技术领域
[0001] 本
发明属于生物制剂技术领域，特别涉及一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂及其应用。
背景技术
[0002] 近年来，重金属污染已成为全球性的环境问题。2014年《全国
土壤污染状况调查
公报》显示，镉(Cd)的点位超标率居重金属污染物之首，引起人们的广泛关注。由于采矿
冶炼、农业污
水灌溉及
农药化肥施用，大量的镉被释放到土壤中，加剧了土壤镉污染问题。一方面，镉会破坏
植物的叶绿体结构，造成光合作用受阻，降低植物的代谢，严重抑制植物，特别是叶菜类蔬菜的生长。另一方面，镉的
水溶性高，蔬菜茎叶可食用部分容易累积人为进入
土壤耕作层的镉，进而通过食物链传递到动物及人体内，严重威胁人类健康与生存。因此，如何缓解或抑制植物受镉毒害，减少植物体内吸收传输镉成为目前迫切要解决的课题。
[0003] 叶菜类蔬菜在我国有广泛种植，其在从土壤中汲取大量水分的同时易富集土壤中的镉，且其对土壤中镉造成的生理胁迫十分敏感，因此，如何缓解叶菜类蔬菜的镉胁迫，降低其可食用部分的镉积累具有十分重要的意义。目前微
生物修复在Cd污染的治理方面具有很大的潜在应用前景，成为目前重金属污染治理的重要研究方向。枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)是一种广泛分布的需
氧性细菌，其在防治植物病虫害方面发挥了多种有益作用。研究显示，枯草芽孢杆菌作为优势种的
微生物肥料，可以降低Cd的酸提取态，使有机结合态增加，从而减少Cd的迁移、转化，减少重金属被植物吸收转化进而进入食物链的生态
风险，而且在修复Cd污染的土壤-微生物-植物
生态系统中发挥着重要作用。
[0004] 缓解植物镉胁迫的方法有许多，而原位外源添加剂则由于其应用性高而被广泛关注。研究发现，硒(Se)可通过抑制自由基的形成、与镉离子形成螯合蛋白、抑制植物对镉的吸收途径减轻镉对植物的毒性效应，并抑制镉向地上部分的运输。同时，Se也是植物生长的有益元素和人体必需的微量元素，还能够促进植物的生长，提升可食用植物的品质。目前应用于农业生产的硒主要有硒酸钠、亚硒酸钠、硒矿粉等无机硒类和
氨基酸硒肥、腐植酸硒肥等有机硒类，二者虽然能够提高食品中硒含量，但都存在成本较高、肥效流失严重等问题。尤其是无机硒类大部分具有较强的毒性，有益浓度范围窄，易对土壤及植物本身造成二次毒害。
[0005] 纳米硒是近年来纳米科技的新产品，其最大的特点是安全性高，
稳定性高，易于被植物体吸收和利用。但检索发现利用可以在土壤中固氮的枯草芽孢杆菌168制备的生物纳米零价硒与枯草芽孢杆菌按比例水溶稀释制备的缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂及其应用还未见报道。
发明内容
[0006] 针对土壤镉污染及硒应用现状，本发明要解决的问题是提供一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂及其应用。
[0007] 本发明所述的缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂，其特征是：
[0008] 所述生物制剂由采用枯草芽孢杆菌168生物法制得的纳米硒与枯草芽孢杆活菌数量≥1×109/g的枯草芽孢杆菌在水中均匀混合制成，其混合比例是：每15L水中混有300mL～700mL的浓度为200～400mg L-1纳米硒水溶液和1kg～4kg枯草芽孢杆菌。
[0009] 上述缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂，进一步优选的实施方式是：所述纳米硒与枯草芽孢杆混合比例是：每15L水中混有500mL的浓度为300mg L-1纳米硒水溶液和4kg枯草芽孢杆菌。
[0010] 其中，所述采用枯草芽孢杆菌168生物法制得的纳米硒以如下步骤制备：
[0011] (1)在灭菌后的添加了50～600mmol L-1亚硒酸钠的LB培养基中，按体积比的量接种4～10％的枯草芽孢杆菌168活菌体，然后将培养瓶置30±2℃的摇瓶
