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用于改进重组蛋白表达的方法

阅读：992发布：2021-09-18

专利汇可以提供用于改进重组蛋白表达的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明提供允许增加重组宿主细胞中目标转染基因的表达的材料和方法。，下面是用于改进重组蛋白表达的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于增加宿主细胞中异源蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：在允许蛋
白表达的条件下培养包含编码所述异源蛋白的第一异源多核苷酸序列的所述宿主细胞，所
述第一多核苷酸在载体上编码，所述宿主细胞进一步包含具有针对选择标记蛋白的蛋白编
码序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸与编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷
酸相比具有序列修饰，所述序列修饰降低由所述第二多核苷酸编码的mRNA的翻译效率，所
述序列修饰、具有所述序列修饰的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸编码针对所述
选择标记蛋白的相同氨基酸序列。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在单个载
体中。
3.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不同启
动子的转录控制。
4.根据权利要求2所述的方法，其中所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受单个启
动子的转录控制。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在独立载
体中。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰在编码所述选择标记蛋白的所述第二多
核苷酸的非翻译区中。
7.根据权利要求6所述的方法，其中所述修饰在5′非翻译区中。
8.根据权利要求6所述的方法，其中所述修饰在3′非翻译区中。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述修饰在编码所述选择标记蛋白的所述基因的
蛋白编码区中。
10.根据权利要求9所述的方法，其中所述修饰具有针对所述选择标记基因的所述蛋
白编码区的起始密码子的25、20、15、10或5个密码子。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列
包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸
中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，并非是针对所述宿主细胞编码的所
述氨基酸的偏好密码子。
12.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列
包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸
中的野生型密码子，所述被修饰的密码子作为密码子，是针对所述宿主细胞编码的所述氨
基酸的最不偏好密码子。
13.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列
包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸
中的野生型密码子，且所述修饰在所述mRNA的二级结构中引入了降低所述mRNA的翻译效
率的变化。
14.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列
包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸
中的野生型密码子，且所述修饰增加所述mRNA中的密码子配对。
15.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列
包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸
中的野生型密码子，且所述修饰改变所述mRNA的G+C含量。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述修饰增加所述mRNA的G+C含量。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述G+C含量被改变1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
18.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸序列中的所述蛋白编码序列
包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸
中的野生型密码子，且所述修饰改变所述mRNA的A+T含量。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述修饰降低所述mRNA的A+T含量。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述A+T含量被改变1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、
11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、
36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、
61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、
86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100％。
21.根据权利要求11所述的方法，其中所述第二多核苷酸蛋白编码序列中的至少1％、
至少2％、至少3％、至少4％、至少5％、至少6％、至少7％、至少8％、至少9％、至少10％、至少11％、至少12％、至少13％、至少14％、至少15％、至少16％、至少17％、至少18％、至少19％、至少20％、至少21％、至少22％、至少23％、至少24％、至少25％、至少26％、至少27％、至少28％、至少29％、至少30％、至少31％、至少32％、至少33％、至少34％、至少35％、至少36％、至少37％、至少38％、至少39％、至少40％、至少41％、至少42％、至少43％、至少44％、至少45％、至少46％、至少47％、至少48％、至少49％、至少50％、至少51％、至少52％、至少53％、至少54％、至少55％、至少56％、至少57％、至少58％、至少59％、至少60％、至少61％、至少62％、至少63％、至少64％、至少65％、至少66％、至少67％、至少68％、至少69％、至少70％、至少71％、至少72％、至少73％、至少74％、至少75％、至少76％、至少77％、至少78％、至少79％、至少80％、至少81％、至少82％、至少83％、至少84％、至少85％、至少86％、至少87％、至少88％、至少89％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少
99％或100％的密码子是被修饰的密码子。
22.根据权利要求1所述的方法，其中所述选择标记蛋白是选自由以下组成的组：新
霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、硫酸博来霉素、腐草霉素、博来霉素抗性基因ble(未知酶)、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化
物岐化酶(sod1)、金属硫蛋白(cup1，MT1)、β-内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移
酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰基转移酶(bls)、杀稻瘟菌素脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(ade1)、精氨基琥珀酸裂解酶
(arg4)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、转化酶(suc2)和乳清酸核苷-5’-磷酸(OMP)脱
羧酶(ura3)。
23.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是真核细胞。
24.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是原核细胞。
25.根据权利要求25所述的方法，其中所述宿主细胞是大肠杆菌。
26.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是酵母细胞。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞是酿酒酵母。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述宿主细胞是毕赤酵母。
29.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是昆虫细胞。
30.根据权利要求29所述的方法，其中所述宿主细胞是草地贪夜蛾。
31.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是植物细胞。
32.根据权利要求1所述的方法，其中所述宿主细胞是原生动物细胞。
33.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是哺乳动物细胞。
34.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是人细胞。
35.根据权利要求23所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠细胞。
36.根据权利要求35所述的方法，其中所述宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞。
37.根据权利要求1所述的方法，其中所述表达载体是中国仓鼠延伸因子1(CHEF1)表
达载体。
38.根据权利要求1所述的方法，其中所述第二多核苷酸包含图2中展示的多核苷酸。
39.根据权利要求38所述的方法，其中所述表达载体是中国仓鼠延伸因子1(CHEF1)表
达载体。

