인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 가지는 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 및 이의 이용{Burkholderia ambifaria CJ4 strain Possessing antifungal activity against Root Rot Pathogen of ginseng and Use Thereof}

본 발명은 인삼뿌리썩음병에 대한 항균활성을 가지는 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 및 이의 이용에 관한 것으로, 보다 상세하게는 인삼뿌리썩음병을 유발하는 것으로 알려진 다양한 병원균에 대한 항균활성을 가지는 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 균주, 상기 균주 배양액을 유효성분으로 함유하는 인삼뿌리썩음병원균 방제용 미생물제제 및 상기 미생물제제를 이용하여 인삼뿌리썩음병원균을 방제하는 방법에 관한 것이다.

고려인삼은 우리나라 고유의 중요한 천연자원으로서, 수 천년 전부터 영약 또는 선약으로 동양의학적으로는 물론 인류의 보건을 위해 오늘날까지 널리 사용되고 있는 한국의 대표적인 생약이다. 합성의약품의 부작용과 난치성 질병의 극복에 서양의학이 한계를 보임에 따라, 인삼을 비롯한 생약재 및 천연물에 대한 가치가 새롭게 부각되고 있다. 인삼은 암을 예방하고, 노화를 억제하며, 간장을 보호하고, 피로회복과 뇌기능을 강화하며, 최근에는 환경호르몬의 피해를 막아준다는 보고도 있다. 모든 생약재 중에서 으뜸인 인삼은 극히 제한된 환경에서 자라는 식물로서 다른 작물에 비하여 생육기간이 길고 재배방법 또한 특수하고 까다로워 지금까지 세계의 몇몇 나라에서만 생산되고 있다.

한국은 기후풍토가 인삼의 자생과 재배지로 알맞아 약효가 탁월한 고려인삼을 생산하는 인삼 종주국이다. 그러나 인삼이 건강식품 또는 보건의약품으로서 갖추고 있는 이상적인 조건에 대하여 많은 국가들의 관심이 높아지고, 기존의 인삼생산국 뿐만 아니라 비생산국도 경쟁적으로 인삼의 연구와 생산을 장려하는 정책을 적극 펼쳐 나가고 있는 추세이다. 인삼을 재배하는 나라는 한국을 비롯한 중국, 일본, 미국, 유럽 일부 지역이며, 인삼을 소비하는 나라는 과거에는 그 대부분이 유교 문화권으로 한국, 중국, 일본, 대만 및 동남아 등이었으나 세계 각국에 인삼소비층이 확대되고 있다. 하지만, 고려인삼은 가격면에서 국제경쟁력이 약화되고 있는 실정이며, 국제경쟁력을 강화하기 위해서는 원료삼인 수삼품질 향상을 위한 재배기술 개발 연구가 필요하다. 특히 최근 인삼재배시 가장 시급한 문제점은 적정예정지의 절대부족, 산지토양 조건 악화로 인한 높은 발병율, 이에 따른 농약 사용량의 증가로 인한 잔류 농약으로 인해 수출하지 못하는 예가 많으므로 무농약 원료삼의 안전한 다수확 생산방법에 관한 집중연구가 시급히 요구되고 있다. 한편, 인삼재배에 있어서 중요하게 여기는 인삼뿌리썩음 증상(인삼 근부 증상)은 연작지뿐만 아니라 초작지에서도 관찰이 되고 있으며 근부 증상은 묘삼 식부 후 고년근으로 재배되면서 출아 및 잔존율을 떨어뜨리게 하는 원인중의 하나일 것으로 생각된다. 실제로 농가에서 식부한 묘삼은 5년 후 수확시에는 약 50% 이하의 잔존율을 나타내는 것이 보통이다. 그 이유는 초작재배중 인삼 뿌리를 썩히는 부위에서 근부병원균들이 서식하고 있기 때문이다. 이와 같이 초작지에서 근부병원균에 의해 인삼이 피해를 받은 후 연작으로 인삼을 재배할 때 토양내에서 잔존 근부병원균의 후막포자 등이 예정지 관리시 7-10회 기경 및 로타리 작업으로 토양에 균일하게 분포되면 더욱 인삼에 피해를 일으킬 것으로 판단된다. 실제로 뿌리썩음의 원인으로는 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ), 푸사리움 소라니( Fusarium solani ), 피시윰( Pythium sp.), 파이토프토라 캑토럼( Phytophthora cactorum ), 어위니아 카로토보라( Erwinia carotovora )등에 의한 병해가 단독으로 또는 복합적으로 크게 관여한다고 보고되어 있다 (인삼재배, 표준영농교본 p 103, 농촌진흥청, 2000). 또한, 인삼의 지상부병의 원인으로는 유묘의 지상부에 발병하는 모잘록병의 원인인 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani ) 및 피시윰( Pythium sp.) 및 점무늬병의 원인인 알터나리아 파낙스( Alternaria panax ) 등에 의해 피해를 받기 때문에 문제시되고 있다. 이러한 병해의 방제법으로는 토양내 병원균의 밀도를 감소시키거나 발병을 억제시키기 위한 유기물 사용 등을 통한 예정지 관리와 토양훈증제를 이용한 화학적방제가 시도중이며, 답전 윤환의 논삼 재배법 등에 의한 경종적 방제가 실시되고 있다.

