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一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法

阅读:68发布:2021-09-18

专利汇可以提供一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种畜禽原代 肝细胞 分离、培养与鉴定的方法,将螯合法与原位两步灌流法进行整合,预先脱去畜禽肝脏组织内Ca2+与Mg2+,使之尽量多地释放出原代肝细胞,通过调整培养液的添加物配方,完善其无血清培养体系,并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。本发明能有效提高分离到的原代畜禽肝细胞数量、活率和纯度,并可适用于畜禽各类动物,所获得的原代肝细胞损伤少,易贴壁,活性好,能广泛应用于畜禽肝细胞的生理功能调节、代谢性 疾病 ,药理和毒理学机制,建立 病毒感染 细胞模型,以及理化和毒物因素影响等领域的研究。,下面是一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法专利的具体信息内容。

1.一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法,其特征在于将螯合法与原位两步灌
2+ 2+
流法进行整合,预先脱去畜禽肝脏组织内Ca 与Mg ,使之尽量多地释放出原代肝细胞,通过调整培养液的添加物配方,完善其无血清培养体系,并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。
2.如权利要求1所述畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法,其特征在于操作步骤是:
一、畜禽原代肝细胞的分离
畜禽手术前禁食,自由饮过夜,颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝,腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物;
将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上,该手术台放在大瓷盘上,用75%酒精擦拭全身,转入超净工作台内;
无菌条件下打开腹腔,轻轻把肠道拉向躯体右侧,暴露肠系膜静脉,结扎下腔静脉两端,并在其中汇入肝静脉方向插管,然后松开流向肝脏的一端;
进行灌流分离,首先进行消化前灌流,又分为两部分:第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA,待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉,持续20min,然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O,持续5min;
待流出的液体变清后,进行第二步消化灌流,即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶,并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉,使灌流液缓慢流出,15min后肝脏逐渐被消化;
触动肝脏表面呈现组织比较松软后,开始将其摘取并放入一无菌平皿中,加入50ml预冷的威廉斯(氏)介质E( Williams’ medium E)基础培养液,剔除血管、脂肪和结缔组织,剪去肝脏周边消化不完全的部分;
镊子撕掉肝脏包膜,剪碎肝组织,大口径吸管轻轻吹打,随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛,所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E( Williams’ medium E)基础培养液清洗2次,再在4℃ 500rpm离心5min;
-6
用贴壁培养液,该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生血清、10 M人胰-6
岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及
100µg/ml链霉素,Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数;
二、畜禽肝原代细胞的培养
5
细胞计数后,用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2~5×10 cell/ml,在直径为60ml的
5 2
培养瓶中接种15ml ,接种密度为1×10 cell /cm,在37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养,4h细胞贴壁后,用生长培养液全量换液,该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h,此后,用无血清培养液、10µg/ml维生素C、
0.15% BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液,该无血清培养液中含-7
5×10 M地塞米松、1×SITE (这是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine) 的缩写,也可写成ITES,Sigma-Aldrich公司,含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、-8
2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺),以后每24h更换培养液,倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况;
三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定
取上述无血清培养液培养48 h(接种后第3 d)的肝细胞进行糖原染色鉴定,具体操作步骤如下:
吸去培养液,加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液,加入95%酒精,5 min;
弃液,加入70%酒精15 min后弃液,加入质量百分比为0.8%的过碘酸酒精溶液化,10 min;
蒸馏水洗2 min后,加入Schiff’s酒精混合液,10 min;
弃液后,加入0.5%偏亚硫酸钠溶液,2 min后蒸馏水再洗2 min;
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核,20 min;
以0.5%盐酸酒精分色,自来水蓝化10 min;
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min;
甲苯透明,树胶封片,倒置显微镜下观察。

说明书全文

一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法

技术领域

[0001] 本发明属于生物技术领域,涉及一种适用于畜禽各类动物的畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法。

