[0001] 本发明属于生物杀虫剂领域；尤其是细菌性杀虫剂、其基因、基因产物以及其使用方法。

[0002] 参考序列表

[0003] 本申请含有一个序列表，它通过EFS-Web以ASCII格式提交并且特此以全文引用的方式并入本文中。所述ASCII拷贝的名称是MBI-203-0005-PCT_seq_ST25.txt并且大小是335个千字节。

[0004] 活性紫色细菌

[0005] 在2000年，从马里兰州(Maryland)的森林土壤中分离出了带紫色细菌(PRAA4-1)(马丁(Martin)等人，2004)。在初始筛选中，发现这种细菌对科罗拉多马铃薯甲虫(Colorado potato beetle)和其它昆虫害虫有毒(马丁等人，2007a)。所述分离物的进一步研究揭示出抗螨虫、蛆、不同甲虫物种、蚜虫以及植物寄生线虫以及其它植物害虫的活性(马丁等人，2007b，第2012/0100236 A1号美国专利申请公开)。在有关抗昆虫的蛋白质活性剂的领域中，存在一些PRAA4-1蛋白质研究。

[0006] 蛋白酶和昆虫防治

[0007] 蛋白酶具有靶向并且破坏昆虫的必需蛋白质和组织的能力。植物经过自然进化，表达蛋白酶来免受虫害。昆虫捕食者也会在其毒液中产生蛋白酶，毒液导致死亡。蛋白酶已被鉴定为农业上防治昆虫的重要杀昆虫剂。

[0008] 具有杀昆虫活性的蛋白酶分为三大类：半胱氨酸蛋白酶、金属蛋白酶和丝氨酸蛋白酶。这几类蛋白酶靶向中肠、表皮和血腔。中肠的围食膜基质是用于昆虫防治的理想标靶，因为它围住并且保护中肠上皮细胞不受食物颗粒、消化酶和病原体的影响；此外还充当生化屏障(埃热迪(Hegedus)等人，2009)。增效蛋白是由杆状病毒表达的锌金属蛋白酶，有助于鳞翅目昆虫中的核型多角体病毒感染(莱波雷(Lepore)等人，1996)。这些蛋白酶通过消化围食膜基质的无脊椎肠粘蛋白促进鳞翅目幼虫的感染，鳞翅目幼虫的感染又促进中肠上皮细胞的感染(王(Wang)和格拉纳多斯(Granados)，1997)。已在鼠疫耶尔森菌(Yersinia pestis)、炭疽杆菌(Bacillus anthracis)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)和蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)的基因组中鉴别到了杆状病毒中所发现的增效蛋白基因的同源物(盖勒韦(Galloway)等人，2005；哈贾杰-埃卢兹(Hajaij-Ellouze)等人，2006)。

[0009] 植物半胱氨酸蛋白酶也展现出抗鳞翅目幼虫的活性。木瓜乳汁和野生无花果树中的半胱氨酸蛋白酶为防御各种鳞翅目幼虫所必需的。当乳汁经过洗涤时或当叶子用半胱氨酸蛋白酶抑制剂处理时，对幼虫的毒性丢失，表明防御可能归因于乳汁中高浓度的半胱氨酸蛋白酶(康诺(Konno)等人，2004)。

[0010] 靶向表皮的蛋白酶在昆虫防治方面也很重要。表皮覆盖了昆虫的整个外部以及内部结构的一些内陷。表皮由蜡质上表皮、外表皮和内表皮构成，它们由蛋白质、脂质和几丁质组成(哈里森(Harrison)和波恩(Bonning)，2010)。黑僵菌(Metarhizium anisopliae)和球孢白僵菌(Beauveria bassiana)对昆虫的真菌感染通过以下发生：当真菌孢子在表皮上萌发时，形成可使各种酶(包括蛋白酶)穿透表皮的结构(弗瑞莫泽(Freimoser)等人，2003；卓(Cho)等人，2006)。由黑僵菌产生的一种著名的丝氨酸蛋白酶PR1A消化表皮并且在穿透中起至关重要的作用(圣莱格(St.Leger)等人，1987)。黑僵菌的克隆体经过工程改造含有额外的pr1a基因拷贝并且显示出比野生型多杀死25％的烟草天蛾(圣莱格等人，1996)。球孢白僵菌也经过工程改造以表达黑僵菌PR1A蛋白酶并且展示出对马尾松毛虫(Masson's pine caterpillar/Dendrolimus punctatus)和大蜡螟(wax moth/Galleria mellonella)的幼虫的毒性增强(陆(Lu)等人，2008)。

[0011] 昆虫的基底膜由蛋白质组成，蛋白质包围着组织并且有助于从结构支撑到病毒屏障的各种功能。使用苜蓿丫纹夜蛾多核多角体病毒(Autographa californica multiple nucleopolyhedrovirus；AcMNPV)评估三种潜在的基底膜降解蛋白。这种杆状病毒经过工程改造以表达两种脊椎动物金属蛋白酶大鼠基质溶素和人类白明胶酶A以及果蝇组织蛋白酶L(ScathL)。ScathL蛋白酶展现出最佳的杆状病毒活性。被感染的烟夜蛾幼虫的中值存活时间相比于被野生型感染的幼虫缩短了50％(哈里森和波恩，2001)。此数据支持以下观点：在病毒中表达的蛋白酶具有穿过昆虫基底膜的能力，昆虫基底膜一般用作病毒屏障。早先报导鉴别出了果蝇幼虫的成虫盘的两种易被组织蛋白酶L水解的基底膜蛋白(霍马(Homma)和名取(Natori)，1996)。当将纯化后的ScathL蛋白酶注射到血腔中时，它对各种昆虫害虫仍然有毒。纯化后的蛋白酶在鳞翅目幼虫中展现出与ScathL表达的杆状病毒感染所看到的类似的黑化、死亡率和血淋巴蛋白酶活性(李(Li)等人，2008)。纯化后的ScathL蛋白酶在体内和体外均造成基底膜破坏(唐(Tang)等人，2007；菲利普(Philip)等人，2007)。

[0012] 节肢动物捕食者的毒液中也显示出含有裂解基底膜的蛋白酶。一个实例是寄生蜂(parasitic wasp/Eulophus pennicornis)，其中在毒腺中鉴别到了3种金属蛋白酶(EpMP1-3)。将重组性EpMP3注射到番茄蛾(Lacanobia oleracea)幼虫的血腔中，造成显著的死亡率，或存活幼虫的发育和生长减弱(普莱斯(Price)等人，2009)。群居性兵蚜若虫在其肠内产生毒性组织蛋白酶B蛋白酶(半胱氨酸蛋白酶)。蛋白酶经口排向敌人，并展现出杀昆虫活性(沓挂(Kutsukake)等人，2008)。

[0013] 从细菌嗜线虫致病杆菌(Xenorhabdus nematophila)分离的蛋白酶已显示抑制昆虫免疫反应中所参与的抗细菌肽，使得昆虫易受致病过程的影响(卡尔达(Caldas)等人，2002)。肠杆菌发光杆菌(Photorhabdus luminscense)已显示可使广泛范围的昆虫致病。这种细菌的基因组序列鉴定与毒性相关的基因，包括蛋白酶(迪绍(Duchaud)等人，2003)。

[0014] 植物修饰也对蛋白酶作为杀昆虫剂的用途感兴趣。对降解基底膜的蛋白酶进行表征并且针对转基因杀昆虫方案进行工程改造，目标是研发出对昆虫害虫具有抗性的转基因植物(第6,673,340号美国专利，哈里森和波恩，2004)。昆虫肠道中的蛋白酶已显示会影响苏云金芽孢杆菌Cry杀昆虫蛋白的效果。一些蛋白酶通过将Cry蛋白质从原毒素处理成毒性形式来活化Cry蛋白质。昆虫毒素经过修饰以包含蛋白水解活化位点，目标是将这种修饰并入到转化后的植物、植物细胞和种子中。昆虫肠道蛋白酶裂解这些位点，在害虫肠道内产生活性昆虫毒素(第7,473,821号美国专利，阿巴德(Abad)等人，2009)。

[0015] 几丁质酶的杀昆虫活性

[0016] 几丁质酶通过刺穿昆虫中肠壁和降解昆虫表皮而加快杀昆虫活动。这些膜的降解使昆虫暴露于病原体、其它杀昆虫化合物和/或植物防御中。

[0017] 几丁质酶使结构多糖几丁质水解，结构多糖几丁质是2-乙酰氨基-2-脱氧-D-吡喃葡萄糖苷的线性均聚物，通过β-1→4键连接，是昆虫的外骨骼和肠壁的组分。几丁质酶归类为家族18或家族19糖基水解酶。家族18几丁质酶广泛可见于细菌、植物和动物中；而家族19几丁质酶主要可见于植物中(亨利萨塔(Henrissat)和巴洛赫(Bairoch)，1993)。在昆虫中，几丁质酶起蜕皮作用(塞缪尔斯(Samuels)和雷诺(Reynolds)，1993；梅宗多费尔(Merzendorfer)和齐莫赫(Zimoch)，2003)。

[0018] 单独的几丁质酶显示出一些杀昆虫活性。发现来自粘质沙雷氏菌(Serretia marcenscens)的几丁质酶对七龄大蜡螟幼虫有毒(赖森科(Lysenk)，1976)。表达昆虫几丁质酶的转基因植物显示具有增强的昆虫害虫抗性。用编码烟草天蛾(Manduca sexta)几丁质酶的cDNA转化烟草植物。用美洲烟叶蛾(Heliothis virescens)幼虫侵扰这些转基因植物的叶子。3周后发现，几丁质酶阳性叶相比于几丁质酶阴性叶，幼虫生物质少并且饲料破坏小。可能几丁质酶的活性使得昆虫更容易遭到植物防御(丁(Ding)等人，1997)。

[0019] 昆虫表皮提供物理屏障，用于保护昆虫不受病原体或其它环境危害物的影响，并且主要由几丁质构成(克拉默(Kramer)等人，1995)。昆虫病原性真菌黑僵菌、蚕白僵菌(Beauvaria bassiana)、多形白僵菌(Beauvaria amorpha)、蜡蚧轮枝菌(Verticillium lecanii)和黄曲霉(Aspergillus flavus)全部分泌几丁质酶来分解表皮并进入昆虫宿主(圣莱格等人，1986，1992；坎波斯(Campos)等人，2005)。根据金姆(Kim)等人，含几丁质酶的球孢白僵菌上清液对棉蚜(Aphis gossypii)成虫有毒。然而，当用过量的几丁质处理这些上清液以抑制真菌几丁质酶的活性时，这种死亡率显著降低，表明几丁质酶在分解表皮和促进感染方面起不可或缺的作用(金姆等人，2010)。还从内寄生蜂甲腹茧蜂(Chelonus sp.)的毒液中分离出了几丁质酶，其中几丁质酶可能有助于毒液渗透几丁质保护的猎物的防御(克里希南(Krishnan)等人，1994)。

[0020] 围住昆虫中肠的围食膜是另一种主要由几丁质构成的保护昆虫远离病原体的屏障。任何可以穿过这种膜的酶都具有作为生物杀虫剂的潜力(王和格拉纳多斯，2001)。哈布纳(Hubner)等人证明，疟原虫排出几丁质酶以渗透蚊子的围食膜(哈布纳等人，1991)，并且沙哈布丁(Shahabuddin)等人证实，用阿洛氨菌素(allosamidin)抑制几丁质酶足以防止疟原虫鸡疟原虫(Plasmodium gallinaceum)穿过自由繁殖按蚊(Anopheles freeborni)的围食膜。此外，在自由繁殖按蚊中肠的发育期间，添加来自灰色链霉菌(Streptomyces griseus)的外源性几丁质酶防止形成围食膜(沙哈布丁等人，1993)。这证明几丁质酶可以分解围食膜。雷格夫(Regev)等人使用大肠杆菌(E.coli)来表达粘质沙雷氏菌内切几丁质酶ChiA，并用电子显微镜证实，暴露于内切几丁质酶的灰翅夜蛾(Spodoptera littoralis)幼虫展现出围食膜刺穿(雷格夫等人，1996)。

[0021] 因为几丁质酶具有刺穿围食膜的能力，所以内切几丁质酶还显示提高了苏云金芽孢杆菌(Bt)的杀昆虫活性。用经过Bt和几丁质酶的经过稀释的商业调配物的混合物处理的香脂冷杉(Abies balsamea)饲养的云杉卷叶蛾(Choristoneura fumiferana)幼虫比仅用经过单独的Bt处理的叶子饲养的幼虫被杀死得快(斯米诺夫(Smirnoff)，1973)。低浓度的Bt和粘质沙雷氏菌几丁质酶的混合物也导致灰翅夜蛾幼虫的死亡率比单独的Bt高(希合(Sheh)等人，1983)。可以认为，这种协同效应归因于几丁质酶刺穿了昆虫肠道的围食膜壁，促进Bt孢子渗透到昆虫中(斯米诺夫，1973)。

[0022] Yen-Tc是对于昆虫褐新西兰肋翅鳃角金龟(Costelytra zealandica)中的鼠疫食虫动物(Yersinia entomophaga)的昆虫病原性来说所需要的并且足够的ABC型蛋白质，含有两种家族18几丁质酶，使它成为第一种经过鉴定并入有几丁质酶的杀昆虫毒素复合物。假设几丁质酶负责分解围食膜并且使中肠上皮细胞暴露于毒素。然而，几丁质酶可以仅在具有相对中性的pH的中肠区域中具有活性(巴斯比(Busby)，2012)。

[0023] 几丁质酶还是一些昆虫病毒的活性所不可或缺的。哈特温(Hatwin)等人制造了缺乏几丁质酶基因的苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒(AcMNPV)突变体。这种病毒通常造成宿主幼虫液化，有助于病毒扩散。当粉纹夜蛾(Trichoplusia ni)幼虫被几丁质酶阴性病毒感染时，不会出现这种液化。还证实了，AcMNPV几丁质酶在昆虫中肠的碱性条件下具有活性(哈特温等人，1997))发现同一苜蓿丫纹夜蛾核型多角体病毒的表达长角血蜱(Haemaphysalis longicornis)几丁质酶的重组版本具有抗长角血蜱若虫的生物杀螨活性(阿赛纳(Assegna)等人，2006)。

[0024] Rhs样基因编码杀昆虫毒素

[0025] rhs(重组热点)基因家族最早在大肠杆菌中鉴别到。这些基因通过同源交换赋予染色体重排(林(Lin)等人，1984)。它们的大小是2到12kb，并且展现出长核心与短尖端。核心序列富含GC并且高度保守，但尖端序列GC稀少并且高度可变。它们编码具有大核心域和短C端尖端域的蛋白质。蛋白质核心域是亲水性的并且含有YD重复序列(杰克逊(Jackson)等人，2009)。Rhs蛋白能够与细菌细胞表面相互作用并且结合到特异性配体(王(Wang)等人，1998)。虽然Rhs蛋白的功能仍然未知(希尔(Hill)等人，1994)，但是结构很重要，因为YD重复序列和高度保守序列类似于编码由细菌产生的杀昆虫毒素的rhs和rhs样基因。

[0026] 发光杆菌是异小杆线虫科(Heterorhabditae family)线虫的共生有机体。线虫感染昆虫并将细菌注入昆虫血腔中。然后，细菌分泌毒素杀死昆虫(弗罗斯特(Frost)等人，1997)。博文(Bowen)等人(1998)纯化出了靶向昆虫的与经口和可注射杀昆虫毒性相关的高分子量蛋白质。在另一项研究中，博文等人(1998)使用高效液相色谱将这种蛋白质分离成四种毒素复合物(tc)，称为Tca、Tcb、Tcc和Tcd，由tc基因座编码(博文等人，1998)。沃特菲尔德(Waterfield)等人(2001)分析了tc基因在大肠杆菌中的重组表达以了解Tc蛋白的经口毒性。他们发现，在没有tccC样同源物的情况下，他们无法在大肠杆菌中恢复经口毒性。
这些作者推断，TccC参与了毒素分泌的活化。此外，氨基酸序列分析显示，TccC和TccC样蛋白具有高度保守的核心和高度可变的延伸部分。这种结构与rhs样元件有相似之处(沃特菲尔德NR、博文DJ、费瑟斯顿JD(Fetherston JD)、佩里RD(Perry RD)和弗伦奇-康斯坦特RH(ffrench-Constant RH)，2001)。这种相似性表明TccC样蛋白和Rhs蛋白在毒素迁移率和活化肠内菌科(Enterobacteriaceae family)方面共同具有旧作用(弗伦奇-康斯坦特R等人，
2003)。

[0027] 另一种微生物嗜虫沙雷氏菌(Serratia entomophila)具有杀昆虫活性，它靶向新西兰草金龟(New Zealand grass grub)褐新西兰肋翅鳃角金龟，并且造成琥珀病(amber disease)(格里蒙(Grimont)等人，1988)。嗜虫沙雷氏菌的毒性与称作琥珀病相关质粒(pADAP)的大型质粒有关(格雷尔(Glare)等人，1993)。赫斯特(Hurst)等人分析pADAP的突变诱发和核苷酸序列来了解它是如何赋予草金龟致病性的。他们发现，pADAP编码负责琥珀病症状的三个基因sepA、sepB和sepC。所有三个基因都为致病性所需的，因为这些基因的突变会祛除琥珀病。他们说明了由sep基因编码的蛋白质类似于由发光杆菌的杀昆虫毒素复合物编码的蛋白质。举例来说，SepC和TccC的前680种氨基酸显示出强相似性。此外，这个区域类似于大肠杆菌的rhs元件。sepC基因小于Rhs元件，但它编码具有九种Rhs肽变异体的亲水性蛋白质核心。基于sep与tc基因之间的相似性，赫斯特等人推断这些产物是一组新的杀昆虫毒素的一部分(赫斯特等人，2000)。

[0028] 原田(Harada)等人发现，玉米细菌性枯萎病菌(Pantoea stewartii ssp.)DC283是感染蚜虫的侵袭性病原体(原田等人，1996)。蚜虫摄入细菌，DC283能够在肠道中聚集并导致蚜虫死亡。斯塔费里尼德(Stavrinides)等人进行了突变诱发筛选并且发现ucp1(你不能通过(you cannot pass))基因座负责DC283的毒性。ucp1基因序列的分析揭示出与Rhs蛋白家族的相似性。ucp1基因小于编码RHS/YD蛋白的基因并且不具有结合YD重复序列的配体，但它具有保守的5'核心、非同源3'端，并且它是膜结合蛋白。这些结构相似性表明肠植物定殖体具有定殖于昆虫宿主的遗传能力。此外，ucp1与rhs基因之间的相似性表明rhs样基因具有潜在的杀昆虫活性(斯塔费里尼德等人，2010)。

[0029] 尽管存在这些已知蛋白质，但是昆虫可能会对表达这些已知基因的植物进化出抗性。因此，需要寻找具有杀昆虫活性的新颖蛋白质。

[0030] 一方面，本发明提供来自细菌活性紫色细菌的杀昆虫蛋白质的核苷酸序列。这种细菌的分离和部分表征描述于例如第7,244,607号美国专利中。另外提供由活性紫色细菌杀昆虫蛋白质编码的多肽的氨基酸序列。

[0031] 另一方面，本发明提供经分离核酸(例如，DNA、RNA、核酸类似物)，其包含活性紫色细菌杀昆虫蛋白质序列、基因序列、其片段和或突变变异体。还提供了核酸载体(例如，质粒载体、病毒载体)，包括表达载体，其包含具有活性紫色细菌基因序列和/或其片段的核酸。例示性细菌载体包括(但不限于)根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)、根瘤菌NGR234、苜蓿中华根瘤菌(Sinorhizobium meliloti)和百脉根根瘤菌(Mesorhizobium loti)。

[0032] 例示性病毒载体包括(但不限于)花椰菜花叶病毒(CaMV)、豌豆早枯病毒(PEBV)、菜豆荚斑点病毒(BPMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、苹果潜隐球形病毒(ALSV)、烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯病毒X、雀麦草花叶病毒(BMV)以及大麦条纹花叶病毒(BSMV)。

[0033] 还提供了用以上核酸或载体转染的细胞。这类细胞可以是植物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、细菌细胞或真菌细胞(例如，酵母)。还提供了包含已用以上核酸或载体转染的细胞(植物细胞或其它细胞)的植物、来自所述植物的种子以及所述植物的后代。经过转染的细菌细胞可以包括农杆菌(例如，根癌农杆菌)、根瘤菌、苜蓿中华根瘤菌和百脉根根瘤菌。还提供了包含核酸载体的昆虫载体(例如，玻璃翅叶蝉(Homalodisca vitripennis/glassy-winged sharpshooter))，所述核酸载体本身包含活性紫色细菌序列。

[0034] 在其它实施例中，提供由活性紫色细菌基因编码的多肽。还提供了活性紫色细菌多肽的功能片段和活性紫色细菌多肽的经过保守取代的变异体。

[0035] 在其它实施例中，提供包含一或多个经分离核酸的植物，所述经分离核酸包含活性紫色细菌基因序列和/或其片段。这些经分离核酸可以存在于植物外部或细胞内部或细胞之间。

[0036] 在其它实施例中，提供包含一或多个核酸载体的植物，其中所述载体包含活性紫色细菌基因序列和/或其片段。所述载体可以存在于植物外部或内部。

[0037] 在其它实施例中，提供包含一或多个活性紫色细菌多肽的植物。所述活性紫色细菌多肽可以存在于植物外部或内部。

[0038] 还提供了包含活性紫色细菌多肽的一或多个功能片段和/或一或多个经过保守取代的变异体的植物。所述片段和/或经过保守取代的变异体可以存在于植物外部或内部。

