许多传染原能够在宿主机体内引起感染和疾病；此类传染原包 括原生动物，真菌，细菌，病毒，甚至虫子。这些传染原中，那些有细 胞内作用机制的，对预防和治疗提出了最大挑战。当胞内传染原的 宿主为哺乳动物，如人时，尤为如此。
哺乳动物具有复杂的免疫系统，其具有多种不同的机制以防御 传染原的侵入。在正常情况下，免疫系统的作用是从哺乳动物宿主 体系中彻底排除传染原。因为哺乳动物的免疫系统通常能够排除传 染原，所以大多数感染是自身限制的。然而，当免疫系统不能够或者 不对传染原的存在作出反应时，就会产生问题。这种情况下，感染会 变成慢性并持续存在多年甚至受感染的人或动物一生，通常导致严 重的疾病。
传统的、标准疫苗特免疫系统暴露给外来抗原，如那些传染原， 以引发抗原特异性免疫应答。这种免疫应答大多常为体液免疫而非 细胞免疫，也就是说，它导致抗体的产生，而不是下面所述的基于T -细胞的免疫。有效的接种预防感染或减轻感染引起的疾病，感染 是由疫苗针对的传染原引起的。
引发中和抗体的免疫应答足以预防某些病毒的感染。Murphy 等(1990)。所以，这些病毒引起的感染可以通过接种产生中和抗体 的抗原来预防。然而，对某些病毒和非病毒传染原，不能引发中和 抗体，或即使能够引发，中和抗体也不足以预防感染和/或疾病的发 展。
两种传统的疫苗类型为死病毒和活的减毒病毒。死病毒由完整 的病毒体组成或者其它传染原组成，其传染性已被灭活。这些病毒 也可以由抗原的亚单位或病毒体的组成部分或其它传染原组成。这 些疫苗以非肠道途径接种或直接用于粘膜上。活的减毒疫苗由活病 毒或其它经遗传学手段已改变毒力的传染原组成。当用于接种时， 这些疫苗会引起减轻形式的疾病或根本不发病。
已经研究出并在实验中使用了第三种类型的疫苗，但还没有用 于临床。该方法是使用活的物质(如病毒或细菌)做载体来表达异源 传染原的疫苗抗原。编码抗原的基因或核苷酸序列由该载体表达， 并且当用于接种时，直接将宿主暴露给抗原。期望对该抗原产生的 免疫应答能保护宿主不受传染原(上述抗原源自该传感染)的感染。
死疫苗的例子包括破伤风类毒素，流感病毒亚单位，狂犬病，脊 髓灰质炎和HBV。活的减毒疫苗的例子包括伤寒杆菌(Salmonella typhi)Ty21-α和脊髓灰质炎，麻疹，风疹，腮腺炎，天花和黄热病 病毒活疫苗。用于表达异源疫苗抗原的活载体的例子有牛痘病毒， 腺病毒，腺病毒相关病毒和S.typhi Ty21-α株。
与严重发病和早死有关的慢性感染的例子包括两种人肝炎病 毒，乙型肝炎病毒(HBV)和丙型肝炎病毒(HCV)，它们可导致慢性 肝炎，肝硬化和肝癌。人HBV传染很类似于在某些动物中由密切相 关的肝DNA病毒引起的传染，包括感染Beechey地松鼠的地松鼠 肝炎病毒(GSHV)，感染土拨鼠的土拨鼠肝炎病毒(WHV)和感染鸭 子的鸭肝炎病毒(DHBV)，Robihson，在，Virology，第2版，编辑 B.Fields，Raven Rress，NewYork，PP.2137-2169(1990)。人类 由病毒传染原引起的慢性感染的其它例子包括那些由人逆转录病毒 引起的感染：人免疫缺陷病毒(HIV-1和HIV-2)，它引起获得性 免疫缺陷综合症(AIDS)；和引起T细胞性白血病和骨髓病的人T 亲淋巴性病毒(HTLV-1和HTLV-2)。许多其它的感染如包括单 纯性疱疹病毒(HSV)型1和2的人疱疹病毒，Epstein Barr病毒 (EBV)，巨细胞病毒(CMV)，水痘-带状疱疹病毒和人疱疹病毒6 (HHV-6)不能被宿主机制根除，而是变为慢性并在此情况下会引 起疾病。人乳头状瘤病毒引起的慢性感染与子宫颈癌有关。许多其 它的病毒和传染原当宿主防御机制不能将它们排除时在胞内进行复 制并且会变为慢性感染。这些包括病原性的原生动物(如卡氏肺囊 虫Pneumocystis  Carinii，锥虫属Trypanosoma，利什曼原虫属 Leishmania，疟Malaria和兔弓形虫Toxoplasma gondii)，细菌 (如，分支杆菌mycobacteria，沙门菌Salmonella和李斯特菌属Lis- teria)，和真菌(如假丝酵母属Candida和曲霉属aspergillus)。
可以产生显著的临床效果的，对慢性病毒感染的治疗还未取得 重大成功，因为治疗不能终止感染或排除病毒。以前的治疗包括服用 如核苷类似物的小分子化合物或如干扰素的有生物活性的蛋白质。 这些治疗抑制病毒的复制但没有从细胞中排除病毒或排除病毒感染 的细胞，并且仅在用药过程中使疾病得到有限的改观。遗憾的是，当 给药中断时病毒感染经常会加重。
常用的抗病毒治疗包括核苷类似物，如治疗慢性HIV感染和 有关AIDS的叠氮脱氧胸苷(AZT)，双脱氧肌苷(DDI)和双脱氧胞 苷(DDC)和治疗HBV感染和有关的肝病的阿糖腺苷(araA)。在治 疗慢性感染的过程中干扰素相似地抑制HBV和HCV，但是当治疗 中断时，病毒通常会返回治疗前的水平且疾病会进一步加重。
哺乳动物的免疫系统对于控制和彻底排除胞内传染原导致的不 断发展的感染所采取的一个重要机制是通过某些T细胞的活化来 激活细胞免疫应答。T细胞的活化导致细胞毒性的T淋巴细胞 (CTL)对被感染细胞表面的病毒(或其它胞内传染原)抗原的应答和 感染细胞的排除。Guilhot等，J.Virolm，66：2670-2678(1992)。这 样最终导致被感染细胞的排除和感染细胞中的传染原的排除。对病 毒传染原的免疫应答的总体论述参见Whitton等，在Virology，第2 版，编辑B.Fields，Raven Press，New York，PP.369-381( 1990)；和Roitt.Essential Immunology，第7版(1991)。
