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表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用

阅读：216发布：2020-05-11

专利汇可以提供表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用，所述重组菌是以干酪乳杆菌为表达载体，通过基因改造技术将编码鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的基因转入所述干酪乳杆菌中而获得。该重组菌添加到饲喂鱼类的饲料中制备成口服疫苗，该疫苗通过口服方式使目标抗原进入机体，进而表达释放抗原，刺激机体产生细胞免疫反应，使其达到注射免疫的效果，为预防和控制鲇鱼爱德华氏菌病提供一种实际可行的技术手段和理论支撑，可为解决大范围水域养殖动物的群体免疫防治难题、避免抗生素残留以及促进水产养殖业可持续发展提供技术支持，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。，下面是表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌，其特征在于，所述重组菌是以干酪乳杆菌为表达载体，通过基因改造技术将编码鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的基因转入所述干酪乳杆菌中而获得。
2.如权利要求1所述的一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌，其特征在于，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌GCGR-16,保藏号为CCTCC NO:M 2019755。
3.一种如权利要求1-2任一项所述的表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌的构建方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤1：优化表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列；
步骤2：按步骤1优化表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列后，经扩增与载体pSIP409连接，构建重组质粒pSIP409-ompN2；
步骤3：将所构建的pSIP409-ompN2电转法导入干酪乳杆菌中，获取重组菌。
4.如权利要求3所述的一种所述的表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤1中通过去除稀有密码子对表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列进行优化。
5.如权利要求3所述的一种所述的表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌的构建方法，其特征在于，步骤2中扩增所用的引物包含：
SompN2 R：5'-GGCACGATTGCGGCGGTCGACCCACTTCACATGATTCCGCAAG-3'；
SompN2 F：5'-CGTGCTGTAATTTGAAGCTTTTATTATCTAAAGTTTGC-3'。
6.如权利要求1-2任一项所述的一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌在制备防治鲇鱼爱德华氏菌的疫苗中的应用，其特征在于，所述鲇鱼爱德华氏菌的宿主为鱼类。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述重组菌添加到饲喂鱼类的饲料中现配现用制成免疫鱼粮。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述重组菌以口服方式饲喂鱼类，饲喂剂量按每克饲料含1.0×109CFU重组菌，连续饲喂3天。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于，所述鱼类为黄颡鱼。

说明书全文

表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，特别是涉及一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用。

背景技术

[0002] 鲇鱼爱德华氏菌(Edwardsiella ictaluri)是一种胞内寄生的重要鱼类病原菌，主要感染鲇形目的一些种类，该病发病率在50％以上，发病后死亡率为70％-100％，给重要的养殖品种如黄颡鱼等养殖业造成巨大经济损失。该病目前主要以抗生素和化学药物控制为主，因为鲇鱼爱德华氏菌为胞内菌，一般抗生素很难将其杀死，同时长期使用药物易带来环境污染、耐药性、药物残留、水产品质量安全等问题。而疫苗是预防和控制传染性疫病的重要武器，是现代养殖业抵御风险的关键；但其免疫途径一直以来是限制其规模化使用的瓶颈之一。口服免疫作为鱼类最理想的免疫接种方式，不仅对鱼类应激小，免疫成本低，而且可以方便地实现对各生长阶段鱼类的免疫，然而胃肠道的降解以及肠上皮细胞和抗原呈递细胞的吸收较差等制约着口服疫苗的发展。因此，探寻新的能有效模拟抗原入侵途径且安全、廉价、效力稳定、操作简单的免疫途径，是目前预防水产动物病害的主要任务，同时对科学防治具有重要理论意义和实践价值。

[0003] 乳酸菌是人与动物胃肠道的常见菌和共生菌，很久以来，乳酸菌作为重要的益生菌己广泛地用于食品、饮料和微生态制剂等行业中，被公认为是安全级微生物。利用乳酸菌作为表达系统具有以下优点：安全、没有内毒素；可直接口服，不需注射、免疫方便、操作简单；能够调控、保护并修复肠道功能；具有定植能力，能在肠道黏膜定居，可以顺利呈递抗原；能够容纳大量外源基因，并且对外源基因的表达具有高效的调控系统，且可以源源不断在肠道中产生并起到相应的作用。近年来，随着对乳酸菌分子生物学的深入了解，乳酸菌基因工程技术及载体系统得到了较快发展。以乳酸菌表达功能性蛋白或作为活载体进行疫苗、微生态制剂、药物等异源蛋白的传递和表达的研究受到了广泛关注。而目前还没有将乳酸菌直接用于水产养殖业病害防治的疫苗中的先例，如何将乳酸菌直接作为口服疫苗用于水产养殖业病害防治中，对于解决现有技术存在的问题具有重要意义。

