一种贝莱斯芽孢杆菌HMB28023及其应用
阅读：901发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种贝莱斯芽孢杆菌HMB28023及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 防治领域，具体公开了一种贝莱斯芽孢杆菌((Bacillus velezensis)菌株HMB28023，其保藏编号为CGMCC No.19002；本发明还公开了含有该菌株的 微生物 菌剂。本发明HMB28023菌株对葡萄灰霉病菌的防效在84.39％以上；防治谱广，该菌株不仅对葡萄灰霉病防效高，还对油松枯梢病菌、苹果轮纹病菌，杨树腐烂病菌、核桃溃疡病菌和核桃褐斑病菌也有很好的防治效果；HMB28023菌株对葡萄灰霉病菌专化性强，且不易产生抗药性；本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题。，下面是一种贝莱斯芽孢杆菌HMB28023及其应用专利的具体信息内容。
1.一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMB28023，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.19002。
2.权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMB28023在防治葡萄灰霉病菌(Bortrytis cinerea)、油松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、苹果轮纹病菌(Botryospuaeria berengeriana)，杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、核桃溃疡病菌(Dothiorella gregaria)或核桃褐斑病菌(Cercospora insulana)上的应用。
3.一种微生物菌剂，其特征在于，所述的微生物菌剂含有权利要求1所述贝莱斯芽孢杆菌HMB28023的菌体和芽胞。
4.根据权利要求3所述的微生物菌剂，其特征在于，所述微生物菌剂为液体制剂。
5.权利要求3或4所述的微生物菌剂在防治葡萄灰霉病菌(Bortrytis cinerea)、油松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、苹果轮纹病菌(Botryospuaeria berengeriana)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、核桃溃疡病菌(Dothiorella gregaria)或核桃褐斑病菌(Cercospora insulana)上的应用。
6.用于鉴定菌株HMB28023的分子标记，其特征在于，所述分子标记由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。
7.一种基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以HMB28023为出发菌而得，且该基因工程菌具有防治葡萄灰霉病的功能。
一种贝莱斯芽孢杆菌HMB28023及其应用
技术领域
背景技术
[0002] 葡萄灰霉病是由灰葡萄孢菌(Bortrytis cinerea)引起的真菌性病害，葡萄的花序、花冠、果实和幼嫩茎叶等多个部位均可发病，每年因此而造成的葡萄损失为20％～30％，严重的在50％以上，因此，葡萄灰霉病对葡萄生产的危害十分严重。
[0003] 对葡萄灰霉病的防治主要采用化学药剂、栽培措施和生物防治等防治方法。化学防治虽然防治效果较好，但是存在污染环境和容易产生耐药性等问题。而采用栽培措施防治的防治效果较差。生物防治由于具有防效高、专一性强、药效持久性好、环境友好，以及不易产生抗药性等优点，因而受到越来越多的青睐。目前，用于防治葡萄灰霉病的微生物主要有：枯草芽孢杆菌(CN102876605A、CN106818881A、CN101870959A)、植物乳杆菌(CN108220212A、CN108522647A)、解淀粉芽孢杆菌(CN103243044A)、多粘类芽孢杆菌(CN104694446A)、放线菌(CN106434499A)、酿酒酵母(CN107904181A)、黄麻链霉菌(CN102899356A)、葡萄酒有孢汉生酵母(CN107868759A)、毕赤酵母(CN107988088A、CN107937289A)、核果梅奇酵母(CN107904180A)和葡萄酒酿酒酵母(CN107881122A)等。