说明书全文

用于改进重组蛋白表达的方法

[0001] 相关申请的交叉引用

[0002] 本申请案要求2009年8月6日提交的题为“Methods for Improving RecombinantProtein Expression”的美国临时申请案第61/231,906号的优先权利益，此申请案的代理
人案号为31351/44743，其全文以引用的方式并入本文。

技术领域

[0003] 本发明借助于增加载体上的选择压力，从而增加载体相关的异源蛋白表达，在真核细胞中的重组蛋白表达领域中具有实际应用。

背景技术

[0004] 在重组蛋白产生领域中，增加转染基因的表达是细胞系发育期间的基本首要工作。改进转录、翻译、蛋白质折叠和分泌是增加异源蛋白效价的密集研究的所有目标。

[0005] 无论过去所用方法如何，本领域中需要提供增加所需蛋白的产率的较好的用于重组蛋白产生的方法。

发明内容

[0006] 一方面，本发明提供一种用于增加宿主细胞中的异源蛋白表达的方法，所述方法包括以下步骤：在允许蛋白表达的条件下培养包含编码所述异源蛋白的第一异源多核苷酸
序列的宿主细胞，所述第一多核苷酸在载体上编码，所述宿主细胞进一步包含具有针对选
择标记蛋白的蛋白编码序列的第二多核苷酸序列，所述第二多核苷酸与编码所述选择标记
蛋白的野生型多核苷酸相比具有序列修饰，所述序列修饰降低由所述第二多核苷酸编码的
mRNA的翻译效率，具有所述序列修饰的所述第二多核苷酸和所述野生型多核苷酸编码针对
所述选择标记蛋白的相同氨基酸序列。一方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在
单个载体中，且在这方面的一个实施方案中，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸各自受不
同启动子的转录控制。在其它方面，所述第一多核苷酸和所述第二多核苷酸在独立载体
中。另一方面，所述第一多核苷酸和第二多核苷酸受相同启动子的转录控制。

[0007] 在所述方法的一个实施方案中，所述修饰在编码所述选择标记蛋白的第二多核苷酸的非翻译区中，且在某些方面，所述修饰在5′非翻译区中和/或所述修饰在3′非翻译
区中。

[0008] 在所述方法的另一实施方案中，所述修饰在编码所述选择标记蛋白的基因的蛋白编码区中。一方面，所述修饰在针对选择标记基因编码序列的蛋白编码区的起始密码子的
25、20、15、10或5个密码子中。

[0009] 在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码
子，所述被修饰的密码子作为密码子，并非是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的偏好
密码子。一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，所述被修饰的密
码子作为密码子，是针对所述宿主细胞编码的所述氨基酸的最不偏好密码子。

[0010] 在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码
子，且所述修饰在所述mRNA的二级结构中引入了降低所述mRNA的翻译效率的变化。在所
述方法的一个实施方案中，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密
码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码子，且所
述修饰增加mRNA中的密码子配对。在所述方法的另一实施方案中，第二多核苷酸序列中的
蛋白编码序列包含至少一个被修饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野
生型多核苷酸中的野生型密码子，且所述修饰改变mRNA的G+C含量。在多个方面，所述修
饰增加mRNA的G+C含量，且在多个方面，G+C含量增加1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、
14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、
39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、
64、65、66、67、68、69、70、 71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、
89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99或100%。在其它方面，G+C含量增加超过100%。 [0011] 在所述方法的另一方面，第二多核苷酸序列中的蛋白编码序列包含至少一个被修
饰的密码子，所述密码子并非编码所述选择标记蛋白的野生型多核苷酸中的野生型密码
子，且所述修饰可改变mRNA的A+T含量。在一个实施方案中，所述修饰降低mRNA的A+T含
量，且在某些方面，A+T含量降低1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、
45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、
70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、
95、96、97、98、99或100%。

[0012] 在所述方法的其它方面，在编码所述选择标记蛋白的第二多核苷酸蛋白编码序列中至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少
92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的密码子为被修饰的密码子。

[0013] 在所述方法的其它方面，选择标记蛋白是选自由以下组成的组：新霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、硫酸博来霉素(zeocin)、腐草霉素(phleomycin)、博来霉素抗性基因ble、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)合酶(aro A)、肌肉特异性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化
物岐化酶(sod1)、金属硫蛋白(cup1,MT1)、β-内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移
酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰基转移酶(bls)、杀稻瘟菌素脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸(SAICAR)合成酶(ade1)、精氨基琥珀酸裂解酶
(arg4)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、转化酶(suc2)、乳清酸核苷-5’-磷酸(OMP)脱
羧酶(ura3)和这些标记蛋白中任一者的直系同源物。

[0014] 在所述方法的多个实施方案中，宿主细胞是真核细胞，宿主细胞是哺乳动物细胞，宿主细胞是人细胞，宿主细胞是中国仓鼠细胞，宿主细胞是中国仓鼠卵巢细胞，宿主细胞是酵母细胞，宿主细胞是酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)细胞，宿主细胞是毕赤酵母(Pichia pastoris)细胞，宿主细胞是原核细胞，宿主细胞是大肠杆菌(Escherichia coli)细胞，宿主细胞是昆虫细胞，宿主细胞是草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)细胞，宿主细胞是植物细胞，或宿主细胞是真菌细胞。