当T细胞受体(TCR)和抗原多肽形成一种三元复合物(这里的 抗原多肽已在专门的抗原呈递细胞(APC)表面和自身-MHC(主 要组织相容性复合物)形成复合物)时发生T细胞的活化，专门的 APCs包括巨噬细胞和活化的B细胞。Townsend等，Cell，44：959 -968(1986)；Townsend等，Ann.Rev.Immunol.，7：601-624 (1989)；Bjorkman等，Nature，329：512-518(1987)；和Jardetsky 等，Nature，353：326-329(1991)。该三元复合物允许一种共同刺激 信号在细胞间通过。T细胞的活化不仅要求TCR对抗原多肽- MHC复合物的识别，而且还要求位于APCs表面的“共同刺激因 子”与T细胞表面的特异性分子“共同刺激配体”相互作用。Free- man等，J.Exp.Med.，174：625-691(1991)。正如此处所说的， APCs上的共同刺激因子包括在T细胞表面与CD28和CTL-4蛋 白特异结合的B7-1蛋白，和T细胞活化时与CTLA-4结合的 B7-2和B7-3蛋白，但并不限于这些。Boussiotis等，Proc.Natl. Acad.Sci.USA，90：11059-11063(1993)。B7配体专一地由专门的 APCs表达。Freeman等，J.Exp.Med.，174：625-631(1991)； Razi-Wolf等(1992)；和Larsen等(1992)已表明，CD28和B7-1 的相互作用对T细胞活化是非常必要的。Jenkihs等，J.Im- munol.，140：3324-3330(1988)；Linsley等(1990)；Linsley等，J. Exp.Med.，173：721-730(1991)；Gimmi等，Proc.Natl.Acad. Sci.USA，88：6575-6579(1991)；Jenkins等，J.Immunol.，147： 2461-2466(1991)；和Harding等(1992)。
发现于APC上的共同刺激因子分子之一是B7蛋白，它是T 细胞表面分化抗原CD28的配体。已发现，通常受专门APCs影响 的B7的表达对原始(naive)T细胞的活化是至关重要的。Larsen 等，J.Exp.Med.，176：1215-1220(1992)，其它研究已经表明，T细 胞功能活性的提高与B7表达的增强之间存在直接的联系。Razi- Wolf等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，89：4210-4214(1992)。在缺 乏以CD28为受体的共同刺激配体的细胞上，当T细胞与抗原多肽 相遇时，T细胞不显示变应性。Harding等，Nature，356：607-609 (1992)。
当结合有MHC I类分子的特异性病毒抗原多肽片断作为 MHC限制的CTL的靶呈现在细胞表面时，被感染细胞中的病毒 抗原会降解。Whitton等(1990)。然而，被病毒感染的宿主中的大多 数感染细胞不是表达共同刺激蛋白的专门APCs。并且，缺乏如B7 -1，B7-2，B7-3这样的共同刺激分子的被感染的细胞不会引发 有效的细胞免疫应答。当这些机制不足以且不能够排除传染原时， 感染就会持续下去并转为慢性。
有些参与消除胞内传染原引起的不断发展的感染的免疫机制， 如CTL应答，在预防新的感染中也起一定的作用。而其它免疫机制， 如中和抗体，在预防某些病毒感染方面比在消除不断发展的感染方 面显得更为重要。在中和抗体这种情形中，直接作用于表面抗原的 抗体能够通过促使病毒的聚集并从血流中彻底移去病毒来中和病毒 的传染性。通常由病毒中和抗体阻断的病毒感染也能通过引发相同 中和抗体的抗原产生的免疫来预防。然而，对其它胞内传染原来说， 中和抗体不会被引发，或即使被引发，也不足以起到保护作用。不 过，通过引入适当的免疫制剂仍能获得保护。在这种情况下，细胞免 疫机制显示出能促进免疫制剂保护机体不受感染。为使免疫应答产 生保护作用，免疫制剂必须引发一种强烈而持续的CTL应答。Mur- phy等，在Virology，第2版，编辑B.Field，Raven Press，New York，pp.469-502(1990)。
因此，需要一种通过引发强烈的CTL应答来增强对胞内传染原 (如病毒)的免疫应答的方法。本发明即满足了这种需要。
发明概述
本发明提供了增强个体对胞内传染原如病毒，原生动物，真菌或 细菌的免疫应答的物质和方法。物质包括编码用于T细胞活化的共 同刺激因子(以后均称“共同刺激因子”)和一来自传染原的“靶抗 原”的载体。载体可以是一种核苷酸，也可以装配于病毒中，可以直 接给药于受治疗的个体，或者可选择地，插入于一细胞中然后特该细 胞给药于受治疗的个体。编码共同刺激因子和靶抗原的遗传信息的 摄入通过引发针对于传染原感染的细胞的CTLs的产生增强了免疫 应答，此处靶抗原来自传染原。
相应地，本发明的一个实例是重组多核苷酸，其包含一个编码 共同刺激因子的区域(该区域可操纵地与转录控制区连接)，进一步 包含一个编码靶抗原多肽的区域(该区可操纵地与转录控制区相 连)。共同刺激因子和靶抗原多肽在个体上的表达，使个体对自然编 码靶抗原多肽的胞内传染原至少具有部分免疫力。重组多核苷酸可 以包括一个病毒载体或其它如下所述的载体。
