盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用
阅读：966发布：2021-04-14
专利汇可以提供盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了 盐酸 氨 溴索联合氟康唑的抗 真菌 产品及其应用，属于医药技术领域，本发明以多种方法研究氟康唑和盐酸氨溴索联用对耐药白色念珠菌的静态与动态联合抗真菌作用。盐酸氨溴索与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：盐酸氨溴索＝1:64(μg/mL)， 最低抑菌浓度 分别为：128μg/mL与2μg/mL。盐酸氨溴索联合氟康唑时，可以增强氟康唑对耐药白色念珠菌的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药白色念珠菌对氟康唑的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。，下面是盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用专利的具体信息内容。
盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用
技术领域
[0001] 本发明涉及医药技术领域，具体涉及盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。
背景技术
[0002] 近年来，随着获得性免疫缺陷综合征(AIDS)患者的增多以及广谱抗菌药物的广泛应用，器官移植技术和导管技术等医疗技术的开展，侵袭性真菌感染的发病率和病死率逐年上升，特别是曲霉属和念珠菌属引起的感染，患者的生存率分别不足30％和70％。念珠菌感染对临床的威胁虽然没有曲霉菌感染所造成的威胁大，但由于这类真菌容易出现药物外排增强与基因靶位改变(如ERG11)等，使得对唑类抗真菌药物敏感的念珠菌不断出现耐药性，这给临床抗真菌感染带来极大的挑战。数据表明，AIDS患者晚期感染真菌后，超过三分之一耐药，对唑类药物耐药率更是高达65％。其中念珠菌尤其是白色念珠菌(Candida albicans，CA)，是呼吸系统、血流感染、消化系统、泌尿系统真菌感染的常见分离菌。根据美国院内感染控制组织的资料显示，CA是第4位引起院内血流感染的病原微生物，是死亡率最高的致病菌，死亡率可高达40％。CA血流感染的高死亡率也与其耐药现象的不断出现有关。新药研究与联合用药研究均是解决真菌耐药的途径。由于联合用药前期投入少、效果显著，受到国内外研究者的广泛关注。联合用药研究包括两种抗真菌药联合及非抗真菌药与抗真菌药联合，由于目前临床可用的抗真菌药物品种有限，且大多价格昂贵、毒副作用明显，使得非抗真菌药物与抗真菌药物的联合应用研究备受关注。近年来唑类药物，尤其是氟康唑，的广泛应用虽然取得了良好的临床效果，但随之而来的耐药株的出现使临床治疗变得棘手，这使得克服白色念珠菌对氟康唑的耐药问题成为研究热点。
[0003] 盐酸氨溴索(Ambroxol hydrochloride，ABH)是一种治疗呼吸系统疾病的安全、有效药物，在常见呼吸道疾病的化痰、排痰治疗中应用广泛。近年来有临床用药报道发现，盐酸氨溴索可与抗生素发挥协同抗细菌作用，可缩短呼吸系统感染的治疗时间，降低并发症发生率和病死率，适用年龄宽广，可广泛用于各种急慢性肺部疾病、呼吸窘迫综合征，具有降低痰液黏度、改善患者排痰功能及肺功能的作用，疗效确切，患者通常能很好耐受。目前，ABH在临床上有与抗真菌药物联合应用的机会(孙红爽，乜春城，马红芳，陈赫军，种宝贵.1例老年肺部细菌合并真菌感染患者的药学监护[J].2015，12(3)：182-185.)，另外，临床治疗中发现氨溴索注射液与抗菌药物合用可使抗菌药物在肺组织的分布浓度升高，增强抗菌药物的作用(王永莉，曹永宁.氨溴索注射液治疗小儿支原体肺炎56例[J].中国药业，2014，23(19)：97-98.)。对于ABH和FLC的联用抗白色念珠菌的作用研究，目前尚无研究报道，具有广阔的研究前景。
发明内容
[0004] 本发明的目的是为了克服目前真菌耐药问题，提供一种盐酸氨溴索联合氟康唑的抗真菌产品及其应用。
[0005] 为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0006] 一种盐酸氨溴索联合氟康唑在制备抗真菌产品中的应用。
[0007] 优选：所述产品为药物。