그러나 이상의 방제법으로는 뚜렷한 효과를 거두기 어렵고 인삼뿌리썩음병 등과 같은 토양전염성 병원균들은 토양중에 후막포자를 형성하면서 병을 일으키므로 방제가 거의 불가능하다. 토양훈증제의 사용은 토양 생태계의 파괴로 5년간에 병원균이 우점할 위험성도 있다. 특히 인삼의 주요 토양병들은 다양한 온도범위에서 감염이 성립되므로 한번 감염되면 비록 병의 진전은 느리지만 연중 피해를 받게 된다. 따라서 효과적인 토양병 방제를 위해서는 인삼재배 특성상 병방제 효과가 지속적이고 환경에 안정적인 인삼병의 방제 대책으로 생물학적 방제가 가장 적합하리라 생각되며 이에 관해 국내에서 인삼뿌리썩음병균( Cylindrocarpon destructans )에 길항력을 나타내는 스트렙토마이세스 종들( Streptomyces species)의 동정과 길항작용에 관해 보고된 바 있다 (제 2차 세계인삼심포지움 논문집, 정후섭, 김충희, p 67-74, 1978, 고려인삼연구소).

현재까지 인삼뿌리썩음병을 방제하기 위한 방안으로 길항미생물을 이용한 생물학적 방제법과 특히 연작지의 경우 사이론, 밧사미드 등 토양훈증제를 이용한 화학적 방제법 및 답전 윤환의 논삼재배법등 경종적 방법이 사용되고 있으나, 현재까지 그 방법이 체계화되어 있지 않은 실정이다. 특히, 인삼 토양병에 대한 지금까지의 생물학적 방제연구는 길항미생물 선발과 포장처리 효과검정등에 대해 주로 수행되어 왔지만 다양한 근권토양 환경에 대한 이해부족, 대상병원균에 대한 선발균주의 항균력이 높지 않거나 균제제 방법 또는 처리방법의 미비로 토양이나 종묘에서의 균 정착능력이 떨어지는 등 인삼뿌리썩음병에 대한 방제 효과가 뛰어난 길항 미생물이 발견되지 않고 있다.

이에, 본 발명자들은 인삼뿌리썩음병을 유발하는 병원균에 대한 높은 항균활성을 갖는 미생물을 선별하고자 예의 노력한 결과, 인삼뿌리썩음병원균에 대한 높은 항균활성을 가지는 버크홀데리아 암비파리아 균주를 선별하였으며, 인삼뿌리썩음병을 유발하는 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ) 병원균뿐만 아니라, 보트리티스 시네레아 ( Botrytis Cinerea ), 푸사리움 소라니( Fusarium solani ), 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani ) 등과 같은 다양한 인삼뿌리썩음병원균에 대한 높은 항균활성을 가지는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명은 상기와 같은 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 본 발명의 첫번째 해결하려는 과제는 인삼뿌리썩음병원균, 인삼모잘록병을 유발하는 병원균 및 인삼잿빛곰팡이병을 유발하는 병원균에 대해 항균활성을 가지는 버크홀데리아 암비파리아 균주를 제공하는 것이다.

본 발명의 두번째 해결하려는 과제는 상기 균주, 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 포함하는 미생물 제제 및 상기 미생물제제를 이용하여 인삼뿌리썩음병원균을 방제하는 방법을 제공하는 것이다.

