛋白改变了酵母菌细胞膜的完整性。
[0038] （4）黄瓜与白菜霜霉病的防治采用一种靶向细菌核酸的抗菌VpBDef-2重组蛋白抑制白菜和黄瓜霜霉病的实验，具体步骤为：采用1×MIC Rpmacin重组蛋白喷涂于白菜和黄瓜叶片表面，采用莴苣盘梗霉进行攻毒实验，对照组为未喷涂Rpmacin重组蛋白的蔬菜组，统计实验组和对照组蔬菜发病的比例。
[0039] 实验结果如图5所示，喷涂Rpmacin重组蛋白后，可抑制莴苣盘梗霉引起的白菜或黄瓜霜霉病，发病比例分别降低23%和30%。
[0040] 应当理解，以上所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定本发明。由本发明的精神所引伸出的显而易见的变化或变动仍处于本发明的保护范围之中。
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