[0039] 还提供了上述植物的后代。另外提供来自上述植物和来自其后代的种子。

[0040] 本文还披露了害虫防治方法；例如用于调整植物中的害虫侵扰的方法。这类害虫可以是例如昆虫、真菌、线虫、螨虫、蛾或蚜虫。方法包括向植物内部或外部施用包含活性紫色细菌基因序列或其片段的核酸。其它方法包括向植物内部或外部施用活性紫色细菌多肽、或其片段、或其经过保守取代的变异体。

[0041] 还提供了杀虫(例如，杀昆虫)组合物，其包含由活性紫色细菌基因编码的核酸和/或多肽。这类组合物可以任选地包括其它天然产生的或人造的杀昆虫剂或杀虫剂。

[0042] 本文尤其披露了以下实施例：

[0043] 1.一种细胞，其包含具有异源启动子的重组载体，所述异源启动子操作性地连接到编码与SEQ ID NO:1-3具有95％一致性的多肽的核苷酸。

[0044] 2.一种植物或植物部分，其包含一或多个根据实施例1所述的细胞或其后代或种子。

[0045] 3.根据实施例2所述的植物或植物部分，其中所述植物部分选自由花粉、胚珠、花、芽、根、茎、丝、穗、耳穗以及叶组织组成的群组。

[0046] 5.一种抗体，其结合到根据实施例1所述的多肽。

[0047] 6.根据实施例1所述的细胞，其中所述细胞是细菌、哺乳动物或真菌细胞。

[0048] 7.一种产生昆虫抗性植物的方法，其包含将根据实施例1所述的重组载体转化到植物细胞中的步骤。

[0049] 8.一种防伪研磨种子，其具有根据实施例1所述的植物细胞作为来源指示。

[0050] 9.一种杀虫组合物，其包含(a)一或多个具有如SEQ ID NO:1-6中所阐述的序列的核酸和/或多肽和(b)载剂。

[0051] 10.根据实施例9所述的杀虫组合物，其中所述组合物是杀昆虫剂。

[0052] 11.根据实施例10所述的杀虫组合物，其进一步包含第二杀虫剂。

[0053] 12.根据实施例11所述的杀虫组合物，其中所述第二杀虫剂是杀昆虫剂。

[0054] 13.一种用于调整植物中的害虫侵扰的方法，所述方法包含使植物或植物部分与可有效调整所述害虫侵扰的量的根据实施例9所述的杀虫组合物接触。

[0055] 14.根据实施例13所述的方法，其中所述害虫选自由昆虫、真菌、线虫、细菌和螨虫组成的群组。

[0056] 15.根据实施例14所述的方法，其中所述昆虫包含粉纹夜蛾、甜菜夜蛾、草盲蝽或小菜蛾。

[0057] 16.一种种子包衣材料，其包含根据实施例1所述的多肽，和载剂、稀释剂或佐剂中的一或多种。

[0058] 除非另外指明，否则本发明实践采用农业、植物分子生物学、昆虫学、细胞生物学、分子生物学、生物化学、重组DNA领域和相关领域中在技术范围内的标准方法和常规技术。这类技术在文献中有描述并且因此可供本领域的普通技术人员使用。参见例如艾伯茨B.(Alberts,B.)等人“, 细胞分子生物学(Molecular Biology of the Cell),”第5版,加兰科学出版社(Garland Science),纽约州纽约(New York,NY),2008；富特D.(Voet,D.)等人“生物化学基本原理：分子水平的生命(Fundamentals of Biochemistry:Life at the 
Molecular Level),”第3版,约翰·威利父子公司(John Wiley&Sons),新泽西州霍博肯(Hoboken,NJ),2008；萨姆布鲁克J.(Sambrook,J.)等人,“分子克隆实验指南(Molecular Cloning:A Laboratory Manual),”第3版,冷泉港实验室出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press),2001；奥斯贝F.(Ausubel,F.)等人,“最新分子生物学实验方法汇编(Current Protocols in Molecular Biology),”约翰·威利父子公司,纽约,1987和定期更新；格洛弗(Glover),DNA克隆实用方法(DNA Cloning:A Practical Approach),第I卷和第II卷,IRL出版社(1985),第III卷,IRL出版社(1987)；佩巴尔(Perbal),分子克隆实践指南,约翰·威利父子公司(1984)；里格比(Rigby)(编)“,基因工程(Genetic Engineering)”系列(学术出版社(Academic Press))；赛特洛(Setlow)和霍兰德(Hollaender)(编)“, 基因工程：原理和方法(Genetic Engineering:Principles and Methods)”系列,普雷纳姆出版社(Plenum Press)；盖特(Gait)(编),寡核苷酸合成实用方法(Oligonucleotide 
Synthesis:A Practical Approach),IRL出版社(1984,1985)；埃克斯坦(Eckstein)(编)寡核苷酸和类似物实用方法(Oligonucleotides and Analogues:A Practical Approach),IRL出版社(1991)；哈梅斯(Hames)和希金斯(Higgins),核酸杂交实用方法(Nucleic Acid Hybridization:A Practical Approach),IRL出版社(1985)；哈梅斯和希金斯,转录与转译实用方法(Transcription and Translation:A Practical Approach),IRL出版社(1984)；
B.布加南(B.Buchanan),W.格吕塞姆(W.Gruissem)和R.琼斯(R.Jones)(编)“植物生物化学和分子生物学(Biochemistry and Molecular Biology of Plants),”威利(Wiley)(2002)以及“酶学方法(Methods in Enzymology)”系列,学术出版社,加利福尼亚州圣地亚哥(San Diego,CA)。以上所有参考文献的披露内容出于描述相关领域中的方法和组合物的目的以全文引用的方式并入本文中。

[0059] 当提供数值范围时，应理解，除非上下文另外明确规定，否则在该范围上下限之间的达到下限单位十分之一的每一中间值，以及所述范围内的任何其它所述值或中间值都包括在其中。也包括更小的范围。这些更小范围的上限和下限也包括在其中，但不包括所述范围中的任何特定排除的界限。

[0060] 除非另外定义，否则本文中所用的所有技术和科学术语都具有与本发明所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。尽管在本发明的操作或测试中也可以使用与本文中描述的方法和材料类似或等效的任何方法和材料，但是现在描述优选方法和材料。

[0061] 必须指出，除非上下文另外明确规定，否则如本文中和所附权利要求书中所用的单数形式“一”和“所述”包括复数个参考物。

[0062] 如本文中所用，术语“构筑体”意指源自任何来源、能够基因组整合或自主复制、包含多核苷酸分子的任何重组多核苷酸分子，如质粒、粘粒、病毒、自主复制多核苷酸分子、噬菌体或线性或环状单链或双链DNA或RNA多核苷酸分子，其中一或多个多核苷酸分子按功能上操作性方式连接，即可操作地连接。

[0063] 如本文中所用，术语“可操作地连接”是指第一分子连接到第二分子，其中所述分子安排成第一分子影响第二分子的功能。两个分子可以是或者可以不是单个连续分子的一部分，并且可以是相邻的或者可以是不相邻的。举例来说，如果启动子调整细胞中相关可转录多核苷酸分子的转录，那么启动子可操作地连接于可转录多核苷酸分子。

[0064] 构筑体可以包括本领域中已知的任何启动子或前导序列。举例来说，启动子可以可操作地连接于异源非转译5'前导序列，如源自热休克蛋白基因的前导序列(参见例如第5,659,122号美国专利和第5,362,865号美国专利)。或者，前导序列可以可操作地连接于异源启动子，如花椰菜花叶病毒35S转录启动子(参见第5,352,605号美国专利)。

[0065] 如本文中所用，术语“可转录多核苷酸分子”是指任何能够被转录到RNA分子中的DNA分子，包括(但不限于)具有蛋白质编码序列(SEQ ID NO:4-6)的那些和具有适用于基因抑制的序列的那些。“转基因”是指宿主细胞异源可转录多核苷酸分子和/或人工并入到宿主细胞基因组中的可转录多核苷酸分子。

[0066] 启动子可以可操作地连接于就启动子分子而言是异源的可转录多核苷酸分子。如本文中所用，术语“异源”是指当两个或更多个多核苷酸分子的组合通常不存在于自然界中时的此类组合。举例来说，两个分子可以源自不同物种和/或两个分子可以源自不同基因，例如来自相同物种的不同基因或来自不同物种的相同基因。因此，如果此类组合通常不存在于自然界中，那么就可操作地连接的可转录多核苷酸分子而言，启动子是异源的，即与该启动子分子组合可操作地连接的可转录多核苷酸分子不是天然产生的。

[0067] 可转录多核苷酸分子一般可以是任何为RNA转录物的表达所需的DNA分子。RNA转录物的这类表达可以引起所得mRNA分子的转译并且因此引起蛋白质表达。或者，可转录多核苷酸分子可以设计成最终导致可以增强SEQ ID NO:1-3的蛋白质表达的特定基因或蛋白质的表达降低。这可以通过使用沿反义方向定向的可转录多核苷酸分子来实现。本领域的普通技术人员熟悉这类反义技术的使用。简单来说，当反义可转录多核苷酸分子转录时，RNA产物与细胞内部的互补RNA分子杂交并且螯合。这种双螺旋RNA分子不能通过细胞的转译机器转译成蛋白质并且在细胞中降解。任何基因都可以按这种方式进行负向调节。

[0068] 多核苷酸和寡核苷酸

[0069] 多核苷酸是核苷酸的聚合物，并且所述术语意味着涵盖通过较大的多核苷酸的片段化产生的较小多核苷酸(片段)。术语多核苷酸和核酸涵盖RNA和DNA，以及单链和双链多核苷酸和核酸。多核苷酸还包括经修饰的多核苷酸和核酸，其含有如本领域中所知的碱基、糖或磷酸酯基的修饰。

[0070] 寡核苷酸是短核酸，一般是DNA并且一般是单链。一般而言，寡核苷酸将短于200个核苷酸，更确切地说，短于100个核苷酸，最确切地说，50个核苷酸或更短。

[0071] 经修饰的碱基和碱基类似物是本领域中已知的，例如能够与天然产生的碱基形成胡斯坦(Hoogsteen)和反胡斯坦碱基对的那些。实例包括(但不限于)8-氧代-腺苷、假异胞苷、5-甲基胞苷、肌苷、2-氨基嘌呤以及各种吡咯并和吡唑并嘧啶衍生物。类似地，经修饰的糖残基或类似物(例如2'-O-甲基核糖或肽核酸主链)也可以形成经修饰的碱基或碱基类似物的组分。参见例如孙(Sun)和海林(Helene)(1993)现代结构生物学评论(Curr.Opin.Struct.Biol.)3:345-356。能够与多核苷酸进行任何类型的序列特异性相互作用的非核苷酸大分子适用于本文所披露的方法和组合物中。实例包括(但不限于)肽核酸、小沟结合剂和抗生素。能够参与双螺旋体或三螺旋体形成的新的经修饰碱基、碱基类似物、经修饰糖、糖类似物、经修饰磷酸酯和磷酸酯类似物可用于本领域中，并且适用于本文中所披露的方法和组合物中。

[0072] 核酸和多肽的同源性和一致性

[0073] 如本文在核酸和多肽的情况下所使用的“同源性”或“一致性”或“相似性”分别是指两个多肽或两个核酸分子之间基于氨基酸序列或核酸序列的比对的关系。同源性和一致性可以各自通过比较每个序列中可以出于比较目的比对的位置来进行测定。举例来说，可以比较“参考序列”与“测试序列”。当参考序列的位置被测试序列中等效位置的相同碱基或氨基酸占据时，那么所述分子在那个位置是相同的；当等效位置被类似氨基酸残基(例如，立体和/或电子性质类似)占据时，那么所述分子可以称为在那个位置同源(类似)。两个序列的亲缘关系当表示为同源性/相似性或一致性的百分比时，是所比较序列所共用的位置处的相同或类似氨基酸的数量的函数。在比较两个序列时，一个序列相比于另一个序列来说不存在残基(氨基酸或核酸)或存在额外残基都会降低一致性和同源性/相似性。

[0074] 如本文中所用，术语“一致性”是指当比对两个或更多个序列以使序列匹配达到最大(即考虑了间隙和插入)时，所述序列中在对应位置处的相同核苷酸或氨基酸残基的百分比。一致性可以通过已知方法容易地计算，方法包括(但不限于)以下各者中所述的那些：计算分子生物学(Computational Molecular Biology),莱斯克A.M.(Lesk,A.M.)编,牛津大学出版社(Oxford University Press),纽约,1988；生物计算：信息学和基因组计划(Biocomputing:Informatics and Genome Projects),史密斯D.W.(Smith,D.W.)编,学术出版社,纽约,1993；序列数据的计算机分析(Computer Analysis of Sequence Data),第I部分,格里芬A.M.(Griffin,A.M.)和格里芬H.G.(Griffin,H.G.)编,胡马纳出版社(Humana Press),新泽西州(New Jersey),1994；分子生物学中的序列分析(SequenceAnalysis in Molecular Biology),冯·海涅G.(von Heinje,G.),学术出版社,1987；以及序列分析引物(Sequence Analysis Primer),格里布科夫M.(Gribskov,M.)和德弗罗J.(Devereux,J.)编,M斯托克顿出版社(M Stockton Press),纽约,1991；以及卡里洛H.(Carillo,H.)和利普曼D.(Lipman,D.),SIAM应用数学杂志(SIAM J.Applied Math.),48:1073(1988)。设计用于测定一致性的方法以在所测试序列之间得到最高程度的匹配。此外，在公开可用的计算机程序中编码用于测定一致性的方法。用于测定两个序列之间的一致性的计算机程序方法包括(但不限于)GCG程序包(德弗罗等人(1984)核酸研究(Nucleic Acids Research)12:387)、BLASTP、BLASTN和FASTA(奥特查尔(Altschul)等人(1990)分子生物学杂志
(J.Molec.Biol.)215:403-410；奥特查尔等人(1997)核酸研究25:3389-3402)。BLAST X程序可从NCBI和其它来源公开获得。参见例如BLAST手册(BLAST Manual),奥特查尔S.等人,NCBI NLM NIH马里兰州贝塞斯达(Bethesda,Md.)20894；奥特查尔等人(1990)分子生物学杂志215:403-410。还可以使用众所周知的史密斯-沃特曼算法(Smith-Waterman 
algorithm)来测定一致性。

[0075] 关于序列比较，通常一个序列充当参考序列，让一或多个测试序列与它进行比较。一般比对序列在指定区域内的最大对应关系，例如长度为至少约20、25、30、35、40、45、50、
55、60、65或更多个氨基酸或核苷酸的区域，并且所述区域可以长达参考氨基酸序列或参考核苷酸序列的全长。当使用序列比较算法时，将测试序列和参考序列输入计算机程序中，必要时指定子序列座标，并且指定序列算法程序参数。接着，序列比较算法根据所指定的程序参数来计算测试序列相对于参考序列的序列一致性百分比。

[0076] 适合于测定序列一致性百分比的算法的实例是BLAST和BLAST 2.0算法，它们分别描述于奥特查尔等人(1990)分子生物学杂志215:403-410和奥特查尔等人(1977)核酸研究25:3389-3402中。用于执行BLAST分析的软件可通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information)在www.ncbi.nlm.nih.gov公开获得。其它例示性算法包括ClustalW(希金斯等人(1994)核酸研究22:4673-4680)，可在www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw/index.html获得。

[0077] 在另一个实施例中，两个核酸之间的序列一致性也可以在通过碱基配对介导的两个多核苷酸彼此退火、重新结合或杂交方面加以描述。多核苷酸之间的杂交根据已知的并且领域公认的碱基配对特性进行，使得腺嘌呤与胸腺嘧啶或尿嘧啶进行碱基配对，并且鸟嘌呤与胞嘧啶进行碱基配对。核苷酸的允许它与第二核苷酸进行碱基配对的特性称作互补性。因此，腺嘌呤与胸腺嘧啶和尿嘧啶互补，并且反之亦然；类似地，鸟嘌呤与胞嘧啶互补，并且反之亦然。沿着整个长度与靶序列互补的寡核苷酸或多核苷酸被称为与靶序列完美互补、完美匹配或完全互补，并且反之亦然。两个多核苷酸可以具有相关序列，其中两个序列中的大部分碱基是互补的，但是一或多个碱基是非互补的或错配的。在这种情况下，序列可以称为大体上彼此互补。如果两个多核苷酸序列的情况是两者在除了一个核苷酸位置之外的所有核苷酸位置互补，那么所述序列彼此来说具有单核苷酸错配。

[0078] 术语“大体上相同”是指第一氨基酸序列与第二氨基酸序列之间的一致性使得第一和第二氨基酸序列共用共同结构域和/或共同功能活性，第一氨基酸序列含有足够的或最小数量的i)与第二氨基酸序列中的所比对的氨基酸残基相同或ii)为第二氨基酸序列中的所比对的氨基酸残基的保守取代的氨基酸残基。举例来说，含有与如本文所披露的氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1-3)具有至少约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或99.5％的一致性的共同结构域的氨基酸序列称为大体上相同的。在核苷酸序列的情况下，术语“大体上相同”在本文中用于指第一核酸序列含有足够的或最小数量的与第二核酸序列中所比对的核苷酸相同的核苷酸，使得第一和第二核苷酸序列编码具有共同功能或结构活性的多肽，或编码共同结构多肽域或共同功能多肽活性。

[0079] 在另一个实施例中，术语“同源性”描述序列相似性的基于数学计算的比较，所述比较用于鉴别具有类似功能或模体的基因或蛋白质。使用参考核苷酸或氨基酸序列(例如，如本文所披露的序列)作为“查询序列”对公共数据库进行搜索，以例如鉴别其它家族成员、相关序列或同源物。此类搜索可以使用奥特查尔等人(1990)分子生物学杂志215:403-410的NBLAST和XBLAST程序(2.0版)进行。可以用NBLAST程序，评分＝100，字长＝12进行BLAST核苷酸搜索，以获得与参考核苷酸序列同源的核苷酸序列。可以用XBLAST程序，评分＝50，字长＝3进行BLAST氨基酸搜索，以获得与参考氨基酸序列同源的氨基酸序列。为了获得用于比较目的的间隙比对，可以如奥特查尔等人(1997)核酸研究25:3389-3402中所述采用间隙BLAST。当采用BLAST和间隙BLAST程序时，可以使用各别程序(例如，XBLAST和BLAST)的默认参数(参见万维网ncbi.nlm.nih.gov)。

[0080] 本发明的核酸和多核苷酸涵盖与SEQ ID NO:4-6中的任何一个具有至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％一致的核苷酸序列的那些核酸和多核苷酸。

[0081] 核苷酸类似物和氨基酸类似物是本领域中已知的。因此，本发明还涵盖包含核苷酸类似物的核酸(即，SEQ ID NO:4-6)和包含氨基酸类似物的多肽(即，SEQ ID NO:1-3)。

[0082] 可转录多核苷酸分子可以是农艺相关基因。如本文中所用，术语“农艺相关基因”是指当在特定植物组织、细胞或细胞类型中表达时提供与植物形态、生理学、生长、发育、产率、产物、营养概况、疾病或昆虫/害虫抗性和/或环境或化学耐受性相关的所要特征的可转录多核苷酸分子。农艺相关基因包括(但不限于)由SEQ ID NO:4-6编码的昆虫防治基因或其相关蛋白质SEQ ID NO:1-3，它们编码产率蛋白、抗胁迫蛋白、发育控制蛋白、组织分化蛋白、分生组织蛋白、环境反应蛋白、衰老蛋白、激素反应蛋白、脱落蛋白、源蛋白、下落蛋白(sink protein)、花控制蛋白、种子蛋白、除草剂抗性蛋白、疾病抗性蛋白、脂肪酸生物合成酶、生育酚生物合成酶、氨基酸生物合成酶、杀虫蛋白或任何其它试剂，如靶向特定抑制基因以增强SEQ ID NO:1-3的蛋白质表达的反义或RNAi分子。农艺相关基因的产物可以在植物内起作用，以便在植物生理学或代谢后造成影响或者可以充当以植物为食的害虫的食物中的杀虫剂。

[0083] 如本文中所用，“对照植物”意指不含重组DNA的植物，所述重组DNA表达赋予增强性状的蛋白质。对照植物用于鉴别和选择具有增强性状的植物。合适的对照植物可以是用于产生转基因植物的亲本品系的非转基因植物，例如不含重组DNA。在一些情况下，合适的对照植物可以是不含重组DNA的半合子转基因植物品系的后代，称为阴性分离体。

[0084] 如本文中所用，“增强性状”意指转基因植物的如下特征，包括(但不限于)增强的农艺性状，其特征在于增强的昆虫抗性、增强的植物形态、生理学、生长和发育、产率、营养强化、疾病或害虫抗性、或环境或化学耐受性。在本发明的更具体方面，增强性状选自由以下组成的增强性状的群组：增强的水使用效率、增强的耐寒性、增加的产率、增强的氮使用效率、增强的种子蛋白以及增强的种子油。在本发明的一个方面，增强性状是增加的产率，包括在非胁迫条件下的增加的产率和在环境胁迫条件下的增加的产率。胁迫条件可以包括例如干旱、幽暗、真菌疾病、病毒疾病、细菌疾病、昆虫侵扰、线虫侵扰、低温暴露、热暴露、渗透胁迫、降低的氮养分有效性、降低的磷养分有效性以及高植物密度。“产率”可能受到多种性质的影响，包括(但不限于)植物高度、荚果数量、荚果在植物上的位置、节间数量、荚果落粒的发生率、谷粒大小、结瘤固氮效率、营养同化效率、对生物和非生物胁迫的抗性、碳同化、植物构型、对倒伏的抗性、种子发芽百分比、幼苗活力以及幼体性状。产率还会受到发芽效率(包括在胁迫条件下的发芽)、生长速率(包括在胁迫条件下的生长速率)、耳穗数量、每耳穗的种子数量、种子大小、种子组成(淀粉、油、蛋白质)以及种子填充特征的影响。