[0008] 优选：所述真菌为白色念珠菌。
[0009] 优选：所述盐酸氨溴索与氟康唑联合应用时的有效浓度配比：氟康唑：盐酸氨溴索＝1:64。
[0010] 所述应用时盐酸氨溴索的最低抑菌浓度为：128μg/mL。
[0011] 所述应用时氟康唑的最低抑菌浓度为：2μg/mL。
[0012] 一种抗真菌产品，以盐酸氨溴索和氟康唑为主要活性成分。
[0013] 优选：所述盐酸氨溴索与氟康唑的有效浓度配比为氟康唑：盐酸氨溴索＝1:64。
[0014] 所述盐酸氨溴索的最低浓度为：128μg/mL。
[0015] 所述氟康唑的最低浓度为：2μg/mL结果表明，大于128μg/mL的盐酸氨溴索与大于2μg/mL的氟康唑联合应用具有协同抗耐药白色念珠菌作用。
[0016] 一种抗真菌的制剂，由盐酸氨溴索和氟康唑以及药学上可接受的辅料组成。在本发明提供的制剂中，药学上可接受的辅料为药物制剂中的常规辅料，为本领域技术人员认为可行的常规辅料均在本发明的保护范围之内，本发明在此不做限定。
[0017] 本发明发现，ABH在体外可与抗真菌药物发挥联合抗真菌作用，由此可见，两者协同抗真菌作用并不仅仅局限于ABH使抗菌药物在肺组织的分布浓度升高这一作用机制。
[0018] 本发明采用耐药白色念珠菌细胞进行研究，利用棋盘肉汤微量稀释法，分别评价不同联合用药组合的联合抗真菌作用。具体内容如下：
[0019] A：ABH与FLC联合抗耐药CA作用：采用棋盘肉汤微量稀释法测定联合用药时最低有效浓度，以FICI法选择最佳药物组合浓度及评价药物联合用药的作用。此外，为更直观地表现联合用药对耐药CA作用的程度，将联合药敏测定数据用生长百分数差值模型(ΔE)进行了进一步分析。
[0020] B：ABH在临床使用中用量大、安全、有效，如果能在抗真菌方面发挥作用，特别是对耐药真菌感染的治疗，意义重大。本研究表明，ABH联合应用FLC可产生协同抗耐药CA作用，可扩大其应用范围，具有良好的应用前景。
[0021] 总之，本发明包含ABH与FLC联合应用产生协同抗耐药CA的作用。上述发现为临床联合用药作为治疗耐药真菌感染的方案提供了思路。
[0022] 盐酸氨溴索除了单用具有抗白色念珠菌浮游细胞及生物膜的活性外，发明人在研究中还偶然发现它能与氟康唑联用产生明显的协同抗真菌作用。ABH与FLC联合应用在体外具有协同抗耐药CA作用，且效果明显。低剂量的ABH可使FLC对耐药CA的MIC值从512μg/mL以上降至2μg/mL。
[0023] 本发明与现有技术相比，具有以下优点与效果：
[0024] 1.本发明表明，ABH与FLC联合应用时，可以增强FLC对耐药CA的抗菌活性，可以产生协同抗真菌作用，并能够逆转耐药CA对三唑类抗真菌药物的耐药性，为新药的开发及老药新用提供了研究方向。对FLC耐药的CA，联合用药可使其最低抑菌浓度明显降低，128μg/mL的ABH与2μg/mL的FLC合用可以杀灭80％以上的真菌，浓度再增大，效果更强。
[0025] 2.ABH在临床上应用量大、安全，其对FLC抗真菌的增效作用，可扩大其应用范围，并且降低FLC的最低有效抑菌浓度，降低抗真菌药物的用药量，从而降低药物的不良反应的发生，克服临床上真菌耐药问题。
[0027] 图1.盐酸氨溴索与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA10作用结果；
[0028] 图2.盐酸氨溴索与氟康唑联用对抗耐药白色念珠菌CA16作用结果；
[0029] 其中：X轴代表氟康唑的浓度，Y轴代表盐酸氨溴索的浓度，Z轴代表的是各个药物组合下的ΔE值，高于或低于平面(ΔE＝0)的值分别表示协同或拮抗作用，平面周围的值表示无关作用，图右侧的色彩编码条中，越靠近上端说明协同作用越强。
具体实施方式
[0030] 下面结合附图与实施例对本发明作进一步说明。
[0031] 实施例盐酸氨溴索与氟康唑联合抗真菌作用测定
[0032] 1.材料
[0033] 1.1药品与试剂
[0034] 氟康唑(Fluconazole，FLC)，大连美仑生物技术有限公司；
[0035] 盐酸氨溴索(Ambroxol hydrochloride，ABH)，大连美仑生物技术有限公司；
[0036] 科玛嘉念珠菌显色培养基，郑州博赛生物工程有限公司；
[0037] TTC-沙保罗培养基，青岛高科技园海博生物技术有限公司；
[0038] 酵母膏，北京奥博星生物技术有限责任公司；
[0039] 蛋白胨，北京奥博星生物技术有限责任公司；
[0040] 葡萄糖，国药集团化学试剂有限公司；