发明内容

[0004] 本发明的目的是提供一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用，以解决上述现有技术存在的问题，该重组菌制备的疫苗可以通过口服方式饲喂水产动物，实现了疫苗注射的效果，减少了抗生素的应用，为有效的预防和控制鲇鱼爱德华氏菌病提供一种切实可行的技术手段和理论基础。

[0005] 为实现上述目的，本发明提供了如下方案：

[0006] 本发明提供一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌，所述重组菌是以干酪乳杆菌为表达载体，通过基因改造技术将编码鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的基因转入所述干酪乳杆菌中而获得。

[0007] 优选的是，所述干酪乳杆菌为干酪乳杆菌GCGR-16(Lactobacillus casei GCGR-16),保藏号为CCTCC NO:M 2019755，保藏日期为2019年9月26日，保藏于武汉大学，中国典型培养物保藏中心。

[0008] 本发明还提供一种所述的表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌的构建方法，包括以下步骤：

[0009] 步骤1：优化表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列；

[0010] 步骤2：按步骤1优化表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列后，经扩增与载体pSIP409连接，构建重组质粒pSIP409-ompN2；

[0011] 步骤3：将所构建的pSIP409-ompN2电转法导入干酪乳杆菌中，获取重组菌。

[0012] 优选的是，步骤1中通过去除稀有密码子对表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列进行优化。

[0013] 优选的是，步骤2中扩增所用的引物包含：SompN2 R：5'-GGCACGATTGCGGCGGTCGACCCACTTCACATGATTCCGCAAG-3'；SompN2 F：5'-CGTGCTGTAATTTGAAGCTTTTATTATCTAAAGTTTGC-3'。

[0014] 本发明还提供所述的一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌在制备防治鲇鱼爱德华氏菌的疫苗中的应用，所述鲇鱼爱德华氏菌的宿主为鱼类。

[0015] 优选的是，所述重组菌添加到饲喂鱼类的饲料中现配现用制成免疫鱼粮。

[0016] 优选的是，所述重组菌以口服方式饲喂鱼类，饲喂剂量按每克饲料含1.0×109CFU重组菌，连续饲喂3天。

[0017] 优选的是，所述鱼类为黄颡鱼。

[0018] 本发明公开了以下技术效果：

[0019] 本发明以鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2为研究对象，以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，GCGR-16)作为表达外源基因的载体，通过基因工程改造技术将鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2基因转化至干酪乳杆菌中，构建重组乳酸菌递呈表达系统，并利用该系统制备递呈ompN2的干酪乳杆菌口服疫苗；通过口服方式使目标抗原进入机体，进而表达释放抗原，刺激机体产生细胞免疫反应，使其通过口服方式达到注射免疫的效果，为预防和控制鲇鱼爱德华氏菌病提供一种实际可行的技术手段和理论支撑，可为解决大范围水域养殖动物的群体免疫防治难题、避免抗生素残留及促进水产养殖业的可持续发展提供技术支持，具有较好的经济效益、社会效益和生态效益。

[0020] 本发明公开的重组菌的制备方法，是利用基因工程技术进行的改造，可以使得所构建的重组菌具备表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的功能，直接用于饲喂水产动物，提高了水产动物的免疫力，实现了预防和控制鲇鱼爱德华氏菌病。该制备方法操作简单，易于实施，对于成功制备口服重组菌疫苗提供了重要基础。附图说明

[0021] 为了更清楚地说明本发明实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。

[0022] 图1为ompN2基因的PCR扩增结果；M：DL5000DNA Marker；1：PCR扩增产物；

[0023] 图2为重组质粒pSIP409-ompN2的PCR扩增结果；M：DL10000DNAMarker；1、2均为PCR产物；

[0024] 图3为pSIP409-ompN2重组质粒酶切鉴定结果；M：DL10000DNA Marker；1、2、3为扩增产物。

[0025] 图4为重组乳酸菌ompN2蛋白的Western Blot鉴定结果；M：Marker；1：pSIP409-ompN2在干酪乳杆菌中诱导后的表达产物；2：空载体诱导后的表达产物；