[0085] 植物的增加的产率可以用多种方式测量，包括测试重量、每株植物的种子数量、种子重量、每单位面积的种子数量(例如，每英亩的种子或种子重量)、每英亩的蒲式耳数、每英亩的吨数、每英亩的吨数、每公顷的千克数。举例来说，玉米产率可以按每单位生产面积的带壳玉米粒的产量来测量，以蒲式耳/英亩或公吨/公顷计，常常在已按约15.5％水分针对水分调整的基础上报告。增加的产率是由对关键生化化合物(如氮、磷和碳水化合物)的利用改良或对环境胁迫(如冷、热、干旱、盐渍以及害虫或病原体的攻击)的反应改良引起的。

[0086] 保守取代和功能片段

[0087] 在比较氨基酸序列时，不相同的残基位置可以通过保守氨基酸取代不同。保守氨基酸取代是指具有类似侧链的残基的互换性。举例来说，具有脂肪族侧链的一组氨基酸是甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸；具有脂肪族羟基侧链的一组氨基酸是丝氨酸和苏氨酸；具有含酰胺侧链的一组氨基酸是天冬酰胺和谷氨酰胺；具有芳香族侧链的一组氨基酸是苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸；具有碱性侧链的一组氨基酸是赖氨酸、精氨酸和组氨酸；并且具有含硫侧链的一组氨基酸是半胱氨酸和蛋氨酸。相对于参考多肽序列，仅相差保守取代的测试多肽序列表示参考序列的“经过保守取代的变异体”。

[0088] 蛋白质、多肽或核酸的“功能片段”是序列与全长蛋白质、多肽或核酸不相同，但仍保留与全长蛋白质、多肽或核酸相同的功能的蛋白质、多肽或核酸。功能片段可以具有比对应的天然分子多、少或相同数量的残基，和/或可以含有一或多个氨基酸或核苷酸取代。用于测定核酸功能(例如，编码功能、与另一个核酸杂交的能力)的方法是本领域中已知的。类似地，用于测定蛋白质功能的方法也是已知的。举例来说，多肽的DNA结合功能可以例如通过过滤结合、电泳迁移率改变或免疫沉淀分析测定。参见奥斯贝等人的同前文献。一种蛋白质与另一种蛋白质相互作用的能力可以例如通过共免疫沉淀、双杂合分析或遗传和生化上的互补测定。参见例如菲尔茨(Fields)等人(1989)自然(Nature)340:245 246；第5,585,245号美国专利和PCT WO 98/44350。

[0089] 功能片段通常保留至少50％的多肽活性或功能。在一些实施例中，功能片段保留至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少99％或100％的多肽活性或功能。

[0090] 多肽的功能片段可以包括基本上不改变多肽活性或功能的保守氨基酸取代(相对于天然多肽序列)。术语“保守氨基酸取代”是指基于某些共同结构和/或性质给氨基酸分组。就共同结构来说，氨基酸可以分成以下各组：具有非极性侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸和色氨酸)；具有不带电极性侧链的氨基酸(丝氨酸、苏氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺、酪氨酸和半胱氨酸)；以及具有带电极性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸、天冬氨酸、谷氨酸和组氨酸)。含有芳香族侧链的一组氨基酸包括苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸。在脯氨酸、色氨酸和组氨酸中存在杂环侧链。在含有非极性侧链的氨基酸组内，含有短烃侧链的氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸)可以与具有较长的非烃侧链的氨基酸(蛋氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸)区别开来。在具有带电极性侧链的氨基酸组内，酸性氨基酸(天冬氨酸、谷氨酸)可以与具有碱性侧链的氨基酸(赖氨酸、精氨酸和组氨酸)区别开来。

[0091] 用于定义个别氨基酸的共同性质的功能方法是为了分析同源生物体的对应蛋白质之间氨基酸改变的标准化频率(舒尔茨G.E.(Schulz,G.E.)和R.H.斯戈默(R.H.Schirmer),蛋白质结构原理(Principles of Protein Structure),施普林格出版社(Springer-Verlag),1979)。根据这类分析，可以定义各组氨基酸，其中一个组内的氨基酸优先在同源蛋白质中彼此取代，并且因此对整体蛋白质结构具有类似影响(舒尔茨G.E.和R.H.斯戈默的同前文献)。根据这种类型的分析，“保守氨基酸取代”是指一个氨基酸残基取代另一个共用氨基酸侧链的化学和物理性质(例如，电荷、大小、疏水性/亲水性)的氨基酸残基。以下是共用某些化学和/或物理性质的氨基酸残基的实例：

[0092] (i)含有带电基团的氨基酸，由Glu、Asp、Lys、Arg和His组成，

[0093] (ii)含有带正电基团的氨基酸，由Lys、Arg和His组成，

[0094] (iii)含有带负电基团的氨基酸，由Glu和Asp组成，

[0095] (iv)含有芳族基的氨基酸，由Phe、Tyr和Trp组成，

[0096] (v)含有氮环基的氨基酸，由His和Trp组成，

[0097] (vi)含有大脂肪族非极性基团的氨基酸，由Val、Leu和Ile组成，

[0098] (vii)含有弱极性基团的氨基酸，由Met和Cys组成，

[0099] (viii)含有小残基的氨基酸，由Ser、Thr、Asp、Asn、Gly、Ala、Glu、Gln和Pro组成，[0100] (ix)含有脂族基的氨基酸，由Val、Leu、Ile、Met和Cys组成，以及

[0101] (x)含有羟基的氨基酸，由Ser和Thr组成。

[0102] 某些“保守取代”可以包括在以下各组氨基酸残基内的取代：gly、ala；val、ile、leu；asp、glu；asn、gln；ser、thr；lys、arg；以及phe、tyr。

[0103] 因此，如上文所举例说明，氨基酸的保守取代对本领域的技术人员来说是已知的并且一般可以在不改变所得分子的生物活性或功能的情况下完成。本领域的技术人员还认识到，一般来说，多肽非必需区域中的单一氨基酸取代基本上不改变生物活性。参见例如沃森(Watson)等人“, 基因的分子生物学(Molecular Biology of the Gene),”第4版,1987,本杰明/卡明斯出版公司(The Benjamin/Cummings Pub.Co.),加利福尼亚州门洛帕克(Menlo Park,CA),第224页。

[0104] 本发明多肽涵盖相较于如SEQ ID NO:1-3中所阐述的氨基酸序列具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10或更多个氨基酸取代(例如保守氨基酸取代)的多肽。可以被取代的氨基酸残基可以位于非高度保守的残基位置。一般技术人员将了解，基于活性位点的位置和/或与相关蛋白质的同源性，蛋白质将耐受在其某些氨基酸残基处的取代、缺失和/或插入，且不显著改变其整体物理和化学性质。

[0105] 本发明多肽涵盖具有与SEQ ID NO:1-3中所示的多肽中的任何一个至少75％、至少80％、至少90％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％一致的氨基酸序列的多肽。

[0106] RNA抑制

[0107] 调节蛋白质表达的小RNA包括miRNA和ta-siRNA。miRNA是小(通常约21个核苷酸)RNA，它通过结合到靶蛋白的信使RNA，引起靶蛋白信使RNA不稳定或抑制靶蛋白信使RNA的转译，最终引起靶蛋白减少，从而具有调整靶基因的表达的能力。艾伦(Allen)和卡林顿(Carrington)在美国专利申请公开US 2006/0174380A1中披露了ta-siRNA构筑体的设计和构筑以及其在调整转基因植物细胞中的蛋白质方面的用途，所述公开以引用的方式并入本文中。这类小RNA的表达或抑制是本发明的宜参考miRNA的使用来加以说明的方面。

[0108] 可以使用重组DNA构筑体，通过各种手段修饰天然miRNA的活性。通过增加miRNA的表达，例如在时间上或在空间上，可以增强对天然靶基因的表达的调整。用于抑制靶蛋白的表达的替代性基因抑制方法可以包括使用重组DNA构筑体，它产生一种合成miRNA，所述合成miRNA被设计成用于结合到靶蛋白信使RNA上的天然或合成miRNA识别位点。

[0109] 通过降低miRNA的表达，可以减弱对天然靶基因的调整，促使靶蛋白(如SEQ IDNO:1-3)的表达增强。更确切地说，可以通过抑制结合到从靶蛋白的天然基因转录的信使RNA中的识别位点的miRNA的活性来增强靶蛋白的表达。可以设计若干类型的重组DNA构筑体来抑制miRNA的活性。

[0110] 举例来说，产生大量具有miRNA识别位点的RNA的重组DNA构筑体可以用作天然miRNA的诱饵，使具有miRNA识别位点的内源性信使RNA在无天然miRNA干扰的情况下转译成靶蛋白。产生具有经修饰的miRNA识别位点(例如具有在位置10和/或11在21mer miRNA识别位点中的关于天然miRNA不成对的核苷酸)的RNA的重组DNA构筑体可以用来螯合自然表达的miRNA，从而减少通常在miRNA结合到识别位点时发生的裂解。不成对的核苷酸可以例如通过位置10与11之间的额外核苷酸或通过位置10和11处的核苷酸取代产生。

[0111] 此外，可以产生如下重组DNA构筑体，它产生的RNA可以在植物中被加工成可以结合内源性miRNA识别位点，但不能够诱导mRNA裂解的合成小RNA(miRNA样)，这是因为小RNA经过修饰，例如通过具有在位置10和/或11的经修饰的核苷酸或具有缺失，所述缺失在小RNA与miRNA识别位点配对，在位置10与11之间产生凸起。所得合成小RNA是裂解阻断剂，可以减少内源性miRNA结合并且从而阻断所保护的miRNA目标位点的裂解，增强靶蛋白的表达。

[0112] 被设计成用于产生蛋白质的经修饰信使RNA的重组DNA构筑体也可以用于从不再受天然miRNA调整的异源信使RNA表达蛋白质，其中天然miRNA识别位点经过修饰以对调节天然基因的同源miRNA的结合具有抗性。

[0113] 通过增强miRNA的表达或通过增强miRNA结合编码靶蛋白的RNA的能力来增强miRNA下调内源性蛋白质的活性。设计一种编码RNA的重组DNA，所述RNA编码miRNA或miRNA敏感性信使RNA，其编码添加有miRNA结合位点的蛋白质，从而增强miRNA活性，促使对靶mRNA和同源蛋白质的抑制增强。使用美国专利申请公开US 2009/0070898A1中所披露的方法设计编码RNA的重组DNA，所述RNA编码miRNA或miRNA敏感性RNA。

[0114] 一些(如果不是很多)miRNA调整多个蛋白质的表达或生化路径。抑制或增强特定蛋白质的表达所提供给植物的增强性状不如通过调整miRNA水平改变路径中的酶活性来得多。因此，本发明的一些方面通过在植物细胞中使用可产生提高水平的miRNA的重组DNA构筑体增强miRNA活性来实现。本发明的其它方面通过在转基因植物细胞中使用可产生降低水平或活性的miRNA的重组DNA构筑体降低miRNA活性来实现。

[0115] 活性紫色细菌核酸

[0116] 还提供了编码活性紫色细菌基因的核苷酸序列和功能性RNA分子(例如，rRNA、tRNA)的核苷酸序列(SEQ ID NO:4-6)。还提供了包含这些序列的核酸。还提供了活性紫色细菌基因序列的片段。这类片段的长度是10个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、或1,000个或更多个核苷酸。还提供了具有与上述序列50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、
97％、98％、99％或99.9％一致的序列的核酸。本文中所披露的核酸可以是DNA或RNA，并且可以是单链或双链。还提供了包含与上述序列互补的核苷酸序列的核酸作为在严格条件下杂交到上述核酸的核酸。

[0117] 本发明还提供多核苷酸，其包含编码本文中所披露的多肽序列中的任一个的核苷酸序列。这类多核苷酸的核苷酸序列与编码本文中所披露的多肽中的任一个的核酸的连续序列至少70％(例如，至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％、至少99％、至少99.5％或100％)一致。一致性百分比是基于所比较的序列中较短的序列。可以采用已知程序，如BLASTN(2.0.8)(奥特查尔等人(1997)核酸研究25:3389-3402)，使用默认参数并且不使用过滤器来进行序列比较。由于遗传密码的简并，所以核酸序列一致性(例如编码相同氨基酸序列的两个不同多核苷酸之间)可能低于氨基酸序列一致性百分比。

[0118] 编码本发明多肽的多核苷酸中的核酸序列的实例可见于SEQ ID NO:4-6中。也可以在表达载体中提供这些核酸序列(参见下文)。

[0119] 活性紫色细菌多肽和蛋白质

[0120] 本发明提供由活性紫色细菌基因组编码的蛋白质的氨基酸序列，以及包含所述氨基酸序列(即，SEQ ID NO:1-3)的多肽。还提供了所述多肽的功能片段和经过保守取代的变异体。另外，还提供了本文中所披露的多肽的不保留功能的片段并且所述片段适用作例如用于制造抗体的表位。这类片段的长度是4个或更多个、10个或更多个、25个或更多个、50个或更多个、75个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、500个或更多个、或1,000个或更多个氨基酸。

[0121] 本发明还提供了一种多肽，它包含与如本文中所披露的多肽的连续序列至少50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％、96％、97％、98％、98.5％、99％、
99.5％或99.9％一致的氨基酸序列。一致性百分比是基于所比较的序列中较短的序列。用于测定多肽序列一致性程度的方法是本领域中已知的。

[0122] 本发明多肽可以包括源自SEQ ID NO:1-3中的任一个的氨基酸序列，其进一步包含异源氨基酸序列。这类多肽可以是融合蛋白，如含有表位标签、纯化标签和/或可检测标记的融合蛋白。融合蛋白可以任选地在异源序列与活性紫色细菌氨基酸序列之间包括连接子序列。融合蛋白的制造方法是本领域中已知的。其它异源元件和例示性融合蛋白更详细地描述于下文中。

[0123] 含有异源元件的例示性多肽可以包括myc和/或His6标签并且可以任选地包括侧接连接子序列。

[0124] 本发明多肽进一步涵盖连接到报告多肽(例如荧光蛋白)和/或结合到分子的多肽。结合到多肽的分子可以是载体分子或有助于传递本发明多肽和/或增加本发明多肽的半衰期的部分。

[0125] 本发明多肽可以通过任何合适的方法产生，包括重组和非重组方法(例如，化学合成)。本发明多肽可以通过本领域中已知的固相合成方法制备，(例如，Fmoc-或t-Boc化学法)，如梅里菲尔德(Merrifield)(1963)美国化学学会杂志(J.Am.Chem.Soc.)85:2149和分子生物学方法(Methods  in Molecular Biology),第35卷:肽合成方案(Peptide Synthesis Protocol)所述的方法。

[0126] 应注意，本发明多肽还可以含有额外元件，如可检测标记，例如放射性标记、荧光标记、生物素标记、免疫可检测标记(例如，血球凝集素(HA)标签、多组氨酸标签)等。可以通过各种方法(例如，以融合多肽形式)提供额外元件以促进本发明多肽的表达(例如N端蛋氨酸和/或用于促进宿主细胞中的表达的异源信号序列)和/或分离(例如，生物素标签、免疫可检测标签)。多肽还可以任选地通过共价或非共价连接固定于载体上。

[0127] 本发明多肽的分离和纯化可以根据本领域中已知的方法实现。术语“经分离”打算意指化合物(例如多肽或多核苷酸)与它在自然界中所伴随的所有或一些组分分离。“经分离”还指化合物在制造(例如，化学合成、重组表达、培养基等)期间与它所伴随的所有或一些组分分离的状态。

[0128] 举例来说，根据本发明的多肽可以从已经经过基因修饰以表达本发明多肽的细胞溶解产物中、从细胞培养基中或从合成的反应混合物中分离。分离另外可以通过免疫亲和力纯化实现，免疫亲和力纯化一般涉及使样品与特异性结合到多肽表位的抗体(任选地固定)接触，洗涤以去除非特异性结合的材料，并且洗脱特异性结合的多肽。经分离多肽可以进一步通过透析和蛋白质纯化中通常采用的其它方法纯化，例如金属螯合色谱、离子交换和尺寸排阻。

[0129] 同源物

[0130] 在又另一个实施例中，本发明提供获得本文中所披露的活性紫色细菌基因的片段的同源物和由本文中所披露的ORF编码的蛋白质的同源物的方法。具体地说，通过使用本文中所披露的核苷酸和氨基酸序列作为探针或作为引物，并且使用如PCR克隆和菌落/噬菌斑杂交等技术，本领域的普通技术人员可以获得所述同源物。这类同源物可以从任何生物体获得；例如色素杆菌属的其它种或其它细菌。

[0131] 在另一个实施例中，可以通过例如手动比较氨基酸序列，或通过使用基于计算机的工具，使用已知的基于同源性的搜索算法，如通常已知的并且被称为BLAST、FASTA和史密斯-沃特曼的那些算法来鉴别同源物。可以使用局部序列比对程序(例如BLAST)搜索序列数据库，寻找类似序列，并使用总计预期值(E值)测量序列碱基相似性。因为针对特定生物体具有最佳E值的蛋白质命中(hit)可能不一定是直系同源物，例如具有相同功能，或者不一定是唯一的直系同源物，所以使用倒易移位查询(reciprocal query)来过滤针对直系同源物鉴别具有显著E值的命中序列。倒易移位查询需要搜索来自基础生物体的氨基酸序列数据库中类似于查询蛋白质的序列的显著命中。当倒易移位查询的最佳命中是查询蛋白质本身或由物种形成后复制的基因编码的蛋白质时，命中可以被鉴定为是直系同源物。由适用于本发明转基因植物中的DNA编码的同源物的另一方面是由于在天然序列中缺失或插入一或多个氨基酸而不同于所披露蛋白质的那些蛋白质。

[0132] 抗体、检测方法、试剂盒

[0133] 还提供了选择性结合由活性紫色细菌基因(如SEQ ID NO:1-3)编码的蛋白质或多肽片段的抗体。这类抗体另外可以包含可检测标记和/或连接到固体载体。这类抗体包括单克隆和多克隆抗体。还提供了产生上述单克隆抗体的融合瘤。

[0134] 在其它实施例中，本发明提供鉴别测试样品的方法，所述测试样品源自细胞，所述细胞表达本文中所披露的ORF中的一或多个或其同源物。这类方法包含在允许本领域技术人员判定样品是否含有ORF(或其一部分)或由其产生的产物的条件下，将测试样品与一或多种本发明抗体或活性紫色细菌基因的一或多个片段一起培育。

[0135] 在其它实施例中，提供含有执行上述分析所需的试剂的试剂盒。具体地说，本文提供一种分区试剂盒，它被设计成用于以紧密约束容纳一或多个容器，其包含：(a)第一容器，包含抗体中的一种或本发明的活性紫色细菌基因片段中的一种；和(b)一或多个包含以下中的一或多个的其它容器：洗涤试剂、能够检测结合抗体的存在情况的试剂或能够检测杂交核酸的存在情况的试剂。

[0136] 使用本文中所披露的经分离蛋白质，本发明进一步提供获得并且鉴别能够结合到由活性紫色细菌ORF编码的蛋白质的试剂的方法。具体地说，这类试剂包括抗体(上文所述)、肽、碳水化合物、药学制剂等。这类方法包含以下步骤：(a)使试剂与由本文中所披露的ORF中的一种编码的经分离蛋白质接触；和(b)判定试剂是否结合到所述蛋白质。用于检测蛋白质-蛋白质结合的方法是本领域中已知的并且包括例如过滤结合、免疫沉淀、双杂合分析、凝胶阻滞以及报告亚单位互补(reporter subunit complementation)。参见例如美国专利5,503,977和5,585,245；菲尔茨(Fields)等人(1989)自然340:245-247；白(Bai)等人(1996)酶学方法(Meth.Enzymol.)273:331-347以及罗(Luo)等人(1997)生物技术(BioTechniques)22:350-352。

[0137] 载体

[0138] 关于使用重组技术产生多肽的实施例，方法可以涉及任何合适的构筑体和任何合适的宿主细胞，它可以是原核或真核细胞(例如细菌宿主细胞、酵母宿主细胞、植物宿主细胞、昆虫宿主细胞或经过培养的哺乳动物宿主细胞)。用于将遗传物质引入到宿主细胞中的方法是本领域中已知的并且包括例如生物射弹、转化、电穿孔、脂质体转染、结合、磷酸钙共沉淀等。转移方法可以经过选择，从而实现所引入的编码多肽的核酸的稳定表达。可以提供编码多肽的核酸作为可遗传的游离元件(例如，质粒)或可以对它进行基因整合。

[0139] 还可以使用病毒载体进行本文中所披露的核酸的克隆和表达。例示性植物病毒载体包括花椰菜花叶病毒(CaMV)、豌豆早枯病毒(PEBV)、菜豆荚斑点病毒(BPMV)、黄瓜花叶病毒(CMV)、苹果潜隐球形病毒(ALSV)、烟草花叶病毒(TMV)、马铃薯病毒X、雀麦草花叶病毒(BMV)以及大麦条纹花叶病毒(BSMV)。

