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一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘醇单胞菌的方法及其专用引物

阅读:923发布:2021-09-18

专利汇可以提供一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘醇单胞菌的方法及其专用引物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 学技术和分子生物学技术交叉领域,具体的说一种基于属特异性引物-PCR结合 链霉素 抗性平板特异性分离鞘 氨 醇单胞菌的方法及其专用引物。具体为,将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板,挑取黄色菌落反复划线分纯,经液体培养后,提取纯菌株基因组DNA,采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA 片段 ,存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌。采用本发明提供的属特异性引物扩增结合链霉素抗性平板法能够特异性的从 土壤 中直接分离可培养的鞘氨醇单胞菌,针对这一特殊种属进行计数,同时获得可培养的鞘氨醇单胞菌菌株资源。,下面是一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘醇单胞菌的方法及其专用引物专利的具体信息内容。

1.一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘醇单胞菌的专用引物,其特征在于:鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph-429f:
5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;Sph-933r:5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。
2.一种权利要求1所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法,其特征在于:将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板,挑取黄色菌落反复划线分纯,经液体培养后,提取纯菌株基因组DNA,采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段,存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌;
鞘 氨 醇 单 胞 菌 属 特 异 性 引 物 Sph-429f 和 Sph-933r 为 Sph-429f:
5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;Sph-933r:5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。
3.按权利要求2所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法,其特征在于:
1)制备样品土壤生物细胞悬液:称取5g待测土样加入45mL生理盐并添加玻璃珠,于150rpm振荡2h;而后将悬浮液静置,取上清液,用生理盐水对土壤悬液进行10倍梯度稀释;
-2 -6
2)涂布链霉素抗性LB固体平板:取0.1ml步骤1)中稀释度为10 -10 的土壤悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上,以30℃倒置培养4天;
3)划线分纯:挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落,在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯,直至分离出单菌落;
4)提取纯菌株基因组DNA:将步骤3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基,30℃摇床过夜培养;而后采用试剂SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl提取基因组DNA;
5)属特异性引物扩增纯菌株16SrDNA片段:以Sph-429f和Sph-933r作为鞘氨醇单胞菌属16SrDNA特异性引物,模板为步骤4)中提取的基因组DNA进行PCR扩增,PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,得到阳性PCR产物且片段大小为504bp的菌株,即为鞘氨醇单胞菌;
Sph-429f:5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;Sph-933r:5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。
4.按权利要求3所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法,其特征在于:所述步骤5)PCR扩增PCR反应体系组成如下:1μlDNA模板,
10×PCR反应缓冲液5μl,2.5mmol/LdNTP混合溶液4μl,20pmol/L引物Sph-429f1μl,
20pmol/L引物Sph-933r1μl,Taq酶(5U/μl)0.25μl,加灭菌去离子水至总体积为50μl;
PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后72℃延伸8min。
5.按权利要求3所述的基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法,其特征在于:所述步骤4)提取纯菌株基因组DNA:将3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基,30℃150rpm摇床过夜培养,8000rpm离心2min收集菌体,加入-1
597μlTE缓冲液重悬菌体,并加入30μl10%的SDS和3μl20mgml 的蛋白酶K于37℃温-1
浴1h;然后加入100μl5moll NaCl和80μl10%CTAB/NaCl混匀,65℃温浴10min;水浴后加入800μl的酚-氯仿-异戊醇混合液混合均匀,6000×g离心10min收集上清,上清液中再加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液混合均匀,6000×g离心10min收集上清;上清液中再加入上清液0.8倍体积的异丙醇室温静置1h,12000×g离心20min离心收集DNA沉淀。

说明书全文

一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性

分离鞘醇单胞菌的方法及其专用引物

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学技术和分子生物学技术交叉领域,具体的说一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法。