[0015] 在所述方法的一方面，表达载体是(中国仓鼠延伸因子1(CHEF1)表达载体。另一方面，所述方法利用包含图2中展示的多核苷酸的第二多核苷酸，且在一个实施方案中，所述第二多核苷酸在(中国仓鼠延伸因子1(CHEF1)表达载体中包含图2中展示的多核苷酸。
附图说明

[0016] 图1A为编码DHFR的多核苷酸且图1B为与小家鼠(Mus musculus)cDNABC005796相同的用于密码子去优化的DHFR多肽序列。

[0017] 图2显示密码子去优化的DHFR序列(称为弱化(cr)和最差(wst))的DNA序列。

[0018] 图3显示与野生型(wt)序列对准的去优化的DHFR(最差的,wst和弱化的,cr)。指示了核苷酸变化(*)，包括仓鼠最不偏好密码子(参见表4)和新的串联密码子对(以
粗体表示；参见表5)。简并符号为：B(C或G或T)、D(A或G或T)、H(A或C或T)、V(A或C
或G)。

[0019] 图4显示具有野生型(WT)DHFR的CHEF1表达载体pDEF38。密码子去优化的DHFR置换WT DHFR来制备pDEF81(弱化DHFR)和pDEF82(最差DHFR)。报告基因FIGI克隆到
XhoI-XbaI克隆位点中以制备pDEF38:FIGI、pDEF81:FIGI和pDEF82:FIGI。

[0020] 图5显示使用密码子去优化的DHFR使得蛋白表达增加。CHO细胞用共表达目标蛋白(FIGI)的野生型(wt)和密码子去优化的(弱化,pDEF81:FIGI和最差,pDEF82:FIGI)
DHFR来转染。由蛋白A HPLC测定并以μg/ml报告的效价值是两次独立转染的平均值，每
次转染重复测量三次(总共6次产生测定)。结果指示密码子去优化的DHFR的所选转染池
的表达效价相对于野生型DHFR池具有明显改进。

[0021] 图6展示转染池分批补料产生模型在密码子去优化的细胞系中提供改进的产生率。这一实验是在50ml离心管中用汇集的转染子进行12天；野生型(pDEF38:FIGI,蓝
色)和密码子去优化的(pDEF81:FIGI,紫色和pDEF82:FIGI,粉红色)DHFR共表达目标蛋
白FIGI。两个转染池(A和B)重复进行两次。密码子去优化的池显示比野生型样品大的产
生率。

[0022] 图7显示密码子去优化的DHFR的所选细胞的DHFR降低和目标蛋白表达增加。CHO细胞用共表达目标蛋白FIGI的野生型(T462)和密码子去优化的(pDEF81:FIGI,T463和
pDEF82:FIGI,T464)DHFR来转染。转染池用荧光甲氨蝶呤(F-MTX)染色以检测DHFR，并用
荧光标记的抗体染色以识别FIGI(RPE)。染色的细胞通过在FACSCalibur上进行的流式细
胞术来分析。图7A显示来自每次转染的10,000个个别细胞的双重染色FACS概况，对合并
的DHFR(F-MTX)和FIGI(RPE:FIGI)表达绘图。图7B显示来自两个10,000个细胞的群体
的对每次转染取平均值所得到的平均F-MTX(DHFR)和RPE荧光强度。这些结果指示，与野
生型细胞相比时，两个密码子去优化的DHFR池的DHFR都降低并且FIGI产生都增加。

[0023] 图8展示密码子去优化的DHFR克隆的DHFR降低并且目标蛋白表达增加。CHO细胞转染池(野生型T462、弱化T463和最差T464)通过限制性稀释来克隆，并且每次转染扩
增23个确认的单克隆细胞系。克隆细胞用荧光甲氨蝶呤(DHFR RFU)染色以检测DHFR，并
用RPE标记的抗FIGI荧光抗体(FIGI RFU)染色。来自每个克隆群体的总共10,000个染
色的细胞通过在FACSCalibur上进行的流式细胞术来分析。图8A显示F-MTX染色的细胞
的平均荧光。每个数据点是个别克隆。克隆按从低到高的平均荧光排序。图8B显示RPE
染色的细胞的平均荧光。每个数据点是个别克隆。克隆按从低到高的平均荧光排序。

[0024] 图9显示与野生型克隆相比，密码子去优化的克隆具有改进的产生率。克隆效价通过对在第8天从6孔产生模型采集的上清液进行蛋白A HPLC来测定。克隆按从高到低
的效价排序。与野生型DHFR克隆(pDEF38:FIGI)相比，密码子去优化的克隆pDEF81:FIGI
和pDEF82:FIGI显示较大的FIGI产生率。