[0140] 可以使用其它载体在非植物生物体中表达活性紫色细菌多肽序列。这些载体包括原核克隆载体(例如，pBR322、pUC、噬菌体λ)、真菌载体(例如，酵母2微米质粒)、昆虫克隆载体(例如，杆状病毒)以及哺乳动物载体(例如，SV40)。

[0141] 适合转移编码多肽的核酸的载体的组成可以不同。整合载体可以是条件复制型或自杀质粒、噬菌体等。构筑体可以包括各种元件，包括例如启动子、可选择遗传标记(例如，赋予抗生素抗性的基因，例如新霉素(neomycin)、G418、甲氨蝶呤(methotrexate)、氨苄青霉素(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、红霉素(erythromycin)、氯霉素(chloramphenicol)或健大霉素(gentamycin))、复制起点(用于促进宿主细胞中的复制，例如细菌宿主细胞)等。载体的选择取决于各种因素，如期望繁殖的细胞的类型和繁殖的目的。某些载体适用于扩增和制造大量所要DNA序列。其它载体适合于在细胞中表达蛋白质。
其它载体适合于在完整的动物或植物的细胞中转移和表达。适当载体的选择完全在本领域的技术范围内。多种此类载体是可商购的。

[0142] 所用载体可以是基于游离质粒的表达载体，所述游离质粒含有可选择抗药性标记和在不同的宿主细胞中实现自主复制的元件。载体在本领域的普通技术人员众所周知的众多出版物中有充分描述，所述出版物包括例如分子生物学短方案(Short Protocols in Molecular Biology),(1999)F.奥斯贝等人编,威利父子公司(Wiley&Sons)。载体可以实现编码本发明多肽的核酸的表达，可以实现本发明核酸的繁殖，或实现这两者。

[0143] 构筑体可以通过例如将相关多核苷酸插入到构筑体主链中来制备，通常是借助于连接到载体中的已裂解的限制酶位点的DNA连接酶。或者，可以通过同源重组或位点特异性重组，或通过一或多种扩增方法(例如，PCR)插入所要核苷酸序列。通常通过将同源性区域连接到所要核苷酸序列的侧接序列上的载体来实现同源重组，同时可以通过使用有助于位点特异性重组(例如，cre-lox、att位点等)的序列实现位点特异性重组。含有这类序列的核酸可以通过例如寡核苷酸的连接或通过聚合酶链反应，使用包含同源性区域和所要核苷酸序列的一部分的引物来添加。

[0144] 关于相关多肽的表达，可以采用表达盒。因此，本发明提供一种包含本发明核酸的重组性表达载体。表达载体可以提供转录和转译调控序列，并且还可以实现诱导型或组成型表达，其中将编码区可操作地放置在转录起始区(例如，启动子、增强子)以及转录和转译终止区的转录控制下。这些控制区域可以是活性紫色细菌基因组与生俱来的，或可以源自外源性来源。因此，来自外源性来源的控制区域可以被视为可操作地连接于编码本发明多肽的核酸的异源元件。一般来说，转录和转译调控序列可以包括(但不限于)启动子序列、操纵基因序列、核糖体结合位点、转录开始和停止序列、转译开始和停止序列、聚腺苷酸化位点以及增强子或活化子序列。启动子可以是组成型或诱导型，并且可以是强组成型启动子(例如，T7启动子、SP6启动子等)。

[0145] 可以在本文中所披露的重组构筑体中使用的例示性植物调控序列包括组成型启动子，如CaMV 19S和35S启动子以及来自编码肌动蛋白或泛素的基因的那些。或者，还可以使用经过调节的启动子，如经过化学调节的启动子(例如，经过四环素调节)；和伤口诱导型启动子(在伤口位点和在植物病原性感染位点表达)。在其它实施例中，启动子可以是组织特异性的(例如，指定在根、叶、花、花序中表达)和/或时间调节型(例如，指定在幼苗中表达)。

[0146] 用于植物细胞中的其它启动子已有描述。参见例如斯坦福(Stanford)等人(1989)分子遗传学与普通遗传学(Mol.Gen.Genet.)215:200-208；许(Xu)等人(1993)植物分子生物学(Plant Molec.Biol.)22:573-588；罗格曼(Logemann)等人(1989)植物细胞(PlantCell)1:151-158；罗尔迈尔(Rohrmeier)和莱勒(Lehle)(1993)植物分子生物学22:
783-792；费雷克(Firek)等人(1993)植物分子生物学22:129-142以及华纳(Warner)等人(1993)植物杂志(Plant J.)3:191-201。

[0147] 共同植物转译起始序列(即，核糖体结合位点)已经由乔希(Joshi)(1987)核酸研究15:6643-6653和克隆科技公司(Clontech)目录1993/1994,第210页描述。

[0148] 表达载体一般具有便利的限制位点，其位于启动子序列附近以实现编码相关蛋白质的核酸序列的插入。可以存在可在表达宿主中操作的可选择标记以促进含有载体的细胞的选择。另外，表达构筑体可以包括其它元件。举例来说，表达载体可以具有一个或两个复制系统，从而允许它例如在用于表达的植物或昆虫细胞中和在用于克隆和扩增的原核宿主中得以维持。另外，表达构筑体可以含有可选择标记基因以选择经过转化的宿主细胞。选择基因是本领域中已知的并且取决于所用宿主细胞而改变。

[0149] 本文中提供的表达载体含有上述核酸和/或多核苷酸。这类表达载体可以含有启动子(例如，T7启动子、T3启动子、SP6启动子、大肠杆菌RNA聚合酶启动子、lac启动子和其衍生物、tac启动子、trp启动子、阿拉伯糖诱导型PBAD启动子、L-鼠李糖诱导型rhaPBAD启动子、噬菌体λ启动子(例如PL)、CMV启动子、SV40启动子、PGK启动子、EF-1α启动子)、操纵基因、转录终止信号(例如，SV40终止信号)、剪接位点(例如，SV40剪接位点、β-血球蛋白剪接位点)、核糖体结合位点、信号序列(例如，免疫球蛋白κ信号序列)、表位标签(例如，myc、FLAG)、纯化标签(例如，His6)、复制起点和药物选择标记。编码连接子氨基酸和/或包含限制酶识别位点的连接子序列或任何其它类型的连接子序列也可以可操作地连接到存在于本文中所披露的载体中的编码本发明多肽的核酸。

[0150] 粘粒库可以通过本领域中已知的方法制备。参见例如马尼亚迪斯(Maniatis)等人分子克隆实验指南.冷泉港出版社,第2版,1989和萨姆布鲁克等人，2001。这类文库可以用于细胞、或上清液、全细胞培养液、无细胞溶解产物、或源自细胞的提取物的基于序列的筛选和任何类型的功能性筛选。用于除草剂筛选、酶活性、抗癌活性等的高通量生物分析是本领域中已知的并且描述于文献中。另外参见其中的实例7-11。

[0151] 宿主细胞

[0152] 本发明进一步涵盖含有外源性多核苷酸的重组宿主细胞。所述多核苷酸可以包含如本文中所披露的活性紫色细菌基因的一或多个片段，或可以编码本发明多肽中的一或多个。宿主细胞可以是原核的(例如，细菌)或真核的(例如，酵母、昆虫、哺乳动物)。宿主还可以是合成细胞。

[0153] 在某些实施例中，宿主细胞是微生物。合适的微生物是能够定殖于植物组织(例如根、茎、叶、花、内部以及表面上)或根围的那些微生物，以此方式它们开始与昆虫害虫接触。一些宿主微生物还能够定殖于昆虫害虫的肠道，并且能够从一只昆虫传递到另一只昆虫。
宿主微生物还可以定殖于植物害虫的肠道和体表。宿主细胞还可以用作用于制造活性紫色细菌蛋白质或用于制造一或多种通过活性紫色细菌蛋白质的活动产生的化合物的微生物工厂，所述化合物如肽、脂质、脂肽、糖蛋白、次级代谢物、抗生素以及小有机化合物。

[0154] 适合于异源表达的革兰氏阴性微生物包括：大肠杆菌(例如，大肠杆菌K12、大肠杆菌BL21)、假单胞菌属(Pseudomonas  sp.)(例如荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)、桔黄假单胞菌(Psuedomonas aurantiaca)、金色假单胞菌(Psuedomonas aureofaciens)、防御假单胞菌(Psuedomonas protegens))、肠杆菌属(Enterobacter sp.)(例如阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae))以及沙雷氏菌属(Serratia sp.)。例示性大肠杆菌菌株包括大肠杆菌BL21和大肠杆菌K12用于常规表达。其它用于更专门的目的的大肠杆菌菌株是呈现蛋白酶缺乏的大肠杆菌菌株(BL21-B838)和过度表达膜蛋白质的大肠杆菌菌株，如BL21衍生物DE3、C41(DE3)和C43(DE3)。

[0155] 用于在大肠杆菌中高水平表达异源蛋白质的方法是已知的并且包括(a)IPTG诱导方法，(b)自诱导方法，以及(c)高细胞密度IPTG诱导方法。参见例如萨瓦欣木加姆(Sivashanmugam)等人(2009)。

[0156] 适合于异源表达的革兰氏阳性微生物包括芽孢杆菌属(Bacillus sp.)(例如，巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、蜡样芽孢杆菌)和链霉菌属(Streptomyces sp.)。使用杆菌作为表达宿主的一个优势是这个属的成员产生孢子，孢子提供调配物较佳的稳定性和较长的保存期限。基于巨大芽孢杆菌和枯草芽孢杆菌的表达系统可购自MoBiTec(德国)。使用在木糖操纵子的启动子的控制下，相关核苷酸序列可以在巨大芽孢杆菌中表达。

[0157] 适合于异源表达的真菌微生物包括木霉属(Trichoderma  sp.)、粘帚霉(Gliocadium)、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)以及巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)。可以通过原生质体介导的转化，使用聚乙二醇(PEG)或通过基于电穿孔的方法，将异源DNA引入丝状真菌中。粒子轰击是另一种已成功用于转化真菌细胞的方法。

[0158] 用于转化酿酒酵母的方法和组合物是本领域中已知的。举例来说，可以在诱导型启动子(如GAL1)和CYC1终止子的控制下，将核酸克隆到合适的载体(例如，YES载体(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司(Invitrogen,Carlsbad,CA))中，并且使它在酿酒酵母中表达。可以测试所得细胞的所期望的活性或蛋白质表达情况。

[0159] 异源表达还可以在其它酵母物种中进行(杰弗里斯(Jeffries)等人，2010)，如巴斯德毕赤酵母、多形汉逊酵母(Hansenula polymorpha)、陆地酵母(Arxula adenivorans)以及解脂耶氏酵母(Yarrowia lipolytica)。巴斯德毕赤酵母的转化可以通过使用商业试剂盒实现，所述商业试剂盒如PichiaPink表达系统(加利福尼亚州卡尔斯巴德的英杰公司)、毕赤酵母属经典蛋白质表达系统或Pichia GlycoSwitch(用于糖基化蛋白质)(亚利桑那州土桑的技术研究公司(Research Corporation Technologies,Tucson,AZ))。关于酵母巴斯德毕赤酵母或多形汉逊酵母的转化，还可以使用电穿孔。

[0160] 在某些实施例中，使用能够在植物组织内存活并且复制的非致病性共生细菌(即，内寄生菌)或能够定殖于叶圈或根围中的非致病性共生细菌(即，体表寄生菌)。这类细菌包括农杆菌属(Agrobacterium)、产碱杆菌属(Alcaligenes)、固氮螺菌属(Azospirillum)、固氮菌属(Azotobacter)、杆菌属(Bacillus)、棍状杆菌属(Clavibacter)、肠杆菌属(Enterobacter)、欧文菌属(Erwinia)、黄杆菌属(Flavobacter)、克雷伯氏菌
(Klebsiella)、假单胞菌属(Pseudomonas)、根瘤菌属(Rhizobium)、沙雷氏菌属
(Serratia)、链霉菌属以及黄单胞菌属(Xanthomonas)的细菌。

[0161] 还可以使用共生真菌(如木霉属(Trichoderma)和粘帚霉属(Gliocladium))作为用于本文中所披露的序列的繁殖和/或表达的宿主。

[0162] 调配物和杀虫组合物

[0163] 本发明提供包含本文中所披露的核酸和多肽的杀虫(例如，杀昆虫)组合物和调配物。

[0164] “害虫”是增加植物的死亡率和/或减缓、妨碍或以其它方式改变植物生长的生物体(原核、真核或古生菌)。害虫包括(但不限于)线虫、昆虫、真菌、细菌和病毒。

[0165] 如本文中所定义的“杀虫剂”是源自生物产品或化学物质的增加植物害虫的死亡率和/或抑制植物害虫的生长速率的物质。杀虫剂包括(但不限于)杀线虫剂、杀昆虫剂、除草剂、植物杀真菌剂、植物杀细菌剂以及植物杀病毒剂。

[0166] 如本文所定义的“生物杀虫剂”是具有杀虫性质的微生物。

[0167] “杀虫组合物”是包含杀虫剂和任选地一或多种其它组分的调配物。其它组分包括(但不限于)溶剂(例如，乙酸戊酯、四氯化碳、二氯化乙烯；煤油、二甲苯、松树油以及EPA清单4a和4b中列出的其它物质等)、载剂(例如，有机面粉、胡桃壳面粉、树皮)、粉状矿物(硫、硅藻土、板状硅石、石灰、石膏滑石、叶蜡石)、粘土(绿坡缕石、膨润土、高岭土、火山灰以及EPA清单4a和4b中列出的其它物质)、稳定剂、乳化剂(例如，碱性皂、有机胺、长链醇的硫酸盐和如海藻酸盐、碳水化合物、胶状物、脂质以及蛋白质等材料，以及EPA清单4a和4b中列出的其它物质)、表面活性剂(例如，EPA清单4a和4b中列出的那些物质)、抗氧化剂、防晒液、第二化学或生物杀虫剂(例如，杀昆虫剂、杀线虫剂、杀螨剂、除藻剂、杀真菌剂、杀细菌剂)、除草剂和/或抗生素。

[0168] 如本文中所定义的“载剂”是惰性有机或无机材料，活性成分与它混合或调配可有助于将活性成分施用到植物或其它待处理的物体，或有助于活性成分的储存、运输和/或处置。

[0169] 如本文中所披露的杀虫组合物适用于调整植物中的害虫侵扰。如本文中所定义的术语“调整”用于意指改变害虫侵扰的量或害虫侵扰扩散的速率。一般来说，这类改变是降低侵扰的程度和/或比率和/或扩散。

[0170] 如本文中所定义的术语“害虫侵扰”是害虫以造成有害影响的量存在，所述有害影响包括宿主群体的疾病或感染或在生长系统中出现不当的野草。例示性植物害虫包括(但不限于)螨虫(例如，棉叶螨(Tetranychus urticae)(二斑叶螨))、果蝇(例如，樱桃果蝇(Drosophila suzukii)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster))、苍蝇(例如，家蝇(Muscadomestica))、蛛形纲动物(例如，壁虱属(Acari spp.))、根蛆(花蝇属(Anthomyidae spp.)，例如甘蓝菜根蛆)、蚜虫(例如，桃蚜(Myzus persicae)(桃蚜(green peach aphid)))、个木虱属(Triozidae spp.)(例如，马铃薯尖翅木虱(马铃薯木虱(Bactericera cockerelli)))、甲虫(拟步甲属(Tenebrionidae spp.)，例如枯叶甲虫(黑菌虫(Alphitobius diaperinus)))、蛆(例如白蛴螬(圆头无斑犀金龟(Cyclocephala 
lurida)))、南方假面金龟子(欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis))、日本甲虫(日本丽金龟(Popillia japonica))幼虫、葡萄黑象甲(黑葡萄耳象(Otiorhyncus sulcatus))幼虫、东方甲虫(东方丽金龟(Anomala  orientalis))幼虫、圣甲虫(例如，金龟子属
(Scarabaeidae spp.))、线虫(例如，根节线虫(根结线虫属(Meloidogyne spp.)))、真菌、细菌以及各种植物病毒，例如烟草花叶病毒、番茄斑萎病毒、番茄黄化曲叶病毒、黄瓜花叶病毒、马铃薯病毒Y、花椰菜花叶病毒、非洲木薯花叶病毒、李痘病毒、雀麦草花叶病毒、马铃薯病毒X、柑桔衰退病毒、大麦黄矮病毒、马铃薯卷叶病毒以及番茄丛矮病毒。

[0171] 如本文中所披露的杀虫组合物可以出于预防或调整目的使用。当以预防方式提供时，在任何侵扰症状之前提供组合物。组合物的预防性投与用以预防、减弱任何后续感染或侵扰的发作或降低发作率。当出于调整目的提供时，在感染或侵扰迹象开始时(或在开始后不久)提供。化合物的调整性投与用以减弱感染或侵扰的病理症状和增加恢复速率。

[0172] 可以采用其它方法来控制作用的持续时间。可以通过用聚合物复合或吸收组合物组分中的一或多种来实现控制释放。为了控制释放，可以通过选择适当大分子(例如聚酯、聚氨基酸、聚乙烯化合物、吡咯烷酮、乙烯乙酸乙烯酯、甲基纤维素、羧甲基纤维素、或鱼精蛋白、硫酸盐)和大分子的浓度以及并入方法来练习控制传递。通过控制释放制剂来控制作用的持续时间的另一种可能的方法是将如本文中所披露的组合物并入到聚合物材料粒子中，所述聚合物材料如聚酯、聚氨基酸、水凝胶、聚(乳酸)或乙烯乙酸乙烯酯共聚物。或者，代替将这些组合物并入到聚合物粒子中，可能例如通过凝聚技术或通过界面聚合使这些材料陷入所制备的微胶囊中，例如分别陷入羟甲基纤维素或明胶微胶囊和聚(甲基丙烯酸甲酯)微胶囊中；或者使这些材料陷入胶质传递系统中，例如脂质体、白蛋白微球、微乳液、纳米粒子和纳米胶囊或粗乳液中。这类技术是本领域中已知的。

[0173] 如本文中所披露的杀虫组合物(例如，杀虫毒素)可以通过所选择的活性紫色细菌基因序列在适合实验室规模、中试规模和生产规模的发酵的异源宿主中表达而产生(例如，大肠杆菌、假单胞菌属、酵母等)。毒素可以通过本领域中已知的发酵程序，使用异源宿主产生，并且直接调配，或在从发酵培养液中提取并纯化毒素之后进行调配。调配物可以包括活细胞或非活细胞。

[0174] 本文中所披露的杀虫组合物可以按任何方式调配。非限制性调配物实例包括(但不限于)可乳化浓缩物(EC)、可湿性粉剂(WP)、可溶性液体(SL)、气雾剂、超低体积浓缩溶液(ULV)、可溶性粉剂(SP)、微胶囊、水分散粒剂、流体(FL)、微乳液(ME)、纳米乳液(NE)等。在本文中所述的调配物中的任一个中，活性成分的百分比在0.01％到99.99％范围内。杀虫剂调配物的详细说明可见于以下各者中：柯克·奥思默化工百科全书(Kirk-Othmer Encyclopedia of Chemical Technology)；诺尔斯A(Knowles,A).2005.作物保护产品调配物的新发展(New Developments in Crop Protection Product Formulation),Agrow报导,英国伦敦(London,UK)；瓦肯堡W.范(Valkenburg,W.van)(编)1973,杀虫剂调配物(Pesticide Formulation),马塞尔·德克尔(Marcel Dekker),美国纽约(New York,USA)；
诺尔斯D.A.(编)1998,农业化学调配物的化学和技术(Chemistry and Technology of Agrochemical Formulations),克吕维尔科学出版社(Kluwer Academic Publishers),荷兰多德勒克(Dordrecht,the Netherlands)。

[0175] 粉末和粉尘调配物

[0176] 这些调配物是通常含有0.1-25％活性成分的单一调配物。然而，视效能和特定应用而定，可以使用较高浓度的活性成分。杀虫剂毒素与固体载剂、优选小粒度固体载剂混合。固体载剂可以包括：硅酸盐粘土(例如，绿坡缕石、膨润土、火山灰、蒙脱土、高岭土、滑石、硅藻土等)、碳酸盐(例如，方解石、白云石等)、合成物(沉淀二氧化硅、烟雾状二氧化硅等)、经过研磨的植物性药材(例如，玉米棒屑、稻壳、椰子壳等)、有机面粉(例如，胡桃壳面粉、树皮等)或粉状矿物(例如，硫、硅藻土、板状硅石、石灰、石膏滑石、叶蜡石等)。粉尘调配物中所用的惰性成分还可以来自EPA惰性清单中针对常规调配物的4a(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Acas.pdf)和针对有机调配物的4b(www.epa.gov/
opprd001/inerts/inerts_list4Bname.pdf)中列出的那些惰性成分。小粒度可以通过将活性成分与载剂混合并在碾磨机中粉碎来实现。粉尘定义为粒度小于100微米；并且随着粒度增加，调配物的毒性降低。在选择粉尘调配物时，应考虑其相容性、精细度、容积密度、流动性、磨损性、可吸收性、比重以及成本。例示性粉尘调配物提供于表1中。

[0177] 表1

[0178]