[0004] 贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)属于芽孢杆菌属的一个新种，目前已用于防治小麦纹枯病、小麦赤霉病、油菜菌核病、辣椒根腐病、菜豆枯萎病、烟草赤星病菌、香蕉枯萎病、稻瘟病等几十种病害，但是没有发现用于防治葡萄灰霉病的报道。
发明内容
[0005] 针对葡萄灰霉病对葡萄等造成的为害，本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMB28023，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.19002。
[0006] 本发明还提供了上述贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)HMB28023在防治葡萄灰霉病菌(Bortrytis cinerea)、油松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、苹果轮纹病菌(Botryospuaeria berengeriana)，杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、核桃溃疡病菌(Dothiorella gregaria)或核桃褐斑病菌(Cercospora insulana)上的应用。
[0007] 本发明还提供了一种微生物菌剂，所述微生物菌剂含有上述贝莱斯芽孢杆菌HMB28023菌体和芽胞。
[0008] 上述微生物菌剂为液体制剂。
[0009] 本发明还提供了上述微生物菌剂的制备方法，包括如下步骤：
[0010] (1)菌种活化：将低温保存的HMB28023菌株在LB平板培养基上活化，挑取单菌落在LB斜面培养基上，在25～35℃培养10～16小时，得活化的菌株；
[0012] (3)发酵培养：按照体积比为1～3％的比例将步骤(2)所得的种子液接入到pH值为7.0的玉米粉黄豆粉培养基中，在25～35℃、摇床转速为150～220rpm的条件下发酵培养35～40h，得发酵液；
[0013] (4)检测发酵液中菌体和芽胞数量，待发酵液中成熟芽胞占到芽胞和菌体总数的95％时停止发酵培养；所得即为HMB28023的液体制剂。
[0015] 上述制备方法步骤(2)中所述的LB液体培养基的组成成分及其重量比为：胰蛋白胨8～12g，酵母提取物4～6g，氯化钠4～6g，水1000mL。
[0016] 所述的LB平板培养基、LB斜面培养基和LB液体培养基均按照常规方法制备。
[0017] 上述制备方法步骤(3)中所述的玉米粉黄豆粉培养基的组成成分及其重量百分比为：玉米粉1.0～3.0％，黄豆粉1.0～3.0％，NaCl 0.1～0.8％，MnSO4·H2O 0.5～1.0％，其余为水。
[0018] 所述的玉米粉黄豆粉培养基的制备方法，按照重量百分比将玉米粉、黄豆粉、NaCl和MnSO4·H2O混合，再加水，调节pH，搅拌均匀即可。
[0019] 本发明还提供了上述微生物菌剂在防治葡萄灰霉病菌(Bortrytis cinerea)、油松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)、苹果轮纹病菌(Botryospuaeria berengeriana)、杨树腐烂病菌(Valsa sordida)、核桃溃疡病菌(Dothiorella gregaria)或核桃褐斑病菌(Cercospora insulana)上的应用。
[0020] 上述微生物菌剂的使用方法：将上述所得微生物菌剂用水稀释至活菌体数为107cfu/mL，于葡萄灰霉病发病前2周进行叶面喷雾，即可达到预防葡萄灰霉病发生的目的。
[0021] 本发明还提供了用于鉴定菌株HMB28023的分子标记，所述分子标记由SEQ ID No.1或SEQ ID No.3所示的核苷酸序列组成。
[0022] 本发明还提供了一种基因工程菌，所述基因工程菌是以HMB28023为出发菌而得，且该基因工程菌具有防治葡萄灰霉病的功能。
[0023] 本发明具有的优点和有益效果：(1)本发明菌株HMB28023对葡萄灰霉病菌的防效高，平均防效在84.39％以上；(2)本发明菌株HMB28023对葡萄灰霉病菌专化性强，且不易产生抗药性；(3)本发明菌株HMB28023防治谱广，不仅对葡萄灰霉病防效高，还对油松枯梢病菌、苹果轮纹病菌，杨树腐烂病菌、核桃溃疡病菌和核桃褐斑病菌也有很好的防治效果；(4)本发明微生物菌剂对人、畜安全，没有环境污染问题；(5)本发明制备方法简单、成本低、使用简单。