具体实施方式

[0025] 本发明提供一种新的产生表达载体的方法和其用途，它们改进重组蛋白产率。本发明的载体允许增加宿主细胞中目标基因(GOI)的表达和降低共转化的选择标记的翻译
效率，从而增加选择严格度。选择标记用于转染实验中以补足宿主细胞蛋白缺陷或对另外
的毒性剂赋予抗性，从而选择目标共转化基因的存在(表达)。设计提供选择标记蛋白的降
低的翻译效率的载体，使得编码所述选择标记蛋白的多核苷酸关于一个或多个参数“去优
化”。所提供载体在实践用于增强重组蛋白表达的材料和方法中的使用是违反直觉的。实
际上，改进的蛋白表达通常受“优化”编码目标蛋白的多核苷酸的作用，从而增加翻译效率和蛋白表达。通过延伸，将以相同方式优化针对选择标记基因的蛋白编码区。然而，本文中意外地显示修饰编码选择标记基因序列的多核苷酸使其不优选用于翻译(与在目标基因
中进行类似变化无关)，允许分离用编码GOI的多核苷酸和编码选择标记的多核苷酸转化
或转染的宿主细胞，其中由GOI编码的蛋白以意外的较高水平表达。

[0026] 因此，本文关于多核苷酸所用的术语“去优化”意指多核苷酸已以某一方式被修饰，使得由所述多核苷酸编码的蛋白的翻译不优选用于已经引入所述多核苷酸的宿主细
胞。多核苷酸以多种方式去优化，且本发明不受本文所示例的方法限制。

[0027] 用于密码子优化的方法已经由他人描述(Itakura 1987,Kotula 1991,Holler1993,Seed 1998)。然而，关于密码子去优化效用的实例很有限。一个这种实例是将
病毒基因去优化以通过并入最不偏好密码子或非随机化密码子对来降低复制适应性
(Burns2006,Mueller 2006,Coleman2008,Kew 2008)。本文描述了通过并入物种特异性最
不偏好密码子和串联密码子对来降低用于宿主细胞的dhfr基因的翻译效率的方法考虑。
所提供的方法通常可适用于针对物种特异性宿主来去优化编码任何选择标记的多核苷酸
中的密码子。

[0028] 不受任何特定作用机制的限制，减少选择标记的翻译可导致经由除翻译外的替代路径的同种蛋白质产生的补偿性增加，例如但不限于增加的转录或分泌，以使得具有无效
基因的细胞能够存活。因此，能够克服标记基因的无活力并因此存活的宿主细胞也可以增
加的速率表达GOI。不考虑精确的机制，本文意外地显示与传统认知相反，以降低翻译效率的方式修饰选择标记基因的多核苷酸序列由于某种原因增加共转化的编码GOI的基因的
表达。

[0029] 本发明的载体和方法可与提供阳性选择的任何选择标记基因一起使用。示例性选择标记包括但不限于抗生素抗性基因编码的新霉素磷酸转移酶(npt II)、潮霉素磷酸转移
酶(hpt)、二氢叶酸还原酶(dhfr)、硫酸博来霉素、腐草霉素、博来霉素抗性基因ble(未知酶)、庆大霉素乙酰基转移酶、链霉素磷酸转移酶、乙酰乳酸合酶突变形式(als)、溴苯腈水解酶、草胺膦乙酰基转移酶(bar)、烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸(EPSP)酶(aro A)、肌肉特异
性酪氨酸激酶受体分子(MuSK-R)、铜锌超氧化物岐化酶(sod1)、金属硫蛋白(cup1,MT1)、
β-内酰胺酶(BLA)、嘌呤霉素N-乙酰基-转移酶(pac)、杀稻瘟菌素乙酰基转移酶(bls)、
杀稻瘟菌素脱氨酶(bsr)、组氨醇脱氢酶(HDH)、N-琥珀酰-5-氨基咪唑-4-甲酰胺核苷酸
(SAICAR)合成酶(ade1)、精氨基琥珀酸裂解酶(arg4)、β-异丙基苹果酸脱氢酶(leu2)、
转化酶(suc2)和乳清酸核苷-5’-磷酸(OMP)脱羧酶(ura3)。

[0030] 本领域中众所周知的是，遗传密码陈述的密码子指导在所翻译的多肽中添加特定氨基酸。本领域中也众所周知的是，20种天然存在的氨基酸是由不同数目的密码子编码，这些数目对于每种氨基酸来说在1到6个不同密码子的范围变动。如本文所用，编码相同氨
基酸的不同密码子被称为“同义密码子”。这些同义密码子陈述于下表1中。

[0031] 表1-遗传密码

[0032]

[0033] 因为同义密码子编码相同氨基酸，所以通过用同义密码子置换野生型密码子来改变蛋白质的编码序列不会使所编码的多肽序列的氨基酸序列变化。然而，编码蛋白质的基
础mRNA的序列发生改变并且mRNA核苷酸序列的变化可通过影响翻译效率来改变基因表达
(Ikemura 1981a,Ikemura 1981b,Ikemura1985)。

[0034] 控制翻译效率的特定因素包括“偏好”密码子、串联或连续密码子的并入(Rosenberg 1993)、密码子对偏向性(Gutman1989,Boycheva 2003)、RNA二级结构
(Kozak 2005,Kudla 2009)、GC含量和核苷酸重复结构(Hall 1982,Zhang1991,Carlini
2003,Griswold 2003,Gustafsson 2004)。这些因素中的一些导致(例如，但不受特定机制
的限制)翻译暂停位点，这些位点不仅停止翻译，而且可影响蛋白质折叠动力学，最终都改变蛋白表达。翻译暂停的经过充分表征的实例发生在细菌中的氨基酸生物合成基因合成期
间，并被广泛称作衰减(Watson 1988)。