상술한 본 발명의 첫번째 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 기탁번호 KACC 92097P의 버크홀데리아 암비파리아 균주를 포함한다. 본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 균주는 인삼뿌리썩음병을 유발하는 병원균, 인삼모잘록병을 유발하는 병원균 및 인삼잿빛곰팡이병을 유발하는 병원균에 대한 항균활성을 가질 수 있다.

본 발명의 바람직한 다른 실시예에 따르면, 상기 인삼뿌리썩음병을 유발하는병원균은 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ), 보트리티스 시네레아( Botrytis Cinerea ), 푸사리움 소라니( Fusarium solani ) 및 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani )로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 포함할 수 있다.

본 발명의 바람직한 또 다른 실시예에 따르면, 상기 균주는 pH 5 내지 7 및 20 내지 40 ℃ 온도를 최적의 생육 조건으로 갖는 것일 수 있다.

두번째 과제를 해결하기 위해 본 발명은, 상기 기탁번호 KACC92097P의 버크홀데리아 암비파리아 균주, 그의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 이용하는 것을 특징으로 하는 인삼뿌리썩음병 방제 방법를 포함한다.

본 발명의 바람직한 일실시예에 따르면, 상기 배양액은 상기 균주를 LB 배지, NB 배지, BHI 배지, KB(King'B) 또는 TSB 배지로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 배지에서 15℃ 내지 35℃에서 배양하여 수득할 수 있다.

본 발명의 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 가지는 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 은 다른 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 가지는 미생물에 비하여 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성이 우수한 효과가 있으며, 다양한 인삼뿌리썩음병원균에 대한 높은 항균활성을 가지므로, 버크홀데리아 암비파리아 균주, 상기 균주의 배양액 및 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인삼뿌리썩음병원균 방제용 미생물 제제, 상기 미생물 제제를 이용한 인삼뿌리썩음병원균 방제방법을 제공하는 효과가 있다.

도 1은 본 발명에서 선별한 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 가지는 CJ4 균주의 분리 및 배양 특성을 나타낸 결과이다.
도 2는 본 발명에서 선별한 CJ4 균주의 pH 조건에 따른 생육 특성을 확인한 결과이다.
도 3은 본 발명에서 선별한 CJ4 균주의 온도 조건에 따른 생육 특성을 확인한 결과이다.
도 4는 본 발명에서 선별한 CJ4 균주의 인삼뿌리썩음병원균 균사 생육 억제효과를 확인한 결과이다.
도 5는 본 발명에서 선별한 CJ4 균주의 인삼뿌리썩음병원균 균사 생육 억제효과 및 포자발아 억제효과를 확인한 결과이다.
도 6은 본 발명에서 선별한 CJ4 균주의 인삼모잘록병원균 균사 생육 억제효과를 확인한 결과이다.

이하, 본 발명을 보다 상세히 설명한다.

상술한 바와 같이, 인삼뿌리썩음병을 방제하기 위한 방안으로 길항미생물을 이용한 생물학적 방제법과 특히 연작지의 경우 사이론, 밧사미드 등 토양훈증제를 이용한 화학적 방제법 및 답전 윤환의 논삼재배법등 경종적 방법이 사용되고 있으나, 현재까지 그 방법이 체계화되어 있지 않은 실정이며, 근권토양 환경에 대한 이해부족, 대상병원균에 대한 선발균주의 항균력이 높지 않거나 균제제 방법 또는 처리방법의 미비로 토양이나 종묘에서의 균 정착능력이 떨어지는 등 인삼뿌리썩음병에 대한 방제 효과가 뛰어난 길항 미생물이 발견되지 않은 문제점이 있다.

본 발명은 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 가진 버크홀데리아 암비파리아 균주를 제공함으로써 상술한 문제의 해결을 모색하였다. 이를 통해, 다양한 인삼뿌리썩음병원균의 생장을 효과적으로 억제할 수 있는 버크홀데리아 암비파리아 균주, 이의 배양액 및 이들의 혼합물의 유효성분으로 포함하는 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물 제제 및 인삼뿌리썩음병 방제 방법을 제공하는 효과가 있다.