背景技术

[0002] 鞘氨醇单胞菌从属于α-变形菌纲,鞘氨醇单胞菌目,鞘氨醇单胞菌科,由于其具有某些生理特征(如含大质粒、可降解多环芳类化合物、产生黄色素等)以前曾被归于假单胞菌属(Pseudomoans)或黄杆菌属(Flavobacterium)。1990年,日本学者Yabuuchi等通过研究16SrRNA的核苷酸序列、胞内脂质中出现的特殊鞘糖脂和辅酶Q的主要类型,首次提出这是一个新的细菌属——鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)。该属的菌株均为革兰氏阴性菌,无孢子,以单侧生极性鞭毛运动,多呈黄色,专性需且能产生过氧化氢酶。其细胞膜组成不同于一般的革兰氏阴性好氧菌特有的脂多糖,而是糖鞘脂,这是所有鞘氨醇单胞菌都具有的重要特征。
[0003] 近年来,大量的鞘氨醇单胞菌已经陆续从环境中被分离出来,而且大多数是从多氯联苯、杂酚油、五氯苯酚除草剂、多环芳烃(PAHs)等污染环境中发现的。这些分离自污染环境的鞘氨醇单胞菌几乎都具有降解污染物的能,表明鞘氨醇单胞菌是一类具有代谢多样性的微生物资源,暗示了其在生物修复方面的潜在重要性。此外,由于其能够耐受极端贫营养条件,并产生有价值的高分子聚合物,该属逐渐成为环境微生物领域关注的一个热点研究对象。
[0004] 目前,还没有一种选择性培养基能够针对鞘氨醇单胞菌进行专一培养,因此目前所获得的可培养鞘氨醇单胞菌资源大多是通过从环境样品中分离某种特定功能菌株,然后经生理生化特性鉴定,确认其为鞘氨醇单胞菌,这使得鞘氨醇单胞菌的发现和分离具有偶然性和随机性,大大降低了挖掘这一特定种属菌株资源的几率。目前,还没有一种能够从环境样品中特异性快速直接分离可培养鞘氨醇单胞菌的方法。
[0005] 目前,国内尚未有其他学者以16SrDNA为研究对象,针对鞘氨醇单胞菌这一特定种属进行研究。国外有少数报道曾尝试设计鞘氨醇单胞菌16S rDNA属特异性引物或探针,包括简并引物或非简并引物,但所设计的引物检测特异性差,即除了能扩增鞘氨醇单胞菌外,还能扩增其它属的菌株;或检测谱小,不能扩增绝大多数的鞘氨醇单胞菌属菌株。因此,目前还没有一对合适的非简并引物能够特异性扩增鞘氨醇单胞菌16SrDNA。