[0024] 生物保藏：本发明贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)菌株HMB28023己于2019年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.19002。
附图说明
附图说明
[0025] 图1为根据16S rDNA序列获得的HMB28023菌株系统发育树。
[0026] 图2为根据gyrB基因序列获得的HMB28023菌株系统发育树。
[0027] 图3为根据ropB基因序列获得的HMB28023菌株系统发育树。
具体实施方式
[0028] 下面以具体实施例来进一步解释本发明，但是不以任何方式构成对本发明的限制。下述实施例中的实验方法，如无特别说明，均为常规方法；下述实施例中的百分含量，如无特别说明，均为重量百分含量。
[0029] 实施例1 HMB28023菌株的筛选分离过程
[0030] 2013年1月16日至20日，河北省农林科学院植物保护研究所从西藏自治区林芝市米林县、工布江达县，日喀则市江孜县、定日县、仁布县、拉孜县，山南市浪卡子县，拉萨市曲水县、墨竹工卡县等9县市采集22份冰川低地、草地、湖畔、峡谷、山口等多种类型土壤样本，带回实验室后分别称取1g土样放到250mL的灭菌三角瓶中，加入无菌水100mL，放到摇床上，170rpm振荡30min，静置2h，取上清液10mL加入50mL灭菌离心管中，在80℃恒温水浴30分钟，然后取1mL加无菌水9mL，即成10mL10-3倍土壤微生物悬液，继而将土壤悬液稀释成10-4、10-5、10-6倍稀释液，取各浓度微生物悬液200μL涂于LB培养基平板上，每个浓度重复3次，在30℃恒温培养1d～3d，进行细菌的分离和纯化。并以葡萄灰霉病为靶标，通过平板对峙法、盆栽试验法进行生防菌的筛选。结果从1805株土壤细菌中筛选出一个对葡萄灰霉病具有良好防治效果的菌株，命名为HMB28023。
[0031] 实施例2 HMB28023菌株的分类鉴定：
[0032] (1)形态特征鉴定
[0033] 在LB培养基上培养菌体为杆状，培养10h后产生芽胞，芽胞中生，椭圆形，胞囊不膨大，抗酸染色阴性，无伴胞晶体，能运动，鞭毛周生。在营养琼脂平板上，培养初期菌落淡乳白色，脓状，圆形，边缘整齐，菌落隆起呈馒头状，表面湿润；培养后期菌落淡黄色，边缘不整齐，表面干燥有褶皱；在营养琼脂斜面上划线培养，呈直线形；在液体培养基中静止培养，表面形成白色菌膜。这些形态特征与《常见细菌系统鉴定手册》(东秀珠等编著.科学出版社.2001年)中描述的芽孢杆菌属形态特征基本一致，初步判断HMB28023菌株属于芽孢杆菌。
[0034] (2)利用16S rDNA序列鉴定分类
[0035] 以HMB28023的基因组DNA为模板，以通用引物F27和R1492为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物序列为：
[0036] 27F：5’-AGAGTTTGATCATGGCTCAG-3’
[0037] R1492：5’-GGCTACCTTGTTACGACTT-3’
[0038] 16S rDNA的PCR反应体系(50μL)为:10×PCR Buffer(Mg2+)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL，27F(10μmol/L)1μL，R1492(10μmol/L)1μL；HMB28023基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1.5min，30个循环；72℃10min。将所得PCR扩增产物进行凝胶电泳，送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28023的16S rDNA序列(见SEQ ID No.1)。将所得HMB28023的16S rDNA序列在Genbank中进行同源性比较，结果菌株HMB28023与芽孢杆菌属的16S rDNA同源性达到
99.91％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树，结果((见图1))HMB28023与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB28023属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