따라서, 본 발명은 기탁번호 KACC92097P의 버크홀데리아 암비파리아 균주를 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 균주는 인삼뿌리썩음병을 유발하는 병원균, 인삼모잘록병을 유발하는 병원균 및 인삼잿빛곰팡이병을 유발하는 병원균으로 이루어지는 군에서 선택되는 어느 하나 이상에 대한 항균활성을 가지는 것일 수 있다. 상기 인삼뿌리썩음병을 유발하는병원균은 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ), 보트리티스 시네레아 ( Botrytis Cinerea ), 푸사리움 소라니( Fusarium solani ) 및 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani )로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상일 수 있다. 또한, 인삼모잘록병원균을 유발하는 병원균으로는 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani ) 또는 피씨움 속 균( Phythium spp.) 일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서는 인삼 연작장해에 주요 원인균으로 알려져 있는 인삼뿌리썩음병원균인 실린드로카폰 디스트럭턴스 ( Cylindrocarpon destructans )를 효과적으로 방제할 수 있는 길항균을 선별하기 위해 100여개의 인삼시료에서 200여 종의 균주를 분리하였으며, 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans )에 대해 특이적으로 항균활성을 가지는 CJ4 균주를 선별하였다.

상기 선별된 CJ4 균주의 항균활성을 확인하기 위해, 실린드로카폰 디스트럭턴스의 공시된 균주인 12hon 1-6, 12 Poc2-7 및 12Yeol-3에 대한 균사 생육억제 정도를 확인한 결과, 표 2 및 도 4에 나타난 바와 같이 모든 실린드로카폰 디스트럭턴스 균주의 생육을 억제하는 것을 확인하였으며, 인삼뿌리썩음병을 유발하는 다른병원균인 보트리티스 시네레아 ( Botrytis Cinerea ), 푸사리움 소라니( Fusarium solani ) 및 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani )에 대해서도 균사생육 억제 효과를 보이는 것을 확인하였다.

본 발명에서는 본 발명에서 선별한 CJ4 균주의 높은 항균활성이 유지되는 최적 배양 조건을 확립하기 위해 선발 균주의 배양 조건을 조사하였다.

그 결과, 도 2에 나타난 바와 같이, pH 4 이하 또는 pH 9 이상에서는 균이 생존하지 못하였으며, pH8 이상에서도 잘 생존하지 못하는 것으로 나타났다. 그러나, pH 5 내지 7에서는 균이 잘 배양되는 것으로 확인되었다.

또한, 도 3에 나타난 바와 같이, 15℃의 온도에서는 균이 잘 자라지 못하였으나 그 이상의 온도에서는 잘 자라는 것으로 확인되었다. 따라서, CJ4 균을 배양하기에 최적의 온도는 20 내지 40 ℃ 일 수 있으며, 더욱 바람직하게는 25 내지 40 ℃일 수 있다.

상기 20℃ 미만의 온도에서 배양할 경우, 균사생육이 아주 느려 장시간 배양해야 할 문제가 발생할 수 있으며, 40 ℃를 초과하는 온도에서 배양할 경우, 급격한 균사생육 억제와 장기간 배양시 균주 사멸의 문제가 발생할 수 있다.

본 발명에서는 상기 선별한 균주를 동정하기 위해 16S rRNA 서열을 분석한 결과, CJ4 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 가지며, 버크홀데리아 암비파리아( Burkholderia ambifaria ) 종에 해당하는 것을 확인할 수 있었으며, 상기 균주를 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 (이하 'CJ4 균주'로 표기)로 명명하였으며, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다 (기탁번호 KACC92097P).

본 발명은 또한, 기탁번호 KACC92097P의 버크홀데리아 암비파리아 균주, 상기 균주의 배양액 또는 이들의 혼합물을 유효성분으로 포함하는 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물 제제 및 상기 미생물 제제를 이용하는 인삼뿌리썩음병 방제 방법을 포함한다.

본 발명에 있어서, 상기 배양액은 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 균주를 LB 배지, NB 배지, BHI 배지, KB(King'B) 또는 TSB 배지로 구성된 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 배지에서 배양할 수 있으나, 본 발명의 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 의 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 높게 유지시킬 수 있는 배지라면 제한 없이 사용할 수 있다.

