VASA 항체를 유효성분으로 포함하는 포유동물의 정소세포 동정용 조성물{Composition for identification of mammal testicular cell comprising VASA antibody}

본 발명은 VASA 항체를 유효성분으로 포함하는 포유동물의 정소세포 동정용 조성물에 관한 것이다.

인간을 포함한 포유동물에 있어서 생식세포인 정자는 남성측 유전정보를 다음세대에 전달하는 매개체이다. 따라서 정자를 생산하는 일련의 복합적인 과정을 포함하는 정자형성과정 (spermatogenesis)은 종의 보존과 유전적 다양성에 있어서 필수적인 과정이다. 이러한 정자형성과정은 성체의 세포생산 시스템 중 가장 생산적인 과정으로서, 인간의 경우 정상 성인 남성이 매일 100 x 10 ⁶ 개의 정자를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 복합적이고 생산적인 정자형성과정에 있어서 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells)는 남성의 생애 전반에 걸쳐 정자형성과정을 유지시키는 기본이자 토대를 제공하는 중요한 세포이다. 정원줄기세포는 여러 성체 줄기세포들이 지닌 특성과 같이 자가-증식 (self-renewal) 능력과 분화 (differentiation) 능력을 지니고 있다. 정자형성과정의 첫 단계는 최종적으로 정자로 분화되는 다양한 단계의 분화된 딸세포 (daughter progeny)를 생산할 수 있는 정원줄기세포의 분화기작 결정 (fate decision)으로부터 시작된다. 비록 현재까지 단일 정원세포(single spermatogonia; As spermatogonia)군 중 정원줄기세포가 존재한다고 알려져 있지만, 아직까지 정확히 정원줄기세포를 구분할 수 있는 형태학적인 기준이나 마커로 활용될 수 있는 생화학적 혹은 분자생물학적 특성이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다.

따라서 과거 여러 해 동안 정원줄기세포의 생물학적인 특성에 관한 연구들은 정원줄기세포를 구분하고 연구할 수 있는 분석기법이 개발되지 못한 관계로 형태학적인 관찰에 의지한 이론적인 지식에 의존되고 있었다.

1994년 브린스터 (Brinster; Proc Natl Acad Sci USA 1994, 22;91(24): 11303-7) 연구팀은 생쥐 정소세포의 이식기법을 개발하여 생쥐의 정소에 정원줄기세포가 존재하는 것을 실제로 입증하고, 동시에 정원줄기세포의 기능적 특성을 직접적으로 연구할 수 있는 전기를 마련하였다. 이후 정소세포 및 정원줄기세포 이식기법은 정원줄기세포의 생물학적인 특성과 활용법 개발에 있어서 필수적이고 가장 핵심적인 기술로 사용되고 있다.

그러나 동물 종에 따라 다소 차이는 있지만, 성체의 경우 정소 내에 극히 적은 수의 정원줄기세포가 존재하기 때문에 정원줄기세포의 특성 연구 및 활용법 개발에 많은 어려움이 있는 실정이다. 실제로 성체 생쥐의 경우 정소세포 3,333개당 1개, 성체 랫트의 경우 정소세포 500개당 1개의 정원줄기세포가 존재하고, 다른 포유류의 경우에는 현재까지 정확한 보고가 없다.

포유동물의 발생에 있어서 생식선줄기세포 (germ-line stem cells)는 배아의 외배엽 (embryonic ectoderm)으로부터 생성되는 원시생식세포 (primodial germ cells; PGCs)로 구별될 수 있다. 태아 (fetus) 발생과정 중 PGCs는 세포분열 과정을 통하여 증식되면서 생식선융기부(genital ridge)로 이동한다. 여성에 있어서는 PGCs가 여성 생식세포인 난자 (oocytes)를 형성하고 이후 분열은 중지되며 성숙된 난자를 생성하기 위한 감수분열에 돌입된다.