发明内容

[0006] 本发明目的在于提供一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法。
[0007] 为实现上述目的,本发明采用的技术方案为:
[0008] 一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的专用引物,鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r为Sph-429f:5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;Sph-933r5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。
[0009] 一种基于属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板特异性分离鞘氨醇单胞菌的方法,将待测样品悬液涂布含链霉素的LB培养基固体平板,挑取黄色菌落反复划线分纯,经液体培养后,提取纯菌株基因组DNA,采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段,存在阳性扩增且扩增得到504bpPCR产物的片段即为鞘氨醇单胞菌;
[0010] 鞘 氨 醇 单 胞 菌 属 特 异 性 引 物 PCRph-429f和 Sph-933r为 Sph-429f:5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;Sph-933r:5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。
[0011] 具体为:
[0012] 1)制备土壤样品微生物细胞悬液:称取5g待测土样加入45mL生理盐并添加玻璃珠,于150rpm振荡2h;而后将悬浮液静置,取上清液,用生理盐水对土壤悬液进行10倍梯度稀释;
[0013] 2)涂布链霉素抗性LB固体平板:取0.1ml步骤1)中稀释度为10-2-10-6的土壤悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上,以30℃倒置培养4天;
[0014] 3)划线分纯:挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落,在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯,直至分离出单菌落;
[0015] 4)提取纯菌株基因组DNA:将步骤3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基,30℃摇床过夜培养;而后采用试剂SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl提取基因组DNA;
[0016] 5)属特异性引物扩增纯菌株16SrDNA片段:以Sph-429f和Sph-933r作为鞘氨醇单胞菌属16SrDNA特异性引物,模板为步骤4)中提取的基因组DNA进行PCR扩增,PCR反应产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,得到阳性PCR产物且片段大小为504bp的菌株,即为鞘氨醇单胞菌;
[0017] Sph-429f:5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;Sph-933r:5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。
[0018] 所述LB液体培养基配方为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,NaCl10g,用蒸馏水定容至1000ml,pH7.2-7.4;LB固体培养基配方为:在LB液体培养基中加入2%重量的琼脂粉;链-1
霉素抗性LB固体培养基配方为:在LB固体培养基中加入50μgmL 预先用0.22μm滤膜过滤除菌的链霉素。
[0019] 所述步骤5)PCR扩增PCR反应体系组成如下:1μlDNA模板,10×PCR反应缓冲液5μl,2.5mmol/LdNTP混合溶液4μl,20pmol/L引物Sph-429f1μl,20pmol/L引物Sph-933r1μl,Taq酶(5U/μl)0.25μl,加灭菌去离子水至总体积为50μl;PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后72℃延伸
8min。
[0020] 所述步骤4)提取纯菌株基因组DNA:将3)中分纯后的菌落接种LB液体培养基,30℃150rpm摇床过夜培养,8000rpm离心2min收集菌体,加入597μlTE缓冲液重-1悬菌体,并加入30μl10%的SDS和3μl20mgml 的蛋白酶K于37℃温浴1h;然后加入-1
100μl5moll NaCl和80μl10%十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠(十六烷基三甲基溴化铵/氯化钠为4.1gNaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml)混匀,65℃温浴10min。水浴后加入800μl的酚-氯仿-异戊醇混合液(酚-氯仿-异戊醇按体积比
24∶1∶1混合)混合均匀,6000×g离心10min收集上清,上清液中再加入与上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液(氯仿-异戊醇按体积比24∶1混合)混合均匀,6000×g离心
10min收集上清。上清液中再加入上清液0.8倍体积的异丙醇室温静置1h,12000×g离心
20min离心收集DNA沉淀。
[0021] 本发明的有益效果如下:
[0022] 1.本发明结合了传统选择性培养基培养和分子生物学技术,提供链霉素抗性平板培养结合属特异性引物-PCR的方法,从环境样品中特异性分离鞘氨醇单胞菌,克服了以往获得鞘氨醇单胞菌菌株资源的偶然性和随机性。
[0023] 2.采用本发明提供的属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板的方法,可以直接从土壤样品中快速分离可培养鞘氨醇单胞菌菌株资源,并在此基础上研究这些菌株的功能,有望获得携带特定功能基因(例如有机污染物降解、高分子物质生产等)的菌株。
[0024] 3.本发明设计的鞘氨醇单胞菌16SrDNA属特异性引物,除了用于特异性分离该属菌株以外,还为采用不依赖于培养的16SrDNA指纹图谱分析方法(例如变性梯度凝胶电泳技术、扩增核糖体DNA限制性分析)研究鞘氨醇单胞菌在环境样品中的多样性和群落结构等生态学信息提供了基本工具。
[0025] 4.实验室研究表明,采用本发明提供的属特异性引物-PCR结合链霉素抗性平板的方法,能够从石油污染土壤中直接筛选可培养鞘氨醇单胞菌菌株,从而为进一步研究这些菌株的多环芳烃降解功能和开发合适的生物修复技术提供了菌种资源。附图说明
[0026] 图1为本发明实施例提供的土壤细胞悬液涂布LB链霉素抗性平板培养结果。
[0027] 图2为本发明实施例提供的采用属特异性引物Sph-429f/933r扩增黄色菌落16SrDNA的PCR产物电泳图谱。
[0028] 图3为本发明实施例提供的16SrDNAPCR扩增产物三酶切分型指纹图谱。
[0029] 图4为本发明应用例提供的所分离的鞘氨醇单胞菌16SrDNA序列系统发育树状图。
[0030] 图5为本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 4c 16SrDNA SG.sqnSG-4c JF716058全长序列。
[0031] 图6本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 9b 16SrDNA SG.sqnSG-9b JF716059全长序列。
[0032] 图7为本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 9e 16SrDNA SG.sqnSG-9e JF716060全长序列。
[0033] 图8本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 18h 16SrDNA SG.sqnSG-18h JF716062全长序列。
[0034] 图9本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 19e 16SrDNA SG.sqnSG-19e JF716063全长序列。
[0035] 图10本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 23i 16SrDNA SG.sqnSG-23i JF716064全长序列。
[0036] 图11本发明应用例所分离的菌株Sphingomonas 26b 16SrDNA SG.sqnSG-26b JF716065全长序列。