상기 배양액은 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 균주를 20℃ 내지 40℃에서, 바람직하게는 25℃ 내지 40℃ 범위인 것이 좋으나, 반드시 이에 제한되는 것은 아니며, 본 발명의 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 의 인삼뿌리썩음병원균에 대한 항균활성을 높게 유지시킬 수 있는 조건이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 배양은 pH 5.0 ~ 7.0에서 배양할 수 있으며, 보다 바람직하게는 pH 5.7 ~ 6.8에서 배양할 수 있다.

하지만, 상기 20℃ 미만의 온도에서 배양할 경우, 균사생육이 아주 느려 장시간 배양해야 할 문제가 발생할 수 있으며, 40 ℃를 초과하는 온도에서 배양할 경우, 급격한 균사생육 억제와 장기간 배양시 균주 사멸의 문제가 발생할 수 있다.

게다가, 만약, pH 5.0 미만의 pH에서 배양할 경우, 생육이 저조하여 배양시간이 길어지는 문제가 발생할 수 있으며, pH 7.0을 초과하는 pH에서 배양할 경우, 생육이 급격하게 느려져 장시간 배양의 문제가 발생할 수 있다.

상기 본 발명의 버크홀데리아 암비파리아 균주를 포함하는 방제제는 인삼뿌리썩음병 예방 및 치료를 위해 사용되는 통상의 방제제라면 특별히 제한하지 않으나, 바람직하게는 미생물농약, 종자코팅제, 인삼의 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물농약, 인삼재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 바이오상토, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제로 이루어진 군 중 1종 이상일 수 있다.

특히, 인삼 배양시 문제가 되는 인삼뿌리썩음병원균인 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ), 보트리티스 시네레아 ( Botrytis Cinerea ), 푸사리움 소라니( Fusarium solani ) 및 라이족토니아 소라니( Rhizoctonia solani )의 성장억제에 탁월한 효과가 있어, 인삼의 인삼뿌리썩음병 방제용 미생물 농약, 인삼재배용 무살균 배지제조를 위한 첨가제, 바이오상토의 제조에도 활용될 수 있다.

상기 미생물농약은 본 발명의 버크홀데리아 암비파리아 균주를 포함하여 통상의 방법으로 제조된 것이라면 특별히 제한하지 않는다.

예를 들면, 버크홀데리아 암비파리아 균주 및 미생물 담체인 바이오 매트릭스를 포함하는 것일 수 있으며, 상기 바이오 매트릭스는 식물자원 고분자 재료, 미생물 기원 생체 고분자 재료, 영양제, 보조 재료 및 첨가제를 포함할 수 있다.

또한, 상기 식물자원 고분자 재료는 감자가루, 콩가루, 전분가루 등을 포함할 수 있으며, 상기 미생물기원 생체 고분자는 뮤코폴리사카라이드, 폴리-베타하이드록시-알카노에이트 및 응집제를 포함할 수 있다. 나아가, 상기 영양제는 포도당, 펩톤 및 무기염류를 포함할 수 있으며, 상기 보조 재료는 질석, 왕겨 태운가루 등을 포함할 수 있고, 상기 첨가제는 증량제, UV 차단제, 계면활성제를 포함할 수 있다.

상기 미생물농약은 항진균 미생물농약, 종자 코팅제, 미생물영양제, 토양개량제, 퇴비부숙제, 엽면살포제 또는 관주살포제 등으로 사용될 수 있다.

이하 본 발명을 바람직한 실시예를 참고로 하여 본 발명이 속하는 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자가 용이하게 실시할 수 있도록 상세히 설명한다. 그러나 본 발명은 여러 가지 상이한 형태로 구현될 수 있으며 여기에서 설명하는 실시예에 한정되는 것은 아니다.

인삼뿌리썩음병원균에 대한 길항균 분리

본 발명에서는 인삼 뿌리썩음병을 일으키는 주요 병원균인 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans )의 방제에 효과적인 길항균을 분리하기 위하여 2015년 인삼 재배지와 연작지로부터 5~6년근 인삼 100 여개의 시료를 채집하여 200여종의 내생균을 분리하였다.