반면, 남성에 있어서는 PGCs가 성삭 (sex cord)으로 둘러싸이게 되면서 gonocyte로 분화되고 출생 시까지 세포분열이 중지된 상태로 유지된다. 따라서 gonocyte는 남성생식선발생 (male germ-line development)에 있어서 최초로 남성 생식선줄기세포 (germ-line stem cells)로 분화된 세포로 이해되고 있다. 신생자 (neonate)의 정소 내에서 gonocyte는 유일한 남성생식선줄기세포로서 출생 후 세포분열을 다시 시작하면서 세포수가 증가되고 일부는 정소내 세정관 (seminiferous tubule)의 기저부로 이동하여 정원줄기세포로 분화되면서 정자형성과정을 시작하게 된다. 남성측에 있어서 최초의 생식선줄기세포인 gonocyte는 정원줄기세포로 분화되기 전까지 세정관의 중앙부위에 위치하게 되며 형태학적으로 독특한 특이성을 지니고 있다. 이러한 특이성은 신생자 정소에 존재하는 여러 다른 종류의 세포들과 비교하여 gonocyte는 크기가 다소 크며 (직경 12~15 um), 세포질의 복잡성(complexity) 정도가 낮고 구형의 핵이 두드러지게 구분되며, 경우에 따라 세포막이 위족형태 (pseudopod)를 이루는 형태학적인 독특한 특징으로 대별된다. 반면 gonocyte로부터 분화된 정원줄기세포는 상기의 gonocyte와 같은 형태학적으로 두드러진 특징을 상실하게 되기 때문에 형태학적으로 정원줄기세포를 다양한 종류의 정소세포들과 구분하는 것은 불가능하게 된다.

이에 본 발명자들은 포유동물의 정소세포 발달 과정 중 특이적으로 post-meiotic 단계를 식별할 수 있는 방법을 연구하던 중 VASA 항체를 사용 시 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid)를 특이적으로 동정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서 본 발명의 목적은 VASA 항체를 유효성분으로 포함하는, 포유동물의 정소세포 동정용 조성물을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명은 (a) 동정하고자 하는 세포를 VASA 항체의 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 상기 프로브가 상기 세포에 결합하였는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 포유동물의 정소세포 동정 방법을 제공하는 것이다.

나아가, 본 발명은 (a) 분리된 정소를 세절한 다음, 콜라게나제로 처리하는 단계;(b) 상기 콜라게나제로 처리된 정소조직을 트립신으로 처리한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; ⒞ 상기 수득된 세포를 퍼콜(Percoll) 침전법으로 침전시켜 퍼콜 40% 내지 50% 층의 세포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 세포를 형광물질이 결합된 VASA 항체와 접촉시켜 VASA를 발현하는 세포를 형광분석장치를 사용하여 분리하는 단계를 포함하는, 말의 미분화 정원줄기세포 분리방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 VASA항체를 유효성분으로 포함하는, 포유동물의 정소세포 동정용 조성물을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포유동물은 소, 돼지, 말, 개, 양, 염소, 고양이, 토끼에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 조성물은 포유동물 정소세포의 발달단계 중 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid)를 식별할 수 있다.

또한, 본 발명은 (a) 동정하고자 하는 세포를 VASA 항체의 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 상기 프로브가 상기 세포에 결합하였는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 포유동물의 정소세포 동정 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 프로브가 동정하고자하는 세포에 결합하면 정소세포의 발달 단계 중 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid) 단계인 것으로 판단할 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 포유동물은 소, 돼지, 말, 개, 양, 염소, 고양이, 토끼에서 선택되는 1종 이상일 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) 분리된 정소를 세절한 다음, 콜라게나제로 처리하는 단계;(b) 상기 콜라게나제로 처리된 정소조직을 트립신으로 처리한 다음, 원심분리하여 세포를 수득하는 단계; ⒞ 상기 수득된 세포를 퍼콜(Percoll) 침전법으로 침전시켜 퍼콜 40% 내지 50% 층의 세포를 분리하는 단계; 및 (d) 상기 분리된 세포를 형광물질이 결합된 VASA 항체와 접촉시켜 VASA를 발현하는 세포를 형광분석장치를 사용하여 분리하는 단계를 포함하는, 말의 미분화 정원줄기세포 분리방법을 제공한다.