[0035] 密码子偏好

[0036] 一方面，本发明提供增加由GOI编码的重组蛋白的表达的载体和方法，所述方法利用包含GOI的表达载体且也编码在设计具有并非宿主细胞中偏好的密码子的合成多核
苷酸中的选择标记蛋白。本领域中众所周知在不同物种中，某些同义密码子比其它密码子
的使用更频繁。那些最频繁使用的密码子被称为所述物种的“偏好密码子”。有人已经
提议，某些密码子的偏好是随物种基因组中编码的特定转移RNA(tRNA)的相对数目而变，
且已经开发了特定程序来测定特定基因组中编码的每种tRNA的精确数目(Lowe和Eddy，
1997)。因此，一方面，对较不偏好的密码子的选择是基于先前测定的同义密码子在特定宿主细胞起源物种中的使用频率。

[0037] 一方面，本发明提供编码选择标记的多核苷酸，其中所述多核苷酸的蛋白编码区包括至少一种密码子修饰，所述修饰是以并非宿主细胞的偏好密码子的密码子置换野生型
密码子。另一方面，所述修饰是以作为宿主细胞的最不偏好密码子的密码子置换野生型密
码子。涵盖多种所述密码子置换，只要至少一种所述修饰并入蛋白编码区中即可。因此，本发明涵盖在选择标记基因的蛋白编码区中某处存在一个所述被修饰的密码子到所有密码
子都被修饰。

[0038] 更具体说来，在多个方面，在编码选择标记基因的多核苷酸的蛋白编码序列中至少1%、至少2%、至少3%、至少4%、至少5%、至少6%、至少7%、至少8%、至少9%、至少10%、至少11%、至少12%、至少13%、至少14%、至少15%、至少16%、至少17%、至少18%、至少19%、至少20%、至少21%、至少22%、至少23%、至少24%、至少25%、至少26%、至少27%、至少28%、至少29%、至少30%、至少31%、至少32%、至少33%、至少34%、至少35%、至少36%、至少37%、至少38%、至少39%、至少40%、至少41%、至少42%、至少43%、至少44%、至少45%、至少46%、至少47%、至少48%、至少49%、至少50%、至少51%、至少52%、至少53%、至少54%、至少55%、至少56%、至少57%、至少58%、至少59%、至少60%、至少61%、至少62%、至少63%、至少64%、至少65%、至少66%、至少67%、至少68%、至少69%、至少70%、至少71%、至少72%、至少73%、至少74%、至少75%、至少76%、至少77%、至少78%、至少79%、至少80%、至少81%、至少82%、至少83%、至少84%、至少85%、至少86%、至少87%、至少88%、至少89%、至少90%、至少91%、至少
92%、至少93%、至少94%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%或100%的密码子为被修饰的密码子。

[0039] 使用可公开获得的核苷酸序列和本领域中已知并在表2和3中示例的密码子使用频率表(Nakamura等,2000)，可通过并入选择用于由GOI编码的重组蛋白的表达的宿主细
胞的起源物种的最不偏好密码子的随机选择来产生任何选择标记的密码子去优化型式。来
自仓鼠(中国地鼠(Cricetulus griseus))的最不偏好密码子的实例显示于表4中。这些
密码子用于优先置换编码标记基因的天然基因序列中的同义密码子，使得至少一个到所有
同义密码子由并非特定氨基酸残基的偏好密码子的任何密码子置换。

[0040] 表2.仓鼠密码子使用频率表

[0041] 来自仓鼠(中国地鼠)的密码子使用频率表的实例来自331个蛋白编码区和153527个密码子。对于每个密码子，第一个数字是每一千个碱基中的使用频率且第二个数
字是观察到密码子的实际次数。

[0042]

[0043]

[0044] 表3.人密码子使用频率表

[0045] 提供来自人(智人)的密码子使用频率表的实例，由93487个蛋白编码区和对40662582个密码子的分析所测定。对于每个密码子，第一个数字是每一千个碱基中的使用
频率且第二个数字是观察到密码子的实际次数。

[0046]

[0047] 表4.仓鼠最不偏好密码子

[0048] 来自仓鼠(中国地鼠)的最不偏好密码子的实例。

[0049]氨基酸最不偏好密码子
丙氨酸 GCG，GCA
精氨酸 CGT,CGA,CGC
天冬氨酸 GAT
天冬酰胺 AAT
半胱氨酸 TGT
谷氨酸 GAA
谷氨酰胺 CAA
甘氨酸 GGT,GGG
异亮氨酸 ATA,ATT
组氨酸 CAT
亮氨酸 TTA,CTA,CTT
赖氨酸 AAA
苯丙氨酸 TTT
脯氨酸 CCG，CCA
丝氨酸 AGT,TCG，TCA
苏氨酸 ACG，ACT
酪氨酸 TAT
缬氨酸 GTA,GTT

[0050] 密码子去优化可通过多种方法，例如通过选择较不偏好用于给定宿主细胞中的高度表达基因的密码子来进行。可使用并入密码子使用频率表(例如针对高度表达的细
菌基因的密码子偏好的“Ecohigh.cod”)的计算机算法，并且这些算法由University of
Wisconsin Package Version 9.0,Genetics Computer Group,Madison,WI提供。其它适
用的密码子使用频率表包括“Celegans_high.cod”、“Celegans_low.cod”、“Drosophila_high.cod”、“Human_high.cod”、“Maize_high.cod”和“Yeast_high.cod”。