먼저, 인삼 뿌리를 1% NaOCl에 10분 간 표면 소독하고 멸균 증류수로 2회 세척하고 무균작업대에서 20분간 표면을 충분히 건조하였다. 멸균된 칼을 이용하여 인삼뿌리를 가로로 절단하고 인삼 조각을 King'B 배지 위에 올려 놓고 배양기에서 25℃ 온도 조건에서 1주일간 배양 하였다. King'B 배지위에 자라 나온 형태적으로 차이는 보이는 집락을 대상으로 순수 분리하였다. 그 다음 30℃ 온도 조건에서, LB 배지에 2일간 배양하면서 형태적인 특징을 확인하였다. 순수 분리한 균주를 LB 배지에 접종하여 30℃, 200rpm에서 1일간 배양한 다음 균주 배양액에 멸균된 20% 글리세롤(glycerol)을 첨가하여 보관균주를 제작한 다음 실험에 사용하였다.

상기와 같은 방법으로 100 개의 인삼 시료에서 200 여 종의 균주를 분리하였으며, 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ) 균주에 대한 항균능력을 조사하여 인삼뿌리썩음병원균에 특이적으로 항균활성을 갖는 그림음성 세균인 CJ4 균주를 선발하였다. 선발한 CJ4 균주는 LB 배지 위에서 자라나온 집락에 진황색의 색소를 띄는 특징을 가지고 있었다(도 1).

선발된 CJ4 균주의 동정

본 발명의 실시예 1에서 선별한 CJ4 균주를 동정하기 위하여 분자생물적 방법을 이용하였다.

먼저, 실시예 1에서 선별한 CJ4 균주를 LB 배지 20 ㎖에 접종하여 30℃에서 1일간 배양 한 후 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 균체를 수확하였다.

퀴아젠 지노믹 DNA 추출 키트(Qiagen Genomic DNA Extraction Kit; Qiagen, 독일)를 이용하여 수확한 균체에서 지노믹 DNA(genomic DNA)를 분리하였다. 16S rRNA 유전자 부위를 증폭하기 위하여 하기 표 1의 일반적인 프라이머(universal primer) 27F 및 1492R(마크로젠, 한국)를 이용하여 PCR을 수행하였다.

PCR 산물은 QIAquick PRC purification kit(Qiagen, 독일)를 이용하여 정제하였으며 염기서열 분석은 (주) 마크로젠에 의뢰하여 분석하였으며, 미국 국립생물정보센터(National Center for Biotechnology Information; NCBI)에서 블라스트 서치(Blast search)를 통해 균주를 동정하였다.

선발한 균주의 동정을 위하여 16S rRNA 유전자를 분석 한 결과, CJ4 균주는 서열번호 1의 16S rRNA 염기서열을 가지는 것을 확인하였다.

NCBI 웹에서 상동성 분석을 한 결과, 버크홀데리아 암비파리아( Burkholderia ambifaria ) IHB B 1065(GenBank No. KF475832)과 99%의 높은 상동성을 보이는 것을 확인하였으며, 본 발명의 CJ4 균주는 버크홀데리아 암비파리아( Burkholderia ambifaria ) 종에 해당하는 것을 확인하였다.

이에, 본 발명에서는 CJ4 균주를 버크홀데리아 암비파리아 CJ4 (이하 'CJ4 균주'로 표기)로 명명하였으며, 국립농업과학원 농업유전자원센터에 기탁하였다 (기탁번호KACC92097P).

3-1. pH 조건에 따른 CJ4 균주의 생육 특성 확인

내생균의 생육 특성을 확인하기 위하여, 1N KCl 과 1N NaOH를 이용하여 LB 배지의 pH를 4에서 9까지 조정하였다. CJ4 균주를 LB Agar에서 30℃, 1일간 배양한 다음 20 ㎖ LB 배지에 접종하여 전배양하였다. 배양액 20 ㎕를 pH 별로 조정한 LB배지 20 ㎖에 접종하고 37℃에서 1일간 배양하면서 균의 생육을 확인하였다.

내생균 B. ambifaria 의 pH 조건에 따른 균의 생육 특성을 확인하기 위하여, LB배지에서 35℃, 200rpm으로 배양한 결과, pH 4와 9에서 균의 생장이 전혀 되지 않았으며, 최적 pH 조건은 pH 6으로 확인되었다. 24시간 후에 pH6, OD ₆₀₀ nm에서 1.52 로 가장 높은 생육을 확인하였다(도 2).