본 발명의 포유동물 정소세포 동정용 조성물은 정소세포 발달과정 중 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid)를 특이적으로 식별할 수 있어 기존 형태학적으로 확인할 수 있었던 정소세포의 발달 과정을 간단하고 정확하게 동정할 수 있다.

따라서, 본 발명의 조성물을 사용 시 포유동물의 번식에 유용하게 사용될 수 있는 효과가 있다.

도 1은 웨스턴 블롯팅 실험을 통해 말 정소 단백질에 VASA 항체와 특이적으로 반응하는 단백질의 발현을 확인한 결과이다.
도 2는 정소조직 및 세포의 성숙단계별 VASA 항체(1:500 희석) 발현양상을 조사하기 위해 면역조직 화학법, 면역세포화학법을 수행한 결과로써, VASA 항체 발현은 녹색으로, GATA4 항체 발현은 보라색으로 표시하였다.
도 3은 정소세포를 정소조직에서 분리한 후 슬라이드에 고정시키고 VASA 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 실시한 후 형광현미경으로 확인한 결과이다.
도 4는 VASA 항체가 말 정소 세포 발달 단계 중 어느 단계를 식별할 수 있는지를 표기한 결과이다.

상기에서도 설명하였듯이, 인간을 포함한 포유동물에 있어서 생식세포인 정자는 남성측 유전정보를 다음세대에 전달하는 매개체이다. 따라서 정자를 생산하는 일련의 복합적인 과정을 포함하는 정자형성과정 (spermatogenesis)은 종의 보존과 유전적 다양성에 있어서 필수적인 과정이다. 이러한 정자형성과정은 성체의 세포생산 시스템 중 가장 생산적인 과정으로서, 인간의 경우 정상 성인 남성이 매일 100 x 10 ⁶ 개의 정자를 생산하는 것으로 알려져 있다. 이와 같은 복합적이고 생산적인 정자형성과정에 있어서 정원줄기세포 (spermatogonial stem cells)는 남성의 생애 전반에 걸쳐 정자형성과정을 유지시키는 기본이자 토대를 제공하는 중요한 세포이다. 정원줄기세포는 여러 성체 줄기세포들이 지닌 특성과 같이 자가-증식 (self-renewal) 능력과 분화 (differentiation) 능력을 지니고 있다. 정자형성과정의 첫 단계는 최종적으로 정자로 분화되는 다양한 단계의 분화된 딸세포 (daughter progeny)를 생산할 수 있는 정원줄기세포의 분화기작 결정 (fate decision)으로부터 시작된다. 비록 현재까지 단일 정원세포(single spermatogonia; As spermatogonia)군 중 정원줄기세포가 존재한다고 알려져 있지만, 아직까지 정확히 정원줄기세포를 구분할 수 있는 형태학적인 기준이나 마커로 활용될 수 있는 생화학적 혹은 분자생물학적 특성이 명확히 밝혀져 있지 않은 실정이다.

따라서 과거에는 정원줄기세포의 생물학적인 특성에 관한 연구들은 정원줄기세포를 구분하고 연구할 수 있는 분석기법이 개발되지 못한 관계로 형태학적인 관찰에 의지한 이론적인 지식에 의존되고 있었다.

이에 본 발명자들은 포유동물의 정소세포 발달 과정 중 특이적으로 post-meiotic 단계를 식별할 수 있는 방법을 연구하던 중 VASA 항체를 사용 시 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid)를 특이적으로 동정할 수 있음을 확인하고 본 발명을 완성하였다.

따라서, 본 발명은 VASA 항체를 유효성분으로 포함하는, 포유동물의 정소세포 동정용 조성물을 제공함에 그 특징이 있다.

