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治疗激素受体相关疾病抗体及方法

阅读:263发布:2021-04-14

专利汇可以提供治疗激素受体相关疾病抗体及方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 的某些实施方式中提供了调节雌 激素 受体α36功能的 抗体 、抗体 片段 、药物组合物、及调节雌激素受体α36功能的方法,以及 预防 和/或 治疗 由雌激素α36介导的 疾病 的方法。,下面是治疗激素受体相关疾病抗体及方法专利的具体信息内容。

1.一种抗体或其抗原结合片段,其结合的抗原表位基本上相同于ScFv 1(SEQ ID NO
3)、ScFv 2(SEQ ID NO 5)、ScFv 3(SEQ ID NO 7)、ScFv 4(SEQ ID NO 9)、ScFv 5(SEQ ID NO 11)、ScFv 6(SEQ ID NO 13)、或ScFv 7(SEQ ID NO 15)特异性结合的表位。
2.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一个或多个选自于如下一组的成员:ScFv
1HCDR1、ScFv 2 HCDR1、ScFv 3 HCDR1、ScFv 4 HCDR1、ScFv 5 HCDR1、ScFv 6 HCDR1、ScFv
7 HCDR1、ScFv 1 HCDR2、ScFv 2 HCDR2、ScFv 3 HCDR2、ScFv 4 HCDR2、ScFv 5HCDR2、ScFv
6 HCDR2、ScFv 7 HCDR2、ScFv 1 HCDR3、ScFv 2 HCDR3、ScFv 3 HCDR3、ScFv 4 HCDR3、ScFv
5 HCDR3、ScFv 6 HCDR3、ScFv 7 HCDR3、ScFv 1 LCDR1、ScFv 2LCDR1、ScFv 3 LCDR1、ScFv
4 LCDR1、ScFv 5 LCDR1、ScFv 6 LCDR1、ScFv 7 LCDR1、ScFv 1 LCDR2、ScFv 2 LCDR2、ScFv
3 LCDR2、ScFv 4 LCDR2、ScFv 5 LCDR2、ScFv 6LCDR2、ScFv 7 LCDR2、ScFv 1 LCDR3、ScFv
2 LCDR3、ScFv 3 LCDR3、ScFv 4 LCDR3、ScFv 5 LCDR3、ScFv 6 LCDR3、和ScFv 7 LCDR3。
3.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一个或多个选自于如下一组的成员:
a)一含有ScFv 1的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区;
b)一含有ScFv 2的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区;
c)一含有ScFv 3的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区;
d)一含有ScFv 4的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区;以及
e)一含有ScFv 5的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区;
f)一含有ScFv 6的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区;
g)一含有ScFv 7的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列的重链可变区。
4.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一个或多个选自于如下一组的成员:
a)一含有ScFv 1的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区;
b)一含有ScFv 2的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区;
c)一含有ScFv 3的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区;
d)一含有ScFv 4的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区;
e)一含有ScFv 5的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区;
f)一含有ScFv 6的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区;以及
g)一含有ScFv 7的LCDR1,LCDR2,和/或LCDR3序列的轻链可变区。
5.一种抗体或其抗原结合片段,其含有:
a)权利要求3中的任一重链可变区;以及
b)权利要求4中的任一轻链可变区。
6.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一重链可变区含有:
a)一重链CDR1选自于如下一组:ScFv 1 HCDR1,ScFv 2 HCDR1,ScFv 3 HCDR1,ScFv 4 HCDR1,ScFv 5 HCDR1,ScFv 6 HCDR1,Sc Fv 7 HCDR1;
b)一重链CDR2选自于如下一组:ScFv 1 HCDR2,ScFv 2 HCDR2,ScFv 3 HCDR2,ScFv 4 HCDR2,ScFv 5 HCDR2,ScFv 6 HCDR2,Sc Fv 7 HCDR2;以及
c)一重链CDR3选自于如下一组:ScFv 1 HCDR3,ScFv 2 HCDR3,ScFv 3 HCDR3,ScFv 4 HCDR3,ScFv 5 HCDR3,ScFv 6 HCDR3,Sc Fv 7 HCDR3;
7.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一轻链可变区含有:
a)一轻链CDR1选自于如下一组:ScFv 1 LCDR1,ScFv 2 LCDR1,ScFv 3 LCDR1,ScFv 4 LCDR1,ScFv 5 LCDR1,ScFv 6 LCDR1,Sc Fv 7 LCDR1;
b)一轻链CDR2选自于如下一组:ScFv 1 LCDR2,ScFv 2 LCDR2,ScFv 3 LCDR2,ScFv 4 LCDR2,ScFv 5 LCDR2,ScFv 6 LCDR2,Sc Fv 7 LCDR2;以及
c)一轻链CDR3选自于如下一组:ScFv 1 LCDR3,ScFv 2 LCDR3,ScFv 3 LCDR3,ScFv 4 LCDR3,ScFv 5 LCDR3,ScFv 6 LCDR3,Sc Fv 7 LCDR3。
8.一种抗体或其抗原结合片段,其含有:
a)权利要求6中的任一重链可变区;以及
b)权利要求7中的任一轻链可变区。
9.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一基酸序列选自于如下一组:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:
23、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、SEQ ID NO:49、SEQ ID NO:52、SEQ ID NO:
53、SEQ ID NO:54、SEQ ID NO:55、和SEQ ID NO:58。
10.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一重链可变区选自于如下一组:
a)一含有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和/或SEQ ID NO:22的重链可变区;
b)一含有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和/或SEQ ID NO:28的重链可变区;
c)一含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和/或SEQ ID NO:34的重链可变区;
d)一含有SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、和/或SEQ ID NO:40的重链可变区;
e)一含有SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、和/或SEQ ID NO:46的重链可变区;
f)一含有SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和/或SEQ ID NO:52的重链可变区;以及g)一含有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、和/或SEQ ID NO:58的重链可变区。
11.根据权利要求10所述的抗体或其抗原结合片段,其含有一重链可变区选自于如下一组:
a)含有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:22的重链可变区;
b)含有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和SEQ ID NO:28的重链可变区;
c)含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和SEQ ID NO:34的重链可变区;
d)含有SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、和SEQ ID NO:40的重链可变区;
e)含有SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、和SEQ ID NO:46的重链可变区;
f)含有SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和SEQ ID NO:52的重链可变区;以及g)含有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、和SEQ ID NO:58的重链可变区。
12.根据权利要求11所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述重链可变区选自于如下一组:
a)含有SEQ ID NO:60的重链可变区;
b)含有SEQ ID NO:62的重链可变区;
c)含有SEQ ID NO:64的重链可变区;
d)含有SEQ ID NO:66的重链可变区;
e)含有SEQ ID NO:68的重链可变区;
f)含有SEQ ID NO:70的重链可变区;以及
g)含有SEQ ID NO:72的重链可变区。
13.根据权利要求10-12所述的抗体或其抗原结合片段,其进一步含有一轻链可变区选自于如下一组:
a)一含有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和/或SEQ ID NO:19的轻链可变区;
b)一含有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和/或SEQ ID NO:25的轻链可变区;
c)一含有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和/或SEQ ID NO:31的轻链可变区;
d)一含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和/或SEQ ID NO:37的轻链可变区;
e)一含有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、和/或SEQ ID NO:43的轻链可变区;
f)一含有SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、和/或SEQ ID NO:49的轻链可变区;以及g)一含有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、和/或SEQ ID NO:55的轻链可变区。
14.根据权利要求13所述的抗体或其抗原结合片段,其含有一轻链可变区选自于如下一组:
a)含有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19的轻链可变区;
b)含有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25的轻链可变区;
c)含有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:31的轻链可变区;
d)含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和SEQ ID NO:37的轻链可变区;
e)含有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、和SEQ ID NO:43的轻链可变区;
f)含有SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:49的轻链可变区;以及g)含有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、和SEQ ID NO:55的轻链可变区。
15.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:22。
16.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和SEQ ID NO:28。
17.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:31;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和SEQ ID NO:34。
18.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和SEQ ID NO:37;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、和SEQ ID NO:40。