本发明的另一实例是由包含一个可操纵地与转录控制区相连 接、编码共同刺激因子的区域的重组多核苷酸和包含一个可操纵地 与转录控制区相连接、编码靶抗原多肽的区域的重组多核苷酸转化 的宿主细胞。共同刺激因子和靶抗原多肽在个体中的表达使个体对 自然编码靶抗原多肽的胞内传染原至少具有部分免疫力。
本发明的另一实例是使用含有可操纵地与转录控制区相连接、 编码共同刺激因子的区域的重组多核苷酸和含有可操纵地与转录控 制区相连接、编码靶抗原多肽的区域的重组多核苷酸的方法，该方 法包括给予个体治疗有效果的重组多核苷酸；并确定身体症状的减 轻程度，其与对自然编码靶抗原的胞内病原体产生的感染的应答有 关。
本发明的另一实例是一种使用上述重组多核苷酸的方法，包含 多核苷酸转化宿主细胞。用这种方法制备的宿主细胞和其子代也是 要求保护的内容。
附图的简要说明
图1是两种病毒载体的直线图。
发明详细描述
共同刺激因子的关键作用是使表达所需的靶抗原，如病毒抗原 的细胞成为有效的APCs，以促进T细胞的活化。通过产生一个同时 表达共同刺激因子(或其功能部分)和靶抗原的系统，结果应答可导 致被感染宿主细胞的排除和对未感染宿主细胞免受新感染的更强保 护。
本发明说明，免疫疗法能用来活化和/或增强被感染哺乳动物宿 主的免疫应答，该免疫疗法是将编码共同刺激因子的功能部分和靶 抗原的遗传信息导入个体。这种增强效果包括对胞内传染原(靶抗 原来自该传染原)所引起的感染的细胞应答，和一种在未感染细胞 内诱导的保护性免疫应答，以预防传染原的新感染。
此处所用的术语定义如下。
术语“多肽”是指氨基酸的多聚物而不是指特定长度的产品；因 此，肽、寡肽和蛋白质均包括在多肽的定义中。这一术语也不指或排 除表达后多肽的修饰，如糖基化，乙酰化，磷酸化等。此定义包括如 含一个或多个氨基酸(包括如非天然氨基酸等)类似物的多肽，有取 代键的多肽，以及其它本领域所公知的修饰的多肽，自然产生的和非 天然产生的。
这里用的“转化”是指将外源多核苷酸插入宿主细胞，而不用考 虑所使用的插入方法，如直接摄取，转导，f-接合或电穿孔。外源多 核苷酸可以保持为一个非整合的载体中，如质粒或可选择地，可以整 合到宿主细胞的基因组中。
这里用的“治疗”是指预防和/或治疗。治疗的有效性由通常与 由胞内病原体引起的疾病有关的一个或多个症状的减轻程度而确 定。
“胞内病原体”是指能在敏感个体上引起疾病状态的物质，病原 体的部份或全部复制循环过程发生于被感染的个体细胞中。胞内病 原体包括，例如，原生动物，真菌，细菌和病毒。
“协助细胞”或“TH细胞”是能协助产生细胞毒性的T细胞和协 助B细胞产生抗体应答的T细胞的功能性亚类。协助细胞通常识别 与II类MHC分子有关的抗原。
“抗原特异的T细胞克隆”由单一细胞的子代组成；这种类型克 隆的细胞具有相同的表型并且均靶向于同样的抗原。制备抗原特异 T细胞克隆的方法在本领域是公知的。
术语“重组表达载体”是指能够通过转化，电穿孔，转导或病毒感 染被转入靶细胞中的DNA或RAN的可复制单位，其编码异源结 构编码序列的表达如细胞因子，在基因表达中起调节作用的单位的 控制下被转录到mRNA并被翻译成蛋白质。这种载体也优选含有 适当的转录和翻译控制序列，包括可操纵地与编码序列连接的起始 序列。
这里的“重组体”意思是指，一种特定的DNA序列是克隆、限制 作用和连接步骤的各种组合的产物，得到具有区别于自然系统中发 现的同源序列的结构编码序列的构建物。通常，编码结构编码序列的 DNA序列，如细胞因子，可通过cDNA片断和短的寡核苷酸接头， 或一系列的寡核苷酸装配而得，以提供能在重组体转录单位中被表 达的合成基因。优选以未被内部非翻译序列或内含子中断的开放阅 读框的形式提供这些序列，其通常存在于真核生物基因中。也可使 用含有相关序列的基因组DNA。非翻译DNA序列可位于开放阅读 框的5′或3′端，这里此序列不干扰编码区的操作和表达。
“重组宿主细胞”，“宿主细胞”，“细胞”，“细胞系”，“细胞培养物” 和其它这类术语表示作为单一细胞整体培养的微生物或更高级真 核生物细胞系是指能或已用作重组载体或其它转移多核苷酸的接受 者，并包括已被转染的原代细胞的子代。由于自然的，偶然的或人为 造成的突变，单一细胞的子代可以不必在形态上或基因组的或整个 的DNA补体上与原代亲本细胞完全相同，它一点已为人所知。
若CTL能选择性识别并溶解带有抗原的细胞，则CTL对表达 抗原的细胞具有“细胞溶解特异性”。如果CTL能溶解带有抗原的细 胞，而不考虑其选择识别这些细胞的能力，则CTL对表达抗原的细 胞具有细胞溶解反应性。
“抗原特异的表达”指当T细胞识别其同源抗原时发生的表达。
“同源抗原”是指一种抗原，即一种多肽，当与其MHC分子结 合时，形成一种配体，该配体与识别它的淋巴细胞结合，并引发细胞 的效应子功能信号和/或增殖信号。
“靶抗原”是指一种抗原，当其在细胞中被表达时能引发直接针 对于表达该抗原的细胞的CTL应答。
“配位”是指抗原或抗原片断的一部分，其允许抗原与MHC分 子结合。
“活化的淋巴细胞”是指作为同源抗原多肽：MHC分子的结合 结果，其可以比未结合配体的淋巴细胞更高水平产生多肽刺激因子 (包括，例如细胞因子)。
“转录调节区”包括所有转录所必需的单位并且可包括调节和细 胞特异转录所必需的单位。因此，转录调节区至少包括启动子序列， 并也可包括其它调节序列，如增强子，和转录因子结合位点。
“可操纵地连接”是指一种并置，其中所描述的组成部分处在一 种允许其行使所欲想的功能的关系中。例如，如果启动子能影响编 码序列的转录或表达，则称启动子与编码序列是可操纵地连接。