본 발명에서 용어“항체”란 항원성 부위에 대해서 지시되어 특이적으로 결합하는 단백질 분자를 의미한다. 항체는 당업계에서 통상적으로 실시되는 방법들, 예를 들어, 융합 방법(Kohler and Milstein, European Journal of Immunology, 6:511-519(1976)), 재조합 DNA 방법(미국 특허 제4,816,56호) 또는 파아지 항체 라이브러리 방법(Clackson et al, Nature, 352:624-628(1991) 및 Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597(1991))에 의해 제조될 수 있다. 항체 제조에 대한 일반적인 과정은 Harlow, E. and Lane, D., Using Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, New York, 1999; Zola, H., Monoclonal Antibodies: A Manual of Techniques, CRC Press, Inc., Boca Raton, Florida, 1984; 및 Coligan, CURRENT PROTOCOLS IN IMMUNOLOGY, Wiley/Greene, NY, 1991에 상세하게 기재되어 있다. 예를 들어, 단일클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포의 제조는 불사멸화 세포주를 항체-생산 림프구와 융합시켜 이루어지며, 이 과정에 필요한 기술은 당업자에게 잘 알려져 있으며 용이하게 실시할 수 있다. 폴리클로날 항체는 단백질 항원을 적합한 동물에게 주사하고, 이 동물로부터 항혈청을 수집한 다음, 공지의 친화성(affinity) 기술을 이용하여 항혈청으로부터 항체를 분리하여 얻을 수 있다. 본 발명의 "항체"는 통상적으로 생체 내에 존재하는 형태의 항체 이외에, 항체의 H쇄 또는 L쇄의 가변영역 또는 그의 조합으로 형성되는 항원 결합 부위를 적어도 1개 갖는 분자를 포함한다. 예를 들면, H쇄의 가변영역만 포함하는 펩티드, 1조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 Fab, 2조의 H쇄 단편과 L쇄 단편으로 이루어진 (Fab')2, H쇄 단편과 L쇄 단편이 동일 펩티드 상에 직렬로 결합된 단쇄 항체 "ScFv" 등도 포함된다. 상기 항체는 모노클론 항체이거나, 폴리 클론 항체 또는 단쇄 항체 또는 재조합 항체 일 수 있다. 상기 항체와의 결합의 확인을 용이하게 하기 위하여 상기 항체에 리간드, 자기 비드, 효소 등을 결합시킬 수 있다. 상기 리간드는 이에 한정되는 것은 아니나, 바이오틴, 아비딘 또는 스트렙토아비딘 일 수 있고, 상기 효소는 이에 한정되는 것은 아니나, 루시퍼라아제, 퍼옥시다아제 또는 베타 갈락토시다아제 일 수 있다. 당업자는 항체의 확인을 위하여 적절한 리간드, 비드 및 효소를 선정하여 사용할 수 있다.

본 발명에서 상기 포유동물은 소, 돼지, 말, 개, 양, 염소, 고양이, 토끼에서 선택되는 1종 이상일 수 있으며, 이에 제한되지는 않지만 가장 바람직하게는 말일 수 있다.

말 세정관(seminiferous tubule) 내 8단계의 분화과정을 나타낸 것은 표 1과 같다.

본 발명의 포유동물의 정소세포 동정용 조성물은 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid)의 생식세포 발달과정을 특이적으로 인식할 수 있다.

나아가 본 발명은 (a) 동정하고자 하는 세포를 VASA 항체의 프로브와 접촉시키는 단계; 및 (b) 상기 (a)에서 상기 프로브가 상기 세포에 결합하였는지 여부를 확인하는 단계를 포함하는, 포유동물의 정소세포 동정 방법을 제공한다.

본 발명에서 상기 프로브가 동정하고자하는 세포에 결합하면 정소세포의 발달 단계 중 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte) 또는 둥근 정세포(round spermatid)로 판단할 수 있다.

본 발명의 포유동물의 정소세포 동정 방법에 있어서, 상기 (a)단계는 동정하고자 하는 세포에 있는 항원이나 당류 등이 본 발명의 프로브와 결합하도록 유도하는 단계이다. 동정하고자 하는 세포에 있는 항원과 본 발명의 조성물이 결합하도록 유도하기 위해서는 당업계에 공지되어 있는 일반적인 면역학적 분석 방법이 사용된다.