[0026] 图5为免疫黄颡鱼血清中IgM水平检测结果；

[0027] 图6为黄颡鱼肾脏中IL-1β基因相对表达量结果；

[0028] 图7为黄颡鱼肾脏中IFN I基因相对表达量结果；

[0029] 图8为黄颡鱼肾脏中MHC-IIB基因mRNA相对表达量结果；

[0030] 图9为口服重组菌对黄颡鱼血清中溶菌酶活性影响的结果；

[0031] 图10为口服重组菌对黄颡鱼肝脏中的POD活性影响的结果；

[0032] 图11为口服重组菌对黄颡鱼肝脏中SOD活性影响的结果。

具体实施方式

[0033] 现详细说明本发明的多种示例性实施方式，该详细说明不应认为是对本发明的限制，而应理解为是对本发明的某些方面、特性和实施方案的更详细的描述。

[0034] 应理解本发明中所述的术语仅仅是为描述特别的实施方式，并非用于限制本发明。另外，对于本发明中的数值范围，应理解为还具体公开了该范围的上限和下限之间的每个中间值。在任何陈述值或陈述范围内的中间值以及任何其他陈述值或在所述范围内的中间值之间的每个较小的范围也包括在本发明内。这些较小范围的上限和下限可独立地包括或排除在范围内。

[0035] 除非另有说明，否则本文使用的所有技术和科学术语具有本发明所述领域的常规技术人员通常理解的相同含义。虽然本发明仅描述了优选的方法和材料，但是在本发明的实施或测试中也可以使用与本文所述相似或等同的任何方法和材料。本说明书中提到的所有文献通过引用并入，用以公开和描述与所述文献相关的方法和/或材料。在与任何并入的文献冲突时，以本说明书的内容为准。

[0036] 在不背离本发明的范围或精神的情况下，可对本发明说明书的具体实施方式做多种改进和变化，这对本领域技术人员而言是显而易见的。由本发明的说明书得到的其他实施方式对技术人员而言是显而易见的。本申请说明书和实施例仅是示例性的。

[0037] 关于本文中所使用的“包含”、“包括”、“具有”、“含有”等等，均为开放性的用语，即意指包含但不限于。

[0038] 实施例1

[0039] 一种表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的重组菌的制备方法，具体如下。

[0040] 1、表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的基因优化

[0041] 根据干酪乳杆菌的密码子偏好性，对表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列进行优化，去除稀有密码子，进而使其在干酪乳杆菌细胞内顺利表达，其优化原则具体如下：

[0042] TTC→TTT；GTA→GTT；TCC→TCT；GAG→GAA；TGC→TGT；AGA→CGT；AGG→CGT；

[0043] 优化后表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，其编码的蛋白序列如SEQ ID NO：2所示。

[0044] 2、鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白ompN2的表达质粒的构建

[0045] 根据编码ompN2蛋白的基因序列，利用Primer 5.0 软件设计一对特异性引物SompN2R、SompN2F，克隆编码ompN2蛋白的基因片段，引物序列如下：

[0046] SOMPN2F：5'-GGCACGATTGCGGCGGTCGACCCACTTCACATGATTCCGCAAG-3'；

[0047] SOMPN2R：5'-CGTGCTGTAATTTGAAGCTTTTATTATCTAAAGTTTGC-3'；

[0048] 根据设计的特异性引物进行PCR扩增，获取编码ompN2蛋白的基因片段，并将该基因片段经电泳检测得到约为831bp大小的条带，与预期结果相符，如图1所示。

[0049] 将电泳检测正确的目的片段与pSIP409载体采用无缝克隆的连接方式进行连接，获取重组质粒pSIP409-ompN2。

[0050] 3、重组质粒pSIP409-ompN2的PCR扩增与酶切鉴定

[0051] 以重组质粒pSIP409-ompN2为模板，进行PCR验证和Sal I和Xho I双酶切验证。

[0052] 结果显示：PCR扩增片段大小和双酶切条带大小与预期结果一致，PCR扩增结果显示出约为831bp大小的目的条带；双酶切检测结果则显示出一条约为6000bp和一条约为831bp大小的条带。将PCR扩增产物送往测序公司测序，得到序列片段与目的片段序列完全一致。