“重组”多核苷酸或核酸是指非天然产生的，或是通过两个其它 分离的序列片断的人工组合而制得。这种人工组合通常由化学合成 法来完成，或由对分离的核酸片断的人工操纵如基因工程技术手段 来完成。一般地，当导入或移去一个序列识别位点时，通常以编码同 样氨基酸或共有氨基酸的丰余密码子来取代一个密码子。可选择 地，将所需功能的核酸片断连接在一起，产生一个需要的功能组合。
“调节序列”是指那些通常与影响基因表达(包括基因的转录，和 翻译，剪切，稳定性或信使RNA的诸方面)的基因座编码区有关的 序列(例如，在50kb之内)。调节序列包括特别是，启动子，增强子，剪 切位点和聚腺苷酸化位点。
核酸的“有意义链”含有与同源mRNA具有序列同源性的序 列。“反意义链”含有“有意义链”的互补序列。
此处所用的“个体”是指脊椎动物，尤其是哺乳类动物，并包括家 畜、竞技动物和灵长类动物(包括人)，但并不限于此范围。
“免疫”是指通过给予治疗或预防制剂使个体产生的免疫状态。
通过“免疫”是指减轻和/或预防一种或多种身体症状，该症状与 对病原体(靶抗原源自该病原体)的感染产生的应答相关。
对组合物或疫苗的“免疫应答”是在宿主中对编码靶抗原的胞内 传染原产生的细胞和/或抗体介导的免疫应答的发展。通常，这种应 答包括个体产生的对表达靶抗原的APCs具有特异性的CTLS和/ 或B细胞和/或各种不同类型的T细胞。
组合物的“治疗有效量”是足以诱导免疫应答和/或对自然编码 靶抗原的胞内传染原具有免疫力的剂量。
除非另有说明，本发明的实施手段将采用分子生物学，微生物 学，重组DNA和免疫学的常规技术，其均为本领域所熟知。这类技 术在文献中有充分的说明，参见如，Sambrook，Fritsch，和Mani- atis，MOLECULAR  CLONING：A LABORATORY MANU- AL，第2版(1989)，OLIGONUCLEOTIDE SYNTHESIS(M.J. Gait编，1984)，ANIMAL CELL CULTURE(R.I.Freshney编， 1987)，the Series METHODS IN ENZYMOLOGY(Academ- ic Press，Inc.)；GENE TRANSFER VECTORS FOR MAMMALIAN CELLS(J.M.Miller和M.P.Calos编，1987)， HANDBOOK OF EXPERIMENTAL IMMUNOLOGY，( D.M.Weir和C.C.Blackwell，编)；CURRENT PROTOCOLS IN MOLECULAR BIOLOGy，(F.M.Ausubel，R.Brent，R.E. Kingston，D.D.Moore，J.G.Siedman，J.A.Smith，和K.Struhl编， 1987)；和CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY(J. E.Coligan，A.M.kruisbeek，D.H.Margulies，E.M.Shevach和 W.Strober编，1991)。所有这里所提及的专利，专利申请以及专利 公开，无论是前述的或后提到的，在此均被引为参考文献。
根据本发明，表达靶抗原和能刺激T细胞应答，尤其是CTL 应答的APCs既可在体内产生，也可在体外产生，即通过插入一段或 多段含有编码至少一种共同刺激因子和至少一种靶抗原多肽的序列 来产生，这样共同刺激因子和靶抗原多肽便在受体宿主细胞内得到 表达。
由重组多核苷酸表达的共同刺激因子至少包括蛋白质的一部 分，其足以使表达共同刺激因子的细胞与其共同刺激配体结合。确定 这种结合的方法在本领域为公知技术。参见，例如，Linsley等描述 的一种方法，其中要检测的细胞用51Cr标记，然后与CD28+和 CD28-CHO细胞一起保温，通过测定51Cr的释放来确定标记细胞 和CHO细胞粘着。Proc.Natl.Acad.Sci.USA，87：5031-5035 (1990)。共同刺激因子的胞外区域和跨膜区域通常包含于多肽中，在 优选实施例中，对整个共同刺激因子进行编码。编码共同刺激因子 和功能区的多核苷酸序列是已知的，并描述于如Linsley等(1990) (人)和Freeman等J.Immunol.，143：2714-2722(1989)(鼠)。
由重组多核苷酸表达的靶抗原多肽是全部靶抗原或靶抗原的片 断，靶抗原是在致病的胞内微生物中自然编码的，需要一个增强或增 大的免疫应答来对抗它，并由一个或多个来自该微生物的配位组 成。靶抗原优选来自病毒，尤其是导致慢性感染的病毒，例如肝 DNA病毒(包括HBV)，慢病毒属(包括HIV)，疱疹病毒(包括 HSV-1，HSV-2，EBV，CMV，VZV和HHV-6)和黄病毒/瘟病 毒属(包括HCV)。还包括的作为引起慢性病毒感染的病毒有，人反 转录病毒，例如T亲淋巴细胞病毒(HTLV-1和HTLV-2)，其引 起T细胞白血病和骨髓病。引起慢性感染的其它微生物包括，例如， 病原性的原生动物(如卡氏肺囊虫，锥虫属，疟和兔弓形虫)，细菌(如 分支杆菌，沙门菌和李斯特菌属)和真菌(如假丝酵母属和曲霉属)。