99.91％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树，结果((见图1))HMB28023与芽孢杆菌属聚合到一起，说明HMB28023属于芽孢杆菌属(Bacillus)。
[0039] (3)利用gyrB基因序列鉴定分类
[0040] 以HMB28023基因组DNA为模板，以芽孢杆菌gyrB基因的简并引物gyrB-F和gyrB-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的gyrB-F和gyrB-R引物的序列为：gyrB-F：5’-TTGRCGGHRGYGGHTATAAAGT-3’，gyrB-R：5’-TCCDCCSTCAGARTCWCCCTC-3’。
[0041] gyrB的PCR扩增反应体系(50μL)为:10×PCR Buffer(Mg2+)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；gyrB-F(10μmol/L)1μL，gyrB-R(10μmol/L)1μL；HMB28023基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，55℃45s，72℃1min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28023菌株的gyrB基因序列(见SEQ ID No.2)。将获得的HMB28023菌株的gyrB基因序列在Genbank中进行同源性比较。结果发现HMB28023与贝莱斯芽孢杆菌菌株UCMB5007、UCMB5044和VCC-2003的gyrB基因序列同源性最高，达到99.89％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树，结果(见图2)HMB28023菌株与贝莱斯芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB28023为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并且与已知贝莱斯芽孢杆菌菌株不同，是一个新菌株。
[0042] (3)利用rpoB基因序列鉴定分类
[0043] 以HMB28023基因组DNA为模板，以芽孢杆菌rpoB基因的引物rpoB1206-F和rpoB3202-R为引物进行PCR扩增，得PCR扩增产物；其中所述的引物的序列为：rpoB1206-F:5’-ATCGAAACGCCTGAAGGTCCAAACAT-3’，rpoB3202-R:5’-ACACCCTTGTTACCGTGACGACC-3’。
[0044] rpoB的PCR扩增反应体系(50μL)为:10×PCR Buffer(Mg2+)5μL；dNTP Mixture(2.5mM)5μL；Taq(5U/μL)1μL；rpoB1206-F(10μmol/L)1μL，rpoB3202-R(10μmol/L)1μL；HMB28023基因组DNA 50ng；ddH2O补足至50μL。PCR的反应条件为95℃5min；95℃30s，60℃
45s，72℃2min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28023菌株的rpoB基因序列(见SEQ ID No.3)。将获得的HMB28023菌株的rpoB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现HMB28023与贝莱斯芽孢杆菌菌株BH21、K2和LC1的rpoB基因序列同源性最高，达到99.63％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树，结果(见图3)HMB28023菌株与贝莱斯芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB28023为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并且是一个新菌株。
