一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用
阅读：806发布：2022-10-05
专利汇可以提供一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种聚 酮 合成酶基因，尤其涉及一种 真菌 黑色素合成相关的聚酮合成酶基因及其应用，属于基因工程技术领域。一种聚酮合成酶基因，核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。该基因编码的聚酮合成酶， 氨 基酸序列如SEQ ID No.2所示。本发明所述聚酮合成酶基因可用于体外合成黑色素。经检测，体外酶反应液中黑色素含量为35.6g/L。，下面是一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用专利的具体信息内容。
1.一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因，为如下(1)或(2)的DNA分子：
(1)序列表中SEQ ID NO.1所示的DNA分子；
(2)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交且编码聚酮合成酶的DNA分子。
2.由权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因编码的聚酮合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：
(a)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚酮合成酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
3.含有权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因的重组表达载体。
4.如权利要求3所述的重组表达载体，其特征在于，所述重组表达载体为将权利要求1的出芽短梗霉聚酮合成酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。
5.含有权利要求1所述的出芽短梗霉聚酮合成酶基因的表达盒、转基因细胞系或重组菌。
6.如权利要求5所述的重组菌，其特征在于，所述重组菌是将权利要求3或4所述的重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。
7.出芽短梗霉聚酮合成酶基因和/或聚酮合成酶在黑色素体外合成中的应用。
8.一种黑色素体外合成的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组菌，收集发酵上清液，沉淀上清液中的蛋白质，再对蛋白沉淀进行脱盐和浓缩，即得聚酮合成酶粗酶液；将聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合，调节pH至8.0，38～40℃条件下反应，反应期间进行充分供氧，反应40～60分钟；反应结束后，调节pH至2.0～3.0，离心，收集沉淀，得到黑色素粗产物。
9.如权利要求8所述的方法，其特征在于，所述出芽短梗霉粗酶液为出芽短梗霉新鲜菌体经液氮研磨破壁，用磷酸钠缓冲液重溶菌粉，离心，获得的上清液。
10.如权利要求8所述的方法，其特征在于，还包括：将黑色素粗产物进行纯化的步骤，具体如下：将黑色素粗产物溶于NaOH中，加入酸性甲醇(pH＝2)，静置，离心，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，烘干，即得黑色素。
一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因及其应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程领域，具体涉及一种出芽短梗霉(Aureobacidium pullulans)聚酮合成酶基因及其应用。
背景技术