这些病毒包括不同的种，株和分离物，其核苷酸序列均在本领域 所公知。参见：Robinson(1990)(Hepadnaviridae)；Levy，Micro- biological Reviexws，57：183-289(1993)(HIV)；和Choo等，Semi- nars in Liver Disease，12：279-288(1992)(HCV)。特别适合 的靶抗原是那些在感染中能诱导T细胞应答，并特别是CTL应答 的靶抗原。这些可以包括，例如得自HBV的核心抗原，E抗原和表 面抗原(HBsAg)。包括得自各种表面抗原亚型的Pre-S1，Pre-S2 和S区的HBsAg的多核苷酸序列在本领域已公知。见，例如， Okamoto等，J.Gen.Virol.，67：1383-1389(1986)；Genbank accession  numbers DOO329和DOO330。编码HIV糖蛋白 gp160和其它抗原性的HIV区的多核苷酸序列在本领域已公知。 Lautenberger等，Nature，313：277-284(1985)；Starcich等，Cell， 45：637-648(1986)；Wiley等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，83：5038 -5042(1986)；和Modroxw等，J.Virol.，61：570-578(1987)。
本发明范围内也包括编码两种或多种可被融合或不可被融合的 靶抗原多肽的核苷酸。两种靶抗原多肽可以得自同一病原性胞内微 生物，或者当欲增强对多于一种微生物的免疫应答时，两种靶抗原多 肽来自不同的微生物。
编码共同刺激因子和靶抗原多肽的序列与转录控制区可操纵地 连接。转录控制区在本领域已公知，并包括，例如自下述来源分离出 的区域：人巨细胞病毒(HCMV)IE94启动子区(Boshart等，Cell， 41：521-530(1985))；人IL-2基因(Fujita等，Cell，46：401-407 (1986))；人IFN-y基因(Ciccarone等，J.Immunol.144：725-730 (1990))；人IL-3基因(Shoemaker等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA， 87：9650-9654(1990))；人IL-4基因(Arai等，J.Immunol.， 142：274-282(1989)；人淋巴毒素基因(Nedwin等，Nucl.Acids. Res.，13：6361-6373(1985))；人粒细胞-巨噬细胞CSF(GM- CSF)基因(Miyatake等，EMBO J.，4：2561-2568(1985))；人穿 孔素基因(Lictenheld等，J.Immunol.，143：4267-4274(1989)；人 519基因(Manning等，J.Immunol.，148：4036-4042(1992))； 人粒酶B(CTLA-1)基因(Haddad等，Gene，87：265-271(1990)) ；人CTLA-4基因(Harper等，J.Immunol.，147：1397-1044 (1991))；人CGL-2基因(Heuesl等，J.Biol.Chem 266：6152- 6158(1991))；人粒酶H基因(Haddad等，Int.Immunol.，3：57- 66(1990))；人IL-2受体，a链基因(Cross等，Cell，49：47-56 (1987))；鼠T细胞活化3(TCA-3)基因(Wilson等，J.Im- munol.，141：1563-1570(1988))；和人CD69基因。
在本发明的一些实施例中，转录控制区是杂交的。例如，增强子 区(如得自HCMV IE转录控制区和/或得自SV40早期启动子区) 可插入转录控制区的上游区域。可选择地，或另外，多亚基转录因子 的结合位点可插入转录控制区内或转录控制区的上游，将一个控制 区上游区与其它控制区的邻近区域相结合。适合的情况下也包括分 泌信号，其或来自天然蛋白质或来自同种或相关物种的其它分泌性 多肽，该信号允许蛋白质穿过和/或停留于细胞膜，并由此形成蛋白 质的功能拓扑结构，或允许蛋白质从细胞中分泌出来。  
另外，在重组多核苷酸中含有一个正标记是很有用的，以便能 够选择带有重组多核苷酸的细胞。正选择标记可以是一段基因，当 被导入宿主细胞中其表达显性表型，以允许正选择携带该基因的细 胞。这类基因在本领域已公知，包括，特别是对潮霉素B产生抗性的 潮霉素-B磷酸转移酶基因(hph)，来自编码对抗菌素G418产生抗 性的Tn5的氨基糖苷磷酸转移酶基因(neo或apb)，二氢叶酸还原 酶(DHFR)基因，腺苷脱氨酶基因(ADA)和多药耐性(MDR)基因。
编码共同刺激因子和靶抗原多肽的序列可在分离的多核苷酸 上，但优选处于同一多核苷酸上。这些编码序列可受分离的转录控制 序列的控制，也可受同一转录控制序列的控制。
一些实施例中，除转录控制区之外，编码共同刺激因子或靶抗原 的多核苷酸呈现重组表达载体形式。
核酸操作技术概述于，例如，Sambrook等(1989)，Ausubel 等(1987)；和Annual Reviews of Biochemistry，61：131- 156(1992)。用于此项技术的试剂，如限制性内切酶等在本领域已众 所周知，并可从多处购买到。
用来产生本发明细胞的大量多核苷酸可通过在适宜的宿主细胞 中复制而得。编码所需片断的天然或合成的多核苷酸片断可被插入 能够导入并在原核或真核细胞中复制的重组核酸构建物，一般是多 核苷酸构建物中。通常，构建物适宜在单细胞宿主中复制，如酵母或 细菌，但也可和与不和基因组一起，以及整合入基因组的形式导入培 养的哺乳动物或植物或其它真核细胞系中。通过本发明方法生产的 核酸的纯化描述于如Sambrook等(1989)。