45s，72℃2min，30个循环；72℃10min。将扩增产物送交上海生工生物工程有限公司测序，得HMB28023菌株的rpoB基因序列(见SEQ ID No.3)。将获得的HMB28023菌株的rpoB基因序列在Genbank中进行同源性比较，结果发现HMB28023与贝莱斯芽孢杆菌菌株BH21、K2和LC1的rpoB基因序列同源性最高，达到99.63％；同时利用MEGA软件(Molecular Evolutionary Genetics Analysis，分子进化遗传分析)构建系统发育树，结果(见图3)HMB28023菌株与贝莱斯芽孢杆菌聚合到一起，说明HMB28023为贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并且是一个新菌株。
[0045] 综合以上形态特征、16S rDNA、gyrB和rpoB基因序列同源性对比分析的结果，可知HMB28023属于贝莱斯芽孢杆菌(Bacillus velezensis)，并且和现有的贝莱斯芽孢杆菌菌株不同，是一个新的贝莱斯芽孢杆菌菌株。
[0046] 实施例3 HMB28023微生物菌剂的制备
[0047] 按照如下步骤进行：
[0048] (1)菌种活化：将保存于-80℃的贝莱斯芽孢杆菌菌株HMB28023(该菌株HMB28023己于2019年11月25日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC No.19002)在LB平板培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上进行活化(30℃)，挑取单菌落在LB斜面培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，琼脂粉15g，水1000mL)上在30℃下培养30小时，得活化的菌株；
[0049] (2)种子液的制备：按常规方法制作LB液体培养基(其组成成分及其重量比为：胰蛋白胨1g，酵母提取物0.5g，氯化钠1g，水1000mL)，在250mL三角瓶中装入LB培养液100mL，高压湿热灭菌，待温度降到室温后，每瓶中接入一接种环步骤(1)活化好的菌株，在30℃、摇床转速190rpm的条件下进行振荡培养24小时，得种子液；
[0050] (3)玉米粉黄豆粉培养基的制备：按照重量百分比将玉米粉1.5％，黄豆粉2.0％，NaCl 0.5％，MnSO4·H2O 0.6％加入水中，搅拌混合均匀，即得玉米粉黄豆粉培养基；分装于500mL三角瓶中，每瓶200mL；在121℃对玉米粉黄豆粉培养基进行灭菌30分钟，再降温到30℃备用；
[0051] (4)发酵培养：向步骤(3)所得每瓶玉米粉黄豆粉培养基200mL中接种步骤(2)所得种子液2mL；在30℃、摇床转速180rpm条件下进行发酵培养36h，以后每隔30分钟从三角瓶中取样进行镜检，对视野中的芽胞和总菌体数进行计数，并计算芽胞率(芽胞率(％)＝成熟芽胞数/(成熟芽胞数+菌体数)×100)；芽胞率达到90％时停止发酵培养；共发酵培养约48h，得贝莱斯芽孢杆菌HMB28023的液体制剂。
[0052] 实施例4 HMB28023菌株对葡萄灰霉病菌的拮抗作用试验
[0053] (一)供试葡萄灰霉病菌来源：葡萄灰霉病菌GBC-1菌株采自河北省衡水市饶阳县北流满村棚室葡萄灰霉病病叶，经河北省农林科学院植物保护研究所分离纯化，河北农业大学植物保护学院植物病理系鉴定为灰葡萄孢菌(Bortrytis cinerea)，致病力测定表现为强致病力。
[0054] (二)试验方法：
[0055] 平板对峙实验：首先将葡萄灰霉病菌GBC-1菌株在PDA平板上活化培养5天，然后用打孔器 在菌落边缘区域打孔制成菌片，将葡萄灰霉病菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例3步骤(1)活化的贝莱斯芽孢杆菌HMB28023点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB28023菌株)。在25℃恒温培养，待空白对照即将长满整个培养皿时，测量葡萄灰霉病菌的对照生长量(菌落半径)和处理生长量(接种HMB28023后的抑制生长半径)，拮抗作用用抑菌率表示。
[0056] 抑菌率(％)＝(对照生长量-处理生长量)/对照生长量×100。
[0057] 结果(见表1)贝莱斯芽孢杆菌HMB28023对葡萄灰霉病菌的抑制率达73.7％；透明的抑菌带宽8.7毫米；说明本发明贝莱斯芽孢杆菌HMB28023对葡萄灰霉病菌具有明显的抑制作用，具有防治葡萄灰霉病的生防潜力。
[0058] 表1 HMB28023菌株对葡萄灰霉病菌的拮抗作用试验结果
[0059]
[0060] 实施例5 HMB28023菌株及其菌剂对葡萄灰霉病离体防效对比试验
[0061] (一)试验处理：