3-2. 온도 조건에 따른 CJ4 균주의 생육 특성 확인

온도 조건에 따른 배양특성을 조사하기 위하여 LB Agar에서 30℃, 1일간 배양한 다음 20 ㎖ LB 배지에 접종하여 전배양 하였다. 배양액 20 ㎕를 LB배지 20 ㎖에 접종하고 온도 조건별로 배양하면서 균의 생육을 확인하였다.

온도 조건에 따른 CJ4 균의 생육을 조사한 결과, 생육 적온은 35℃로 확인 되었으며, 접종 후 8시간 후에 OD ₆₀₀ nm에서 0.822로 생장하였다. 24시간 후에 1.87로 10 log CFU/㎖ 까지 생장하였다. 25℃에서는 초기 생장 속도가 낮았으나 24시간 후에는 35℃ 온도와 생육에 차이가 나타나지 않아, 25℃에서도 생육이 양호한 것으로 확인되었다(도 3).

4-1. 인삼뿌리썩음병원균에 대한 CJ4 균주의 항균활성 측정

본 발명에서는 실시예 1에서 선별한 CJ4 균주의 항균활성을 확인하기 위해 인삼뿌리썩음병의 주병원균인 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ) 균주는 국립원예특작과학원 인삼과에서 분리 동정되고 병원성이 확인된 균주 12POC 2-7, 12HON1-6과 12YEO1-3 를 사용하였으며, 인삼뿌리썩음병을 일으키는 Botrytis cinerea 와 Fusarium solani 균주도 국립원예특작과학원 인삼과에서 분리 동정되고 병원성이 확인된 균주를 항균활성 검정에 사용하였다.

먼저, 실시예 1에서 선별한 CJ4 균주를 LB 배지 20 ㎖에 접종하여 30℃, 180 rpm의 조건으로 1일간 배양하였으며 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배양액과 상등액을 준비하였다. 배양액 10 ㎕를 PDA 중앙에 떨어뜨린 다음 10분간 표면을 건조시켰다. 각각의 인삼뿌리썩음병원균은 PDA(potato dextrose agar)배지에서 20℃, 10일간 배양하였으며, 8mm 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 균사 조각을 만든 후 PDA 위에 올려놓고 25℃에서 대치배양하였다. 그 후, 1주일 후에 균사 생육 정도를 확인하였다.

또한, 인삼뿌리썩음병원균의 포자발아 억제를 조사하기 위하여, CMC(CMC(carboxymethylcellulose) 배지에 C. destructans 12POC2-7 균사 조각을 접종하여 포자를 형성시킨 다음, 멸균 거즈로 포자를 회수하였다. PDA배지위에 5 log CFU/㎖ 농도의 포자현탁액 100 ㎕를 도말한 다음, CJ4 균주 배양액 10 ㎕를 떨어뜨리고 10분간 건조 한 다음 25℃ 온도에서 1주일 간 배양하면서 포자발아 억제를 조사하였다.

그 결과, 표 2, 도 4 및 도 5에 나타난 바와 같이, CJ4 균주는 실린드로카폰 디스트럭턴스( Cylindrocarpon destructans ) 균주의 3종(12honl-6, 12Poc2-7, 12Yeol-3)에 대해 모두 항균활성을 보였으며(도 4 참조), 특히 12Yeol-3 균주에 대해서 10.82 ㎜의 생육 저지원을 형성하여 제일 높은 항균활성을 보이는 것을 확인하였다. 또한, 인삼뿌리썩음병을 일으키는 다른병원균인 보트리티스 시네레아( Botrytis Cinerea ) 및 푸사리움 소라니( Fusarium solani )에의 균사 생육 억제 정도를 조사한 결과 각각 12mm, 6mm 이상의 생육 저지원을 형성하여 이들 병원균에도 본 발명의 CJ4 균주에 의한 균사생육 억제 효과가 있는 것을 확인하였다(도 5a, 5b참조). 또한, 인삼뿌리썩음병원균의 포자발아도 억제하는 것으로 확인되었다(도 5c).

인삼모잘록병원균에 대한 CJ4 균주의 항균활성 측정

본 발명에서는 실시예 1에서 선별한 CJ4 균주의 항균활성을 확인하기 위해 모잘록병을 일으키는 phythium spp. 과 Rhizoctonia solani 균주를 대상으로 항균활성 검정을 수행하였다.