背景技术

[0002] 肝脏是机体发挥代谢功能,去化,储存肝糖,合成分泌性蛋白质和生物转化等多种生物学功能的重要器官,也是药物发挥毒性作用的主要场所。因此,许多的离体研究都选用畜禽原代肝细胞为生物材料,如肝细胞生理功能调节、代谢性疾病,药理学、病理学和毒理学机制,病毒感染细胞模型的建立,以及理化和毒物因素的影响等领域。
[0003] 可见,原代肝细胞的分离、培养与鉴定是完成以上体外研究的首要环节,而肝细胞在体外能否无血清培养成功,其分离与培养方法至关重要。近年来,国内外许多学者在原代肝细胞分离和培养技术上做了大量的探索,在肝细胞分离、培养技术的实际应用方面取得了不少成果。早期主要采用非酶法分离肝细胞,包括机械分离法及螯合法。机械分离法是利用机械剪切、增压过筛及强吹打等物理手段来分离肝细胞的方法,对肝细胞损伤大,细胞2+ 2+ 2+
活率低。螯合法是用可结合Ca 、Mg 的螯合剂(如EDTA)去除Ca 依赖性黏附因子,使细胞间桥粒断裂而分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞,包括胶原酶消化法与胰蛋白酶消化法等。酶消化法是利用酶来破坏肝细胞之间的桥连,使肝细胞分离的一种方法。酶消化法的通常做法是,将组织剪碎后加入适量浓度的消化酶,放入37℃浴摇床消化适当时间。但是,对于肝脏来说,采用组织消化法通常分离得到的细胞活性较低,而且肝组织块内大量红细胞很难去除。进行酶消化法时,对酶的浓度及其作用时间要求十分严格,尤其是胰蛋白酶为一种强蛋白质消化酶,对肝细胞膜损伤严重,易造成肝细胞死亡。1972年,Seglen首次采用原位两步胶原酶灌流法分离大鼠肝细胞成功取得高活率,因为采用胶原酶消化法分离原代肝细胞,对肝细胞损伤较小,且肝细胞膜在消化过程中所受到损害可在培养后得到修复。此后,众多研究者对该方法进行了一定改进,并用于不同物种肝细胞的分离。如Fraslin等改良原位两步灌流法用于成年鸡肝细胞的分离;Douaire等以Williams’ medium E作为基础培养液建立成年鸡肝细胞无血清培养体系;中国专利申请(200410084625.7)报道了一种生物人工肝用猪和人肝细胞的制备方法;中国专利申请(200610050853.1)用Dispase-胶原酶灌流法获高活率的新鲜原代猪肝细胞等。但以上分离方法均一定的局限性,主要表现为:一方面是原代肝细胞得率与纯度不高,活力不强,过程较繁琐;另一方面为有血清培养体系,无法为部分肝功能研究提供生物学材料。