培养箱中在150-300转/分钟的条件下进行好氧培养0.5～7d，之后以4000g～4500g离心10～20分钟，收集沉淀即获得枯草芽孢杆菌与其代谢产物纳米硒的混合物；
[0012] (2)用0.9％NaCl溶液洗涤所得的沉淀，然后加入液氮并杵打使沉淀
破碎；再以100-300W条件超声处理5～10分钟使沉淀混合物粒径达到200nm以下，用Tris-HCl缓冲液以
10000g，5min条件连续离心洗涤破碎产物2-3次；将离心洗涤收集到的产物悬浮于去离子水中，即得到含有纳米硒和菌细胞碎片的悬浮液；
[0013] (3)将步骤(2)制得的悬浮液转移到试管中，按体积比1:2～2:1加入正辛醇混合；在4℃静置沉淀14～24h；液体出现分层：上层是正辛醇，两相界面是菌细胞碎片，下层是纳米硒颗粒悬浊液；分离出下层的纳米硒颗粒悬浊液，3500g离心10min，沉淀物用氯仿、
乙醇和蒸馏水分别洗涤至完全去除菌细胞碎片后得到纳米硒；将清洁后的纳米硒粒子在去离子水中定量为200-400mg/L的浓度制得纳米硒水溶液，储存在4℃备用。
[0014] 上述采用枯草芽孢杆菌168生物法制备纳米硒的方法中，优选的实施方式是：
[0015] 步骤(1)中所述添加亚硒酸钠的浓度是300～500mmol L-1。
[0016] 步骤(1)中所述摇瓶培养的条件是在30℃，200-250转/分钟的条件下进行好氧培养0.7～2d。
[0017] 步骤(2)中所述超声条件为100-200W处理5分钟。
[0018] 步骤(3)中所述悬浊液与正辛醇的体积比是2:1。
[0019] 本发明所述缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂在缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫中的应用。
[0020] 其中：所述叶菜类蔬菜优选是小白菜或油菜；所述生物制剂在缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫中的应用方法是：选择一
块种植小白菜或油菜的菜地，分为3片区域先预处理土壤，使土壤中重金属镉浓度分别为0、10mg/kg、20mg/kg，放置两周，期间保持土壤湿度恒定；然后以每0.1平方米面积种植16～20棵菜的比例种植小白菜，一周后间苗至每0.1平方米面积12棵；期间准备上述所述的生物制剂在出苗后7-12天进行第一次叶面喷施，在生长期第15-20天进行第二次叶面喷施，在
收获前5-10天第三次叶面喷施；将收获的小白菜或油菜用蒸馏水清洗干净根部及
叶片，检测根部及叶片的镉含量以评价所述生物制剂缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的状况。
[0021] 上述应用中：所述生物制剂组分中纳米硒与枯草芽孢杆混合比例优选是：每15L水中混有500mL的浓度为300mg L-1纳米硒水溶液纳米硒和4kg活菌数量≥1×109/g的枯草芽孢杆菌；所述土壤中重金属镉浓度优选设置为20mg/kg。
[0022] 本发明公开了一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂，其主要组分是利用可以在土壤中固氮的枯草芽孢杆菌168制备的生物纳米零价硒，生物功能性强且环境友好性高，同时配合使用了一定量的枯草芽孢杆菌，可以更好的适应叶菜类蔬菜生长的需要，在缓解镉胁迫的同时提高了植物品质、产量和对病虫害的抗性。
[0023] 本发明所述的生物制剂在缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的应用中，整个过程只需叶面喷施，可实现Cd(II)胁迫的高效缓解。本发明的特色在于该生物制剂在叶面喷施时既可以为植物补充硒元素，防治病虫害又可以显著的抑制镉从地下部分到地上部分的迁移，而且在修复Cd污染的土壤-微生物-植物生态系统中发挥着重要作用。