用于本发明的多核苷酸也可部分地或全部用化学合成的方法来 生产，如亚磷酰胺法，描述于Beaucage和Carruthers，Tetra.Letts， 22：1859-1862(1981)或由Matteucci等J.Am.Chem.Soc.，103： 3185(1981)描述的三酯化合物法，并可用商用自动寡核苷酸合成 仪合成。双链片断可由化学合成的单链产物来制备。通过合成互补 链并在适当的条件一起退火的方法或通过以DNA聚合酶用一适 当的引物序列增加互补链的方法制得。
用于导入原核或真核宿主细胞进行复制的多核苷酸构建物一般 包含一种可由宿主识别的复制系统，包括编码所需多肽的预想的重 组多核苷酸片断。这类载体可由本领域熟知的标准重组技术来制 备，并描述于如Sambrook等(1989)或Ausubel等(1987)。
在克隆阶段，优选多核苷酸构建物含有一选择性标记，编码由载 体转化的宿主细胞的存活或生长所必须的蛋白质的基因。这段基因 的存在仅确保表达插入片断的那些宿主细胞的生长。典型的选择性 基因编码的蛋白质：(a)对抗菌素或其它毒性物质如氨苄青霉素，新 霉素，氨甲蝶呤等产生抗性；(b)补充营养缺陷型的缺失，或(c)提供 不能从复合培养基中获得的关键的营养物，如编码用于芽胞杆菌 (Bacilli)的D-丙氨酸消旋酶的基因。适当的选择性标记的选择取 决于宿主细胞，不同宿主的适当的标记在本领域已熟知。
编码共同刺激因子和靶抗原多肽的重组多核苷酸可以以不同的 方式导入个体体内。例如，多核苷酸可被导入来自体内的宿主细胞， 如树状细胞或得自皮肤活组织检查的细胞。含有重组多核苷酸的细 胞可用来赋予个体免疫力。这些细胞通常以注入形式给药，每次注 入范围至少106至1010细胞/m2，优选范围至少107至109细胞/m2。 克隆细胞可以通过一次注入或一段时间范围内多次注入给药。然而 不同个体的反应性不同，所以注入的细胞的类型，数量以及注入的次 数、多次注入的时间范围均由参加治疗的内科医生或兽医决定，并可 根据日常检查的情况决定。
编码共同刺激因子和靶抗原多肽的多核苷酸可通过本领域已知 技术导入来自体内的所需细胞，这些已知技术包括如转化，电穿孔， 脂质转染法和转导，包括腺病毒相关病毒(AAV)载体的使用和尤其 是使用本领域已知的逆转录病毒基因转移法。
已开发研制使用重组传染病毒颗粒进行基因送递的各种感染技 术。本发明中这是一优选途径。已用于这种方法中的病毒载体包括 来自猴病毒40(SV40；Karlsson等，Proc Natl.Acad.Sci.USA， 82：158(1985))，腺病毒(Karlsson等，EMBO J.，5：2377 (1986))，AAV(Carter，Current Opinion in Biotechnology 1992，3：533-539)和逆转录病毒(Coffin，在Weiss等(编辑)， RNA Tumor Viruses，第2版，Vol.2，Cold  Spring Harbor Laboratory，New York，1985，PP.17-71)的病毒载体。因此，基 因转移和表达的方法多种多样，但对哺乳动物细胞中导入和表达遗 传物质起着必不可少的作用。上述几项技术已用于转导造血或淋巴 细胞，包括磷酸钙转染(Berman等(1984))，原生质体融合(Deans 等(1984))，电穿孔(Cann等，Oncogene，3：123(1988))，和用重组 腺病毒感染(Karlsson等，(1986))；Reuther等，Mol.Cell.Biol.， 6：123(1986))；AAV(Carter(1985))和逆转录病毒载体(Overell等， Oncogene，4：1425(1989))。
逆转录病毒载体为将基因转移入真核细胞提供了一种高效方 法，其是送递本发明多核苷酸的优选方法。进而，逆转录病毒的整合 以一可控制的方式发生，并可导致形成每个细胞中新遗传信息的一 个或几个拷贝的稳定的整合。
逆转录病毒是一类利用病毒编码的、指导RNA的DNA聚合 酶或逆转录酶进行复制的病毒，通过复制病毒RNA基因组提供一 种掺入鸟类和哺乳类宿主细胞染色体DNA的双链DNA中间体。 大多数逆转录载体来自于鼠逆转录病毒。然而，适和于本发明的逆 转录病毒可以从任何鸟或哺乳动物细胞来源中得到。优选这些逆转 录病毒具有兼嗜性，即其能感染包括人类在内的多种物种的广大宿 主范围内的宿主细胞。
逆转录病毒基因组(和这里讲述的逆转录病毒载体)的特点是逆 转录病毒的长末端重复序列，或LTR，其是一种发现于逆转录病毒 基因组5′和3′末端稍微有些变化形式的含大约600个碱基对的非 翻译区。当被掺入DNA作为原病毒时，逆转录病毒的LTR在每一 末端包括一短直重复序列，和通过RNA聚合酶II和3′的切割及 RNA转录物的聚腺苷酸化进行转录的起始信号。LTR包含病毒复 制必需的其它顺式作用序列。
“原病毒”是指逆转录病毒的DNA逆转录物，其中逆转录病毒 是稳定整合于适当的宿主细胞的染色体DNA中，或其克隆复制物 上，或逆转录病毒DNA的未整拿中间体形式的克隆拷贝上。原病 毒的正向转录和装配入感染病毒中发生于适当的辅助病毒存在条件 下或发生于细胞系中，该细胞系包含能衣壳化而不会偶然产生污染 性辅助病毒的适当序列。Mann等人描述了“包装”细胞系(如ψ2)的 发展，其能用于产生重组逆转录病毒的无辅助病毒贮存物(Stocks)。 Cell，33：153(1983)。