具体实施方式

[0037] 本发明筛选路线为:土壤样品采集→土壤微生物细胞悬液制备→涂布含链霉素的LB抗性平板→挑取黄色单菌落划线分纯→提取纯菌株基因组DNA→属特异性引物PCR扩增16SrDNA片段→酶切、对具有阳性扩增的菌株进行遗传分型→细菌通用引物扩增鞘氨醇单胞菌阳性菌株16SrDNA全长→测序验证。
[0038] 详细实施步骤为:
[0039] 1)土壤样品采集和保存:采集表层(0-20cm)土壤样品,过1mm筛,4℃箱保存;
[0040] 2)制备土壤微生物细胞悬液:称取5g土样置于已灭菌的装有玻璃珠的三瓶中,加入45mL生理盐水,于150rpm振荡2h。而后将悬浮液静置,取上清液,用生理盐水对土壤悬液进行10倍梯度稀释;
[0041] 3)涂布链霉素抗性LB固体平板:取0.1ml步骤2)中稀释度为10-2-10-6的土壤悬液涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上。30℃倒置培养4天;
[0042] 4)划线分纯:鞘氨醇单胞菌在LB固体平板上大都产黄色色素(如附图1所示),因此挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落,在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯,直至分离出单菌落;
[0043] 5)提取纯菌株基因组DNA:将4)中分纯后的菌落接种3mlLB液体培养基,30℃150rpm摇床过夜培养,8000rpm离心2min收集菌体,加入597μlTE缓冲液重悬-1
菌体,并加入30μl10%的SDS和3μl20mgml 的蛋白酶K于37℃温浴1h;然后加入-1
100μl5moll NaCl和80μl10%CTAB/NaCl(4.1gNaCl溶解于80ml H2O,缓慢加入10gCTAB,加水至100ml)混匀,65℃温浴10min。水浴后加入800μl的酚-氯仿-异戊醇混合液(酚-氯仿-异戊醇按体积比24∶1∶1混合)混合均匀,6000×g离心10min收集上清,上清液中再加入上清液等体积的氯仿-异戊醇混合液(24∶1)混合均匀,6000×g离心
10min收集上清。上清液中再加入上清液0.8倍体积的异丙醇室温静置1h,12000×g离心
20min离心收集沉淀DNA。DNA用30μlTE缓冲液溶解。DNA粗提产物采用0.8%琼脂糖凝胶电泳检测,基因组总DNA片段大小应约为23kb,并采用DNA凝胶回收试剂盒进行纯化,纯化后的DNA储存于-20℃,备用。
[0044] 6)鞘氨醇单胞菌16SrDNA属特异性引物设计:以鞘氨醇单胞菌属菌株16SrDNA基因序列,包括环境样品和临床分离菌株。采用MegAlign软件对选取的鞘氨醇单胞菌属菌株序列进行比对,然后通过Plotcon软件进一步分析比对后的序列,确定序列的可变区和保守区,引物序列应位于保守区。对于初步选定的上下游引物的溶解链温度(Tm)、GC含量、引物二聚体、发夹结构以及错配等影响引物性能的因素均由软件Primer Premier5和Oligo6进行评价、修改。应用RDPII数据库的Sequence Match和NCBI数据库的Blast Search程序验证引物的特异性。最后选择一对最优的鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f和Sph-933r。
[0045] 上游引物Sph-429f:5’-TAAAGCTCTTTTACCCG-3’;(与E.coli16SrDNA的对应位置为429-445)
[0046] 下游引物Sph-933r:5’-AAACCACATGCTCCACC-3’。(与E.coli16SrDNA的对应位置为917-933)
[0047] 7)属特异性引物扩增纯菌株16SrDNA片段:采用步骤6)中设计的鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f/933r,步骤5)中提取的基因组DNA为模板PCR扩增步骤4)所分纯菌株的16SrDNA片段;50μl的PCR反应体系组成如下:1μlDNA模板,10×PCR反应缓-1 -1 -1冲液5μl,2.5mmoll dNTP混合溶液4μl,20pmoll 引物Sph-429f1μl,20pmoll 引物Sph-933r1μl,Taq酶(5U/μl)0.25μl,加灭菌去离子水至总体积为50μl。PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后72℃延伸8min。最后在72℃延伸8min。
[0048] PCR反应的产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增片段大小应为鞘氨醇单胞菌16SrDNA片段长度504bp(如附图2所示)。