[0041] 琼脂粉，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0042] PBS磷酸盐缓冲剂，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0044] 磷酸二氢钾，上海新宝精细化工厂，批号200602132。
[0045] RPMI 1640原料药粉，美国GIBCO公司；
[0046] 3-(N-吗啉代)丙磺酸(MOPS)，北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司；
[0047] 甲萘醌(Menadione)，美国Sigma公司；
[0048] XTT(二甲氧唑黄)，南京旋光科技有限公司；
[0049] 乳酸林格氏液(复方氯化钠溶液)，山东鲁抗辰欣药业有限公司；
[0050] 丙酮，上海振兴化工一厂，批号200209510；
[0051] XTT-甲萘醌溶液的配制：取XTT粉末0.0500g，溶解于100mL已高压灭菌的林格氏液配成0.5mg/mL的溶液，用0.22μm滤膜滤过灭；加入10μL的10mmol/L的甲萘醌丙酮溶液(取甲萘醌0.0860g溶解于5mL丙酮)，使其终浓度为1μmol/L，摇匀，4℃避光保存。
[0053] PBS缓冲液：称取12gPBS磷酸盐缓冲剂至1L容量瓶，加入蒸馏水搅拌使其完全溶解，再加蒸溜水至刻度线，分装到试剂瓶后在121℃下高压灭菌30min，冷却后放4℃冰箱保存。
[0054] 酵母浸膏－蛋白胨－葡萄糖琼脂培养基：葡萄糖10g，蛋白胨10g，酵母膏5g，琼脂粉10g，加水溶解在500mL锥形瓶中，充分搅拌均匀后121℃灭菌30min，冷却后4℃冰箱保存备用。
[0055] RPMI 1640液体培养液：取RPMI 1640(含L-谷氨酰胺，不含碳酸氢钠)粉末2.08g，加入10％葡萄糖溶液40ml(含糖终浓度2％)及MOPS粉6.906g，加蒸馏水至约为200mL，混合均匀后在22℃用1mol/L的NaOH溶液调pH约为7.0±0.1，临用前用0.22μm混合纤维膜过滤灭菌。
[0056] 1.2仪器
[0057]
[0058]
[0059] 1.3实验菌株
[0060] 质控菌株：白色念珠菌ATCC10231，山东大学药理教研室惠赠；
[0061] 实验菌株：千佛山医院临床分离的白色念珠菌；
[0062] 菌株鉴定：实验用菌株在科玛嘉念珠菌显色培养基35℃下培养48小时，菌落呈绿色或翠绿色的所有菌株再经山东省疾病预防控制中心微生物研究室以标准微生物学方法鉴定为白色念珠菌。
[0063] 菌液制备：-20℃下保存的白色念珠菌室温下解冻，接种到TTC-沙保罗琼脂培养基上，35℃培养24h，取发育良好的单一菌落再次接种，35℃培养24h，以保证菌株处于生长期。选取若干单个较大菌落，PBS配制成菌悬液，经涡旋器振荡均匀后以中国细菌浊度标准管比
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浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×10 CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。
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浊，调整样品管与标准管浊度一致，此时白色念珠菌的菌浓度约为1×10 CFU/mL，系列稀释即得到工作菌液，并以活菌计数进行浓度验证。
[0064] 2.内容与方法
[0065] 2.1盐酸氨溴索与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用测定
[0066] 根据CLSI M27-A3方案的棋盘法，以RPMI-1640液体培养基稀释药液使其成为4倍工作浓度，筛选ABH与FLC联合应用的浓度范围，即ABH终浓度为256～4μg/mL，FLC的终浓度为64～0.125μg/mL。按浓度从低到高的顺序分别吸取FLC药液50μL，分别加入96孔平板的第2～11列，按浓度从低到高的顺序吸取ABH药液50μL，分别加入各96孔平板的第G～A行，除第
12列外各孔再分别加100μL菌液，其余不足200μL的孔用RPMI-1640培养液补足。其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含RPMI-1640液体培养基。根据CLSI M27-A3方案的要求，将加药的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，分别用XTT负载2h后以酶标仪测定OD并记录结果。所有实验重复三次。