면역학적 분석 방법은 예를 들어, 면역세포화학 (immunocytochemistry) 및 면역조직화학 (immunohistochemistry), 방사선 면역 분석법 (radioimmunoassays), 효소결합면역흡착법 (ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 면역 블롯 (immunoblotting), 파아르 분석법 (Farr assay), 침강소 반응법, 비탁계법, 면역확산법, 카운터-전류 전기영동법, 단일 라디칼 면역확산법 및 면역형광법 등이 있다.

상기 (b)단계는 본 발명의 조성물과 세포의 결합 여부를 결정짓는 단계로서, 상기 (a)단계가 면역학적 분석방법일 경우, 적합한 담체, 검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질, 용해제, 세정제 등과 같은 시약을 사용하여 반응을 수행하고, 정량적 및/또는 정성적으로 신호를 측정함으로써, 항원-항체 결합 여부를 간접적으로 확인할 수 있다.

검출 가능한 신호를 생성할 수 있는 표지 물질로는 효소, 형광물질, 발광물질 및 방사성 물질 등을 사용할 수 있다. 효소로는 퍼옥시다아제, 알칼린 포스파타아제, β-D-갈락토시다아제, 글리코스 옥시다아제, 말레이트 디하이드로게나아제, 글루코 스-6-인산디하이드로게나아제, 인버타아제 등을 사용할 수 있으며, 형광물질로는 플루오르신이소티옥시아네이트 (FITC), 로다민 (rhodamine), 피코빌리프로테인 등을 사용할 수 있고, 발광물질로는 이소루시놀, 루시제닌 등을, 방사성 물질로는 131I, 14C, 3H 등을 사용할 수 있다. 또한, 상기 예시된 것들 외에 면역학적 분석법에 사용할 수 있은 것이라면 어느 것이라도 사용할 수 있다.

이하 본 발명을 실시예에 의하여 더욱 상세하게 설명한다. 이들 실시예는 단지 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 국한되지 않는다는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.

< 실시예 1>

정소세포의 분리 및 준비

본 발명의 실험을 위하여 서러브레드(thoroughbred)와 제주말을 섞은 숫말을 사용하였으며, 상기 말을 거세하고 수득된 정소는 DPBS에 담아 4℃에서 보관하였다. 또한, 정소를 성숙 단계별 pre-pubertal(<1yr), pubertal (1-1.5yr), post-pubertal(2-3yr), adult(4-8yr) 로 분류한 뒤 상기 정소들을 4%의 파라포름알데하이드(paraformaldehyde)에 약 24시간 침전시키고, 다양한 농도의 에탄올로 탈수시킨(dehydrated) 다음 파라핀에 고정시켰다. 0.5cm ³ 의 정소세포 조직을 액체질소에서 급속 냉각시킨 다음 웨스턴블롯팅 분석을 하기 전까지 80℃에서 보관하였다.

< 실시예 2>

웨스턴블롯팅 분석

냉각된 정소세포 pre-pubertal, post-pubertal 종마의 샘플을 38℃의 온도에서 해동하고 Polytron PT 1200 CL 균질기(Kinematica AG, Littau-Lucerne, Switzerland)를 사용해 조직을 분쇄하였다.

균질화 된 조직을 1 ㎎ / ㎖의 농도로 시료 준비 완충 버퍼[0.5 M Tris.HCl (pH 6.8), 0.1% glycerol (w/v), 10% sodium dodecyl sulfate (SDS; w/v), 0.05% 2-β-mercaptoethanol (w/v), and bromophenol blue in distilled water]로 희석 하였다. 15 분간 끓는 물(95~100℃)에서 시료를 가열한 후, 샘플(15μL)을 10 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩 한 후 30분간 방치한 다음 4℃에서 15,000rpm로 30분 동안 원심분리하여 상층액만을 취한 후 다시 4℃에서 15,000rpm로 30분 동안 원심분리하여 상층액을 취하여 단백질을 추출한 후 1N NaOH를 이용하여 pH7로 적정하였다. 추출된 단백질은 브래드포드 방법으로 정량한 다음 SDS가 포함된 10% 폴리아크리아마이드(PAGE)를 만들고, 준비된 단백질 샘플을 전기영동 후 transfer buffer(0.25 M Tris, 1.92M Glycin, pH8.3~8.4)를 사용해서 PVDF(Polyvinylidene fluoride) 멤브레인으로 트렌스퍼(transfer)하였다. 15 분간 끓는 수욕에서 시료를 가열 한 후, 샘플을 10 % SDS 폴리 아크릴 아미드 겔 상에 로딩 하였다.