[0051] 密码子对偏向性

[0052] 另一方面，本发明提供增加由转染的GOI编码的重组蛋白的表达的载体和方法，所述方法利用编码在设计具有宿主细胞起源物种中最不偏好的密码子对的合成多核苷酸
中的选择标记蛋白的表达载体。近期实验结果支持以下观点：翻译速率受翻译核糖体表面
上的A和P位点中相邻tRNA的相容性影响(Smith和Yarus,1989；Yarus和Curran,1992)。
现应了解，一些密码子在蛋白编码序列中的使用比根据这些密码子对的个别密码子的用法
所预期的更加频繁(出现频率过高的密码子对)，且观察到一些密码子对的使用频率比预
期少得多(出现频率过低的密码子对)。Coleman和他人(2008)已证实，出现频率过低的
密码子对的翻译比出现频率过高的密码子对慢，且密码子对出现频率越低，其翻译越慢。 [0053] 举例说明，对人的研究显示Ala密码子GCC使用4次，与同义密码子GCG的使用
频率相同且其它同义密码子对的使用或多或少比预期频繁(Coleman等,2008)。特定密码
子对的这种使用频率被称作“密码子对偏向性”。例如且也是在人类中，基于偏好密码子使用，预期氨基酸对Ala-Glu由GCCGAA和GCAGAG以通常大致相同的频率编码。实际上，密码
子对GCCGAA出现频率非常低，即使其含有最常见的Ala密码子，因而使得其使用频率仅为
GCAGAG的七分之一。

[0054] 串联密码子配对

[0055] 另一方面，本发明提供增加由GOI编码的重组蛋白的表达的载体和方法，所述方法利用包含GOI的表达载体且也编码在设计具有串联密码子配对的合成多核苷酸中的选
择标记蛋白。如由衰减(Watson 1988)和翻译框移码(Gurvich等,2005)所证明，基因序
列中密码子对的使用频率和组成可影响翻译速率。衰减机制涉及在相同密码子的串联对或
多聚重复序列处核糖体的暂停且受指定密码子激活的tRNA浓度影响。当稀有密码子配对
时，同源tRNA分子的稀少不仅可导致暂停，而且可导致框移，使得正确翻译的蛋白质减少。
这些串联密码子配对作用机制可用于去优化选择标记基因的表达。

[0056] 并入去优化的dhfr基因中的仓鼠最不偏好串联密码子对的实例显示在表5中。

[0057] 表5.串联密码子对

[0058] 密码子都为最不偏好密码子，粗体表示的密码子除外。

[0059]

[0060]

[0061] 因此，在所述方法的一个实施方案中，选择标记蛋白中的串联的重复氨基酸残基（其中相同氨基酸存在于一级结构中串联的一个以上拷贝中）由并非所述氨基酸的偏好密
码子的密码子编码。在另一实施方案中，选择标记蛋白中的串联的重复氨基酸残基（其中相同氨基酸存在于一级结构中串联的一个以上拷贝中）由作为所述氨基酸的最不偏好密码子
的密码子编码。在另一实施方案中，存在于一个以上拷贝中且串联存在于一级结构中的相
同氨基酸由相同密码子编码。

[0062] 二级结构

[0063] 另一方面，本发明提供增加由GOI编码的重组蛋白的表达的方法，所述方法利用编码在设计具有改变RNA二级结构的序列修饰的多核苷酸中的选择标记蛋白的表达载体。

[0064] 在这个实施方案中，当设计用于密码子去优化的基因时，考虑mRNA的结构。例如，重新设计的密码子的序列上下文可调节RNA二级结构，已证实所述RNA二级结构调控mRNA信使的稳定性和可翻译性(Griswold 2003,Kozak 2005,Kudla 2009)。在设计密码子去优
化的选择标记时考虑的因素包括但不限于二级结构稳定性和整个RNA或其5′端的最小自
由能(MFE)，如可通过开放存取RNA结构预测软件(如RNAfold)(Gruber等,2008)来测定。
在最不偏好密码子周围区域中或在最不偏好密码子的一部分中的去优化基因的序列上下
文也可能是重要的。可降低翻译效率的因素包括GC含量、密码子第三位置中的G+C(Sueoka
和Kawanishi,2000)和密码子适应指数计分(Sharp和Li, 1987)。实际上，已有证据显示
mRNA中的较高GC含量会增加二级结构形成的可能性，所述二级结构形成将阻碍翻译效率，
且降低GC含量会使这些二级结构去稳定化(Bulmer,1989)。相反，为根据本发明方法的建
议降低翻译效率，通过用具有较高GC含量的同义密码子置换蛋白编码区中的野生型密码
子，或简单地修饰非翻译区以包括较高GC含量来增加GC含量，可提供二级结构的增加，从
而降低翻译效率。

[0065] 本领域中众所周知的是，mRNA 5′非编码区的一级结构和二级结构调节翻译效率；已显示翻译效率与mRNA 5′非编码区的二级结构程度成反比。(Pelletier和
Sonenberg,1987)。另一方面，提供一种方法，其中编码选择标记蛋白的多核苷酸在蛋白编码区的上下文外部被修饰，且对基因进行修饰，使得与野生型mRNA相比，所编码mRNA的非
翻译区具有增加的二级结构。一方面，在非翻译所需的5′和/或3′非翻译区中引入一个
或多个修饰。另一方面，在翻译所需的5′和/或3′区中引入所述一个或多个修饰。