[0024] 本发明基于生物制剂优势，环境友好度高，不易造成土壤二次污染与植物的二次伤害。由于生物法制得的纳米硒价态与粒径都发生了极大的变化，其物理化学性质也相应地被改变。也使得本发明的缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂及其应用极大的扩增了现行农业中对硒的应用及硒添加的范围，预示在农业应用方面有较大的应用前景。
[0025] 综上，本发明的突出优点和效果是：
[0026] 1、生物功能性强。本发明中含的生物制纳米硒可以促进作物的生长发育并提高其产
质量。在低浓度施用时可以很好地缓解镉造成的生理抑制，而高浓度施用时也不会造成植物生长的二次毒害。
[0027] 2、防治病虫害。本发明中含有枯草芽孢杆菌，可以在改善土壤微生物环境的同时有效防治病虫害。
[0028] 3、抑制镉传输能
力强。本发明提供的生物菌剂可以很好地抑制镉从地下部分到地上部分的传输，极大地降低镉的迁移率。从而减少叶菜类蔬菜如小白菜或油菜可食用部分镉的含量，降低人体食用风险。同时可以降低土壤内酸提取态镉的含量，改善土壤重金属污染。
[0029] 4、环境友好度高。本发明所使用的枯草芽孢杆菌已被证明可以安全引入生态环境中，而生物法制得的纳米硒可以避免无机硒直接施用造成的土壤二次污染。
附图说明
[0030] 图1本发明所述生物法制得的纳米硒扫描
电子显微镜成像(上图)与
X射线衍射图谱(下图)。
[0031] 图2本发明所述生物制剂扫描电子显微镜(SEM)特写图片。
[0032] 图3不同浓度纳米硒的本发明所述生物制剂对小白菜
幼苗生长的影响。
[0033] 图4不同浓度纳米硒的本发明所述生物制剂对镉胁迫下油菜生长的影响。
[0034] 其中：Control为空白对照，Cd组为
营养液中镉浓度50μmol L-1，Se1、Se2和Se3组分别为在Cd组
基础上(即营养液中镉浓度为50μmol L-1)叶施生物制剂，三组施用的生物制剂组分量分别是稀释后含26.7mg/L枯草芽孢杆菌的5、10、20mg/L纳米硒。
[0035] 图5不同浓度本发明所述含纳米硒的生物制剂与含亚硒酸钠的生物制剂的添加对镉胁迫下小白菜生长的影响。
[0036] 其中：A为不同浓度生物制剂添加对20mg/kg镉浓度下叶片中镉含量的影响；B为不同浓度生物制剂添加对20mg/kg镉浓度下根中镉含量的影响。
[0037] 图6不同浓度本发明所述含纳米硒的生物制剂与含亚硒酸钠的生物制剂的添加对镉胁迫下油菜生长的影响。
[0038] 其中，A为不同浓度生物制剂添加对50μM镉浓度下叶片中镉含量的影响；B为不同浓度生物制剂添加对50μM镉浓度下根中镉含量的影响。Control为空白对照，Cd组为营养液中镉浓度50μmol L-1，Se1、Se2和Se3组分别为在Cd组基础上(即营养液中镉浓度为50μmol L-1)叶施生物制剂，三组施用的生物制剂组分量分别是稀释后含26.7mg/L枯草芽孢杆菌的5、10、20mg/L纳米硒。
[0039] 图7不同浓度含购买纳米硒的生物制剂的添加对镉胁迫下油菜生长的影响。
[0040] 其中：Control为空白对照，Cd组为营养液中镉浓度50μmol L-1，Se-NPs1、Se-NPs2、Se-NPs3和Se-NPs4组分别为在Cd组基础上(即营养液中镉浓度为50μmol L-1)叶施生物制剂，四组施用的生物制剂组分量分别是稀释后含26.7mg/L枯草芽孢杆菌的5、10、15、25mg/L纳米硒。
具体实施方式
[0041] 下面结合具体
实施例对本发明内容进行详细说明。如下所述例子仅是本发明的较佳实施方式而已，并非对本发明作任何形式上的限制，凡是依据本发明的技术实质对实施方式所做的任何简单
修改，等同变化与修饰，均属于本发明技术方案的范围内。
[0042] 本发明以下实施例中所用的枯草芽孢杆菌168或枯草芽孢杆菌均购自广东省微生物研究所或河南省龙灯生物科技有限公司，所用化学
试剂均为常规市售试剂。
[0043] 实施例1
[0044] 一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂及其应用，具体步骤如下：