[0049] 8)对可能的阳性菌株进行酶切遗传分型:将步骤7)中扩增得到的正确片段大小的PCR产物,采用三酶切进行遗传分型,酶切反应体系(20μL):三种内切酶各0.5μl,2μl10×buffer(100mM Tris-HCl,pH7.5,100mM MgCl2,10mM二硫苏糖醇,500mM NaCl)),0.5μl血清白蛋白(BSA),2μlPCR产物,14μL超纯水。反应总体积20μl,37℃,水浴2h,加入
2μl的10×loading buffer(0.9%十二烷基硫酸钠,50%甘油,0.05%溴酚蓝)终止酶切反应。酶切产物用10%的聚丙烯凝胶电泳分离,90V,1h。不同的酶切指纹图谱可代表不同的菌株遗传型(如附图3所示)。
[0050] 9)对可能的鞘氨醇单胞菌阳性菌株进行测序验证:选取步骤8)中鉴定为鞘氨醇单胞菌的不同菌株,采用细菌通用引物27f/1492r扩增16SrDNA全长序列,引物 序 列 分 别 为,27f:5’-AGAGTTTGATC[C/A]TGGCTCAG-3’;1492r:5’-TACGG[A/T/C]TACCTTGTTACGACTT-3’。所采用的PCR反应体系同步骤7);PCR反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸2min,每个循环降0.5℃,共35个循环;最后
72℃延伸8min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测,扩增片段大小应约为1500bp。PCR产物经凝胶回收纯化后,测序。将所得序列在GenBank数据库进行BLAST比对分析,获得相似序列。应用ClustalX软件将测序序列与相似序列比对,然后用MEGA3.1软件构建系统发育树。
[0051] LB液体培养基配方为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,NaCl10g,用蒸馏水定容至1000ml,pH7.2-7.4;LB固体培养基配方为:在LB液体培养基中加入2%重量的琼脂粉;链-1
霉素抗性LB固体培养基配方为:在LB固体培养基中加入50μgmL 预先用0.22μm滤膜过滤除菌的链霉素。
[0052] 用于菌株遗传分型鉴定的限制性内切酶为HaeIII(GG’CC)、HinfI(G’ANTC)和MspI(C’CGG)。
[0053] 实施例1
[0054] 采集沈抚灌区石油污染土壤,过1mm筛,4℃冰箱保存。称取5g土样置于已灭菌的装有玻璃珠的三角瓶中,加入45mL生理盐水,于150rpm振荡2h。而后将悬浮液静置,取上-2 -6清液,用生理盐水对土壤悬液进行10倍梯度稀释。取0.1ml稀释度为10 -10 的土壤悬液-1
涂布至添加链霉素的LB固体培养基平板上,链霉素终浓度50μgml ,30℃倒置培养4天。
挑取LB链霉素抗性平板上生长的黄色菌落,在LB链霉素抗性平板上反复划线分纯,直至分离出单菌落。
[0055] LB液体培养基配方为:胰蛋白胨10g,酵母浸粉5g,NaCl10g,用蒸馏水定容至1000ml,pH7.2-7.4;LB固体培养基配方为:在LB液体培养基中加入2%重量的琼脂粉;链-1
霉素抗性LB固体培养基配方为:在LB固体培养基中加入50μgmL 预先用0.22μm滤膜过滤除菌的链霉素。
[0056] 将上述分纯的黄色单菌落,接种于3mlLB液体培养基中,30℃摇床过夜培养,采用SDS、蛋白酶K和CTAB/NaCl方法提取基因组DNA,并采用DNA凝胶回收试剂盒2.0进行纯化(宝生物工程(大连)有限公司,中国大连))。采用鞘氨醇单胞菌属特异性引物Sph-429f/933r PCR扩增16SrDNA片段,50μl的PCR反应体系组成如下:1μlDNA模板,10×PCR反应缓冲液5μl,2.5mmol/LdNTP混合溶液4μl,20pmol/L引物Sph-429f1μl,
20pmol/L引物Sph-933r1μl,Taq酶(5U/μl)0.25μl,加灭菌去离子水至总体积为50μl。
PCR反应条件:94℃预变性5min,94℃变性1min,55℃退火45s,72℃延伸90s,35个循环,最后72℃延伸8min。最后在72℃延伸8min。PCR反应的产物用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测,PCR产物片段大小为504bp,与鞘氨醇单胞菌16SrDNA片段相同,即,样品中存在鞘氨醇单胞菌。
[0057] 实施例2