发明内容

[0004] 为克服现有技术的上述缺点,本发明提供一种能有效提高分离到的原代畜禽肝细胞数量、活率和纯度, 所获得的原代肝细胞损伤少、易贴壁和活性好的畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法。
[0005] 本发明解决其技术问题所采用的技术方法是:一种畜禽原代肝细胞分离、培养与2+ 2+
鉴定的方法,将螯合法与原位两步灌流法进行整合,预先脱去畜禽肝脏组织内Ca 与Mg ,使之尽量多地释放出原代肝细胞,通过调整培养液的添加物配方,完善其无血清培养体系,并就所获原代肝细胞进行糖原鉴定。
[0006] 它的操作步骤是:一、畜禽原代肝细胞的分离
畜禽手术前禁食,自由饮水过夜,颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝,腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物;
将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上,该手术台放在大瓷盘上,用75%酒精擦拭全身,转入超净工作台内;
无菌条件下打开腹腔,轻轻把肠道拉向躯体右侧,暴露肠系膜静脉,结扎下腔静脉两端,并在其中汇入肝静脉方向插管,然后松开流向肝脏的一端;
进行灌流分离,首先进行消化前灌流,又分为两部分:第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA,待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉,持续20min,然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O,持续5min;
待流出的液体变清后,进行第二步消化灌流,即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶,并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉,使灌流液缓慢流出,15min后肝脏逐渐被消化;
触动肝脏表面呈现组织比较松软后,开始将其摘取并放入一无菌平皿中,加入
50ml预冷的威廉斯(氏)介质E( Williams’ medium E)基础培养液,剔除血管、脂肪和结缔组织,剪去肝脏周边消化不完全的部分;
镊子撕掉肝脏包膜,剪碎肝组织,大口径吸管轻轻吹打,随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛,所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E( Williams’ medium E)基础培养液清洗2次,再在4℃ 500rpm离心5min;
用贴壁培养液,该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生血清、10-6 M人-6
胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及
100µg/ml链霉素,Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数;
二、畜禽肝原代细胞的培养
5
细胞计数后,用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2~5×10 cell/ml,在直径为60ml的
5 2
培养瓶中接种15ml ,接种密度为1×10 cell /cm,在37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养,4h细胞贴壁后,用生长培养液全量换液,该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h,此后,用无血清培养液、10µg/ml维生素C、
0.15% BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液,该无血清培养液中含-7
5×10 M地塞米松、1×SITE (这是(insulin, transferrin, selenium, ethanolamine) 的缩写,也可写成ITES,Sigma-Aldrich公司,含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、-8
2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺),以后每24h更换培养液,倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况;
三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定
取上述无血清培养液培养48 h(接种后第3 d)的肝细胞进行糖原染色鉴定,具体操作步骤如下:
吸去培养液,加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液,加入95%酒精,5 min;
弃液,加入70%酒精15 min后弃液,加入质量百分比为0.8%的过碘酸酒精溶液氧化,10 min;
蒸馏水洗2 min后,加入Schiff’s酒精混合液,10 min;
弃液后,加入0.5%偏亚硫酸钠溶液,2 min后蒸馏水再洗2 min;
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核,20 min;
以0.5%盐酸酒精分色,自来水蓝化10 min;
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min;
甲苯透明,树胶封片,倒置显微镜下观察。
[0007] 本发明的有益效果是:本发明将螯合法与原位两步灌流法进行整合,即在消化前2+ 2+
灌流时,灌注含5mM EDTA的无Ca 、Mg HEPES缓冲液,方法改进后获得的肝细胞分散程度及纯度均为更高,且细胞活率可达90%以上。其机理是灌流液中含有的EDTA可螯合血液及
2+ 2+
肝细胞间液中的Ca 、Mg ,一方面起抗凝作用,更好地将红细胞冲洗出来,另一方面可去除
2+
肝细胞间的Ca 依赖性黏附因子,促进肝细胞的分离。
[0008] 本发明包括了畜禽原代肝细胞的Ⅳ型胶原酶原位灌流消化法分离、原代肝细胞无血清培养与肝细胞糖原鉴定等三个方面,本发明能有效提高分离到的原代畜禽肝细胞数量、活率和纯度,并可适用于畜禽各类动物,所获得的原代肝细胞损伤少,易贴壁,活性好,能广泛应用于畜禽肝细胞的生理功能调节、代谢性疾病,药理和毒理学机制,建立病毒感染细胞模型,以及理化和毒物因素影响等领域的研究。附图说明
[0009] 图1是本发明的工艺流程方框图