단백질은 Mini-Protean II system (Bio-Rad)을 이용하여 분리하였으며, 4℃ 냉장고에서 2시간동안 100V의 전압으로 젖은 니트로셀룰로오스 막(Hybond ECL, GE Health-care, Pittsburgh, PA, USA)을 이용하여 트랜스퍼(transfer)하였다.

멤브레인을 Blotto 시약 (Santa Cruz Biotechnology)으로 차단하였으며, Blotto 시약으로 희석된 anti-VASA 항체(Abcam, ab64809, 1:500)를 4℃에서 밤새 배양하였다.

음성 대조군의 경우, 멤브레인은 일차 항체와 동일한 면역 글로불린 (IgG의) 농도를 사용하여 정상 토끼 혈청(Sigma)으로 처리 하였고, 1:10,000으로 희석된 HRP-conjugate anti-rabbit IgG 이차항체를 1시간 동안 반응시켰으며, X-ray 필름으로 감광하여 밴드의 유무를 관찰하였다.

말 고환과 토끼 VASA 항체의 교차 반응을 확인하기 위해, 웨스턴 블롯은 post-pubertal 고환에서 추출된 고환 조직을 사용하여 수행 하였다 (N = 3). pre-pubertal 정소로부터 추출 고환 조직은 음성 대조군으로 사용하였다.

상기 두 가지 단계에서 여러 밴드가 있었지만 post-pubertal에서의 막에서 대략 76kDa의 고유한 밴드를 확인할 수 있었다(도 1 참조).

< 실시예 3>

면역조직 분석

본 발명자들은 정소조직 및 세포의 성숙단계별 VASA 항체(1:500희석)의 발현양상을 조사하기 위해 면역조직화학법(immunohistochemistry), 면역세포화학법(immunocytochemistry)을 수행하였다.

그 결과, 본 발명의 VASA 항체는 정원세포의 세포질에서 발현하였으며, post-pubertal 단계에서는 정원세포(spermatogonia)와 정모세포(spermacyte), 둥근 정세포(round spermatid)에서 발현되었으나, 긴 정세포(elongated spermatid), 정자(spermatozoa)에서는 발현하지 않았음을 알 수 있었다(도 2c, d, k, j 참조).

또한, 정소세포를 정소조직에서 분리한 후 슬라이드에 고정시키고 VASA 항체를 이용하여 면역조직화학염색을 실시한 결과, 형광현미경으로 특정정소세포(정원세포, 정모세포 또는 둥근 정세포)만을 특이적으로 식별할 수 있음을 확인하였다(도 3 참조).

따라서, 본 발명자들은 VASA 항체는 말 정소세포의 단계 전 단계를 식별할 수 있는 분자표식인자가 아니라 그 중 A _s 정원세포(spermatogonia), A _pr 정원세포(spermatogonia), A _al 정원세포(spermatogonia), A ₁ 정원세포(spermatogonia), A ₂ 정원세포(spermatogonia), A ₃ 정원세포(spermatogonia), B ₁ 정원세포(spermatogonia), B ₂ 정원세포(spermatogonia), 제일 정모 세포(Primary spermatocyte), 이차 정자 세포(Secondary spermatocyte), 둥근 정세포(round spermatid)의 생식세포 발달과정을 특이적으로 인식할 수 있으며, 긴 정세포(elongated spermatid), 정자(spermatozoa)는 인식할 수 없음을 확인하였다는 점에 기술적 특징이 있다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.