먼저, 실시예 1에서 선별한 CJ4 균주를 LB 배지 20 ㎖에 접종하여 30℃, 180 rpm의 조건으로 1일간 배양하였으며 13,000 rpm에서 10분간 원심분리하여 배양액과 상등액을 준비하였다. 배양액 10 ㎕를 PDA 중앙에 떨어뜨린 다음 10분간 표면을 건조시켰다. 각각의 인삼모잘록병원균은 PDA(potato dextrose agar)배지에서 20℃, 10일간 배양하였으며, 8mm 코르크 보러(cork borer)를 이용하여 균사 조각을 만든 후 PDA 위에 올려놓고 25℃에서 대치배양하였다. 그 후, 1주일 후에 균사 생육 정도를 확인하였다.

그 결과, 표 3 및 도 6에 나타난 바와 같이, 모잘록병원균인 Rhizoctonia solani 와 phythium spp.에 대해 모두 모두 균사 생육억제 활성을 보였으며, CJ4 균주는 Rhizoctonia solani 균주에 대해 9.76mm 의 생육저지원을 형성하여 높은 항균활성을 갖는 것으로 확인 되었다(표 3).

이상으로, 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.

농업생명공학연구원

KACC92097P

20151019

<110> REPUBLIC OF KOREA <120> Burkholderia ambifaria CJ4 strain Possessing antifungal activity against Root Rot Pathogen of ginseng and Use Thereof <130> 1042467 <160> 3 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 1451 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Burkholderia ambifaria CJ4 strain 16S rRNA <400> 1 ccggcatgcc ttacacatgc aagtcgaacg gcagcacggg tgcttgcacc tggtggcgag 60 tggcgaacgg gtgagtaata catcggaaca tgtcctgtag tgggggatag cccggcgaaa 120 gccggattaa taccgcatac gatcttcgga tgaaagcggg ggaccttcgg gcctcgcgct 180 atagggttgg ccgatggctg attagctagt tggtggggta aaggcctacc aaggcgacga 240 tcagtagctg gtctgagagg acgaccagcc acactgggac tgagacacgg cccagactcc 300 tacgggaggc agcagtgggg aattttggac aatgggcgaa agcctgatcc agcaatgccg 360 cgtgtgtgaa gaaggccttc gggttgtaaa gcacttttgt ccggaaagaa atccttggtt 420 ctaatatagc cgggggatga cggtaccgga agaataagca ccggctaact acgtgccagc 480 agccgcggta atacgtaggg tgcgagcgtt aatcggaatt actgggcgta aagcgtgcgc 540 aggcggtttg ctaagaccga tgtgaaatcc ccgggctcaa cctgggaact gcattgg tga 600 ctggcaggct agagtatggc agaggggggt agaattccac gtgtagcagt gaaatgcgta 660 gagatgtgga ggaataccga tggcgaaggc agccccctgg gccaatactg acgctcatgc 720 acgaaagcgt ggggagcaaa caggattaga taccctggta gtccacgccc taaacgatgt 780 caactagttg ttggggattc atttccttag taacgtagct aacgcgtgaa gttgaccgcc 840 tggggagtac ggtcgcaaga ttaaaactca aaggaattga cggggacccg cacaagcggt 900 ggatgatgtg gattaattcg atgcaacgcg aaaaacctta cctacccttg acatggtcgg 960 aatcctgctg agaggtggga gtgctcgaaa gagaaccggc gcacaggtgc tgcatggctg 1020 tcgtcagctc gtgtcgtgag atgttgggtt aagtcccgca acgagcgcaa cccttgtcct 1080 tagttgctac gcaagagcac tctaaggaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg 1140 atgacgtcaa gtcctcatgg cccttatggg tagggcttca cacgtcatac aatggtcgga 1200 acagagggtt gccaacccgc gagggggagc taatcccaga aaaccgatcg tagtccggat 1260 tgcactctgc aactcgagtg catgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagcatgcc 1320 gcggtgaata cgttcccggg tcttgtacac accgcccgtc acaccatggg agtgggtttt 1380 accagaagtg gctagtctaa ccgcaaggag gacggtcacc acggtaggat tcatgactgg 1440 ggtg aagtct a 1451 <210> 2 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 27F primer <400> 2 agagtttgat cmtggctcag 20 <210> 3 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 1492R primer <400> 3 tacggytacc ttgttacgac tt 22