包装细胞系含有整合的逆转录基因组，其缺乏顺式衣壳化所需 的序列，但提供产生完整毒粒的所有必需的反式基因产品。从整合 的突变原病毒转录的RNA不能自我包装，但这些细胞能使从导入 同一细胞的重组逆转录病毒上转录的RNA衣壳化。产生的病毒颗 粒具感染性，但又是复制缺陷性，使其成为有用的载体，即导入缺乏 能衣壳化互补遗传信息的细胞后不能产生感染性病毒。
在含有编码亲嗜性病毒外壳(如ψ2)的反式作用单位的细胞系 的衣壳化，可以提供亲嗜性(限制的宿主范围)子代病毒。可选择地， 在含有亲嗜性包装基因(如PA317，ATCC CRL9078)的细胞系中 装配，可以提供亲嗜性子代病毒。Miller和Buttimore，Mol.Cell. Biol.6：2895(1986)。这种包装细胞系提供必需的逆转录病毒的反式 gag、pol和env蛋白质。这种方式导致逆转录病毒颗粒的产生，其对 哺乳动物细胞具有高度的感染性，而这些颗粒整合入靶细胞基因组 后就不能进一步复制。env基因的产物负责在靶细胞表面将逆转录 病毒与病毒受体结合并由此确定逆转录病毒的宿主范围。PA317细 胞产生具有兼嗜性包膜蛋白的逆转录病毒颗粒，其能够转导人的细 胞和其它物种源细胞。其它的包装细胞系产生具有亲嗜性包膜蛋白 的颗粒，其仅能转导小鼠细胞和大鼠细胞。
许多逆转录病毒载体构建物已成功地用于表达外源基因(见， 如，Coffin(1985))。具有插入序列的逆转录病毒载体一般具有功能 性，一贯抑制逆转录病毒感染的序列很少被鉴别出来。功能聚腺苷酸 化基元通过阻断逆转录病毒RNA合成来抑制逆转录病毒的复制， 有上限大小为约11kb的序列，其能被装入逆转录病毒颗粒；然而， 发现起初以为有问题的多重内部启动子的存在在一些逆转录病毒构 建物中被很好地接受。Coffin(1985)；和Overell等，Mol.Cell.Biol 8：1803(1983)。
许多基因产品已在逆转录病毒载体中表达。这既能通过将被表 达的序列置于掺入逆转录病毒LTR的启动子的转录控制下来实现， 也能通过将其置于插入LTRs间的异源启动子的控制之下来实现。 后一方式提供了一种在载体中共同表达显性选择性标记基因的方 法，因而能选择表达特定载体序列的细胞。
在本发明其它实施例中，编码共同刺激因子和靶抗原多肽的重 组多核苷酸被直接导入受治疗的和/或免疫化的个体。在一实例中 本发明的多核苷酸直接给药于受治疗的个体。此方法优选编码共同 刺激因子和靶抗原多肽的多核苷酸。另外，优选呈现表达载体形式 的多核苷酸。
多核苷酸与适合的赋形剂混合，并通过任一合适的本领域已知 方法给药于个体，包括如非肠道(包括如静脉内、腹膜内、肌内和皮 下)注射，脂质转染法和经表皮。合适的赋形剂为本领域已知，可取 决于用多核苷酸给药的个体的种类以及给药方式。给予个体使用的 多核苷酸的量是足以使免疫化个体获得免疫力的量。此量根据受治 疗个体而各不相同，将由实施治疗的内科医生或兽医决定。给药量 以及给药时间(感染前或感染后)和一次或多次剂量数均由本领域技 术人员所知的常规方法决定。
本发明另一实施例中，本发明的多核苷酸在病毒颗粒中衣壳化， 并以该衣壳化的多核苷酸治疗个体。所用病毒颗粒可以是任一本领 域已知的适于基因疗法步骤的毒粒，其中有些在有关将多核苷酸导 入来自体内的细胞的内容中已有描述。给药方式取决于所用的病毒 颗粒，可包括如上面所列的未衣壳化的多核苷酸的给药。病毒颗粒 在适合的赋形剂中制备，并给药于个体。给药量以及给药时间(感染 前或感染后)和一次或多次剂量数均由实施治疗的内科医生或兽医 决定，并由本领域技术人员所知的常规方法获得。
下述实施例是为本领域技术人员提供进一步指导，并不在任何 意义上限定本发明的范围。
                    实施例1
一种表达载体的设计，它编码作为病毒靶抗原多肽的B7多肽 和GSVH c-多肽
Beechey地松鼠的慢性地松鼠肝炎病毒(GSVH)感染，可作为 人类HBV感染的模型系统(参见Seeger等，I.Virol，51：367-375， (1984))。本实施例描述一种用于表达和一种编码GSVH的 基因的逆转录病毒载体构建物。
载体构建物利用基于无复制活性的载体pMV-7的Moloney 鼠白血病病毒(MMLV)。(Ausubel等，(1989)；和Kirschmeier 等，DNA，7：219-225(1988))。PMV-7含有一种HSV胸苷激酶 (TK)启动子控制下的新霉素抗生基因，由此可以在含有该载体的细 胞组织培养物中加以选择。
包含前核心序列的GSHV c-基因，被用作编码靶抗原的多 核苷酸序列。GSVH c-基因是通过聚合酶链反应(PCR)，从病 毒基因组(EMBC/Genbank Accession Number K02715)中分 离出来的。Marion等，Proc.Natl.Acad Sci USA，77：2941- 2945(1980)和Seeger(1984)。分离出来的GSHV c-基因随后在 MMLV LTR的控制下导入pMV-7载体。
人类B7 cDNA(EMBL/Genbank Accession Number M27533)是通过PCR利用引物，从Raji人类B细胞系的B7 mR- NA，克隆成扩增的cDNA，其中引物是根据公开的DNA序列设计 出来的。Freeman(1989)。编码B7-1基因的cDNA，在CMV中间 物早期启动子的控制下，被导入与GSVH c-基因相同的载体。 Gaballe等J.Virol.，62：3334-3340(1988)。