[0179] 粉尘调配物还可以由以1-10％添加到1:1有机填料/滑石组合中的粉尘浓缩物(例如，40％活性成分、5％稳定剂、20％二氧化硅、35％碳酸镁)制备。

[0180] 粉尘调配物被用作针对爬行昆虫的接触粉末(CP)或追踪粉末(TP)。

[0181] 具有高流动性的粉尘调配物可以在温室中通过气动设备施用。

[0182] 颗粒和球粒调配物

[0183] 杀虫毒素以液体形式施加到多孔材料粗颗粒(例如，粘土、胡桃壳、蛭石、硅藻土、玉米棒、绿坡缕石、蒙脱土、高岭土、滑石、硅藻土、方解石、白云石、二氧化硅、稻壳、椰子壳等)。颗粒或球粒可以是水分散性的，并且可以通过挤出(针对具有低水溶性的杀虫活性剂)、聚集或喷雾干燥形成。颗粒还可以用杀虫毒素的基于溶剂的溶液包覆或浸渍。载剂粒子可以选自EPA惰性清单中针对常规调配物的4a(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Acas.pdf)和针对有机调配物的4b(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Bname.pdf)中列出的那些载剂粒子。活性成分可以被载剂材料吸收或被包覆在颗粒表面上。粒度可以按直径在250到1250微米(0.25mm到2.38mm)之间变化。调配物通常含有2到10％浓度的毒剂。颗粒以10kg/ha的比例施用到水中或植物轮生体中或土壤中。通过施用到土壤中，使用内吸杀昆虫剂的颗粒调配物来防治刺吸口器式害虫和土壤害虫。轮生体涂药用于防治如高粱、玉米和甘蔗等作物的钻蛀性害虫。这些类型的调配物减少了漂移并且允许较慢地释放杀虫组合物。

[0184] 颗粒杀虫剂最常用于向土壤施用化学药品来防治野草、火蚁、线虫和在土壤中生活的昆虫或用于通过根吸收到植物中。颗粒调配物有时通过飞机或直升机施用以使漂移降到最低或穿过茂密的植被。施用后，颗粒缓慢地释放出活性成分。一些颗粒需要土壤水分来释放活性成分。颗粒调配物还用于防治蚊子幼虫和其它水生害虫。颗粒被用于农业、建筑、观赏、草坪、水生、公用线路以及公共卫生(咬虫)害虫防治作业中。

[0185] 颗粒调配物的施用一般呈萌芽前除草剂形式或作为土壤杀昆虫剂直接施用并且并入到植物所生长的土壤或其它固体基质中。颗粒或球粒还可以施用在犁沟内。颗粒常用于施用到水中，如灌水稻田中。

[0186] 典型的颗粒调配物包括(w/w％)1-40％活性成分、1-2％稳定剂、0-10％树脂或聚合物、0-5％表面活性剂、0-5％粘合剂并且用载剂材料补足到100％。

[0187] 可湿性粉剂调配物

[0188] 可湿性粉剂是当用水稀释时产生相当稳定的悬浮液的粉末状调配物。它通过掺合杀虫剂与稀释剂(如绿坡缕石)、表面活性剂以及辅助材料(如磺酸钠盐)来调配。任选地添加粘着剂以改良在植物和其它表面上的保持力。可以通过混合杀虫毒素(10-95％)与固体载剂，外加1-2％用于改良可悬浮性的表面活性剂来制备可湿性粉剂。调配物的总组成包括呈固体形式的活性成分(5.0-75％)、阴离子分散剂和阴离子或非离子湿润剂。

[0189] 可湿性粉剂调配物的典型实例包括10-80％活性成分、1-2％湿润剂(例如，苯磺酸盐、萘磺酸盐、脂肪族磺基丁二酸盐、脂肪醇乙氧基化物等)、2-5％分散剂(例如，木素磺酸盐、萘磺酸盐-甲醛缩合物等)以及0.1-1％消泡剂(例如，isopar M(埃克森/美孚(Exxon/Mobil)))，用惰性填料或载剂(例如，硅藻土、二氧化硅等)补足到100％。

[0190] 可乳化浓缩物(EC)调配物

[0191] 这些调配物是经过浓缩的杀虫剂调配物，含有有机溶剂和用于促进用水乳化的表面活性剂。当将EC调配物喷洒到植物部分上时，溶剂快速蒸发，留下水也被蒸发掉了的毒素沉积物。杀昆虫剂调配物中的例示性乳化剂包括碱性皂、有机胺、长链醇的硫酸盐和如海藻酸盐、碳水化合物、胶状物、脂质和蛋白质等材料。乳化剂可以选自EPA惰性清单中针对常规调配物的4a(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Acas.pdf)和针对有机调配物的4b(www.epa.gov/opprd001/inerts/inerts_list4Bname.pdf)中列出的那些乳化剂。

[0192] 溶液调配物

[0193] 溶液调配物是经过浓缩的液体杀虫剂调配物，它可以直接使用，或者在可溶性浓缩物的情况下需要稀释。可溶性浓缩物和溶液是在水中完全混溶的基于水或溶剂的混合物。

[0194] 溶液浓缩物调配物的典型实例包括20-70％活性成分、5-15％湿润剂、5-10％防冻剂，并且用水或水可混溶的溶剂补足到100％。

[0195] 视杀虫毒素的性质和稳定性而定，溶液调配物可以任选地包括增稠剂、防腐剂、防沫剂、pH缓冲液、UV屏蔽剂等。

[0196] 气雾剂和熏蒸剂调配物

[0197] 在杀昆虫气雾剂中，毒素以大小在0.1到50微米范围内的细小粒子形式悬浮于空气中，呈浓雾或薄雾形式。这通过燃烧毒素或通过加热汽化毒素而实现。溶解于液化气中的毒剂如果通过小孔释放，那么可以引起毒剂粒子随着所释放气体的快速蒸发而在空气中浮动。

[0198] 在环境温度下可挥发并且毒性极强的化合物称为熏蒸剂。熏蒸剂一般通过昆虫的气管系统进入昆虫。熏蒸剂用于防治储存箱、建筑物中的昆虫害虫和土壤中的某些昆虫和线虫。大部分熏蒸剂是液体，保存在罐中或桶中，并且常常包含两种或更多种气体的混合物。或者，在存在水分的情况下，可以从由磷化铝和碳酸铵组成的片剂产生膦或磷化氢气体。使用熏蒸剂的优势是，熏蒸剂由于气体的渗透性和分散性，所以可以到达其它化学药品不容易靠近的位点。常用熏蒸剂是EDCT、甲基溴、磷化铝和氢氰酸。

[0199] 肥料混合物中的调配物

[0200] 肥料混合物可以通过向化肥中添加如本文中所披露的杀昆虫组合物或通过将组合物直接撒在肥料上来制造。肥料混合物按常规施肥时间施用，提供植物养分并且防治土壤昆虫。在例示性肥料调配物中，将尿素(2％溶液)与杀昆虫组合物混合并向植物喷洒以供应氮和实现有效害虫防治。

[0201] 作为毒饵的调配物

[0202] 毒饵由对害虫物种具有吸引力的基础或载剂材料和相对较小数量的化学毒剂组成。毒饵用于防治果蝇、咀嚼口器昆虫、金针虫、土壤中的白蛴螬、家中的害虫、地里的老鼠以及鼻涕虫。这些调配物适用于喷雾施用困难的情况。干式诱饵中常用的基质是用水和糖蜜湿润的麦麸。关于吸果夜蛾的防治，使用含毒素的发酵糖溶液或糖蜜。

[0203] 用于种子处理的调配物

[0204] 种子处理包括在播种之前任选地与其它生物活性、拮抗或共生剂组合将杀虫组合物施用到种子的表面。本文中披露的杀虫毒素、蛋白质和/或化合物可以针对种子处理按以下模式中的任一种调配：干粉、水可成浆粉末、液体溶液、可流动浓缩物或乳液、乳液、微胶囊、凝胶或水分散性颗粒；或可以在种植之前通过喷雾到种子上而施用到种子上。

[0205] 在干粉的情况下，活性成分类似于可湿性粉剂加以调配，但要添加例如矿物油的粘着剂而非湿润剂。举例来说，按照由那达古玛(Nandakumar)等人(2001)所描述的方法，在无菌条件下混合1kg经过纯化的滑石粉末(经过12小时除菌)、15g碳酸钙和10g羧甲基纤维素。蛋白质、核酸悬浮液或表达这些的生物体按1:2.5的比率混合(悬浮液，干式混合)并且阴干产物，将水分含量降低到20-35％。

[0206] 组合物可以呈液体、凝胶或固体形式。

[0207] 可以通过将固体载剂悬浮于活性成分的溶液中，并且在温和条件下干燥悬浮液，如室温下蒸发或在65℃或更低温度下真空蒸发，来制备固体组合物。关于液体组合物，可以将活性成分溶解于合适的载剂或溶剂中。

[0208] 组合物可以包含用凝胶囊封的活性成分。这类用凝胶囊封的材料可以通过将凝胶形成剂(例如，明胶、纤维素或木质素)与包含一或多种如本文中所披露的核酸和/或多肽和任选地第二杀虫剂或除草剂的组合物混合；并且诱导试剂形成凝胶来制备。

[0209] 组合物可以另外包含用于以下目的的表面活性剂：乳化、分散、湿润、扩散、整合、控制崩解、稳定活性成分以及改良流动性或缓蚀。在一个具体实施例中，表面活性剂为非植物毒性的非离子表面活性剂，优选属于EPA清单4B。在另一个具体实施例中，非离子表面活性剂为聚氧化乙烯(20)单月桂酸酯。表面活性剂的浓度可以在总调配物的0.1-35％之间的范围内，例如5-25％。分散剂和乳化剂(如非离子、阴离子、两性以及阳离子分散剂和乳化剂)的选择和用量由组合物的性质和试剂促进组合物分散的能力决定。

[0210] 包含微生物的调配物

[0211] 如上文所阐述的杀虫组合物可以与微生物组合。微生物可以是植物生长促进剂。合适的微生物包括(但不限于)：芽孢杆菌属(例如，坚强芽孢杆菌(Bacillus firmus)、苏云金芽孢杆菌、短小芽孢杆菌(Bacillus  pumilus)、地衣芽孢杆菌(Bacillus 
licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)、枯草芽孢杆菌)、拟青霉属(Paecilomyces sp.)(淡紫拟青霉(P.lilacinus))、巴斯德菌属(Pasteuria sp.)(穿刺巴斯德菌(P.penetrans))、假单胞菌属、芽孢短杆菌属(Brevabacillus sp.)、轮枝菌属(Lecanicillium sp.)、白粉寄生孢菌属(Ampelomyces sp.)、酵母菌属(Pseudozyma sp.)、链霉菌属(比基尼链霉菌(S.bikiniensis))、哥斯达黎加链霉菌(S.costaricanus)、阿维链霉菌(S.avermitilis)、伯克霍尔德菌属(Burkholderia sp.)、木霉菌属(Trichoderma sp.)、粘帚霉属、阿维菌素(avermectin)、漆斑菌属(Myrothecium sp.)、拟青霉属(Paecilomyces spp.)、鞘氨醇杆菌属(Sphingobacterium sp.)、线虫捕捉菌属
(Arthrobotrys sp.)、绿腐病菌属(Chlorosplenium sp.)、螺菌属(Neobulgaria sp.)、轮层菌属(Daldinia sp.)、曲霉菌属(Aspergillus sp.)、毛壳菌属(Chaetomium sp.)、溶杆菌属(Lysobacter  sp.)、纸状粒毛盘菌(Lachnum  papyraceum)、亚厚孢轮枝孢
(Verticillium suchlasporium)、少孢节丛孢菌(Arthrobotrys oligospora)、厚孢轮枝菌(Verticillium chlamydosporium)、洛斯里被毛孢(Hirsutella rhossiliensis)、厚垣孢普可尼亚菌(Pochonia chlamydosporia)、糙皮侧耳菌(Pleurotus ostreatus)、发光类脐菌(Omphalotus olearius)、月夜菌(Lampteromyces japonicas)、短波单胞菌属
(Brevudimonas sp.)、内生真菌属(Muscodor sp.)、光杆状菌属(Photorhabdus sp.)以及伯克氏菌属(Burkholderia sp.)。从这类微生物获得或衍生的药剂也可以与本文中所披露的杀虫核酸和多肽组合使用。

[0212] 包含第二杀虫剂的调配物

[0213] 如上文所阐述的杀虫组合物可以与第二杀虫剂(例如，杀线虫剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、除藻剂、杀螨剂或杀细菌剂)组合。这类试剂可以是具有杀真菌、杀细菌、杀线虫、杀螨和/或杀昆虫活性的天然油或油产品(例如，石蜡油、茶树油、柠檬草油、丁香油、肉桂油、柑桔油、迷迭香油、除虫菊(pyrethram))。此外，杀虫剂可以是单一位点抗真菌剂，它可以包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制剂(DMI)(例如，咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制剂、喹啉、二甲酰亚胺、甲酰亚胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烃、肉桂酸、羟基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苯环型化合物(二甲苯基丙氨酸)；选自由咪唑、哌嗪、嘧啶和三唑(例如，联苯三唑醇(bitertanol)、腈菌唑(myclobutanil)、戊菌唑(penconazole)、丙环唑(propiconazole)、三唑酮(triadimefon)、糠菌唑(bromuconazole)、环丙唑醇(cyproconazole)、烯唑醇(diniconazole)、腈苯唑(fenbuconazole)、己唑醇(hexaconazole)、戊唑醇(tebuconazole)、氟醚唑(tetraconazole))组成的群组的去甲基化抑制剂、腈菌唑、邻氨基苯甲酸二酰胺(例如，氯虫苯甲酰胺(chlorantranilipole))以及醌外部抑制剂(例如，嗜球果伞素(strobilurin))。嗜球果伞素可以包括(但不限于)嘧菌酯(azoxystrobin)、醚菌酯(kresoxim-methyl)或肟菌酯(trifloxystrobin)。在又一具体实施例中，抗真菌剂是醌，例如喹氧灵(quinoxyfen)(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。抗真菌剂也可以衍生自虎杖(Reynoutria)提取物。

[0214] 杀真菌剂也可以是多位点非无机化学杀真菌剂，选自由以下组成的群组：氯腈、喹喔啉、磺酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、氯烷基硫代物(chloralkythios)、苯基吡啶胺以及氰基乙酰胺肟。

[0215] 如上文所指出，组合物可以进一步包含杀昆虫剂。杀昆虫剂可以包括(但不限于)阿维菌素、Bt(例如，苏云金芽孢杆菌变种库斯塔克(kurstaki))、印度楝树油(neem oil)、多杀菌素(spinosad)、伯克氏菌属(例如，如WO2011/106491中所阐述)、昆虫病原真菌(如球孢白僵菌)以及化学杀昆虫剂，包括(但不限于)有机氯化合物、有机磷化合物、氨基甲酸酯、拟除虫菊酯(pyrethroid)、除虫菊酯(pyrethrin)和新烟碱(neonicotinoid)。

[0216] 如上文所指出，组合物可以进一步包含杀线虫剂。这种杀线虫剂可以包括(但不限于)阿维菌素；微生物产物，如生物群系(坚强芽孢杆菌)、巴斯德菌属；和有机产物，如皂素。

[0217] 用于调整害虫侵扰的方法

[0218] 因此，根据本发明，提供用于调整植物中的害虫侵扰的方法。方法包含向植物或向土壤或植物所生长的基质中施用杀虫组合物，它包含如本文中所披露的核酸；即SEQ IDNO:4-6中的任一个。

[0219] 用于调整植物中的害虫侵扰的其它方法包含向植物或向土壤或植物所生长的基质中施用杀虫组合物，它包含如本文中所披露的多肽；即SEQ ID NO:1-3中的任一个。

[0220] 当用作生物昆虫防治剂时，由活性紫色细菌基因组编码的杀昆虫毒素可以通过活性紫色细菌核苷酸序列在能够表达所述核苷酸序列的异源宿主细胞中表达来产生。在一个实施例中，将一或多个活性紫色细菌核苷酸序列插入到适当表达盒中，所述表达盒包含例如启动子和转录终止信号。视启动子和/或外部刺激而定，核苷酸序列的表达可以是组成型或诱导型的。在某些实施例中，表达毒素的细胞是微生物，如病毒、细菌或真菌。

[0221] 在某些实施例中，如杆状病毒的病毒经过工程改造在其基因组中含有活性紫色细菌核苷酸序列。这类重组病毒可以在感染适合于病毒复制和表达核苷酸序列的适当真核细胞之后表达大量的例如杀昆虫毒素。由此产生的杀昆虫毒素被用作杀昆虫剂。或者，使用经过工程改造包括核苷酸序列的杆状病毒体内感染昆虫并且通过表达杀昆虫毒素或通过病毒感染与杀昆虫毒素的表达组合来杀死昆虫。

[0222] 因此，上文所阐述的包含活性紫色细菌核酸和多肽的组合物可以用作杀虫剂。具体来说，如上文所阐述的组合物可以单独地或与一或多种如本文中所阐述的第二杀虫物质组合用作例如杀昆虫剂和杀线虫剂。