[0045] (1)在灭菌后的添加了400mmol L-1亚硒酸钠的LB培养基中，按体积比的量接种10％的枯草芽孢杆菌168活菌体，然后将培养瓶置30℃的摇瓶培养箱中在150转/分钟的条件下进行好氧培养24h，之后以4000g离心10分钟，收集沉淀即获得枯草芽孢杆菌与其代谢产物纳米硒的混合物；
[0046] 其中，所述LB(Luria-Bertani)的配方是：10g/L胰蛋白胨，5g/L
酵母提取物和10g/L
氯化钠，调节pH值为7.0-7.5，灭菌。
[0047] (2)用0.9％NaCl溶液洗涤所得的沉淀，然后加入液氮并杵打使沉淀破碎；再以200W条件超声处理5分钟使沉淀混合物粒径达到200nm以下，用含1％十二烷基
硫酸钠的
1.5molL-1、pH 8.3的Tris-HCl缓冲液以10000g，5min条件连续离心洗涤破碎产物3次；将离心洗涤收集到的产物悬浮于去离子水中，即得到含有纳米硒和菌细胞碎片的悬浮液。
[0048] (3)将步骤(2)制得的悬浮液转移到试管中，按体积比2:1加入正辛醇混合；在4℃静置沉淀24h；液体出现分层：上层是正辛醇，两相界面是菌细胞碎片，下层是纳米硒颗粒悬浊液；分离出下层的纳米硒颗粒悬浊液，3500g离心10min，沉淀物用氯仿、乙醇和蒸馏水分别洗涤至完全去除菌细胞碎片后得到纳米硒；制得的纳米硒扫描电子显微镜成像与X射线衍射图谱见图1和图2。
[0049] 将清洁后的纳米硒粒子在去离子水中定量为300mg/L的浓度制得纳米硒水溶液，按每15L水中混有500mL的浓度为300mg L-1纳米硒水溶液和枯草芽孢杆活菌数量≥1×109/g的4kg枯草芽孢杆菌均匀混合制成一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂。
[0050] (4)生物制剂在缓解小白菜种植土壤镉胁迫中的应用：选择一块种植小白菜或油菜的菜地，分为3片区域先预处理土壤，使土壤中重金属镉浓度分别为0、10mg/kg、20mg/kg，放置两周，期间保持土壤湿度恒定；然后将土壤分别装盆，以每个花盆种植16棵菜的比例种植小白菜，一周后间苗至每盆12棵；期间准备生物制剂①1.25mg/kg纳米硒+26.7mg/kg枯草芽孢杆菌②12.5mg/kg纳米硒+26.7mg/kg枯草芽孢杆菌，对比实验制剂③1.25mg/kg亚硒酸钠+26.7mg/kg枯草芽孢杆菌④12.5mg/kg亚硒酸钠+26.7mg/kg枯草芽孢杆菌；在出苗后10天进行第一次叶面喷施，在生长期第20天进行第二次叶面喷施，在收获前5天第三次叶面喷施；每次施入的硒的量相同，在整个小白菜生长期保持室内湿度恒定；将收获的小白菜用蒸馏水清洗干净根部及叶片，检测根部及叶片的镉含量以评价所述生物制剂缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的状况。
[0051] 以预处理土壤中重金属镉浓度为20mg/kg的实验组为例，结果表明：
[0052] 从农艺性状来看，本发明所述含纳米硒的生物制剂缓解小白菜种植土壤镉胁迫的作用表现突出，见图3。与单独镉处理的对照相比，在20mg/kg镉污染土壤中生长的①和②组小白菜生物量比对照分别提高40.21％、37.54％。而在20mg/kg镉污染土壤中生长的③和④组小白菜生物量比对照提高10.34％、27.59％。见图5。
[0053] 实施例2
[0054] 一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂及其应用，具体步骤如下：
[0055] (1)在灭菌后的添加了500mmol L-1亚硒酸钠的LB培养基中，按体积比的量接种6％的枯草芽孢杆菌168活菌体，然后将培养瓶置32℃的摇瓶培养箱中在200转/分钟的条件下进行好氧培养14h，之后以4500g离心15分钟，收集沉淀即获得枯草芽孢杆菌与其代谢产物纳米硒的混合物；