[0002] 黑色素是生物体中广泛存在的保护性色素，具有生物半导体、清除自由基、防紫外线辐射、螯合重金属离子等功能，在日用化妆品工业、食品工业、医药工业、农业等众多领域有重要的用途。按照来源，黑色素可分为动物黑色素、植物黑色素和微生物黑色素；按照化学组成可分为真黑色素(eumelanin)、棕黑色素(phaeomelanin)和异黑色素(allomelanin)。真黑色素含碳、氢、氧、氮，不含硫原子，颜色为深棕色或黑色，主要存在于动物、家禽黑羽或蓝羽、眼、皮肤以及相关的组织中，是酪氨酸经由多巴(Dopa)途径转化聚合生成。棕黑色素含碳、氢、氧、氮、硫原子，颜色为略带红色的棕色和黄色，主要存在于家禽红棕色、浅黄色羽毛、头发和绒毛等组织中，合成途径与真黑色素接近，不同在于胱氨酸或谷胱甘肽参加了合成过程。异黑色素含碳、氢、氧，不含氮、硫原子，颜色为棕色或黑色，主要存在于植物和微生物中，是酚类物质在聚合酶和氧化酶作用下经聚合和氧化形成，研究表明植物和真菌中黑色素多数以二羟基萘(DHN)型黑色素为主要结构骨架。
[0003] 目前黑色素制备主要是从黑豆、黑芝麻等种皮和动物毛发、表皮分离提取，产量低、纯度低、成本高。随着人们对黑色素了解的不断加深，其功能研究与应用范围也日益广阔，使得人们对黑色素的需求量日益增加，仅靠有限的提取不能满足市场需求，迫切需要开发新的获得方法。黑酵母发酵提取与酶法体外合成黑色素具有周期短，能克服气候和产地限制，大大降低生产成本，因而受到广泛关注。
[0004] 聚酮合成酶(polyketide synthase)是一类复杂的多酶体系，目前已发现的聚酮合成酶可大致分为3型，即I型模块型，II型迭代型，III型其他型。III型聚酮合成酶包括1,3,6,8-四羟基萘合成酶、查尔酮合成酶等。DHN型黑色素合成的第一步为聚酮合成酶中的1,
3,6,8-四羟基萘合成酶催化丙二酰辅酶A合成1,3,6,8-四羟基萘，1,3,6,8-四羟基萘依次在小孢柱酮脱水酶(scytalone dehydratase)、羟萘还原酶(HN reductase)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase)作用下合成DHN型黑色素。
3,6,8-四羟基萘合成酶催化丙二酰辅酶A合成1,3,6,8-四羟基萘，1,3,6,8-四羟基萘依次在小孢柱酮脱水酶(scytalone dehydratase)、羟萘还原酶(HN reductase)及多酚氧化酶(polyphenol oxidase)作用下合成DHN型黑色素。
[0005] 但聚酮合成酶基因与DHN黑色素合成相关的报道多集中于细菌中，真菌中有关聚酮合成酶基因与DHN黑色素合成的报道很少，出芽短梗霉在生物分类学上属于霉菌，为真菌的一种，目前很少有关于出芽短梗霉中DHN黑色素合成相关的聚酮合成酶的报道。而且国际上进行黑色素生产研究的聚酮合成酶较少，来源有限，因此，需要开发新的高效合成黑色素的酶源。
发明内容
[0006] 针对上述现有技术，本发明的一个目的是提供一种出芽短梗霉聚酮合成酶基因。
[0007] 本发明提供的出芽短梗霉聚酮合成酶基因，为如下(1)或(2)的DNA分子：
[0009] (2)在严格条件下与SEQ ID NO.1所示的DNA序列杂交且编码聚酮合成酶的DNA分子。
[0010] 上述聚酮合成酶基因来源于出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)3.3984(购于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种编号为3.3984)，基因全长为6492bp。
[0011] 本发明的另一目的是提供由上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因编码的聚酮合成酶。
[0012] 本发明提供的聚酮合成酶，是如下(a)或(b)的蛋白质：
[0013] (a)由序列表中SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列组成的蛋白质；
[0014] (b)将SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列经过一个或几个氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加且具有聚酮合成酶活性的由序列1衍生的蛋白质。
[0015] SEQ ID NO.2所示的蛋白由2163个氨基酸残基组成。
[0016] 含有上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因的重组表达载体也属于本发明的保护范围。
[0017] 所述重组表达载体可用现有的表达载体构建含有所述基因的重组表达载体。
[0018] 所述重组表达载体具体可为将上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因插入到pGAPZα-A表达载体的多克隆位点得到重组质粒。