[0223] 具体地说，可以使用上文所阐述的方法防治的线虫包括(但不限于)寄生线虫，如根节线虫、胞囊线虫和根腐线虫，包括(但不限于)种子虫瘿线虫(维氏线虫(Afrina wevelli))、翦股颖线虫(剪股颖粒线虫(Anguina agrostis))、芽虫瘿线虫(粒线虫属(Anguina spp.))、种子虫瘿线虫(粒线虫属、阿姆辛克粒线虫(A.amsinckiae)、香脂粒线虫(A.balsamophila)、小麦粒线虫(A.tritici))、羊茅叶虫瘿线虫(禾草粒线虫(A.graminis))、小麦穗瘤病(ear-cockle)(或小麦虫瘿)线虫(小麦粒线虫)、芽和叶(或叶面)线虫(滑刃线虫属(Aphelenchoides spp.)、次薄滑刃线虫(A.subtenuis))、秋海棠叶(或蕨类、或春季萎缩病、或草莓叶面、或草莓线虫、或夏季矮秆)线虫(草莓芽线虫(A.fragariae))、蕨类植物线虫(欧乐斯滑刃线虫(A.olesistus))、水稻线虫(白尖病线虫(A.oryzae))、醋栗线虫(里贝斯滑刃线虫(A.ribes))、黑醋栗(或菊花)线虫(菊叶芽滑刃线虫(A.ritzemabosi))、菊花叶面或叶线虫(菊叶芽滑刃线虫)、稻干尖线虫病(rice white-tip)(或春季萎缩病或草莓芽)线虫(水稻干尖线虫(A.besseyi))、食真菌(蘑菇)线虫(堆肥滑刃线虫(Aphelenchoides composticola))、丽皮胞囊属(Atalodera spp.)(金银花丽皮胞囊(Atalodera lonicerae)、尤丽线虫(Atalodera ucri))、棘线虫(spine nematode)(变异刺线虫(Bakernema variabile))、刺线虫(刺线虫属(Belonolaimus spp.)、细长刺线虫(B.gracilis)、长尾刺线虫(B.longicaudatus))、松材线虫(伞滑刃属(Bursaphalenchus spp.)、松材线虫(B.xylophilus)、拟松材线虫(B.mucronatus))、固着线虫(sessile nematode)(固着线虫属(Cacopaurus spp.)、顶花线虫(C.epacris)、鼠疫线虫
(C.pestis))、苋菜胞囊线虫(苋菜线虫(Cactodera amaranthi))、桦木胞囊线虫(桦木线虫(C.betulae))、仙人掌胞囊线虫(仙人掌皮线虫(C.cacti))、爱沙尼亚胞囊线虫(爱沙尼亚线虫(C.estonica))、索氏胞囊线虫(Thorne's cyst nematode)(索氏线虫(C.thornei))、虎杖胞囊线虫(韦西仙人掌胞囊线虫(C.weissi))、环线虫(环线虫属(Criconema spp.))、棘线虫(环线虫属、西韦尔环线虫(C.civellae)、戴科林线虫(C.decalineatum)、具刺腹片线虫(C.spinalineatum))、环线虫(艾克斯线虫(Criconemella axeste)、弯曲小环线虫(C.curvata)、巨大环线虫(C.macrodora)、微细小环线虫(C.parva))、环线虫(轮线虫属(Criconemoides spp.)、柠檬轮线虫(C.citri)、斯摩利轮线虫(C.simile))、棘线虫(伞状线虫(Crossonema fimbriatum))、桉树囊线虫(桉树线虫(Cryphodera eucalypti))、芽、茎干和球茎线虫(茎线虫属(Ditylenchus spp.)、水稻茎线虫(D.angustus)、起绒草茎线虫(D.dipsaci)、腐烂茎线虫(D.destructor)、中型指环虫(D.intermedius))、蘑菇菌柱线虫(蘑菇茎线虫(D.myceliophagus))、锥线虫(锥线虫属(Dolichodorus spp.)、异头锥线虫(D.heterocephalus)、双头花序锥线虫(D.heterocephalous))、矛线虫(矛线虫属
(Dorylaimus spp.))、矮化线虫(多变线虫(Geocenamus superbus))、胞囊线虫(黄金线虫属(Globodera spp.))、蓍草球形胞囊线虫((G.achilleae))、西洋耆草胞囊线虫
((G.millefolii))、苹果胞囊线虫((G.mali))、白马铃薯胞囊线虫(马铃薯白线虫
(G.pallida))、金线虫(马铃薯金线虫(G.rostochiensis))、烟草胞囊线虫(烟草胞囊线虫(G.tabacum))、奥斯本胞囊线虫(Osborne's cyst nematode)(烟草上胞囊线虫(G.tabacum solanacearum))、茄属植物胞囊线虫(弗吉尼亚烟草胞囊线虫(G.tabacum virginiae))、扣针线虫(细针线虫属(Gracilacus spp.)、艾达丽细针线虫(G.idalimus))、螺旋线虫(螺旋线虫属(Helicotylenchus spp.)、非洲螺旋线虫(H.africanus)、双角螺旋线虫
(H.digonicus)、双宫螺旋线虫(H.dihystera)、刺桐螺旋线虫(H.erythrinae)、多色带螺旋线虫(H.multicinctus)、帕拉葛螺旋线虫(H.paragirus)、假强壮螺旋线虫
(H.pseudorobustus)、茄真螺旋线虫(H.solani)、斯皮卡螺旋线虫(H.spicaudatus))、拟鞘线虫(半轮线虫属(Hemicriconemoides spp.)、双形半轮线虫(H.biformis)、加利福尼亚半轮线虫(H.californianus)、奇氏拟鞘线虫(H.chitwoodi)、佛罗里达半轮线虫
(H.floridensis)、韦森(H.wessoni))、鞘线虫(鞘线虫属(Hemicycliophora spp.)、花生鞘线虫(H.arenaria)、生物圈鞘线虫(H.biosphaera)、马加洛蒂鞘线虫(H.megalodiscus)、帕尔瓦娜鞘线虫(H.parvana)、博兰加鞘线虫(H.poranga)、谢里鞘线虫(H.sheri)、拟鞘线虫(H.similis)、条纹鞘线虫(H.striatula))、胞囊线虫(异皮线虫属(Heterodera spp.))、杏仁胞囊线虫(杏仁线虫(H.amygdali))、燕麦(或谷类)胞囊线虫(小麦禾谷胞囊线虫
(H.avenae))、菖蒲(或木豆)胞囊线虫(大豆胞囊线虫(H.cajani))、百慕大草(或心形或瓦伦丁(Valentine))胞囊线虫((H.cardiolata))、胡萝卜胞囊线虫((H.carotae))、甘蓝菜胞囊线虫或芸苔根结线虫(十字花科异皮线虫(H.cruciferae))、香附子(或莎草)胞囊线虫(莎草胞囊线虫(H.cyperi))、日本胞囊线虫(旱稻胞囊线虫(H.elachista))、无花果(或无花果属或橡胶)胞囊线虫(无花果胞囊线虫(H.fici))、鼬瓣花胞囊线虫(鼬瓣花胞囊线虫(H.galeopsidis))、大豆胞囊线虫(甘氨酸线虫(H.glycines))、苜蓿根(或豌豆胞囊)线虫(豌豆异皮线虫(H.goettingiana))、荞麦胞囊线虫(格拉顿尼线虫(H.graduni))、大麦胞囊线虫(大麦胞囊线虫(H.hordecalis))、蛇麻子胞囊线虫(蛇麻草胞囊线虫(H.humuli))、地中海谷类(或小麦)胞囊线虫(大麦胞囊线虫(H.latipons))、胡枝子胞囊线虫(胡枝子胞囊线虫(H.lespedezae))、堪萨斯胞囊线虫(Kansas cyst nematode)(长领胞囊线虫
(H.longicolla))、谷物根结线虫或燕麦胞囊线虫(主要异皮线虫(H.major))、草胞囊线虫(玛尼线虫(H.mani))、苜蓿胞囊线虫(药物线虫(H.medicaginis))、莎草(或蛾)胞囊线虫(莫蒂异皮线虫(Heterodera mothi))、水稻胞囊线虫(水稻胞囊线虫(H.oryzae))、阿姆河(Amu-Darya)(或骆驼刺胞囊)线虫(奥辛那线虫(H.oxiana))、酸模属草胞囊线虫(罗西线虫(H.rosii))、酸模胞囊线虫(卢米西线虫(H.rumicis))、糖用甜菜胞囊线虫(甜菜胞囊线虫(H.schachtii))、柳树胞囊线虫(柳树胞囊线虫(H.salixophila))、纱球草胞囊线虫(斯卡兰蒂线虫(H.scleranthii))、苣荬菜胞囊线虫(苣荬菜线虫(H.sonchophila))、塔吉克胞囊线虫(tadzhik cyst nematode)(塔吉克线虫(H.tadshikistanica))、土库曼胞囊线虫(土库曼线虫(H.turcomanica))、三叶草胞囊线虫(三叶草线虫(H.trifolii))、荨麻胞囊线虫(荨麻线虫(H.urticae))、尤斯蒂诺夫胞囊线虫(ustinov cyst nematode)(斯蒂诺夫线虫(H.ustinovi))、豇豆胞囊线虫(豇豆线虫(H.vigni))、玉米胞囊线虫(玉蜀黍线虫
(H.zeae))、稻根线虫(潜根线虫属(Hirschmanniella spp.)、贝氏潜根线虫(H.belli)、刻尾潜根线虫(H.caudacrena)、纤细潜根线虫(H.gracilis)、水稻潜根线虫(H.oryzae))、矛线虫(纽带线虫属(Hoplolaimus  spp.))、哥伦比亚线虫(哥伦比亚纽带线虫
(H.columbus))、科布斯矛线虫(Cobb's lance nematode)(帽状纽带线虫(H.galeatus))、冠头矛线虫(泰兰线虫(H.tylenchiformis))、假根节线虫(禾本科高臀线虫(Hypsoperine graminis))、针线虫(长针线虫属(Longidorus spp.)、非洲长针线虫(L.africanus)、硫长针线虫(L.sylphus))、环线虫(异盘大茎线虫(Macroposthonia xenoplax)(＝异盘中环线虫(Mesocriconema xenoplax)))、囊状线虫(拟根结线虫属(Meloidodera spp.))、松囊状线虫(佛罗里达拟根结线虫(M.floridensis))、塔吉克囊状线虫(塔吉克拟根结线虫
(M.tadshikistanica))、囊体线虫(半穿刺属(Meloidoderita spp.))、矮化线虫(默林属(Merlinius spp.)、短小节纹线虫(M.brevidens)、圆锥体线虫(M.conicus)、大线虫(M.grandis)、微小线虫(M.microdorus))、根节线虫(根结线虫属、高粱根结线虫
(M.acronea)、花生根结线虫(M.arenaria)、甘蓝根结线虫(M.artiellia)、保鲁根结线虫(M.brevicauda)、山茶根结线虫(M.camelliae)、卡罗莱纳根结线虫(M.carolinensis)、奇特伍德根结线虫(M.chitwoodi)、短小根结线虫(M.exigua)、禾谷根结线虫
(M.graminicola)、北方根结线虫(M.hapla)、西班牙根结线虫(M.hispanica)、南方根结线虫(M.incognita)、南方根结线虫高弓(M.incognita acrita)、印度根结线虫(M.indica)、无饰根结线虫(M.inornata)、爪哇根结线虫(M.javanica)、克苦亚根结线虫
(M.kikuyuensis)、科嫩西根结线虫(M.konaensis)、苹果根结线虫(M.mali)、小结根结线虫(M.microtyla)、纳西根结线虫(M.naasi)、奥瓦利根结线虫(M.ovalis)、悬铃木根结线虫(M.platani)、凯西亚根结线虫(M.querciana)、萨萨里根结线虫(M.sasseri)、塔吉克根结线虫(M.tadshikistanica)、泰晤士根结线虫(M.thamesi))、矢车菊线虫(矢车菊线虫(Mesoanguina picridis))、花旗松线虫(花旗松线虫(Nacobbodera chitwoodi))、假根节线虫(异常珍珠线虫(Nacobbus aberrans)、贝塔珍珠线虫(N.batatiformis)、背侧珍珠线虫(N.dorsalis))、酸酱线虫(腐生线虫(Panagrellus redivivus))、啤酒线虫(西路西亚线虫(P.silusiae))、针线虫(拟长针线虫(Paralongidorusmicrolaimus))、螺旋线虫(异盘旋属(Pararotylenchus spp.))、粗短根线虫(阿利斯线虫(Paratrichodorus allius)、较小拟毛刺线虫(P.minor)、胼胝拟毛刺线虫(P.porosus)、肾形拟毛刺线虫(P.renifer))、扣针线虫(针线虫属(Paratylenchus spp.)、布拉达针线虫(P.baldaccii)、布科文针线虫(P.bukowinensis)、弯曲针线虫(P.curvitatus)、双花针线虫(P.dianthus)、伊拉针线虫(P.elachistus)、钩针线虫(P.hamatus)、霍德曼尼针线虫(P.holdemani)、伊塔针线虫(P.italiensis)、美丽针线虫(P.lepidus)、那努斯针线虫(P.nanus)、新钝头针线虫(P.neoamplycephalus)、拟针线虫(P.similis))、病变(或草原)线虫(短体属
(Pratylenchus spp.)、艾伦短体线虫(P.alleni)、短尾短体线虫(P.brachyurus)、咖啡短体线虫(P.coffeae)、铃兰短体线虫(P.convallariae)、刻痕短体线虫(P.crenatus)、弗莱克短体线虫(P.flakkensis)、全体短体线虫(P.goodeyi)、六裂短体线虫(P.hexincisus)、洛赛短体线虫(P.leiocephalus)、米尼短体线虫(P.minyus)、缪斯短体线虫(P.musicola)、落选短体线虫(P.neglectus)、穿刺短体线虫(P.penetrans)、草地根腐线虫
(P.pratensis)、斯克里布纳短体线虫(P.scribneri)、索氏短体线虫(P.thornei)、伤残短体线虫(P.vulnus)、玉米短体线虫(P.zeae))、茎干虫瘿线虫(茎干虫瘿线虫
(Pterotylenchus cecidogenus))、草胞囊线虫(草胞囊线虫(Punctodera punctate))、矮化线虫(锐利线虫(Quinisulcius acutus)、具头五沟线虫(Q.capitatus))、穿孔线虫(穿孔线虫属(Radopholus spp.))、香蕉根线虫(香蕉穿孔线虫(R.similis))、水稻根线虫(水稻穿孔线虫(R.oryzae))、红色环(或椰子或椰子树)线虫(椰子红环腐线虫
(Rhadinaphelenchus cocophilus))、肾形肾状线虫(肾形线虫属(Rotylenchulus spp.)、普通肾形线虫(R.reniformis)、微小肾状线虫(R.parvus))、螺旋线虫(盘旋属
(Rotylenchus spp.)、布氏盘旋线虫(R.buxophilus)、克氏盘旋线虫(R.christiei)、强状盘旋线虫(R.robustus))、索氏矛线虫(同形节石线虫(R.uniformis))、亲水线虫
(Sarisodera hydrophylla)、螺旋线虫(盾线虫属(Scutellonema spp.)、布拉盾线虫(S.blaberum)、短尾盾线虫(S.brachyurum)、陧盾线虫(S.bradys)、怀氏盾线虫
(S.clathricaudatum)、克里斯蒂盾线虫(S.christiei)、科尼盾线虫(S.conicephalum))、草根虫瘿线虫(小麦根瘿线虫(Subanguina radicicola))、圆囊状线虫(圆囊状线虫
(Thecavermiculatus andinus))、粗短根线虫(毛刺线虫属(Trichodorus spp.)、克里斯蒂毛刺线虫(T.christiei)、库如毛刺线虫(T.kurumeensis)、帕奇毛刺线虫
(T.pachydermis)、原始毛刺线虫(T.primitivus))、醋线虫(或线虫)(醋线虫(Turbatrix aceti))、矮化(或口针)线虫(矮化线虫属(Tylenchorhynchus spp.)、农地矮化线虫(T.agri)、饰环矮化线虫(T.annulatus)、阿斯矮化线虫(T.aspericutis)、克莱顿矮化线虫(T.claytoni)、伊布里矮化线虫(T.ebriensis)、华丽矮化线虫(T.elegans)、金色矮化线虫(T.golden)、格拉西矮化线虫(T.graciliformis)、马丁矮化线虫(T.martini)、马舒德矮化线虫(T.mashhoodi)、微小矮化线虫(T.microconus)、裸矮化线虫(T.nudus)、欧拉矮化线虫(T.oleraceae)、盘尼希矮化线虫(T.penniseti)、普尼希矮化线虫(T.punensis))、柑桔线虫(半穿刺线虫(Tylenchulus semipenetrans))、以及剑线虫(剑线虫属(Xiphinema spp.)、美洲剑线虫(X.americanum)、贝克剑线虫(X.bakeri)、巴西剑线虫
(X.brasiliense)、短颈剑线虫(X.brevicolle)、钱伯斯剑线虫(X.chambersi)、麦考岁剑线虫(X.coxi)、土壤剑线虫(X.diversicaudatum)、标准剑线虫(X.index)、标明剑线虫(X.insigne)、尼格剑线虫(X.nigeriense)、太平洋剑线虫(X.radicicola)、塞塔剑线虫(X.setariae)、瓦格剑线虫(X.vulgarae)、单条剑线虫(X.vuittenezi))。

[0224] 通过上文所阐述的方法防治的植物病原性昆虫包括(但不限于)来自以下目的非蚊科昆虫幼虫：(a)鳞翅目，例如长翅卷蛾属(Acleris spp.)、褐带卷蛾属(Adoxophyes spp.)、透翅蛾属(Aegeria spp.)、夜盗虫属(Agrotis spp.)、棉树叶虫(Alabama argillaceae)、淀粉虫属(Amylois spp.)、黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis)、黄卷蛾属(Archips spp.)、带卷蛾属(Argyrotaenia spp.)、丫纹夜蛾属(Autographa spp.)、玉米茎蛀褐夜蛾(Busseola fusca)、粉斑螟蛾(Cadra cautella)、桃小食心虫(Carposina nipponensis)、禾草螟属(Chilo spp.)、色卷蛾属(Choristoneura spp.)、葡萄果蠹蛾(Clysia ambiguella)、纵卷叶野螟属(Cnaphalocrocis spp.)、云卷蛾属(Cnephasia spp.)、细卷蛾属(Cochylis spp.)、鞘蛾属(Coleophora spp.)、大菜螟(Crocidolomia binotalis)、苹果异形小卷蛾(Cryptophlebia leucotreta)、小卷蛾属(Cydia spp.)、杆草螟属(Diatraea spp.)、苏丹棉铃虫(Diparopsis castanea)、钻夜蛾属(Earias spp.)、粉斑螟属(Ephestia  spp.)、花小卷蛾属(Eucosma  spp.)、葡萄螟蛾(Eupoecilia 
ambiguella)、黄毒蛾属(Euproctis spp.)、切夜蛾属(Euxoa spp.)、小食心虫属
(Grapholita spp.)、云雾广翅小卷蛾(Hedya nubiferana)、实夜蛾属(Heliothis spp.)、菜螟(Hellula  undalis)、美国白蛾(Hyphantria cunea)、番茄蠹蛾(Keiferia 
lycopersicella)、旋纹潜叶蛾(Leucoptera scitella)、潜叶细蛾属(Lithocollethis spp.)、葡萄浆果小卷蛾(Lobesia botrana)、毒蛾属(Lymantria spp.)、潜蛾属(Lyonetia spp.)、天幕毛虫属(Malacosoma spp.)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、烟草天蛾(Manduca sexta)、秋尺蛾属(Operophtera spp.)、欧洲玉米螟(Ostrinia nubilalis)、超小卷蛾属(Pammene spp.)、褐卷蛾属(Pandemis spp.)、冬夜蛾(Panolis flammea)、红铃虫(Pectinophora gossypiella)、马铃薯块茎蛾(Phthorimaea operculella)、菜青虫(Pieris rapae)、菜粉蝶属(Pieris spp.)、小菜蛾(Plutella xylostella)、小白巢蛾属(Prays spp.)、白禾螟属(Scirpophaga spp.)、蛀茎夜蛾属(Sesamia spp.)、长须卷蛾属(Sparganothis spp.)、夜蛾属(Spodoptera spp.)、透翅蛾属(Synanthedon spp.)、异舟蛾属(Thaumetopoea spp.)、卷蛾属(Tortrix spp.)、粉纹夜蛾和巢蛾属(Yponomeuta spp.)；
(b)鞘翅目，例如叩甲属(Agriotes spp.)、花象属(Anthonomus spp.)、甜菜隐食甲(Atomaria linearis)、甜菜茎跳甲(Chaetocnema tibialis)、根颈象属(Cosmopolites spp.)、象虫属(Curculio spp.)、皮蠹属(Dermestes spp.)、根萤叶甲属(Diabrotica spp.)、植食瓢虫属(Epilachna  spp.)、Eremnus属、马铃薯甲虫(Leptinotarsa 
decemlineata)、稻水象属(Lissorhoptrus spp.)、鳃角金龟属(Melolontha spp.)、锯谷盗属(Orycaephilus spp.)、耳象属(Otiorhynchus spp.)、斑象属(Phlyctinus spp.)、弧丽金龟属(Popillia spp.)、蚤跳甲属(Psylliodes spp.)、谷蠹属(Rhizopertha spp-)、金龟子科(Scarabeidae)、谷象属(Sitophilus spp.)、麦蛾属(Sitotroga spp.)、拟步行虫属(Tenebrio spp.)、拟谷盗属(Tribolium spp.)和斑皮蠹属(Trogoderma spp.)；(c)直翅目，例如蠊属(Blatta spp.)、小蠊属(Blattella spp.)、蝼蛄属(Gryllotalpa spp.)、马德拉蜚蠊(Leucophaea maderae)、飞蝗属(Locusta spp.)、大蠊属(Periplaneta spp.)和沙漠蝗属(Schistocerca spp.)；(d)等翅目，例如散白蚁属(Reticulitermes spp.)；(e)啮虫目，例如书虱属(Liposcelis spp.)；(f)虱目，例如血虱属(Haematopinus spp.)、长腭虱属(Linognathus spp.)、人虱属(Pediculus spp.)、瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)和根瘤蚜(Phylloxera spp.)；(g)食毛目，例如畜虱属(Damalinea spp.)和啮毛虱属(Trichodectes spp.)；(h)缨翅目，例如花蓟马属(Frankliniella spp.)、Hercinotnrips属、带蓟马属(Taeniothrips spp.)、南黄蓟马(Thrips palmi)、烟蓟马(Thrips tabaci)和非洲桔梗蓟马(Scirtothrips aurantii)；(i)异翅目，例如臭虫属(Cimex spp.)、可可瘤盲蜂
(Distantiella theobroma)、棉红蝽属(Dysdercus spp.)、美洲蝽属(Euchistus spp.)、扁盾蝽属(Eurygaster spp.)、稻缘蝽属(Leptocorisa spp.)、绿蝽属(Nezara spp.)、拟网蝽属(Piesma spp.)、红猎蝽属(Rhodnius spp.)、可可褐盲蝽(Sahlbergella singularis)、黑蝽属(Scotinophara spp.)和锥蝽属(Tniatoma spp.)；(j)同翅目，例如软毛粉虱(Aleurothrixus floccosus)、菜粉虱(Aleyrodes brassicae)、肾圆盾蚧属(Aonidiella spp.)、蚜科(Aphididae)、蚜属(Aphis spp.)、薄圆盾介壳虫属(Aspidiotus spp.)、烟粉虱(Bemisia tabaci)、蜡蚧属(Ceroplaster spp.)、黑褐圆盾蚧(Chrysomphalus aonidium)、橙褐圆盾蚧(Chrysomphalus dictyospermi)、褐软蚧(Coccus hesperidum)、微叶蝉属(Empoasca spp.)、苹果棉蚜(Eriosoma larigerum)、斑叶蝉属(Erythroneura spp.)、贾第虫属(Gascardia spp.)、灰飞虱属(Laodelphax spp.)、水土坚蚧(Lecanium corni)、牡蛎蚧属(Lepidosaphes spp.)、长管蚜属(Macrosiphus spp.)、瘤蚜属(Myzus spp.)、黑尾叶蝉属(Nephotettix spp.)、褐飞虱属(Nilaparvata spp.)、环翅卷蛾属(Paratoria spp.)、瘿绵蚜属(Pemphigus spp.)、动性球菌属(Planococcus spp.)、拟白轮盾介壳虫属
(Pseudaulacaspis spp.)、粉蚧属(Pseudococcus spp.)、木虱属(Psylla spp.)、棉蚧(Pulvinaria aethiopica)、齿盾蚧属(Quadraspidiotus spp.)、缢管蚜属(Rhopalosiphum spp.)、珠蜡蚧属(Saissetia spp.)、带叶蝉属(Scaphoideus spp.)、二叉蚜属(Schizaphis spp.)、芒蚜属(Sitobion spp.)、温室白粉虱(Trialeurodes vaporariorum)、非洲木虱(Trioza erytreae)和柑橘尖盾阶(Unaspis citri)；(k)膜翅目，例如顶切叶蚁属
(Acromyrmex)、切叶蚁属(Atta spp.)、茎蜂属(Cephus spp.)、松叶蜂属(Diprion spp.)、松叶蜂科(Diprionidae)、云杉叶蜂(Gilpinia polytoma)、实叶蜂属(Hoplocampa spp.)、毛蚁属(Lasius spp.)、小家蚁(Monomorium pharaonis)、新松叶蜂属(Neodiprion spp.)、火蚁属(Solenopsis spp.)和胡蜂属(Vespa spp.)；(l)双翅目，例如伊蚊属(Aedes spp.)、高粱芒蝇(Antherigona soccata)、花园毛蚊(Bibio hortulanus)、红头丽蝇(Calliphora erythrocephala)、实蝇属(Ceratitis spp.)、金蝇属(Chrysomyia spp.)、库蚊属(Culex spp.)、黄蝇属(Cuterebra spp.)、寡毛实蝇属(Dacus spp.)、黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、厕蝇属(Fannia spp.)、胃蝇属(Gastrophilus spp.)、舌蝇属(Glossina spp.)、皮蝇属(Hypoderma spp.)、虱蝇属(Hyppobosca spp.)、斑潜蝇(Liriomyza spp.)、绿蝇属(Lucilia spp.)、黑潜蝇属(Melanagromyza spp.)、蝇属(Musca spp.)、狂蝇属(Oestrus spp.)、痿蚊属(Orseolia spp.)、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit)、甜菜潜叶蝇(Pegomyia hyoscyami)、草种蝇属(Phorbia spp.)、苹果实蝇(Rhagoletis pomonella)、尖眼蕈蚊属(Sciara spp.)、螫蝇属(Stomoxys spp.)、虻属(Tabanus spp.)、螗蜩属(Tannia spp.)和大蚊属(Tipula spp.)；(m)蚤目，例如角叶蚤属(Ceratophyllus spp.)和印鼠客蚤(Xenopsylla cheopis)；以及(n)缨尾目，例如衣鱼(Lepisma saccharina)。