[0056] (2)用0.9％NaCl溶液洗涤所得的沉淀，然后加入液氮并杵打使沉淀破碎；再以100W条件超声处理10分钟使沉淀混合物粒径达到200nm以下，用1.5mol L-1、pH 8.3的Tris-HCl缓冲液以10000g，5min条件连续离心洗涤破碎产物3次；将离心洗涤收集到的产物悬浮于去离子水中，即得到含有纳米硒和菌细胞碎片的悬浮液；
[0057] (3)将(2)制得的悬浮液转移到试管中，按体积比1:1加入正辛醇混合；在4℃静置沉淀20h；液体出现分层：上层是正辛醇，两相界面是菌细胞碎片，下层是纳米硒颗粒悬浊液；分离出下层的纳米硒颗粒悬浊液，3500g离心10min，沉淀物用氯仿、乙醇和蒸馏水分别洗涤至完全去除菌细胞碎片后得到纳米硒；将清洁后的纳米硒粒子在去离子水中定量为250mg/L的浓度制得纯净纳米硒水溶液，储存在4℃备用。
[0058] 按每15L水中混有700mL的浓度为250mg L-1纳米硒水溶液和枯草芽孢杆活菌数量≥1×109/g的3kg枯草芽孢杆菌均匀混合制成一种缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的生物制剂。
[0059] (4)生物制剂在缓解油菜种植土壤镉胁迫中的应用：油菜前期育苗两周，转
水培装置。用1/2Hoagland营养液缓苗三天，转Hoagland营养液培养一周后开始添加含镉溶液(50μmolL-1)。期间准备生物制剂分别是稀释后含26.7mg/L枯草芽孢杆菌的5、10mg/L、20mg/L纳米硒，对比实验制剂分别是稀释后含26.7mg/L枯草芽孢杆菌的5、10mg/L、20mg/L亚硒酸钠，添加含镉溶液之后在油菜苗生长后8天在油菜叶片进行第一次叶面均匀喷施，在生长期第17天进行第二次叶面喷施，在收获前5天第三次叶面喷施；每次施入的硒的量相同，在整个油菜生长期保持室内湿度恒定；将收获的油菜用蒸馏水清洗干净根部及叶片，检测根部及叶片的镉含量以评价所述生物制剂缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的状况。
[0060] 结果表明：从农艺性状来看，本发明所述含纳米硒的生物制剂缓解油菜种植土壤镉胁迫的作用表现突出，见图4。与单独镉处理的对照相比，三种纳米硒浓度分别处理的油菜植株干重分别提高了63.6％、65.9％和105.2％。从油菜叶片与根部的镉含量来看，纳米硒的添加显著降低了油菜从地下部分到地上部分的迁移率。见图6。
[0061] 实施例3
[0062] 本发明所述采用枯草芽孢杆菌168生物法制得的纳米硒制备的生物制剂与利用市售纳米硒制备的生物制剂缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的效果比较
[0063] (1)从东明小麦合作社购入500mL规格
发酵纳米硒营养液(硒含量250mg/L)，加入133.3g枯草芽孢杆菌制备生物制剂。
[0064] (2)油菜前期育苗两周，转水培装置。用1/2Hoagland营养液缓苗三天，转Hoagland营养液培养一周后开始添加含镉溶液(50μmol L-1)。之后在油菜苗生长后8天在油菜叶片进行第一次叶面均匀喷施，具体是分别将稀释后含26.7mg/L枯草芽孢杆菌的5、10、15、25mg/L纳米硒均匀喷洒于油菜叶片，在生长期第17天进行第二次叶面喷施，在收获前5天第三次叶面喷施；每次施入的硒的量相同，在整个油菜生长期保持室内湿度恒定；将收获的油菜用蒸馏水清洗干净根部及叶片，检测根部及叶片的镉含量以评价所述生物制剂缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的状况。
[0065] 结果表明：与单独镉处理的对照相比，利用四种纳米硒浓度制得的生物制剂分别处理的油菜植株干重显著提高了23.5-61.9％。见图7。本发明所述采用枯草芽孢杆菌168生物法制得的纳米硒制备的生物制剂应用效果见实施例2。
[0066] 结果显示使用直接购买的纳米硒也可制备本发明生物制剂缓解油菜镉胁迫，但不及本发明所述采用枯草芽孢杆菌168生物法制得的纳米硒制备的生物制剂缓解叶菜类蔬菜种植土壤镉胁迫的效果好。