具体实施方式

[0010] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明。
[0011] 参见图1,一种畜禽原代肝细胞分离、培养与鉴定的方法,其操作步骤是:一、畜禽原代肝细胞的分离畜禽手术前禁食,自由饮水过夜,颈部注射1400IU/kg剂量肝素钠抗凝,腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)麻醉动物;
将麻醉后的畜禽仰卧位保定在小动物手术台上,该手术台放在大瓷盘上,用75%酒精擦拭全身,转入超净工作台内;
无菌条件下打开腹腔,轻轻把肠道拉向躯体右侧,暴露肠系膜静脉,结扎下腔静脉两端,并在其中汇入肝门静脉方向插管,该管是输液管钝性去针头部分,然后松开流向肝脏的一端;
进行灌流分离,首先进行消化前灌流,又分为两部分:第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA,待肝脏稍鼓胀时剪开上腔静脉,持续20min,然后以同样速率灌注37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O,持续5min;
待流出的液体变清后,进行第二步消化灌流,即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 ,该灌流液 中含有10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶,并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉,使灌流液缓慢流出,15min后肝脏逐渐被消化;
触动肝脏表面呈现组织比较松软后,开始将其摘取并放入一无菌平皿中,加入
50ml预冷的威廉斯(氏)介质E( Williams’ medium E)基础培养液,剔除血管、脂肪和结缔组织,剪去肝脏周边消化不完全的部分;
用镊子撕掉肝脏包膜,剪碎肝组织,大口径吸管轻轻吹打,随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛,所得肝细胞悬液用威廉斯(氏)介质E( Williams’ medium E)基础培养液清洗2次,再在4℃ 500rpm离心5min;
-6
用贴壁培养液,该贴壁培养液中含有体积百分比为10%的新生牛血清、10 M人-6
胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及
100µg/ml链霉素,Gibco公司)的基础培养液)重悬、台盼蓝拒染法检测细胞活率、血细胞计数板计数;
二、畜禽肝原代细胞的培养
5
细胞计数后,用贴壁培养液将细胞悬液稀释为2~5×10 cell/ml,在直径为60ml的
5 2
培养瓶中接种15ml ,接种密度为1×10 cell /cm,在37℃、5% CO2和饱和湿度的条件下培养,4h细胞贴壁后,用生长培养液全量换液,该生长培养液中含体积百分比为10%的新生牛血清及双抗的基础培养液继续培养20h,此后,用无血清培养液、10µg/ml维生素C、0.15% -7
BSA和双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液,该无血清培养液中含5×10 M地塞米松、1×SITE (Sigma-Aldrich公司,含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、-8
2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺),以后每24h更换培养液,倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况;
三、畜禽原代肝细胞的糖原鉴定
取上述无血清培养液培养48 h(接种后第3 d)的肝细胞进行糖原染色鉴定,具体操作步骤如下:
吸去培养液,加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液,加入95%酒精,5 min;
弃液,加入70%酒精15 min后弃液,加入0.8%过碘酸酒精溶液氧化,10 min;
蒸馏水洗2 min后,加入Schiff’s酒精混合液,10 min;
弃液后,加入0.5%偏亚硫酸钠溶液,2 min后蒸馏水再洗2 min;
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核,20 min;
以0.5%盐酸酒精分色,自来水蓝化10 min;
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min;