[0225] 本文中所披露的杀虫组合物可以进一步用于防治十字花科植物跳甲(条跳甲属(Phyllotreta spp.))、根蛆(地种蝇属(Delia  spp.))、甘蓝荚象甲(龟象属(Ceutorhynchus spp.))以及油料种子作物中的蚜虫，油料种子作物如芥花(油菜)、芥菜籽和其杂交体，以及水稻和玉米。在具体实施例中，昆虫是夜蛾属的成员，更确切地说是甜菜夜蛾(Spodoptera exigua)、桃蚜、小菜蛾或美洲蝽属(Euschistus sp.)。

[0226] 提供如本文中所披露的有效杀虫防治量的杀虫组合物的施用。所述杀虫组合物单独地或与另一种杀虫物质组合，以有效害虫防治或杀虫量施用。有效量定义为单独或与另一种杀虫物质组合的杀虫组合物的足以预防或调整害虫侵扰的数量。有效量和比率会受到所存在的害虫物种、害虫生长阶段、害虫种群密度以及环境因素(如温度、风速、雨、当日时间和季节性)的影响。可以通过实验室或现场测试确定在特定情况中将在有效范围内的量。

[0227] 施用方法

[0228] 本文中所披露的杀虫组合物当用于调整害虫侵扰的方法中时，可以使用本领域中已知的方法施用。具体地说，这些组合物可以通过喷雾、浸渍、施用到植物周围的生长基质(例如，土壤)、施用到根区、在种植之前浸渍根部、以草皮或浸液形式施用到植物、通过灌溉或作为土壤颗粒而施用到植物或植物部分。在本文上下文中，植物应理解为意指所有植物和植物群体，如所需和非所需的野生植物或作物植物(包括天然产生的作物植物)。作物植物可以是通过常规植物育种和优化方法、通过生物技术和基因工程方法、或通过这些方法的组合获得的植物，包括受植物育种者权利保护或不受其保护的转基因植物和植物品种。植物部分应理解为意指植物在地上和地下的所有部分和器官，如芽、叶、花和根，可以提及的实例是叶子、针叶、秆、茎、花、果实体、果实、种子、根、块茎和根茎。植物部分还包括收获的物质，以及无性和有性繁殖物质，例如插条、块茎、根茎、分枝和种子。

[0229] 施用可以是外部施用(例如通过喷雾、雾化或喷涂)或内部施用(例如，通过注射、转染或使用昆虫载体)。当内部施用时，组合物可以是细胞内组合物或细胞外组合物(例如，存在于植物的维管系统中、存在于细胞外空隙中)。

[0230] 用上文阐述的组合物处理植物和植物部分可以直接进行或通过使组合物通过例如浸没、喷雾、蒸发、雾化、分散、喷涂或注射来对植物的周围环境、生境或储存空间起作用。在对种子施用组合物的情况下，可以在种植种子之前，使用本领域中已知的方法按一或多个涂层形式对种子施用组合物。

[0231] 如本文中所披露的杀虫组合物还可以例如作为种子包衣对种子施用。在制造种子包衣时可以使用不同的粘附物(“粘着剂”)，包括例如甲基纤维素、海藻酸盐、角叉菜胶和聚乙烯醇。将粘附物溶解于水中，达到介于1-10％之间的百分比，并且在对种子施用之前在室温下储存。将种子在粘附物溶液(3ml/100粒种子)中浸泡15分钟，舀出并且在塑料袋中与有机物质(1.5g/100粒种子)混合并剧烈震荡。这个过程也可以使用种子包衣机实现自动化。

[0232] 关于用如本文中所披露的组合物引发种子，将种子浸泡在两倍种子体积的无菌蒸馏水中，所述无菌蒸馏水含有细菌/蛋白质/核酸悬浮液或滑石调配物(干式调配物)(视种子大小而定，每千克种子4-10g)，并且在25±2℃下培育12-24小时。然后流掉悬浮液，使种子阴干30分钟并用于播种。

[0233] 组合物还可以用作土壤改良剂，例如与载剂(如滑石调配物)组合。用于土壤改良剂的调配物还可以包括粘土、乳化剂、表面活性剂和稳定剂，如本领域中已知。关于基于滑石的调配物的制备，按照由那达古玛等人(2001)所描述的方法，在无菌条件下混合1kg经过纯化的滑石粉末(经过12小时灭菌)、15g碳酸钙和10g羧甲基纤维素。蛋白质、核酸悬浮液或表达这些的生物体按1:2.5的比率混合(悬浮液，干式混合)并且阴干产物，将水分含量降低到20-35％。

[0234] 关于土壤改良剂，视作物而定，可以在播种时和/或在萌芽之后的不同时间或这两者，以介于2.5-10Kg ha-1之间的比率施用调配物(例如，滑石调配物)。

[0235] 本文中所披露的组合物也可以使用本领域中已知的方法施用到土壤中。参见例如USDA网站naldc.nal.usda.gov/download/43874/pdf，于2013年2月20日访问。这类方法包括(但不限于)熏蒸、滴灌或化学灌溉、撒施颗粒或喷雾剂、土壤合并(例如，施用颗粒)、土壤浸透、种子处理和拌种以及裸根浸渍。

[0236] 植物转化

[0237] 本文中所披露的核酸可以使用多种植物转化技术中的任一种引入到植物中并且任选地在植物中表达。植物的转化可以用单一DNA物种或多个DNA物种(即，共转化)进行。

[0238] 在某些实施例中，活性紫色细菌蛋白质或多肽(例如，毒素)在植物中表达并保护植物远离昆虫害虫。举例来说，如本文中所披露的核苷酸序列可以插入到表达盒中，表达盒可以任选地稳定整合到植物的染色体中。在某些实施例中，核苷酸序列被包括在非致病性自我复制病毒中。根据本发明转化的植物可以是单子叶植物或双子叶植物并且包括(但不限于)玉米、小麦、大麦、黑麦、甘薯、豆、豌豆、菊苣、莴苣、甘蓝菜、花椰菜、椰菜、芜菁、萝卜、菠菜、芦笋、洋葱、大蒜、胡椒、芹菜、笋瓜、南瓜、大麻、绿皮西葫芦、苹果、梨、柑橘、甜瓜、李子、樱桃、杏子、草莓、木瓜、鳄梨、芒果、香蕉、苜蓿、水稻、马铃薯、茄子、桃子、棉花、胡萝卜、烟草、高粱、油桃、糖用甜菜、甘蔗、葵花、大豆、番茄、菠萝、葡萄、覆盆子、黑莓、黄瓜、拟南芥以及木本植物，如针叶树和落叶树。

[0239] 一旦将所要核苷酸序列引入到特定植物物种中，所述核苷酸序列就可以在该物种中繁殖，或者使用传统的育种技术转移到同一物种的其它品种，确切地说包括商业品种。

[0240] DNA可以通过使用多种本领域公认的方法引入植物细胞中。本领域的普通技术人员将了解，方法的选择可以取决于定为转化目标的植物的类型。合适的植物细胞转化方法如下。

[0241] 农杆菌属介导的转化

[0242] 植物中主要的DNA转移方法是农杆菌属介导的转化。天然的活的土壤细菌根癌农杆菌能够感染各种植物物种，导致冠瘿病(Crown Gall disease)。当根癌农杆菌感染细胞时，它转移了其T-DNA的拷贝，T-DNA是其Ti(诱导肿瘤的)质粒上所携带的一小段DNA。T-DNA通过两个(不完美的)25碱基对重复序列侧接。这些边界内所含的任何DNA都将被转移到宿主细胞中。朱潘(Zupan)和赞布里斯基(Zambriski)，1995。Ti质粒上的T-DNA区段可以用连接到适当调控序列的转基因替换。然后可以使用含有包含外源性核苷酸序列的Ti质粒的重组根癌农杆菌感染再生细胞或原生质体(即，无壁球形植物细胞)的培养物。可以在Ti质粒构筑体中包括标记基因，如编码抗生素抗性的标记基因，使得可能选择出已被细菌转化的细胞。通过标准方法，对所选细胞进行细胞到植物的再生。参见例如朱潘和赞布里斯基(1995)以及琼斯(Jones)等人(2005)植物方法(Plant Methods)。

[0243] 可以使用根癌农杆菌相对容易地转化多个双子叶植物物种。欣奇(Hinchee)等人,生物技术(Biotechnology)6:915-921(1988)。关于玉米转化的说明，另外参见石田(Ishida)等人,自然·生物技术(Nature Biotechnology)14:745-750(1996年6月)。

[0244] 生物射弹传递

[0245] 这种方法也称为“粒子轰击”，涉及使用“基因枪”将DNA分子直接“射击”到受体植物组织中。用相关DNA涂布钨珠或金珠(它们小于植物细胞本身)，点火穿过停止屏，通过氦气加速，到达植物组织中。粒子通过植物细胞，把DNA留在内部。这种方法可以成功地用于单子叶和双子叶物种。可以使用标记基因(如编码抗生素抗性的标记基因)选择经过转化的组织。所有细胞都含有转基因拷贝的完整植物可以使用购自威斯康星州麦迪逊的阿格雷斯图公司(Agracetus,Inc.(Madison,WI))和特拉华州威尔明顿的杜邦公司(Dupont,Inc.(Wilmington,DE))的装置，从培养液中的全能转化细胞再生(诺丁汉(Nottingham)，1998)。

[0246] 生物射弹植物转化方法是本领域中已知的。参见例如桑福德(Sanford)等人,第4,945,050号美国专利；麦凯布(McCabe)等人,生物技术6.923-926(1988)；魏辛格
(Weissinger)等人,遗传学年评(Annual Rev Genet.)22-421-477(1988)；桑福德等人,粒子科学与技术(Particulate Science and Technology)5.27-37(1987)(洋葱)；斯瓦伯(Svab)等人,美国国家科学院院刊(Proc.Natl.Acad.Sci.USA)87-8526-8530(1990)(烟草叶绿体)；赫里斯图(Christou)等人,植物生理学(Plant Physiol)87,671-674(1988)(大豆)；麦凯布等人,生物技术6.923-926(1988)(大豆)；克莱因(Klein)等人,美国国家科学院院刊,85:4305-4309(1988)(玉米)；克莱因等人,生物技术6,559-563(1988)(玉米)；克莱因等人,植物生理学91,440-444(1988)(玉米)；弗罗姆(Fromm)等人,生物技术8:833-839(1990)；戈登·卡姆(Gordon-Kamm)等人,植物细胞(Plant Cell)2:603-618(1990)(玉米)；
科齐埃尔(Koziel)等人,生物技术11:194-200(1993)(玉米)；岛本(Shimamoto)等人,自然
338:274-277(1989)(水稻)；赫里斯图(Christou)等人,生物技术9:957-962(1991)(水稻)；
达塔(Datta)等人,生物技术8.736-740(1990)(水稻)；欧洲专利申请EP 0 332 581(果园草和其它早熟禾亚科植物(Pooideae))；瓦西尔(Vasil)等人,生物技术11:1553-1558(1993)(小麦)；威克斯(Weeks等人,植物生理学102:1077-1084(1993)(小麦)；万(Wan)等人,植物生理学104:37-48(1994)(大麦)；亚内(Jahne)等人,理论与应用遗传学
(Theor.Appl.Genet.)89:525-533(1994)(大麦)；翁贝克(Umbeck)等人,生物技术5:263-
266(1987)(棉花)；卡萨斯(Casas)等人,美国国家科学院院刊90:11212-11216(1993年12月)(高粱)；萨默斯(Somers)等人,生物技术10:1589-1594(1992年12月)(燕麦)；托伯特(Torbert)等人,植物细胞报告(Plant Cell Reports)14:635-640(1995)(燕麦)；威克斯等人,植物生理学102:1077-1084(1993)(小麦)；常(Chang)等人,WO 94/13822(小麦)以及内拉(Nehra)等人,植物杂志(The Plant Journal)5:285-297(1994)(小麦)。

[0247] 用于通过微弹轰击将重组DNA分子引入到玉米中的方法可见于科齐埃尔等人,生物技术11:194-200(1993)；希尔等人,Euphytica 85:119-123(1995)；以及科齐埃尔等人,纽约科学院年报(Annals of the New York Academy of Sciences)792:164-171(1996)中。

[0248] 原生质体转化和其它方法

[0249] 用于将核酸分子引入到植物中的另一种方法是如EP 0 292 435中针对玉米所披露的原生质体转化方法。用于植物中的基因转移的其它传递系统包括电穿孔(里格斯(Riggs)等人,美国科学院院刊83,5602-5606(1986))、微注射(克劳斯威(Crossway)等人,生物技术4,320-334(1986))、碳化硅介导的DNA转移、直接基因转移(帕什科夫斯基(Paszkowski)等人,EMBO J.3.2717-2722(1984)；哈亚希莫托(Hayashimoto)等人,植物生理学93.857-863(1990)(水稻))。

[0250] 色素体转化

[0251] 在另一个实施例中，如本文中所披露的核苷酸序列被直接转化到色素体(例如，叶绿体)的基因组中。色素体转化的优点包括色素体表达细菌基因且细菌序列无大量修饰的能力，和色素体在单一启动子的控制下表达多个开放阅读框的能力。色素体转化技术描述于第5,451,513号、第5,545,817号和第5,545,818号美国专利；第WO 95/16783号PCT申请；以及麦克布赖德(McBride)等人(1994)美国国家科学院院刊91,7301-7305中。

[0252] 基础的叶绿体转化技术涉及使用例如生物射弹或原生质体转化(例如，氯化钙或PEG介导的转化)，将侧接有可选择标记的克隆色素体DNA区域与相关基因一起引入到合适的靶组织中。1到1.5kb侧接区称为靶向序列，有助于与色素体基因组同源重组，从而实现色素体基因组的特定区域的置换或修饰。首先，采用叶绿体16S rRNA和rpsl2基因中赋予大观霉素和/或链霉素抗性的点突变作为转化可选标记(斯瓦伯Z.等人(1990)美国国家科学院院刊87,8526-8530；斯托布J.M.(Staub,J.M.)和马利加P.(Maliga,P.)(1992)植物细胞(Plant Cell)4,39-45)；从而以每100次轰击目标叶大约一个的频率产生稳定同质转化体。在这些标记之间存在克隆位点允许创建用于引入外来基因的色素体靶向载体。斯托布J.M.和马利加P.(1993)EMBO J.12:601-606。通过用显性可选标记替换隐性rRNA或r蛋白抗生素抗性基因，转化频率大幅增加，所述显性可选标记是编码大观霉素解毒酶氨基糖苷-3'腺苷酰基转移酶的细菌AADA基因。斯瓦伯Z.和马利加P.(1993)美国国家科学院院刊90:913-
917。以前，这种标记成功地用于绿藻莱茵衣藻的色素体基因组的高频转化。戈特斯密特·克莱蒙特M.(Goldschmidt-Clermont,M.)(1991)核酸研究19:4083-4089。

[0253] 适用于色素体转化的其它可选标记是本领域中已知的并且涵盖在本发明的范围内。通常，在转化之后需要大约15-20个细胞分裂周期来达到同质状态。相较于核基因，通过同源重组将基因插入到每个植物细胞中所存在的圆形色素体基因组的所有数千拷贝中的色素体表达利用巨大拷贝数优势来实现可以容易地超过总可溶性植物蛋白的10％的表达水平。因此，在某些实施例中，将如本文中所披露的核苷酸序列插入到靶向色素体的载体中并被转化到所要植物宿主的色素体基因组中。获得含有相关核苷酸序列的色素体基因组的同种植物，并且所述植物能够高水平表达核苷酸序列。

[0254] 高效转染(Magnifection)

[0255] 高效转染是一种瞬时表达方法，它基于使用农杆菌从全身性传递到植物细胞中的病毒RNA复制子表达。这种方法允许以每千克新鲜叶生物质最多5g的产量产生重组蛋白，这接近了蛋白质表达的生物极限。如此高的产量是可能的，因为这种方法具有瞬时特性，瞬时特性允许使用源自RNA病毒(如烟草花叶病毒(TMV)或马铃薯病毒X)的非常有效的扩增子，且不限制生物质积累，生物质积累发生在感染之前。参见例如马里约内(Marillonnet)等人(2005)自然·生物技术.23(6):718-723。

[0256] 用于植物基因工程的方法和组合物的其它披露提供于伯奇JA(Bircher JA)(编)“植物染色体工程改造方法和方案(Plant Chromosome Engineering:Methods and protocols).”分子生物学方法(Methods in Molecular Biology),第701卷,斯普林格出版社(Springer Science)+商业媒体,2011中。

[0257] 转基因植物和种子

[0258] 源自植物细胞的转基因植物可以生长产生具有相比于对照植物来说增强性状的转基因植物，并且产生本发明的转基因种子和单倍体花粉。具有增强性状的这类植物通过针对增强性状选择经过转化的植物或后代种子来鉴别。为了效率，选择方法被设计成用于评估多个转基因植物(事件)，包括重组DNA，例如从2到20或更多个转基因事件的多个植物。从本文中提供的转基因种子生长的转基因植物展现出有助于提高产量的改良农艺性状或提高植物价值的其它性状，所提高的植物价值包括例如改良种子质量。备受关注的是具有增强的水利用率、增强的耐寒性、增加的产量、增强的氮利用率、增强的种子蛋白质和增强的种子油的植物。转基因植物包括(但不限于)玉米、大豆、棉花、芥花、苜蓿、小麦、水稻、甘蔗、糖用甜菜种子、小米、大麦、花生、木豆、高粱、蔬菜(包括(但不限于)椰菜、花椰菜、甘蓝菜、萝卜、大白菜、甜瓜、西瓜、黄瓜、葫芦、南瓜、笋瓜、胡椒、番茄、茄子、洋葱、胡萝卜、四季豆、甜玉米、豌豆、干菜豆、秋葵、菠菜、韭菜、莴苣和茴香)、葡萄、浆果(包括蓝莓、黑莓、覆盆子、桑椹、博伊森莓等)、樱桃和相关果树(包括(但不限于)李子、桃子、杏子、奇异果、石榴、芒果、无花果)、果树(包括(但不限于)橙子、柠檬、酸橙、血橙、葡萄柚等)、坚果树(包括(但不限于)椰子、胡桃(英国胡桃和黑胡桃)、山核桃、杏仁、榛子、巴西果、山核桃、橡果等)、葵花、其它产油籽植物或其任何组合。

[0259] 植物生长促进

[0260] 本文中所披露的组合物，尤其是活性紫色细菌核酸和多肽，可以用于调整或更确切地说促进植物生长，所述植物例如作物，如水果(例如，草莓)、蔬菜(例如，番茄、笋瓜、胡椒、茄子)、谷类作物(例如，大豆、小麦、水稻、玉米)、树、花、观赏植物、灌木(例如，棉花、玫瑰)、球茎植物(例如，洋葱、大蒜)、藤本植物(例如，葡萄藤)以及草皮(例如百慕大草、肯塔基蓝草、羊茅草)。组合物还可以用于调整植物种子的发芽。

[0261] 活性紫色细菌核酸和多肽或其调配产物可以单独使用或与一或多种如下所述的其它组分组合使用，如生长促进剂和/或抗植物病原性剂，在生长季节期间按预定顺序和施用间隔以罐式混合或按某种程序(依序施用，称作轮作)使用。当以比产品标签上所推荐的低的浓度与以上所提到的产品组合使用时，在某些实施例中，两种或更多种产品(其中之一是本文中所披露的所述组合物)的组合功效大于每种个别组分的效果的总和。因此，通过这两种(或更多种)产品之间的协同作用增强了效果，并且降低了在植物病原性菌株中发展出杀虫剂抗性的风险。

[0262] 组合物可以通过在移植时的根部浸渍施用，确切地说通过在将水果或蔬菜移植入土壤中之前，将水果或蔬菜的根部浸渍在所述组合物的悬浮液(按体积计约0.25％到约1.5％，并且更确切地说约0.5％到约1.0％)中用所述组合物处理水果或蔬菜。

[0263] 或者，可以通过滴灌或其它灌溉系统施用组合物。确切地说，组合物可以注入滴灌系统中。在具体实施例中，按浓度为1×108CFU/mL的溶液以约11到约4夸脱/英亩的比例施用组合物。

[0264] 在又另一个实施例中，组合物可以沟内施用的形式添加。确切地说，可以在种植时使用经过校准以传递2-6加仑/英亩的总输出的喷嘴将组合物以沟内喷雾的形式添加。可以将喷嘴放置在种植机上的开沟器中，使得杀虫剂施用与种子落入犁沟中是同时的。