[0058] 将实施例1中扩增得到的正确片段大小的PCR产物,采用三酶切进行遗传分型,酶切反应体系(20μl):三种内切酶各0.5μl,2μl10×buffer,0.5μl牛血清白蛋白(BSA),2μlPCR产物,14μL超纯水。反应总体积20μl,37℃,水浴2h,加入2μl的10×loading buffer终止酶切反应。酶切产物用10%的聚丙烯凝胶电泳分离,90V,1h。不同的酶切指纹图谱可代表不同的菌株遗传型。
[0059] 从上述每个不同遗传型中选取1个代表菌株,采用细菌通用引物27f/1492r扩增16SrDNA全长序列,引物序列分别为,27f:5’-AGAGTTTGATC[C/A]TGGCTCAG-3’;1492r:5’-TACGG[A/T/C]TACCTTGTTACGACTT-3’。所采用的PCR反应体系同实施例1;PCR反应条件为:94℃预变性5min,94℃变性1min,65℃退火1min,72℃延伸2min,每个循环降0.5℃,共35个循环;最后72℃延伸8min。PCR产物经凝胶回收纯化后,并进行系统发育分析,验证其是否为鞘氨醇单胞菌。
[0060] 用于菌株遗传分型鉴定的限制性内切酶为HaeIII(GG’CC)、HinfI(G’ANTC)和MspI(C’CGG)。
[0061] 应用例
[0062] 采集沈抚灌区石油污水灌溉40余年后改旱田耕作的表层(0-20cm)土壤作为供试5 -1
土壤。土壤悬液涂布LB链霉素抗性平板,其中黄色菌落数量达到1.6×10CFUg 干土。从平板上共随机挑取60个抗链霉素的黄色单菌落,经反复划线分纯。提取这60个抗链霉素单菌落的基因组DNA,采用用鞘氨醇单胞菌属-特异性引物Sph-429f/933r进行PCR扩增,PCR产物琼脂糖凝胶电泳检测结果如附图2所示。在60个黄色单菌落中,有48个黄色单菌落产生片段大小合适的PCR产物。将上述48个PCR扩增片段进行三酶切遗传分型,酶切指纹图谱(参见图3),三酶切遗传分型操作按照实施例2中记载进行,根据酶切遗传分型结果,48个单菌落被分成7个遗传型。每种遗传型选取1株代表菌株,菌株编号分别为4c,
9b,9e,18h,19e,23i和26b。采用细菌通用引物27f-1492r扩增这些菌株的16SrDNA全长序列,PCR产物纯化后进行测序。
[0063] 对上述7个菌株扩增16SrDNA序列的BLASTN分析,均归属为鞘氨醇单胞菌,具体为,菌株4c与Sphingomonassp.HI-K4(DQ205308.1)相似性最高(99%);菌株9b和9e均与Sphingomonas aromaticivorans(AB025012.1)的同源性最高(99%);菌株18h与Sphingomonassp.DS3-1(AJ871278.1)亲缘关系最近(99%);菌株19e与Sphingomonassp.MUELAK1(EF628247.1) 同 源 性 最 高 (100 % );菌 株 23i 与 Sphingomonassp.PF-I(DQ207361.1)同源性最高(99%);菌株26b与Sphingomonassp.JSS-54(AF131297.1)同源性最高(99%)。本应用例分离得到的鞘氨醇单胞菌的16SrDNA全长序列已提交至DDBJ数据库,序列登陆号为JF716058-JF716060,JF716062-JF716065。
[0064] 采用Clustalx1.81和MEGA3.1软件对上述鞘氨醇单胞菌以及鞘氨醇单胞属的标准菌株、已报道的具有PAHs降解能力的鞘氨醇单胞菌株序列进行比对,并构建系统发育树(见附图4)。
[0065] 采用液体摇瓶实验验证上述7株鞘氨醇单胞菌降解多环芳烃的能力,结果表明菌株4c、9b、18h、19e、23i和26b能够在以芴为唯一源的液体无机盐培养基中生长,30℃培养5天后芴的降解率分别为87.2%,74.9%,83.0%,63.2%,85.4%,和68.7%。此外,液体摇瓶法表明菌株4c和23i还可以降解菲,降解率分别为64.8%和60.5%。
[0066] 本应用例中液体无机盐培养基配方为:K2HPO42g、KH2PO40.5g、NaCl0.5g、NH4Cl0.5g、MgSO40.2g、CaCl210mg、微量元素溶液1ml,用蒸馏水定容至1000ml;其中,微量元素溶液配方为:FeSO2·7H2O2g、MnSO2·H2O2g、Na2MoSO4·2H2O0.5g、H3BO40.2g、CuSO2·5H2O0.4g、ZnSO20.5g、NH4VO30.2g、CoCl2·6H2O0.5g、NiCl2·6H2O0.2g,用蒸馏水定容至1000ml。
[0067] 以多环芳烃为唯一碳源的液体无机盐培养基:取5g/L芴和菲组分母液,0.22μm滤膜除菌,量取100μl母液,加入50ml灭菌的液体无机盐培养基,使底物的终浓度为-1100mgL 。
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