编码B7多肽和cAg多肽的基于pMV-7的载体构建物，被转 染入逆转录病毒包装细胞系，psi-2。Miller等，Mol，Cell，Biol.，6： 2895-2902(1986)。随后通过在含有新霉素的培养基中的生长选择 出转染细胞。由生长于新霉素培养基中的细胞产生的带有兼嗜性包 膜的无复制活性的逆转录病毒，可在培养基中发现。
                    实施例2
一种表达载体的设计，它编码作为病毒靶抗原多肽的B7多肽 和GSVH GSHsAg-多肽
该构建物按实施例1的方法制备，不同的是，编码地松鼠肝炎 表面抗原(GSHsAg)，包括pre-S1，pre-S2和S区域的GSVH多 核苷酸代替了编码GSVH cAg的多核苷酸。编码前述的S区域的 多核苷酸序列已被Seeger等(1984)描述。
                    实施例3
利用编码B7多肽和GSHsAg的载体给未受感染的个体赋予对 GSHV的免疫力
治疗有效量的组合物用非肠道方式给药于一未感染且对GSHV 敏感的Beechey地松鼠，该组合物由包装于兼嗜性包膜(107个组织 培养物感染性单位)中的感染性逆转录病毒载体组成，这个载体含有 编码B7多肽和GSHsAg多肽的多聚核苷酸序列。Seeger等(1984)。 载体按实施例2所述的方法构建。一个“未感染”的GSHV易感地松 鼠，没有可测出的抗地松鼠肝炎病毒核心抗原(anti-GSHcAg)的 血清抗体或地松鼠肝炎病毒表面抗原(anti-GSHsAg)的抗体。含 有B7基因和GSHV的逆转录病毒载体的非肠道给药，可导致直接 针对于表达GSHsAg的细胞的血清应答(anti-GSHsAg)和CTL 应答。
两种应答，即血清和CTL，至少使未感染地松鼠对将来的 GSHV感染具有部分免疫力。
                实施例4
利用编码B7多肽和GSHsAg多肽的载体治疗慢性病毒感染
两种不同的方法可被用来将编码B7多肽和病毒靶抗原的多核 苷酸给药于GSHV慢性感染的动物，以治疗感染。
将编码B7多肽和GSHsAg多肽的载体直接送递到感染的哺乳 动物
按实施例1的方法构建一种包装于兼嗜性包膜、编码B7多肽 和GSHcAg多肽的感染性逆转录病毒载体。该载体采用非肠道方 式，以治疗有效量给药于GSHV慢性感染的地松鼠。
监测多肽从逆转录病毒载体的表达对地松鼠免疫应答的效果， 包括直接针对于表达GSHcAg的细胞的CTL应答。另外，监测对疾 病慢性作用的效果，包括病毒DNA的存在，GSHsAg的存在和与 疾病相关的致病作用。在治疗个体中，身体症状和/或GSHsAg和/ 或GVSH DNA的减少，表明GSHV引起的慢性疾病的减轻和/或 终止。
用被编码B7多肽和GSHcAg的载体在体外转染的细胞治疗被 感染哺乳动物
从被感染个体的皮肤活检分离出来的成纤维细胞生长于培养 基中，并被编码B7多肽和GSHcAg多肽的逆转录病毒载体转染。 载体构建如实施例1所述。随后，感染(转染)细胞从含有新霉素的培 养基中的生长细胞中选择。表达GSHcAg的细胞可通过用使用抗- HBc的荧光染色法(IFA)来鉴定，B7蛋白的表达用使用抗-B7单 克隆抗体(mAb)的ELISA法来鉴定。治疗有效量的表达GSHcAg 和B7的自身细胞，通过静脉注入GSHV感染的地松鼠。
在监测多肽从得自植入细胞中的逆转录病毒载体的表达对地松 鼠免疫应答的效果，包括直接针对于表达GSHcAg的细胞的CTL 应答。另外，监测对疾病慢性作用的效果，包括病毒DNA的存在， GSHsAg的存在和与疾病有关的致病作用。被治疗个体身体症状和/ 或GSHsAg和/或GVSH DNA的减少，表明由GSHV导致的慢性 疾病得到减轻和/或终止。
                实施例5
表达B7和HBS的逆转录病毒载体的构建
图1描述重组逆转录病毒载体，以证明通过与体内细胞中的B7 -1共表达，增强了对乙肝病毒表面抗原(HBS)的免疫应答。逆转录 病毒载体pMV-7 DNA用来和插入在pMV-7多接头的HBS 编码序列构建重组载体907；与HBS编码序列，一种脑心肌炎病毒 (EMC)帽独立翻译单位和鼠B7-1编码序列构建重组载体1016， 这些序列均处于插在PWV-7多接头处的同一阅读框架中。每个 重组载体通过磷酸钙DNA法转染一个鼠Balbc包装的细胞系，并且 由含有各种载体的细胞通过在含有新霉素的细胞培养基中生长而选 择出来。由新霉素选择出的含有重组载体907和那些含有重组载体 1016的包装细胞群落释放出病毒，通过赋予Balbc 3T3细胞的抗 新霉素能力对病毒进行分析。通过ELISA表明，由重组病毒907 感染的抗新霉素Balbc 3T3细胞释放HBS。由重组病毒1016感染 的抗新霉素Balbc 3T3细胞，通过上述相同的实验表明其表达 HBS，通过使用针对B7-1蛋白的单克隆抗体进行的FACS分析表 明能够表达B7-1蛋白质。每种类型和未转染Balbc 3T3的细胞( 2×107)，通过腹膜内途径，分别接种于10只Balbc鼠的各个组中， 以研究其对HBS的免疫应答。通过ELISA测定的抗-HBS，和通 过表达HBS的Balbc 3T3细胞释放的铬51测定的体外暴露于 HBS的脾细胞的增殖和脾细胞细胞毒性，可在接种后两周时每组5 只鼠中和接种后四周时每组5只鼠中进行分析。图1中，LTR代表 逆转录病毒载体的长末端重复序列，TK代表单纯性疱疹病毒的胸 苷激酶启动子，Neo代表赋予新霉素抗性的基因。
尽管已经通过说明和实施例在一些细节上描述了前述发明，以 达到清楚明了的目的。但是很明显，对本领域技术人员而言，某些变 动和修改是可以实施的。因此，说明书和实施例不应构成对权利要 求所述的本发明范围的限制。