[0265] 如本领域中已知的那样制备所披露的组合物与例如固体或液体佐剂的混合物。举例来说，可以通过均匀混合和/或研磨活性成分连同增量剂制备混合物，所述增量剂例如溶剂、固体载剂以及在适合情况下的表面活性化合物(表面活性剂)。组合物还可以含有其它成分以便获得其它所要效果，所述其它成分例如稳定剂、粘度调节剂、粘合剂、佐剂以及肥料或其它活性成分。

[0266] 与植物生长促进剂组合

[0267] 本文中所披露的组合物可以与其它生长促进剂组合使用，所述生长促进剂例如合成或有机肥料(例如，呈颗粒状或液体形式的磷酸二铵)；堆肥茶；海藻提取物；单独或与例如IBA(吲哚丁酸)和NAA(萘乙酸)的植物生长调节剂组合用于对移植物进行生根激素处理的植物生长激素，例如IAA(吲哚乙酸)；以及促进生长的微生物，例如甲基营养生物、PPFM(粉红着色兼性甲基营养生物)、芽孢杆菌属、假单胞菌、根瘤菌以及木霉菌。

[0268] 种子处理剂/种衣剂

[0269] 本文中所披露的组合物还可以与种衣剂组合使用。这类种衣剂包括(但不限于)乙二醇、聚乙二醇、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、泥煤苔、树脂和蜡或具有单一位点、多位点或未知作用模式的化学杀真菌剂或杀细菌剂。

[0270] 本文中所述的种子处理方法可以结合任何植物物种和/或其种子使用。然而，在各种实施例中，所述方法结合在农艺学上重要的植物物种的种子使用，具体来说，所述种子可以是玉米、花生、芥花/油菜籽、大豆、葫芦、十字花科植物、棉花、甜菜、水稻、高粱、糖用甜菜、小麦、大麦、黑麦、葵花、番茄、甘蔗、烟草、燕麦以及其它植物和产叶作物的种子。在一些实施例中，种子是玉米、大豆或棉籽。种子可以是转基因种子，从转基因种子可以生长出转基因植物并且转基因种子并入了转基因事件，转基因事件赋予例如对特定除草剂或除草剂组合的耐受性、增加的疾病抗性、增强的对胁迫的耐受性和/或增强的产量。转基因种子包括(但不限于)玉米、大豆和棉花的种子。

[0271] 抗植物病原性剂

[0272] 本文中所披露的组合物还可以与其它抗植物病原性剂组合使用，所述抗植物病原性剂例如植物提取物、生物杀虫剂、无机作物保护剂(例如铜)、表面活性剂(例如鼠李醣脂；甘地(Gandhi)等人,2007)，或具有杀虫特性的天然油，例如石蜡油和茶树油，或具有单一位点、多位点或未知作用模式的化学杀真菌剂或杀细菌剂。如本文中所定义，“抗植物病原性剂”是调整植物病原体，确切地说导致植物的土传疾病的病原体的生长，或者防止植物被植物病原体感染的试剂。植物病原体包括(但不限于)真菌、细菌、放线菌和病毒。

[0273] 抗植物病原性剂可以是单一位点抗真菌剂，其可以包括(但不限于)苯并咪唑、去甲基化抑制剂(DMI)(例如咪唑、哌嗪、嘧啶、三唑)、吗啉、羟基嘧啶、苯氨基嘧啶、硫代磷酸酯、醌外部抑制剂、喹啉、二甲酰亚胺、甲酰亚胺、苯基酰胺、苯氨基嘧啶、苯基吡咯、芳香族烃、肉桂酸、羟基苯胺、抗生素、多氧菌素、酰胺、邻苯二甲酰亚胺、苯环型化合物(二甲苯基丙酸胺)。在更具体的实施例中，抗真菌剂是去甲基化抑制剂，其选自由以下组成的群组：咪唑、哌嗪、嘧啶以及三唑(例如，联苯三唑醇、腈菌唑、戊菌唑、丙环唑、三唑酮、糠菌唑、环丙唑醇、烯唑醇、腈苯唑、己唑醇、戊唑醇、氟醚唑)。在最具体的实施例中，抗真菌剂是腈菌唑。在又一个具体实施例中，抗真菌剂是醌外部抑制剂(例如，嗜球果伞素)。嗜球果伞素可以包括(但不限于)嘧菌酯、醚菌酯或肟菌酯。在又一个具体实施例中，抗真菌剂是醌，例如喹氧灵(5,7-二氯-4-喹啉基4-氟苯基醚)。

[0274] 在又一个实施例中，杀真菌剂是多位点非无机化学杀真菌剂，其选自由以下组成的群组：氯腈、喹喔啉、磺酰胺、膦酸酯、亚磷酸酯、二硫代氨基甲酸酯、氯烷基硫代物、苯基吡啶胺以及氰基乙酰胺肟。

[0275] 在又一个实施例中，抗植物病原性剂可以是链霉素、四环素、氧四环素、铜或春日霉素。

[0276] 生物修复

[0277] 活性紫色细菌基因组编码尤其参与磷、铁和芳香族化合物的代谢的基因。参见例如上表6。这类基因和其基因产物可以用于生物修复方法中。举例来说，与金属输送、金属累积、有机化合物的降解和其它代谢物转化相关的基因和序列可以工程改造到植物中，目的是向土壤、泥沙、水和其它被污染的基质的生物修复中施用经过转化的植物。已知印度芥菜(芥菜(Brassica juncea))、葵花(向日葵(Helianthus annus))、番茄和鹅掌楸(北美鹅掌楸(Liriodendron tulipifera))的转化方案。参见例如亚彭(Eapen)和德索萨(D'Souza)(2005)；梅洛·法里亚斯(Mello-Farias)和查韦斯(Chavez)(2008)。

[0278] 可以用编码细胞色素P450的基因转化植物来提高所述植物对特定的有机和无机污染物的抗性。用编码谷胱甘肽结合中所涉及的酶(例如，谷胱甘肽S转移酶)的核酸转化可以提高异型生物质的去毒速率。可以使用表达细菌硝基还原酶的植物对硝酸酯有机化合物(如炸药)进行去毒。

[0279] 转基因植物于植物修复应用的用途已例如由阿比希拉(Abhilash)等人(2009)；范·阿肯(Van Aken)等人(2010)；多提(Doty)(2008)和马采克(Macek)等人(2008)描述。

[0280] 下表2表示本发明关于活性紫色细菌蛋白质的额外信息。

[0281] 表2

[0282]

[0283]

[0284]

[0285]

[0286] 如本说明书和权利要求书中所用，单词“包含(comprising)”(和包含的任何形式，例如“包含(comprise)”和“包含(comprises)”)、“具有(having)”(和具有的任何形式，例如“具有(have)”和“具有(has)”)、“包括(including)”(和包括的任何形式，例如“包括(includes)”和“包括(include)”)或“含有”(和含有的任何形式，例如“含有(contains)”和“含有(contain)”)是包括性或开放式的并且不排除其它未列出的要素或方法步骤。

[0287] 如本文所用的术语“或其组合”是指在所述术语前面所列项目的所有排列和组合。举例来说，“A、B、C或其组合”打算包括以下各项中的至少一个：A、B、C、AB、AC、BC或ABC，并且如果在特定情况下顺序是重要的，那么还有BA、CA、CB、CBA、BCA、ACB、BAC或CAB。继续这个例子，明确地包括含有一或多个项目或术语的重复的组合，例如BB、AAA、AB、BBC、AAABCCCC、CBBAAA、CABABB等。熟练技术人员应理解，除非另外从上下文显而易见，否则通常不存在对任何组合中的项目或术语的数量的限制。

[0288] 本文中所披露和要求的所有组合物和/或方法都可以根据本披露在无不当实验的情况下制造和执行。虽然本发明的组合物和方法已就优选实施例描述过了，但是本领域的普通技术人员清楚，组合物和/或方法以及本文中所述方法的步骤或步骤的顺序可以改变，且不脱离本发明的概念、精神和范围。本领域的技术人员所清楚的所有这类类似取代和修改都视为在由所附权利要求书限定的本发明的精神、范围和概念内。

[0289] 实例

[0290] 实例1：细胞生长和DNA提取

[0291] 使活性紫色细菌PRAA-1在26℃下在以150rpm旋转的1L烧瓶中的200ml LB培养液中生长24-48小时。通过离心收集培养液中的生物质。

[0292] 使用MoBio Power微生物Maxi-DNA提取试剂盒(MoBio目录号122223-25)提取基因组DNA。在1.5ml洗脱缓冲液(包括在试剂盒中)中洗脱DNA。为了评定DNA质量和数量，将10uL等分试样加载到1.5％琼脂糖凝胶中并在100V下电泳30分钟。使用EZ视觉加载染料，用UV透照器使DNA可视化。回收到超过100μg DNA。

[0293] 实例2：DNA序列测定和组装

[0294] 使用HiSeq 2000(加利福尼亚州圣地亚哥的伊路米那(Illumina,San Diego,CA))，按100bp的序列读数，双端测序(pair ended)，按最小40×的覆盖率对准，测定DNA序列。最终数据由两组呈FASTQ形式的双端样品组成，提供大约200×的基因组覆盖率。

[0295] 使用四个FASTAQ文件进行组装。使用FASTQC对FASTAQ序列进行质量控制，并且通过使用BWA比较两组前10,000对与初始组装的重叠群来计算各对之间的平均距离。李(Li)和德宾(Durbin)(2009)生物信息学(Bioinformatics)25(14):1754-1760。然后使用TrimGalore(英国剑桥的巴布拉哈姆生物信息学公司(Babraham Bioinformatics,
Cambridge,UK))产生两组高质量双端测序和针对那些序列的四个单一读数文件，其搭配物读数在Q2上剪裁之后低于至少50个核苷酸的质量阈值。

[0296] 使用射线汇编器(Ray assembler)v2.0.0组装序列读数。布瓦韦尔(Boisvert)等人(2010)计算生物学杂志(J Comput Biol.)17(11):1519-1533。以19-63的kmer范围滴定kmer大小；在19、21、31、41、47、49和63下产生成功组装。使用SSPACE v1.1，使用通过射线分析产生的超长序列片段(scaffold)上的所有可用读数进行进一步超长序列片段分析。博泽尔(Boetzer)等人(2011)生物信息学27(4):578-579。使用GapFiller连接空隙，最大迭代二十个步骤。博泽尔和皮罗瓦诺(Pirovano)(2012)基因组生物学(Genome Biol.)13(6):R56。使用CONTIGuator，e值为1e-10，使所得超长序列片段针对紫色色杆菌(Chromobacterium violaceum)ATCC 12742的参考基因组进行映射。加拉尔迪尼(Galardini)等人(2011)生物学和医学的源代码(Source Code Biol.Med.)6:11。

[0297] 为了确认重叠群和超长序列片段的顺序，使用ACT手动检查比对。卡弗(Carver)等人(2008)生物信息学24(23):2672-2676。使用BWA(李和德宾，同前文献)，按种子长度19将初始数据集映射回活性紫色细菌序列。

[0298] 这种方法产生4,690,330个碱基的高质量基因组，其中重叠群中总共145,992个碱基不匹配参考基因组(紫色色杆菌)并且42个空隙中有4,264个不确定的核苷酸(N)。假重叠群中的空隙的后续填充关闭了42个空隙中的8个并且使假重叠群延伸到4,704,820个碱基，其中大部分空隙是在位置2,153,178-2,153,283(105个碱基)和2,474,439-2,474,486(47个碱基)中仅剩余2个空隙的单一‘N’位置。

[0299] 实例3：针对粉纹夜蛾杀昆虫剂活性筛选蛋白质

[0300] 蛋白质Scott 1-3(分别为Seq ID No:4-6)通过标准FPLC程序分级。

[0301] 将饲料板储存在生物分析冷冻机(4℃)中的带盖子容器中。所有功效测试全部以每培养板最少六个稀释和两个稀释复制(孔)以及每个稀释总共最少40个孔进行。使用去离子水作为阴性对照。连续稀释所有候选蛋白质和标准蛋白质，最少六个稀释(即16％、8％、4％、2％、1％和0.05％)。从最低稀释开始，用移液管移取100μL每种稀释处理到每个孔中。
将培养板移到含小风扇的通风橱中。打开风扇并将风扇按孔中的液体能受到气流影响的角度指向培养板。充分干燥各孔，以便新生幼虫可以被放置到每个孔中而不会溺水。仅将最先通过的早期二龄粉纹夜蛾用于96孔板。使用细笔刷，将单一小幼虫从其饲养区移到孔中。继续侵扰，直到所有孔中都有幼虫。使用牙签或其它小的尖头工具在每个孔上方的盖子上戳一个小孔用于通风。将培养板放置在温度控制在26℃下的腔室中，并且在添加昆虫之后3到
4天记下死亡率。通过检查每个孔中的幼虫确定昆虫死亡率。然后确定每个稀释的平均死亡率。表3到6显示通过Scott 1-3(SEQ ID NO:4-6)的量实现的粉纹夜蛾的死亡率。

[0302] 表3(Scott1；SEQ ID No:1或4)

[0303]

[0304] 表4(scott2；SEQ ID No:2或5)

[0305]

[0306]

[0307] 表5(scott3，SEQ ID No:3或6)

[0308]

[0309]

[0310] 实例4：用农杆菌属转化番茄(番茄(Solanum lycopersicum))

[0311] 根据沙玛M.K.(Sharma,M.K.)等人2009“.简单有效的农杆菌属介导的番茄转化程序(A simple and efficient Agrobacterium-mediated procedure for transformation of tomato).”生物科学杂志(Journal of Biosciences)34:423-433改编以下程序。

[0312] 培养基和溶液

[0313] 表6中描述了各种培养基的组成。将除琼脂之外的培养基组分根据表6组合并且使用1N KOH调整到pH 5.8，然后添加植物组织培养级琼脂。在二甲亚砜(DMSO)中制备BAP(6-苄基氨基嘌呤)和玉米素的储备溶液。在去离子水中制备抗生素储备溶液并进行过滤灭菌。使农杆菌属菌株AGL1在含有100mg/l利福平和50mg/l卡那霉素的YEM琼脂或培养液上生长。

[0314] 制备农杆菌属

[0315] 经过相关基因(例如，SEQ ID NO:1-6中所披露的基因中的任一个)转化的根癌农杆菌在含利福平和卡那霉素的YEM培养基中生长，在28℃下以200rpm震荡培养液72h。通过离心使细胞球粒化，洗涤并再悬浮于WS培养基中。通过测量OD600测定细菌密度并且通过用WS培养基稀释将最终细胞浓度调整到约108个细胞/毫升。

[0316] 植物转化

[0317] 通过切除顶端和底部收集10天子叶的中间部分(0.7×1.0cm)。将所述部分在28℃下在M1培养基上预培养48小时，使近轴表面直接接触培养基。

[0318] 选择健康的外植体并在农杆菌属悬浮液中培育30分钟，每10分钟倒转。在无菌纸巾上吸干外植体并使外植体返回到M1琼脂(每培养板50-80个外植体)，再持续72小时。然后在WS培养基中洗涤外植体4-5次，在无菌纸巾上吸干并转移到含有1mg/L反玉米素的SM中进行再生(每再生培养板20-25个外植体)。

[0319] 再生板在28℃下在16/8的光/暗循环下培育。通过愈伤组织的发展证明再生。每15天选择再生外植体并将其转移到新鲜的SM培养基中。

[0320] 可以从愈伤组织切下再生芽并转移到RM培养基。

[0321] 选择高度至少2英寸并且具有发达根系的组培苗转移到盆中。种植基质由与1:1:1蛭石:珍珠岩:泥炭藓1:1混合的盆栽土组成。

[0322] 表6

[0323]

[0324]

[0325] 实例5：创建包含来自活性紫色细菌的杀昆虫基因的转基因大豆植物

[0326] 将成熟的大豆种子在钟罩内在通风橱下用氯气进行表面灭菌。将种子保持在100×20mm皮氏培养皿中，皮氏培养皿含有通过将100ml的4％次氯酸钠倾倒到烧杯中并且添加5ml的12N盐酸产生的氯气。在灭菌之后，将种子放置在发芽培养基(GM；MS基本盐与维生素、
3％蔗糖、0.8％植物琼脂以及1mg/L BAP，从再生实验优化，pH 5.8)上。村重和斯科格，
1962。使种子在荧光或黑暗下在24±1℃下发芽5-7天以比较转化频率。

[0327] 本文所述的方法是由张(Zhang)等人(1999)植物细胞、组织和器官培养液(PlantCell,Tissue and Organ Culture)56:37-46所描述的方法的修改版。通过用11号手术刀切割下胚轴作水平切片获得两个子叶外植体。接着去除下胚轴并且在子叶节点区表面作十条划痕。将外植体在已经工程改造包含相关基因的根癌农杆菌的悬浮液中浸没30分钟，所述相关基因例如编码杀昆虫蛋白或杀昆虫化合物的合成中所涉及的蛋白质的基因。
有关例示性相关基因的清单，参见以上表2。在浸没之后，将十个外植体随机放置在无菌滤纸上，无菌滤纸放置在100×20mm皮氏培养皿中的固体共培养基(CM；甘伯格B5基本盐与维生素、3％蔗糖、20mM MES、3.3mM L-半胱氨酸、1mM二硫苏糖醇、0.1mM乙酰丁香酮、0.8％植物琼脂，pH 5.4)(冈堡(Gamborg)等人，1968)上，并且在24±1℃下在黑暗条件下培育5天。

[0328] 在共培养5天之后，在液体芽诱导培养基(SIM；甘伯格B5基本盐与维生素、3％蔗糖、3mM MES、1.67mg/L BAP、250mg/L头孢噻肟，pH 5.7)中简单洗涤外植体以去除外植体上的过量根癌农杆菌。然后前14天将外植体转移到不含PPT的固化SIM中以刺激芽诱导，之后在含有5mg/L PPT的新鲜SIM上再次培养外植体以选择经过转化的芽。修整外植体的器官性芽，并且然后转移到芽伸长培养基(SEM；MS基本盐与维生素、3％蔗糖、3mM MES、0.5mg/L赤霉酸、50mg/L天冬酰胺、1mg/L玉米素、0.1mg/L吲哚-3-乙酸、250mg/L头孢噻肟、50mg/L万古霉素、0.8％植物琼脂、5mg/L PPT，pH 5.7)。每14天将外植体转移到新的SEM培养基，并且将存活的芽种植在根诱导培养基(RIM；MS基本盐与维生素、3％蔗糖、1mg/L萘乙酸、0.8％植物琼脂，pH 5.7)上并生长直到发展出根。在适应环境之后，将转基因植物移植到盆栽土中并维持在温室中。通过PCR进行选择。此外参见李(Lee)等人(2011)韩国社会应用生物化学杂志(J.of Korean Soc.Appl.Biol.Chem.)54:37-45。

[0329] 实例6：针对粉纹夜(Cabbage Loopers)(粉纹夜蛾(Trichoplusia ni))(CL)、草盲蝽(豆荚草盲蝽)、甜菜夜蛾(Beet armyworms)(甜菜夜蛾(Spodoptera exigua))(BAW)和小菜蛾(Diamondback Moth)(小菜蛾(Plutella xylostella))(DBM)杀昆虫活性筛选蛋白质[0330] 通过强阳离子交换和疏水相互作用色谱部分纯化蛋白质。使用经过BSA校准的Invitrogen Quant-iT或Qubit分析估算蛋白质浓度。除非另外指出，否则提交以下各者进行生物分析：scott1(SEQ ID NO:1或4)5mg/mL、scott2(SEQ ID NO:2或5)1mg/mL和scott3(SEQ ID NO:3或6)1mg/mL总蛋白质量。在pH 6的20mM MES中或在pH 7.5的20mM Tris中缓冲蛋白质。Scott2外加最多5mM ZnCl2和CaCl2。

[0331] 基于饲料覆盖生物分析测试针对粉纹夜蛾(相比于实例3重复)、甜菜夜蛾和小菜蛾的活性。将适当的人工昆虫饲料分配到标准96孔板的每个孔中并使其干燥。在饲料固化之后，用移液管移取100μL处理液到适当数量的孔中并使其干燥。将单一1龄幼虫传递到96孔板的每个孔中。在处理之后4天记下死亡率。

[0332] 基于人工饲料生物分析如下测试针对草盲蝽的活性：通过组合适当量的草盲蝽人工饲料和储备处理溶液制备饲料包。将混合物涡旋并均匀分配到饲料包中。将10-12只2龄或3龄草盲蝽若虫放置到皮氏培养皿中，盖上网盖并用石蜡膜密封。在暴露于经处理饲料之后4天记下死亡率。

[0333] 功效表示为处理后4天的死亡率百分比。结果(一式两份)用死亡率％表示，显示于表7中。Scott1按4.9mg/mL制备用于第一草盲蝽分析。Scott3按0.42mg/mL制备用于第一草盲蝽分析并且按0.82mg/mL制备用于第一粉纹夜蛾分析。

[0334] 表7

[0335]

[0336] 本文中所述和所要求的发明内容不应限制在本文所披露的具体方面的范围内，因为这些方面本意是示意性的。任何等效方面都打算属于本发明的范围内。实际上，根据前述说明，本领域的普通技术人员将清楚本文中所展示和描述的方法和组合物的各种修改。这些修改也打算包括在所附权利要求书的范围内。在有矛盾的情况下，将以本披露(包括定义)为准。