[0019] 含有上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因的表达盒、转基因细胞系及重组菌均属于本发明的保护范围。
[0020] 所述重组菌可为将所述重组表达载体转化毕赤酵母SMD1168H得到的重组菌。
[0021] 本发明还提供上述出芽短梗霉聚酮合成酶基因和/或聚酮合成酶在黑色素体外合成中的应用。
[0022] 本发明的第三个目的是提供一种黑色素体外合成的方法。
[0023] 本发明提供的方法，包括如下步骤：发酵培养所述重组菌，收集发酵上清液，沉淀上清液中的蛋白质，再对蛋白沉淀进行脱盐和浓缩，即得聚酮合成酶粗酶液；将聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合，调节pH至8.0，38～40℃条件下反应，反应期间进行充分供氧，反应40～60分钟；反应结束后，调节pH至2.0～3.0，离心，收集沉淀，得到黑色素粗产物。
[0024] 所述出芽短梗霉粗酶液为出芽短梗霉新鲜菌体经液氮研磨破壁，50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶菌粉，4000rpm离心5分钟获得的上清液。由于DHN黑色素合成涉及到很多反应步骤，聚酮合成酶粗酶液催化合成1,3,6,8-四羟基萘是反应的第一步，而出芽短梗霉粗酶液包含DHN黑色素合成所需要的多种酶，通过加入出芽短梗霉粗酶液，目的是提供DHN黑色素后续合成所需要的酶，使1,3,6,8-四羟基萘转化为黑色素。
[0025] 本发明提供的方法，还包括：将黑色素粗产物进行纯化的步骤，具体如下：将黑色素粗产物溶于1mol/L NaOH中，加入2倍体积酸性甲醇(pH＝2)，静置4h，6000r/min离心10min后，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，60℃烘干，即得黑色素。
[0026] 本发明的有益效果：
[0027] (1)本发明首次从出芽短梗霉中分离得到聚酮合成酶基因，该聚酮合成酶基因经克隆到pGAPZα-A表达载体上，转化毕赤酵母SMD1168H，获得聚酮合成酶，可用于黑色素体外合成，为黑色素体外合成提供了新的酶源和合成方法。
[0028] (2)本发明还提供了一种体外合成黑色素的方法，通过发酵含有本发明聚酮合成酶基因的重组菌株，得聚酮合成酶粗酶液；再进一步与出芽短梗霉粗酶液、丙二酰辅酶A混合反应，并通过对反应条件的优化，大大提高了体外酶反应合成的黑色素的产量。
[0030] 图1：本发明所述重组聚酮合成酶体外黑色素合成反应产物图；
[0031] 其中，反应前：重组聚酮合成酶粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，反应0分钟。
[0032] 对照组：含空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，38℃反应60分钟；
[0033] 实验组：重组聚酮合成酶粗酶液和出芽短梗霉粗酶液混合后加入0.5mol/L丙二酰辅酶A，38℃反应60分钟。
具体实施方式
[0034] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法。
[0035] 实施例1：出芽短梗霉聚酮合成酶基因的PCR扩增
[0036] 将中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CMGCC)，菌种编号为As3.3984的出芽短梗霉培养液5mL，用RNA提取试剂盒进行总RNA提取，提取步骤参照Takara公司的RNA提取试剂盒说明书。以提取的总RNA为模板用反转录试剂盒进行反转录，得到cDNA，反转录步骤参照Takara公司的反转录试剂盒说明书。
[0037] 从GenBank中检索同属不同菌株聚酮合成酶基因的核苷酸序列，设计一对引物F-I和R-I。引物序列如下：
[0038] F-I：5’-ATGTCTAACGTTCTTCTTTT-3’ SEQ ID NO.3；
[0039] R-I：5’-GATCTGAAGACCTTCTTGGA-3’ SEQ ID NO.4；
[0040] 以cDNA为模板进行扩增，采用上述引物进行扩增。总体积为50μL，超纯水18μL，10×LAtaq buffer(含MgCl2)5μL，dNTP(各2.5mmol/L)4μL，引物(20μmol/L)各1μL，cDNA 25ng，TaKaRa LA Taq酶2.5U。PCR扩增条件：95℃预变性5分钟，反应30个循环(95℃变性30秒，55℃退火30秒，72℃延伸6.5分钟)，30个循环结束后72℃延伸10分钟。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外分析仪检测，用Bioflux凝胶回收试剂盒进行PCR片段切胶回收，测序大小为6492bp。所得产物即为出芽短梗霉聚酮合成酶基因片段，测得序列如SEQ ID No.1。