12列外各孔再分别加100μL菌液，其余不足200μL的孔用RPMI-1640培养液补足。其中H1为生长对照，只含菌液不含药物，第12列为空白对照，只含RPMI-1640液体培养基。根据CLSI M27-A3方案的要求，将加药的96孔平板置35℃恒温培养箱中培养24h后，分别用XTT负载2h后以酶标仪测定OD并记录结果。所有实验重复三次。
[0067] 2.2评价方法与结果判定
[0068] 2.2.1Loewe additivity理论
[0069] Loewe additivity(LA)理论的基本思想认为药物不可能和它本身发生相互作用，因此将药物单用或联用产生相同药效的浓度(等效位点)进行比较。其分析方法分数抑菌浓度指数法(fractional inhibitory concentration index，FICI)，表述如下：
[0070] ΣFIC＝FICA+FICB＝CA/MICA+CB/MICB
[0071] MICA和MICB分别是药物A和B单用时的最小抑菌浓度，CA与CB为两药联用时达到相同药效时各自的浓度。FICI>4为拮抗作用，FICI在0.5与4之间为相加或无关作用，FICI≤0.5定义为协同作用。
[0072] 2.2.2Bliss independence理论
[0073] Bliss independence(BI)理论是以ΔE(药物各浓度下真菌生长百分率的理论值与实验值之差)为数据分析模型。ΔE模型表述如下：
[0074] ΔE＝EA×EB-Ecomb
[0075] 其中，EA为A药单用时真菌的生长率，EB为B药单用时真菌的生长率，Ecomb为A药和B药联用时真菌的生长率。结果分析时，通过ΣSYN与ΣANT，即96孔板中所有正值ΔE和负值ΔE的加和为指标来判断两种药物的相互作用。当ΔE的绝对值<100％时，表示为弱协同或弱拮抗作用；当ΔE的绝对值介于100％与200％之间时，表示为中等协同或拮抗作用，当ΔE的绝对值大于200％时，表示为为强协同或拮抗作用。
[0076] 3.结果
[0077] 3.1盐酸氨溴索与氟康唑联合抗耐药白色念珠菌作用结果
[0078] 3.1.1盐酸氨溴索与氟康唑联合的最低有效抑菌浓度
[0079] 各孔中真菌生长百分数的计算方法为：
[0080] 真菌生长百分数＝(各孔OD值-空白对照孔OD值)/生长对照孔OD值
[0081] 按上述公式计算平板中各孔真菌生长百分数，取能够抑制真菌生长80％的最低联用药物浓度为判读终点。
[0082] ABH与FLC联合抗真菌作用时，对耐药白色念珠菌呈现强协同作用，但对白色念珠菌的敏感株和非白色念珠菌来说无协同作用。现把耐药株CA10和CA16在加药96孔板中的生长百分数实验结果列表如下(表1-3)所示。
[0083] 表.1.用棋盘表示ABH与FLC的联合用药抗耐药白色念珠菌CA10生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。
[0084]
[0085] 表.2.用棋盘表示ABH与FLC的联合用药抗耐药白色念珠菌CA16生长百分率(以FICI法换算的药物最佳作用组合用灰色标出)。
[0086]
[0087] 3.1.2FICI模型和ΔE模型评价ABH与FLC联用的协同作用
[0088] FICI模型的评价指标为FICI值，FICI≤0.5则定义为协同作用。由表3可以看出，各组合的FICI值均小于0.5，表现为较强的协同作用。
[0089] ΔE模型的评价指标为ΣSYN与ΣANT，由表3可以看出，各组∑SYN和∑ANT的总和均远远大于200％，表现为强烈的协同作用，ABH与FLC联用对抗CA10和CA16的三维图如图1和图2。从图中可以直观的看出不同药物组合均具有强烈的协同作用。图片与上述数值分析具有一致性。
[0090] 表.3.以FICI模型和ΔE模型评价盐酸氨溴素和氟康唑联合用药抗真菌作用[0091]
[0092] 注解：FLC：氟康唑；ABH：盐酸氨溴索；MIC：最低抑菌浓度；MICA：药物单用时氟康唑的最低抑菌浓度；CA：药物联用时氟康唑的最低抑菌浓度；MICB：药物单用时盐酸氨溴索的最低抑菌浓度；CB：药物联用时盐酸氨溴索的最低抑菌浓度；FICI：分数抑菌浓度指数；ΣSYN：96孔板中所有正值ΔE之和；ΣANT：96孔板中所有负值ΔE之和。
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