[0066] 载体和宿主细胞

[0067] 涵盖任何真核和原核载体以用于本发明方法中，包括适用于所选宿主细胞的哺乳动物、酵母、真菌、昆虫、植物或病毒载体。术语“载体”如本领域中所公认加以使用，是指任何用于转移编码信息到宿主细胞的分子(例如核酸、质粒或病毒)。术语“宿主细胞”用于
指通过具有所选目标基因的载体已转化或能够转化的细胞，所述细胞接着表达所述基因。
所述术语包括哺乳动物、酵母、真菌、昆虫、植物和原生动物细胞和亲本细胞的后代，无论所述后代是否在形态方面或在遗传组成方面与原始亲本相同，只要所选基因存在即可。一般
来说，任何载体均可用于本发明方法中，且一方面，适当载体的选择是基于选择用于GOI表达的宿主细胞。

[0068] 实例包括但不限于哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)(ATCC编号CCL61)；CHO DHFR细胞、人胚肾(HEK)293或293T细胞(ATCC编号CRL1573)；或3T3细
胞(ATCC编号CCL92)。其它适合哺乳动物细胞系为猴COS-1(ATCC编号CRL1650)和
COS-7(ATCC编号CRL1651)细胞系以及CV-1细胞系(ATCC编号CCL70)。其它适合哺乳动
物细胞系包括但不限于Sp2/0、NS 1和NS0小鼠杂交瘤细胞、小鼠神经母细胞瘤N2A细胞、
HeLa、小鼠L-929 细胞、来源于Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、也获自ATCC的BHK或
HaK仓鼠细胞系。

[0069] 其它示例性哺乳动物宿主细胞包括灵长类动物细胞系和啮齿动物细胞系，包括转化的细胞系。正常二倍体细胞、来源于原代组织的体外培养物的细胞株以及原代外植体也
适合。

[0070] 同样适用作宿主细胞的细胞包括例如大肠杆菌的各种菌株(例如HB101、(ATCC编号33694) DH10和MC1061(ATCC编号53338))、枯草芽胞杆菌(B.subtilis)的各种
菌株、假单胞菌属(Pseudomonas spp.)、链霉菌属(Streptomyces spp.)、鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium)等。

[0071] 所属领域技术人员已知的酵母细胞的多种菌株也可用作表达GOI的宿主细胞且包括例如酿酒酵母、人体酵母菌探针(Schizosaccharomyces pombe)、克鲁维酵母株
(Kluyveromyces strains)、假丝酵母(Candida)、西弗毕赤酵母(Pichia ciferrii)和毕赤酵母。

[0072] 另外，昆虫细胞系统必要时也可用于本发明方法中。所述系统包括(例如且不限于)Sf-9和Hi5(Invitrogen,Carlsbad,CA)。

[0073] 示例性真菌细胞包括但不限于嗜热子囊菌(Thermoascus aurantiacus)；曲霉菌(Aspergillus)(丝状真菌)，包括但不限于米曲菌(Aspergillus oryzaem)、构巢曲
霉(Aspergillus nidulans)、土曲霉(Aspergillus terreus)和黑曲霉(Aspergillus
niger)；镰刀霉(Fusarium)(丝状真菌)，包括但不限于镰刀菌(Fusarium venenatum)；
产黄青霉(Penicillium chrysogenum)、桔青霉(Penicillium citrinum)、枝顶孢霉
(Acremonium chrysogenum)、里氏木霉(Trichoderma reesei)、高山被孢霉(Mortierella alpina)和金孢子菌(Chrysosporium lucknowense)。

[0074] 示例性原生动物细胞包括但不限于四膜虫(Tetrahymena)株和锥虫属(Trypanosoma)株。

[0075] 实施例

[0076] 在一个实施方案中，本发明是使用最不偏好仓鼠密码子产生适于中国仓鼠卵巢(CHO)细胞选择的密码子去优化的DHFR(CDD)编码基因来示例。

[0077] 起始基因与小家鼠DHFR编码的cDNA(Accession编号BC005796)相同且编码野生型DHFR多肽(参见图1)。合成密码子去优化的DHFR编码多核苷酸的两种型式，本文中
称为弱化型式和最差型式，分别表示中间和最大去优化的编码序列。这些多核苷酸是使用
GENEART AG CHO密码子使用算法来设计。密码子去优化的DHFR编码多核苷酸序列显示于
图2中。将密码子去优化的DHFR基因与图3中的野生型DHFR基因序列对准且突出了显示
由于引入仓鼠最不偏好密码子和串联密码子对所产生的核苷酸差异。所有三种基因(野生
型、弱化和最差)的翻译产物相同。

[0078] 密码子去优化的DHFR编码多核苷酸序列被引入表达载体pDEF38(CHEF1表达载体)中(美国专利第5,888,809号)，以置换野生型DHFR编码序列(图4)。所得质粒命名
为pDEF81(弱化DHFR)和pDEF82(最差DHFR)。编码IgG1Fc融合蛋白的目标报告基因FIGI
被克隆到pDEF38、pDEF81和pDEF82的多克隆位点(XhoI到XbaI)中以分别产生表达载体
pDEF38:FIGI、pDEF81:FIGI和pDEF82:FIGI。