[0053] 由上述结果可判断出：pSIP409质粒与目的基因条带连接成功，如图2和3所示。

[0054] 4、表达ompN2蛋白的重组菌的构建

[0055] 将上述经鉴定pSIP409质粒与目的基因条带连接成功的重组质粒pSIP409-ompN2，电转化至干酪乳杆菌GCGR-16，构建乳酸菌，在4℃条件下3500r/min离心10min收集菌体，用0.06％生理盐水反复清洗三次，用生理盐水将重组菌菌体的浓度调整至1.0×109CFU/g，并与满足幼鱼适口性的颗粒饲料混合均匀(每克颗粒饲料含1.0×109CFU重组菌)，制备防治鲇鱼爱德华氏菌病菌的疫苗，并用West bloting进行检测验证。

[0056] 以空白pSIP409载体电转化干酪乳杆菌作为对照。结果显示：与空白pSIP409载体相比，重组质粒pSIP409-ompN2出现一条约为43kD大小的目的条带，该结果与预期大小一致，如图4所示。

[0057] 5、重组菌的免疫效果评价

[0058] 5.1重组菌的制备

[0059] 分别活化含重组载体pSIP409-ompN2重组菌NC8和含对照载体pSIP409的干酪乳杆菌GCGR-16，在4℃条件下3500r/min离心10min收集菌体，用0.06％生理盐水反复清洗三次，9 8
用生理盐水经乳酸菌浓度调整至1.0×10 CFU/g和1.0×10 CFU/g，并与满足幼鱼适口性的颗粒饲料混合均匀，将制备好的免疫鱼粮在35℃条件下烘干，用于投喂幼鱼。为保证重组菌的活性，需要的免疫鱼粮现用现配，并提前对鱼粮进行高压灭菌处理。

[0060] 5.2实验动物分组及免疫方案

[0061] 将3月龄黄颡鱼转至25℃水缸中，观察2周，待幼鱼状态稳定，将其分为5组：1.0×109CFU/g口服免疫(pSIP409-ompN2)组、1.0×108CFU/g口服免疫(pSIP409-ompN2)组、1.0×
109CFU/g空载体(pSIP409)组、1.0×108CFU/g空载体(pSIP409)组和空白对照(PBS)组，每组
30条。

[0062] 每组每次颗粒饵料量为黄颡鱼总体重的3％，每日投喂1次，连续投喂3天，两周后按照相同方法加强免疫一次。

[0063] 5.3特异性抗体IgM检测

[0064] 在口服免疫的第1d、3d、7d、12d、16d、21d、31d和38d，各随机选择3尾黄颡鱼，鱼尾静脉采血，将采集血液在4℃条件下过夜，3500r/min离心10min，收集血清于-80℃保存，并利用ELISA法进行检测。具体检测方法：按照ELISA 试剂盒说明书稀释标准品，用包被液将抗原稀释，4℃包被过夜，用PBST洗涤3次；每孔加入封闭液37℃封闭2h，PBST洗涤3次；每孔加入一抗血清37℃反应2h，加入1：2000稀释黄颡鱼IgM抗体37℃反应1h；加入底物显色液，避光反应30min；每孔加入终止液，测量450nm处吸光值(OD450)。

[0065] 口服重组菌对黄颡鱼血液中IgM抗体水平影响，结果如图5所示。由图5可知：口服免疫(pSIP409-ompN2)组在38d内，两个浓度组血清中IgM抗体水平均呈现先上升后趋于平稳的趋势，并于12d时达到峰值，且两者的抗体水平均显著高于空载体(pSIP409)组和空白对照(PBS)组(P＜0.05)。

[0066] 同时，1.0×109CFU/g口服免疫(pSIP409-ompN2)组抗体水平从第3d后均高于1.08
×10 CFU/g口服免疫(pSIP409-ompN2)组，结果表明口服重组菌可显著提高黄颡鱼血液中IgM抗体水平，且1.0×109CFU/g浓度组优于1.0×108CFU/g浓度组。