[0041] 该段核苷酸序列全长6492bp，是一个完整的ORF，编码2163个氨基酸。该6492bp的ORF即为出芽短梗霉聚酮合成酶基因，其核苷酸序列及编码的氨基酸序列分别为SEQ ID No.1和SEQ ID No.2。
[0042] 实施例2：出芽短梗霉聚酮合成酶基因在毕赤酵母SMD1168H中的表达[0043] 根据SEQ ID No.1所示序列设计引物F-I-A和R-I-A，分别引入能插入pGAPZα-A质粒(购自美国Invitrogen公司)的SacII、XbaI酶切位点(下划线所示)，序列如下[0044] F-I-A：5’-GCGCCGCGGCATGTCTAACGTTCTTCTTTT-3’ SEQ ID NO.5；
[0045] R-I-A：5’-GCGTCTAGAATGATCTGAAGACCTTCTTGGA-3’ SEQ ID NO.6；
[0046] 以反转录的出芽短梗霉cDNA为模板，采用上述引物进行PCR扩增。PCR扩增条件和PCR产物回收方法同实施例1。PCR产物回收后加NdeI、SalI(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化，采用同样酶切方法处理pGAPZα-A质粒载体。将制备好的酶基因片段与pGAPZα-A载体按一定比例混合，采用T4连接酶(NEB，USA)于16℃连接18小时，然后采用CaCl2转化法转化宿主菌大肠杆菌Top10，转化菌液涂布zeocin(25μg/mL)抗性LB平板，37℃过夜培养。挑取生长良好的单菌落至LB液体培养基中37℃培养10小时，提取质粒，通过酶切法和PCR法验证阳性转化子，得到重组质粒pGAPZα-A-alb。
[0047] 将上述重组质粒pGAPZα-A-alb用AvrII内切酶(NEB，USA)于37℃酶切1小时，进行DNA纯化。然后将线性化的pGAPZα-A-alb采用电转化方法转化宿主毕赤酵母SMD1168H，转化菌液涂布zeocin(100μg/mL)抗性YPD平板，30℃培养3天。挑取生长良好的单菌落至YPD液体培养基中30℃培养3天，提取基因组，通过PCR法验证阳性转化子，得到重组毕赤酵母SMD1168H-alb。
[0048] 上述LB培养液成分：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 5g/L，pH7.0～7.5，121℃灭菌20分钟。
[0049] 上述YPD培养液成分：蛋白胨20g/L，酵母粉10g/L，葡萄糖20g/L，自然pH，115℃灭菌30分钟。其中葡萄糖单独配制灭菌，115℃灭菌30分钟，取出后与其他成分混合。
[0050] 实施例3：出芽短梗霉聚酮合成酶体外催化合成黑色素
[0051] 将实施例2中获得的重组毕赤酵母SMD1168H-alb接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养3天，转速200rpm。培养好的发酵液8000rpm离心5分钟收集上清液，上清液中缓慢添加硫酸铵至80％浓度，8000rpm离心5分钟收集蛋白沉淀。蛋白沉淀用50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶后用100KD超滤管进行脱盐和浓缩，最终使蛋白溶液与上述发酵上清液相比体积浓缩1000倍。经过脱盐和浓缩获得的蛋白溶液即为重组聚酮合成酶粗酶液。
[0052] 出芽短梗霉As3.3984菌株接种到YPD液体培养基中，30℃摇床培养2天，转速200rpm。培养好的发酵液8000rpm离心5分钟，弃上清，收集菌体沉淀置于研钵中。在研钵加入适量液氮，快速研磨菌体，待液氮挥发完毕后重新加入液氮，继续研磨至菌体呈粉末状。
用1/1000发酵液体积的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶菌粉，4000rpm离心5分钟，上清液即为出芽短梗霉粗酶液。
用1/1000发酵液体积的50mM磷酸钠缓冲液(pH8.0)重溶菌粉，4000rpm离心5分钟，上清液即为出芽短梗霉粗酶液。