19.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQID NO:41、SEQ ID NO:42、和SEQ ID NO:43;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、和SEQ ID NO:46。
20.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:49;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和SEQ ID NO:52。
21.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、和SEQ ID NO:55;以及所述重链可变区含有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、和SEQ ID NO:58。
22.根据权利要求14所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区选自于如下一组:
a)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:59,
b)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:61,
c)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:63,
d)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:65,
e)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:67,
f)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:69,以及
g)所述轻链可变区含有SEQ ID NO:71。
23.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:59且所述重链可变区含有SEQ ID NO:60。
24.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:61且所述重链可变区含有SEQ ID NO:62。
25.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:63且所述重链可变区含有SEQ ID NO:64。
26.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:65且所述重链可变区含有SEQ ID NO:66。
27.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:67且所述重链可变区含有SEQ ID NO:68。
28.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:69且所述重链可变区含有SEQ ID NO:70。
29.根据权利要求22所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述轻链可变区含有SEQ ID NO:71且所述重链可变区含有SEQ ID NO:72。
30.一种抗体或其抗原结合片段,其含有一重链可变区含有:
a)一重链CDR1选自于如下一组:SED ID NO:20,SEQ ID NO:26,SEQ ID NO:32,SEQ ID NO:38,和SEQ ID NO:44;
b)一重链CDR2选自于如下一组:SED ID NO:21,SEQ ID NO:27,SEQ ID NO:33,SEQ ID NO:39,和SEQ ID NO:45;以及
c)一重链CDR3选自于如下一组:SED ID NO:22,SEQ ID NO:28,SEQ ID NO:34,SEQ ID NO:40,SEQ ID NO:46,SEQ ID NO:52,和SEQ ID NO:58。
31.根据权利要求30所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的重链可变区选自于如下一组:
a)含有SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:22的重链可变区;
b)含有SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和SEQ ID NO:28的重链可变区;
c)含有SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和SEQ ID NO:34的重链可变区;
d)含有SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、和SEQ ID NO:40的重链可变区;
e)含有SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、和SEQ ID NO:46的重链可变区;
f)含有SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和SEQ ID NO:52的重链可变区;以及g)含有SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、和SEQ ID NO:58的重链可变区。
32.根据权利要求31所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的重链可变区选自于如下一组:
a)含有SEQ ID NO:60的重链可变区;
b)含有SEQ ID NO:62的重链可变区;
c)含有SEQ ID NO:64的重链可变区;
d)含有SEQ ID NO:66的重链可变区;
e)含有SEQ ID NO:68的重链可变区;
f)含有SEQ ID NO:70的重链可变区;以及
g)含有SEQ ID NO:72的重链可变区。
33.根据权利要求30-32所述的抗体或其抗原结合片段,其进一步含有一轻链可变区含有:
a)一轻链可变区选自于如下一组:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:47、和SEQ ID NO:53;
b)一轻链可变区选自于如下一组:SEQ ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:54;
c)一轻链可变区选自于如下一组:SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、和SEQ ID NO:55。
34.根据权利要求33所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的轻链可变区选自于以下一组:
a)含有SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19的轻链可变区;
b)含有SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25的轻链可变区;
c)含有SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:31的轻链可变区;