[0062] (1)实施例3制备的HMB28023液体制剂的100倍水稀释液。
[0063] (2)空白对照：清水。
[0064] (二)试验方法：
[0065] 本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。
[0067] (2)葡萄灰霉病菌菌盘制备：将葡萄灰霉病菌GBC-1菌株在PDA平板上活化培养5天，然后用打孔器 在菌落边缘区域打孔制成菌片，备用。
[0068] (3)离体叶片法测定防治效果：选取生长一致的健康葡萄叶片，用无菌水冲洗干净，在实施例3制备的HMB28023液体制剂的100倍水稀释液中浸泡30分钟后，用脱脂棉包住叶柄，叶背朝上，置于垫有无菌湿纱布的培养皿 中，每个培养皿中放置一枚叶片，用保鲜膜密封好，25℃培养1d。之后在叶背主叶脉处接种步骤(2)培养的灰葡萄孢菌片，再次密封，置于25℃培养。每天观察，待对照充分发病后采用十字相乘法测量病斑直径，计算病斑面积。设空白对照，每个处理6次重复。
[0069] 病斑面积(mm2)＝病斑长度(mm)×病斑宽度(mm)×3.14/4
[0070] 防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100
[0071] 结果(见表2)HMB28023液体制剂处理病斑面积为83.18mm2显著低于空白对照的病斑面积(408.20mm2)，HMB28023液体制剂对葡萄灰霉病的防效为79.62％。说明本发明贝莱斯芽孢杆菌菌株HMB28023及其HMB28023液体制剂对葡萄灰霉病具有突出的防治效果。
[0072] 表2 本发明HMB28023菌株对葡萄灰霉病防效对比试验结果
[0073] 处理 病斑面积(mm2) 防效(％)HMB28023液体制剂 83.18b 79.62
空白对照 408.20a --
空白对照 408.20a --
[0074] 实施例6 HMB28023菌株及其菌剂对葡萄灰霉病盆栽防效对比试验
[0075] (一)试验处理：
[0076] (1)实施例3制备的HMB28023液体制剂的100倍水稀释液。
[0077] (2)化学药剂：42.8％氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂(露娜森)1000倍水稀释液。
[0078] (3)空白对照：清水。
[0079] (二)试验方法：
[0080] 本试验在河北省农林科学院植物保护研究所植病生防实验室内进行。
[0081] (1)培育葡萄植株：在直径30cm，深20cm的塑料花盆中装填田园土，栽植夏黑和藤稔两种葡萄苗，温室正常管理。将葡萄苗用竹竿支撑固定培养，并掐掉幼蕾，保证植株营养生长。
[0082] (2)葡萄灰霉病菌菌盘制备：将葡萄灰霉病菌GBC-1菌株在PDA平板上活化培养5天，然后用打孔器 在菌落边缘区域打孔制成菌片，备用。
[0083] (3)盆栽法测定防治效果：选取葡萄植株上生长一致的健康葡萄叶片，喷施无菌水冲洗叶片表面，晾干后喷施实施例3制备的HMB28023液体制剂的100倍水稀释液，24h后在葡萄叶片上接种步骤(2)培养的葡萄灰霉菌菌片，温度控制在20～25℃，湿度控制在90％左右。设置化学药剂对照和空白对照，每个处理6次重复。每天观察，待对照充分发病后采用十字相乘法测量病斑直径，计算病斑面积。
[0084] 病斑面积(mm2)＝病斑长度(mm)×病斑宽度(mm)×3.14/4。
[0085] 防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100
[0086] 结果(见表3)在夏黑葡萄上，HMB28023液体制剂处理病斑面积为19.49mm2，显著低于化学药剂对照的病斑面积(88.61mm2)，极显著低于空白对照的病斑面积(246.40mm2)，HMB28023液体制剂对夏黑葡萄上灰霉病的防效为92.09％；在藤稔葡萄上，HMB28023液体制剂处理病斑面积为61.09mm2，与化学药剂对照的病斑面积(64.94mm2)差异不显著，显著低于空白对照的病斑面积(264.87mm2)，HMB28023液体制剂对藤稔葡萄上的灰霉病防效为76.94％。说明本发明贝莱斯芽孢杆菌菌株HMB28023及其HMB28388液体制剂对葡萄灰霉病具有突出的防治效果。
[0087] 表3 贝莱斯芽孢杆菌HMB28023对葡萄灰霉病防效的对比试验结果
[0088]
[0089] 实施例7 HMB28023菌株及其菌剂对葡萄灰霉病田间防效对比试验
[0090] (一)试验处理：