[0067] 5.4口服重组菌疫苗后黄颡鱼免疫相关基因的表达分析

[0068] 为了评估免疫后黄颡鱼机体内免疫相关基因的表达水平，通过实时荧光定量PCR分析，检测不同免疫时间黄颡鱼肾脏组织内免疫相关基因：IL-1β，IFN I以及MHC-IIB的表达量变化。

[0069] 如图6所示，为IL-1β的表达情况，随着时间的增加各组IL-1β的表达量均有所增加。口服21d后，口服免疫(pSIP409-ompN2)组的IL-1β表达量显著高于空载体(pSIP409)组，其中浓度为1.0×109CFU/g的口服重组菌(pSIP409-ompN2)疫苗组IL-1β的表达量显著高于其它组，且与对空白对照(PBS)组相比差异极显著(P<0.001)。

[0070] 如图7所示，为IFN I的表达情况，随时间增加各组IFN I的表达量均有所增加，在前期上升幅度较大，7d到31d之间趋于平稳，31d后表达量再次提升。其中1.0×109CFU/g的口服重组乳酸菌(pSIP409-ompN2)疫苗组的IFN I表达量要明显高于其他组别，且与空载体组(pSIP409)相比差异显著(P<0.05)，与空白对照(PBS)组差异极显著(P<0.001)。

[0071] 如图8所示，为MHC-IIB的表达情况，口服第16d后，各组分MHC-IIB的表达量呈现大幅度的增长，其中浓度为1.0×109CFU/g的口服免疫(pSIP409-ompN2)组变化幅度最大，在第38d时MHC-IIB的表达量达到最高，且显著高于空载体组(pSIP409)组和空白对照(PBS)组(P>0.05)。

[0072] 5.5非特异性免疫指标检测

[0073] 5.5.1免疫黄颡鱼血清中溶菌酶活性测定

[0074] 口服重组菌对黄颡鱼血清中溶菌酶活性影响，结果如图9所示。由图9可知：口服免疫(pSIP409-ompN2)组和空载体(pSIP409)组溶菌酶活性均呈现先升高后下降的趋势，且口服免疫(pSIP409-ompN2)组溶菌酶活性显著高于空载体组(pSIP409)和空白对照(PBS)组(P<0.05)。浓度为1.0×109CFU/g口服免疫(pSIP409-ompN2)组的活性在各时间点均高于浓度为1.0×108CFU/g口服免疫(pSIP409-ompN2)组，且在第7d时达到峰值。结果表明1.0×109CFU/g浓度口服免疫(pSIP409-ompN2)组提高溶菌酶活性的效果要优于1.0×108CFU/g浓度组。

[0075] 5.5.2免疫黄颡鱼肝脏中POD活性测定

[0076] 口服重组乳酸菌对黄颡鱼肝脏中的POD活性影响，结果如图10所示。如图10可知：1.0×109CFU/g和1.0×108CFU/g浓度的口服免疫(pSIP409-ompN2)组及1.0×109CFU/g浓度的空载体(pSIP409)组均呈现先上升后下降的趋势，在12d时达到峰值，与空白对照(PBS)组相比差异显著(P<0.05)。低浓度空载体组与对照组结果基本相似，无明显波动。结果表明，口服重组乳酸菌可增强肝脏中POD活性。

[0077] 5.5.3免疫黄颡鱼肝脏中SOD活性测定

[0078] 口服重组菌对黄颡鱼肝脏中SOD活性影响，结果如图11所示。由图11可知：各浓度9
组SOD的活性均呈现先升高后下降的趋势且在第7d达到峰值。其中浓度为1.0×10CFU/g和
1.0×108CFU/g的口服免疫(pSIP409-ompN2)组SOD活性显著高于空白组(PBS)组(P<0.05)，其他组则与空白组(PBS)组差异不显著(P>0.05)，12d后各组数值趋于平稳。结果表明，口服重组乳酸菌可显著提高黄颡鱼肝脏中SOD活性。

[0079] 以上所述的实施例仅是对本发明的优选方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案做出的各种变形和改进，均应落入本发明权利要求书确定的保护范围内。

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表达鲇鱼爱德华氏菌外膜蛋白的重组菌、制备方法及应用

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