二甲苯透明,树胶封片,倒置显微镜下观察。
[0012] 本发明的优点在于将螯合法与原位两步灌流法进行整合改进,预先脱去肝脏组织2+ 2+
内Ca 与Mg ,使之尽量多地释放出原代肝细胞;并改进了无血清培养体系,拓展了所获原代肝细胞的科学用途;此外,该发明与以往方法相比缩短了操作时间,有效地提高了原代畜禽肝细胞的数量、活率和纯度,且损伤少,易贴壁,细胞特性完好,分离效果良好。
[0013] 本发明所用试剂均在安全剂量范围之内,且经无菌处理,不会造成肝细胞分离过程中的污染问题,给后续研究引入外源性的有害物质。
[0014] 本发明工艺流程相对简单,器械设备易得,可操作性强,便于实现科学实验。
[0015] 实施例11、仔猪肝细胞的分离与纯化
选取7日龄健康长白仔猪1头,术前自由饮水并禁食过夜,腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉;
采用75%酒精浸泡后的纱布擦拭仔猪全身,将麻醉仔猪仰卧位保定在小动物手术台上(手术台放在大瓷盘上),转入超净工作台内;
无菌条件下打开腹腔,轻轻把肠道拉向躯体右侧,暴露肠系膜静脉,适度结扎下腔静脉两端,并在其中汇入肝门静脉方向插管(输液管钝性去针头部分),然后将插管与静脉绑紧形成通路;
进行灌流分离:第一步为消化前灌流,分为两部分:第一部分以1400IU/kg剂量肝素钠吸入50ml注射器,并混入灌流液 (含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA)注入肝脏组织进行血液抗凝,然后第二部分以37℃预热的灌流液 按 50ml/min的速率灌注,待肝脏稍为鼓胀时剪开下腔静脉胸段,持续大约15min(以流出物无或少红细胞为宜),接着以同样速率灌注37℃预热的灌流液 (含10mM HEPES、
137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O),持续5min(以肝脏变成黄白,且组织较为松散为宜);
待流出的液体变清后,进行第二步消化灌流,即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 (含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶),并用止血钳适当夹住已剪开的下腔静脉胸段,使灌流液经肝脏组织循环后缓慢流出,15min后肝脏逐渐被消化;
轻微触动肝脏被膜,表现比较松软后,开始摘取肝脏,去除胆囊,放入一无菌平皿中,加入50ml预冷的基础培养液,剔除血管、脂肪和结缔组织,剪去肝脏周边消化不完全的部分;
用镊子撕掉肝脏包膜,剪碎肝组织,大口径吸管轻轻吹打,随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及400目(30μm)细胞筛,所得肝细胞悬液用基础培养液清洗2次
10
(4℃ 500rpm离心5min),台盼蓝拒染法检测细胞活率为96%,细胞总数(3.2±1.8)×10 ;
用贴壁培养液【含10%新生牛血清、1×SITE(Sigma-Aldrich公司,含10µg/ml牛-8 -6 -6
胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)、10 M人胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml 维生素C、双抗(100IU/ml青霉素及100IU/ml链霉素,Gibco公司)的基础培养液】重悬,稀释到实验所需细胞浓度接种。
[0016] 2、仔猪肝细胞的原代培养5
细胞计数后,用贴壁培养液将细胞悬液稀释为3×10 个/ml,在6孔板中接种2ml;96孔板中接种100µl,置于37℃、5%CO2与饱和湿度的条件下的细胞培养箱内培养。4h细胞贴壁后,用生长培养液(含5%新生牛血清及100IU/ml双抗的基础培养液)全量换液,尽-7
量去除死细胞与组织碎片,继续培养20h。此后,用无血清培养液(含5×10 M地塞米松、-8
1×SITE(Sigma-Aldrich公司,含10µg/ml牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)、10µg/ml维生素C、0.15%BSA和100IU/ml双抗的Williams’ medium E基础培养液)全量换液,以后每24h更换培养液,定时进行倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况,并拍照记录。
[0017] 3、仔猪原代肝细胞的糖原鉴定取上述无血清培养液培养48 h(接种后第3 d)的肝细胞进行糖原染色鉴定。具体操作步骤如下:
吸去培养液,加入Carnoy’s液室温固定细胞15 min后弃液,加入95%酒精,5 min;
弃液,加入70%酒精15 min后弃液,加入0.8%过碘酸酒精溶液氧化,10 min;
蒸馏水洗2 min后,加入Schiff’s酒精混合液,10 min;
弃液后,加入0.5%偏亚硫酸钠溶液,2 min后蒸馏水再洗2 min;
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核,20 min;
以0.5%盐酸酒精分色,自来水蓝化10 min;
95%酒精及100%酒精分别脱水2 min;
二甲苯透明,树胶封片,倒置显微镜下观察。
[0018] 实施例21、鸡原代肝细胞的分离与纯化
选取健康青年岭南黄鸡1羽,术前禁食3h,翅静脉注射1750IU/kg剂量肝素钠抗凝,腹腔注射戊巴比妥钠(50mg/kg)进行麻醉动物;
将麻醉鸡只仰卧位保定在小动物手术台上(手术台放在大瓷盘上),75%酒精擦拭鸡只全身,转入超净工作台内,无菌条件下打开腹腔,轻轻把肠道拉向躯体左侧,暴露肠系膜静脉,在其中一条直接汇入肝门静脉的肠系膜后静脉中插管(5号头皮针去掉针头),结扎另一条流向肝脏的静脉;
第一步为消化前灌流,分为两部分:第一部分以50ml/min的速率灌注37℃预热的灌流液(含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O和5mM EDTA),待肝脏稍鼓胀时剪开后腔静脉,持续9min,第二部分以同样速率灌注37℃预热的灌流液 (含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl和3mM Na2HPO4.12H2O),持续3min;待流出的液体变清后,进行第二步消化灌流,即以20ml/min速率灌入37℃预热的灌流液 (含10mM HEPES、137mM NaCl、3mM KCl、3mM Na2HPO4.12H2O、5mM EDTA、5.4mM CaCl2和0.4g/L 型胶原酶),并用止血钳适当夹住已剪开的后腔静脉,使灌流液缓慢流出,用37℃温热的无菌纱布覆盖肝脏,并轻轻揉动肝脏以利于消化,15min后肝脏逐渐消化,压下凹陷不易恢复;
摘取肝脏,放入一无菌平皿中,加入50ml预冷的含0.2%BSA的基础培养液,剔除血管、脂肪和结缔组织,剪去肝脏周边消化不完全的部分,用镊子撕掉肝脏包膜,剪碎肝组织,大口径吸管轻轻吹打,随后分别过100目(150μm)、200目(75μm)及500目(30μm)细胞筛;
将所得肝细胞悬液用基础培养液清洗2次(4℃ 500rpm离心2min),用贴壁培养-6 -6
液(含10%新生牛血清、10 M人胰岛素、10 M地塞米松、10 µg/ml人转铁蛋白、10 µg/ml Vit C、双抗(100U/ml青霉素及100µg/ml链霉素,Gibco公司)的基础培养液)重悬,台盼
8
蓝拒染法检测细胞活率为94%,细胞总数(4.3±0.7)×10。
[0019] 2、鸡原代肝细胞的培养5
细胞计数后,用贴壁培养液将细胞悬液稀释为5×10 个/ml,在直径为60mm的平皿中
5 2
接种4ml (接种密度为1×10 个/cm),在37℃、5%CO2和饱和湿度的条件下培养。4h细胞贴壁后,用生长培养液(含7%新生牛血清及双抗的基础培养液)全量换液,继续培养20h。
-7
此后,用无血清培养液(含5×10 M地塞米松、1×SITE(Sigma-Aldrich公司,含10µg/ml-8
牛胰岛素、5.5µg/ml人转铁蛋白、2.9×10 M亚硒酸钠、2µg/ml乙醇胺)、10µg/ml维生素C、
0.15%BSA和双抗的基础培养液)全量换液,以后每24h更换培养液,倒置显微镜下观察肝细胞形态及生长情况。
[0020] 3、鸡原代肝细胞培养后糖原染色鉴定取无血清培养液培养72 h(接种后4 d)的肝细胞样品,吸去平皿内的培养液,加入Carnoy’s 液室温下固定细胞15min;
弃液,加入95%酒精5min,70%酒精15min回水;
弃液,加入0.8%过碘酸酒精溶液氧化10min,蒸馏水速洗;
加入Schiff’s酒精混合液(量取2.9ml Schiff’s试剂、0.125ml 1N HCl和7ml
100%酒精混合,用前现配)作用10min进行糖原染色;
弃液,加入0.5%偏亚硫酸钠溶液去色2min,用自来水和蒸馏水先后速洗;
加入Ehrlich’s苏木精复染细胞核20min,以0.5%盐酸酒精分色,自来水蓝化
10min;
95%酒精及100%酒精分别脱水1min,二甲苯透明,树胶封片,倒置显微镜下观察并拍照。
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