[0053] 取上述重组聚酮合成酶粗酶液1mL、出芽短梗霉粗酶液1mL、2.5mol/L丙二酰辅酶A 0.5mL混合，NaOH调pH至8.0，38℃保温60分钟进行反应，期间进行充分供氧。反应混合液颜色逐渐变深直至黑色。待反应结束后，用6mol/L HCl调pH至2.5，6000r/min离心10min后，收集沉淀，得到黑色素粗产物。将黑色素粗产物溶于1mol/L NaOH中，加入2倍体积酸性甲醇(pH＝2)，静置4h，6000r/min离心10min后，收集沉淀，将沉淀用蒸馏水洗涤至中性，60℃烘干，即得黑色素，黑色素的产量为35.6g/L。
[0054] 实验例：对照组体外酶反应
[0055] 设置该实验例目的为通过对照组实验验证体外黑色素的合成与聚酮合成酶相关。
[0056] 实验组体外反应酶液和反应条件同实施例3。
[0057] 对照组与实验组相比区别在于：用含有空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液与实施例3中所述出芽短梗霉粗酶液混合代替重组聚酮合成酶粗酶液与出芽短梗霉粗酶液。
[0058] 上述含有空载体pGAPZα-A的毕赤酵母SMD1168H发酵液粗酶液制备方法为：将空载体pGAPZα-A用AvrII内切酶线性化后电转化毕赤酵母SMD1168H，获得重组菌，重组菌接种YPD液体培养基培养3天后收集上清液，经硫酸铵沉淀、超滤管脱盐浓缩后即得。具体操作步骤参照实施例2和实施例3。
[0059] 反应结束后，观察对比对照组和实验组的反应液颜色情况，对照组颜色为浅灰色，实验组颜色为黑色(图1)。对反应液中黑色素进行纯化干燥后称重，对照组获得黑色素2mg，实验组获得黑色素89mg。体外反应体系为2.5mL，换算后体外反应液中黑色素含量分别为对照组0.8g/L，实验组35.6g/L。
[0060] 结果分析：对照组体外反应也生成了少量黑色素，这是由于出芽短梗霉粗酶液中含有少量的聚酮合成酶，在体外酶反应条件下可以催化合成黑色素。实验组中通过添加重组聚酮合成酶，体外酶反应合成的黑色素产量为35.6g/L，是对照组的44.5倍。
[0061] 对比例1：
[0062] 以NCBI中记载的Aureobasidium melanogenum strain XJ5-1polyketide synthase gene作为对比，该基因的Sequence ID:KT429644.1，序列长度为6498bp。按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达；按实施例3的方法在体外催化合成黑色素。经检测，黑色素的产量为14.6g/L。
[0063] 对比例2：
[0064] 以NCBI中记载的Aureobasidium namibiae CBS 147.97polyketide synthase partial mRNA作为对比，该基因的Sequence ID:XM_013576562.1，序列长度为6495bp。按实施例2的方法将该基因在毕赤酵母SMD1168H中表达；按实施例3的方法在体外催化合成黑色素。经检测，黑色素的产量为0.9g/L。
[0065] 由对比例1和对比例2可以看出，本发明的出芽短梗霉聚酮合成酶基因所编码的聚酮合成酶具有非常高的催化活性，通过将本发明的出芽短梗霉聚酮合成酶基因经重组表达，并用于体外合成黑色素，可以显著提高黑色素的产量。
[0066] 以上所述，仅为本发明较佳的具体实施方式，但本发明的保护范围并不局限于此，任何熟悉本技术的技术人员在本发明批露的技术范围内，根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，都应涵盖在本发明的保护范围之内。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 熊果酸吗啉盐和熊果酸二乙醇胺盐 | 2020-05-11 | 63 |
| 有效抗细菌和真菌的抗微生物组合物 | 2020-05-11 | 551 |
| 一种以真菌操纵子为基础的外源基因定点定量定时表达系统 | 2020-05-12 | 808 |
| 一种热休克转录因子1显性负效应突变体及其应用 | 2020-05-12 | 707 |
| 新的基于异噻唑并结构的双环、其制备方法及其用作除草剂和/或植物生长调节剂的用途 | 2020-05-11 | 864 |
| 杀微生物的喹啉(硫代)羧酰胺衍生物 | 2020-05-11 | 631 |
| 细胞表面修饰的方法 | 2020-05-11 | 745 |
| 雷帕霉素衍生物 | 2020-05-11 | 625 |
| 腙基桥连的萘酰亚胺咪唑类化合物及其制备方法和应用 | 2020-05-12 | 938 |
| 一种空气净化处理设备 | 2020-05-11 | 768 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