[0079] 将这些FIGI表达载体转染到CHO DG44细胞中，在含次黄嘌呤和胸腺嘧啶脱氧核苷(HT)的非选择培养基中生长2天，接着在缺乏HT(-HT)的培养基中进行选择。将所选的
细胞群体或池扩增并分裂到产生模型培养物中以评估产生率。

[0080] 稀释转染池以将单个细胞接种到96孔板的个别孔中。用Clone SelectImager(Genetix)使板成像且将含有来源于单个细胞的表达FIGI的细胞的孔扩增。对每
次从确认的单克隆组的转染(野生型、弱化和最差DHFR)，随机选择来自限制性稀释板的23
个克隆。

[0081] 将总共1百万个细胞接种到6孔产生模型中的3ml含10%FBS的细胞培养基中且在37℃下生长4天，接着在34℃下生长4天。采集的上清液经0.2微米过滤器过滤且由蛋
白A HPLC测定FIGI产生。分批补料产生模型以每毫升50万个细胞接种于离心管中补充
有10%FBS的培养基中。用15mL工作体积操作50mL离心管。接种后，样品在37℃和6%CO2
下生长3天，同时滋养并从第4天开始温度转变到34℃。在第3、5、7、10和12天收集样品
的效价和细胞密度。在第12天结束研究。

[0082] 用第2天采集并用异硫氰酸荧光素标记的甲氨蝶呤(F-MTX)染色以检测DHFR蛋白以及用R-藻红蛋白(RPE)标记的抗IgG1 Fc染色以检测FIGI的正常生长细胞进行FACS
分析。

[0083] 表达报告蛋白FIGI的稳定细胞系是使用野生型和密码子去优化的编码DHFR选择标记的基因制备。用表达报告蛋白FIGI的野生型、弱化和最差DHFR质粒进行双重复转染
(T462-T464,A和B)。针对每次转染计算的个别群落是以“转染子数目”来报告。如表6中
可见，转染结果指示当使用密码子去优化的DHFR(CDD)时，与野生型DHFR相比，选择压力增加。这一结果被视为缺乏HT的培养基中选择的CDD转染子的数目减少。

[0084] 表6:每次转染的转染子数目

[0085]转染质粒 DHFR标记转染子数目
T462A pDEF38:FIGI 野生型 33834
T462B pDEF38:FIGI 野生型 22663
T463A pDEF81:FIGI 弱化 1915
T463B pDEF81:FIGI 弱化 4309
T464A pDEF82:FIGI 最差 7342
T464B pDEF82:FIGI 最差 6863

[0086] 从6孔、第8天(图5)和离心管、第12天分批补料(图6)产生模型中汇集的转染子产生的FIGI蛋白的量显示，与野生型DHFR基因相比，具有密码子去优化的DHFR选择
标记基因的GOI的产生率意外增加。弱化DHFR基因产生最高效价。这一结果与以下观察
结果一致：弱化DHFR选择是最严格的(参见表6)，且表明群体的多样性可能降低，但平均
细胞表达更多POI。这一结论在图7A中的弱化DHFR(T463)FACS分布中较为明显，图7A显
示针对RPE:FIGI明亮染色的细胞的密集群集，并伴有F-MTX染色的减少。最差DHFR细胞
显示与弱化DHFR相比类似但更宽的RPE:FIGI染色模式，这与产生模型的效价略微降低一
致。与野生型染色模式相比，两个密码子去优化的池都具有显著染色变换，其中DHFR减少
且FIGI增加。这一差异在CDD池的平均荧光相对于野生型池增加方面更明显可见(图7B)
且证实以下结论：密码子去优化的DHFR选择导致POI产生增加。

[0087] 用CDD池观察到的产生率增加进一步在个别克隆中得到证实。使随机选择的克隆扩增，接着通过流式细胞术进行分析并且放入6孔产生模型中。个别克隆的FACS概况
显示，与野生型DHFR所选克隆相比，密码子去优化的所选细胞针对POI的染色较明亮(图
8B)，但DHFR水平较低(图8A)。这些资料与转染池资料一致。蛋白A测定中克隆的产生率
显示于图9中且显示来自CDD所选池的随机克隆的效价增加。CDD克隆的效价差异比野生
型大2倍至3倍之间。

[0088] 本文所公开和要求的所有组合物和/或方法都可根据本发明在无不当实验的情况下制备和进行。虽然本发明的组合物和方法已经根据特定实施方案加以描述，但所属领
域技术人员显而易见，可使所述组合物和/或方法和本文所述方法的步骤或步骤的顺序发
生变化，但不偏离本发明的概念和范畴。更具体说来，显而易见在化学上和生物学上相关的某些多核苷酸可取代本文所述的多核苷酸，同时达成相同或相似结果。所属领域技术人员
显而易见的所有这种相似的取代物和修饰都被认为在所附权利要求书所界定的本发明的
范畴和概念内。

[0089] 本文通篇所引用的参考文献均特定地以引用的方式并入本文，其并入程度使得其对本文所陈述内容提供示例性程序或其他细节补充。

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