[0091] (1)实施例3制备的HMB28023液体制剂的100倍水稀释液。
[0092] (2)化学药剂：42.8％氟吡菌酰胺·肟菌酯悬浮剂(露娜森)1000倍水稀释液。
[0093] (3)空白对照：清水。
[0094] (二)试验方法：
[0095] (1)本试验在河北省衡水市饶阳县北流满乡北流满村设施栽培葡萄园区进行。葡萄品种为维多利亚，田间正常管理。2019年4月，在葡萄灰霉病初始发生时开展本试验。
[0096] (2)葡萄灰霉病菌菌盘制备：将葡萄灰霉病菌GBC-1菌株在PDA平板上活化培养5天，然后用打孔器 在菌落边缘区域打孔制成菌片，备用。
[0097] (3)田间试验：在喷施实施例3制备的HMB28023液体制剂之前预先在接种葡萄灰霉病菌菌盘处扎孔，之后喷施实施例3制备的HMB28023液体制剂的100倍水稀释液，24h后接种步骤(2)制备的葡萄灰霉病菌菌盘，之后用220mm×280mm塑封袋密封保湿。设置化学药剂对照和空白对照每个处理6次重复。每天观察，待对照充分发病后采用十字相乘法测量病斑直径，计算病斑面积。
[0098] 病斑面积(mm2)＝病斑长度(mm)×病斑宽度(mm)×3.14/4。
[0099] 防治效果(％)＝(对照病斑面积-处理病斑面积)/对照病斑面积×100
[0100] 结果(见表4)HMB28023液体制剂处理病斑面积为26.82mm2，与化学药剂对照的病斑面积(20.80mm2)差异不显著，显著低于空白对照的病斑面积(241.49mm2)，HMB28023液体制剂对葡萄灰霉病防效为88.89％。说明本发明贝莱斯芽孢杆菌菌株HMB28023及其HMB28023液体制剂对葡萄灰霉病具有突出的防治效果。
[0101] 表4 HMB28023菌株及其菌剂对葡萄灰霉病田间防效对比试验结果
[0102] 处理 病斑面积(mm2) 防效(％)HMB28023液体制剂 26.82b 88.89
化学药剂 20.80b 91.39
空白对照 241.49a --
化学药剂 20.80b 91.39
空白对照 241.49a --
[0103] 实施例8 HMB28023菌株对五种林果病害病原菌的抑制作用试验
[0104] (一)本试验于2018年5月在河北省农林科学院植物保护研究所植物病害生物防治实验室内进行。
[0105] (二)试验方法：
[0106] (1)供试病害病原真菌及来源：本实施例供试的油松枯梢病菌(Sphaeropsis sapinea)，苹果轮纹病菌(Botryospuaeria berengeriana)，杨树腐烂病菌(Valsa sordida)，核桃溃疡病菌(Dothiorella gregaria)和核桃褐斑病菌(Cercospora insulana)均由河北农业大学林木病理实验室提供。
[0107] (2)平板测定试验：
[0108] 首先将供试的病原真菌在PDA平板上活化，培养3-7天后在菌落边缘区域，用打孔器 打孔制成菌片，将供试病原真菌菌片转接在另一个PDA平板中央，再将实施例3步骤(1)中活化的贝莱斯芽孢杆菌HMB28023点接在距指示菌菌片2.0厘米处，设空白对照(不点接HMB28023菌株)。25℃恒温培养3-7天，逐日观察HMB28023菌株和供试病原真菌的生长情况，待对照病原菌长至培养皿边缘时，观察并记录对照病原菌生长的半径，抑菌带宽度。用“－”表示HMB28023菌株无抑菌效果；“+”表示HMB28023菌株抑菌带1.00-5.00mm，抑菌作用较弱；“++”表示HMB28023菌株抑菌带6.00-10.00mm抑菌作用中等；“+++”表示HMB28023菌株抑菌带11.00-15.00mm，抑菌作用较强；“++++”表示HMB28023菌株抑菌带16.00-20.00mm，抑菌作用超强。
[0109] 表5 HMB28023菌株对五种林果树病害病原真菌的抑制作用试验结果
[0110]
[0111] 结果(见表5)贝莱斯芽孢杆菌HMB28023对供试的五种重要林果病害病原菌均具有中等以上的抑菌作用，对苹果轮纹病菌的抑菌作用较强，对杨树腐烂病菌的抑菌作用超强。说明HMB28023对油松枯梢病菌(Sphaeropsis s apinea)，苹果轮纹病菌(Botryospuaeria berengeriana)，杨树腐烂病菌(Valsa sordida)，核桃溃疡病菌(Dothiorella gregaria)和核桃褐斑病菌(Cercospora insulana)均有较强的抑菌能力，即对上述5种林果病害具有较好的生防潜力。
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