d)含有SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和SEQ ID NO:37的轻链可变区;
e)含有SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、和SEQ ID NO:43的轻链可变区;
f)含有SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:49的轻链可变区;以及g)含有SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、和SEQ ID NO:55的轻链可变区。
35.根据权利要求34所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的轻链可变区选自于以下一组:
a)含有SEQ ID NO:59的轻链可变区;
b)含有SEQ ID NO:61的轻链可变区;
c)含有SEQ ID NO:63的轻链可变区;
d)含有SEQ ID NO:65的轻链可变区;
e)含有SEQ ID NO:67的轻链可变区;
f)含有SEQ ID NO:69的轻链可变区;以及
g)含有SEQ ID NO:71的轻链可变区。
36.根据权利要求1-35任一所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的抗体或其抗原结合片段为单克隆抗体、多克隆抗体、双特异性抗体、嵌合抗体、人源化抗体、重组抗体、人抗体、标记抗体、双价抗体、或抗独特型抗体。
37.根据权利要求1-35任一所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的抗体或其抗原结合片段为骆驼化的单域抗体(camelized single domain antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv′、Fv片段、Fab、Fab′、a F(ab′)2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体或双价域抗体。
38.根据权利要求1-35任一所述的抗体或其抗原结合片段,其中进一步含有免疫球蛋白恒定区。
39.根据权利要求38所述的抗体或其抗原结合片段,其中所述的免疫球蛋白恒定区为λ轻链、κ轻链、γ1重链、γ2重链、γ3重链或γ4重链恒定区。
40.一种含有如权利要求1-39任一所述的抗体或其抗原结合片段的复合物,该复合物可与SEQ ID NO:1所示的hER-α36或hER-α36的片段结合。
41.一种被分离的多肽,其含有一种或多种如权利要求1-39中任一所述的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。
42.一种被分离的多核苷酸,其编码权利要求41所述的多肽。
43.一种被分离的载体,其含有权利要求42所述的多核苷酸。
44.一种被分离的宿主细胞,其含有权利要求43所述的载体。
45.一种表达多肽方法,所述多肽含有一种或多种权利要求41中的氨基酸序列,所述方法包括在权利要求42中的多核苷酸可以被表达的条件下培养权利要求44中的被分离的宿主细胞。
46.一种药物组合物,其含有如权利要求1-39任一所述的抗体或其抗原结合片段以及一种或多种药用可接受的载剂。
47.根据权利要求46所述的药物组合物,其中所述的一种或多种药用可接受的载剂选自于如下的一组:药用可接受的液体、凝胶、固体载剂、相介质、非水相介质、抗生物物质、等渗物质、缓冲液、抗剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释剂、佐剂、辅料、或无毒辅助物质。
48.一种含有如权利要求1-39任一所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,其中所述的抗体或其抗原结合片段与一种或多种化疗物质相连或组合。
49.含有如权利要求48所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,其中所述的一种或多种化疗物质选自于如下的一组:氨柔比星,阿曲生坦、骨化三醇、西仑吉肽、达沙替尼、德卡坦尼(decatanib)、伊多特卡林(edotecarin)、恩扎妥林(enzastaurin)、盐酸厄洛替尼片、依维莫司、吉替康、酚伊匹里单抗(gossypol ipilimumab)、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽、纽莱迪(neuradiab)、诺拉曲特、奥利默森(oblimersen)、欧法图穆单抗(ofatumumab)、欧格沃单抗(oregovomab)、帕尼单抗、帕佐泮尼
(pazopanibrubitecan)、他仑帕奈、特穆斯洛利(temsirolimus)、特斯密利(tesmilifene)、汉防己硷、提斯利姆单抗(ticilimumab)、特拉倍特定(trabectedin)、凡德他尼、维特斯潘(vitespan)、扎诺利姆单抗(zanolimumab)、唑仑二膦酸盐、组氨瑞林、阿扎胞苷、右雷佐生、阿仑单抗、来那度胺、吉姆单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、六甲基嘧胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、伊地托奈特(editronate)、环孢霉素、Edwina-天冬酰胺酶、以及锶89。
50.一种含有如权利要求1-39任一所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,其中所述的抗体或其抗原结合片段与一种或多种治疗物质组合。
51.如权利要求50所述的药物组合物,其中一种或多种治疗物质选自于如下的一组:
淫羊藿、他莫昔芬、17β-雌激素,ICI 182,780,美国专利申请11/877,575中公开的化合物、美国专利申请60/046,255中公开的化合物、细胞因子、抗VEGF抗体(例如,贝伐单抗或阿瓦斯汀)、抗HER2抗体(例如:赫赛汀或曲妥珠单抗),以及抗EGFR抗体、酪氨酸受体抑制剂(例如Gapatinib,拉帕替尼)。
52.如权利要求50所述的药物组合物,其中一种或多种治疗物质选自于如下的一组:
淋巴细胞因子、单核因子、人生长激素、生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、耻骨松弛激素、耻骨松弛激素原、卵泡刺激素、促甲状腺素、黄体生成素、肝生长因子、纤维原生长因子、泌乳刺激素、胎盘催乳激素、肿瘤坏死因子、缪勒(氏)管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、整联蛋白、促血小板生成素、神经生长因子、如NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子如TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子I和II、促红细胞生成素、成骨因子、干扰素、如:干扰素-α、-β、和-γ;集落刺激因子、如:巨噬细胞-CSF、粒细胞巨噬细胞CSF、和粒细胞-CSF、白介素、如:IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、以及IL-12、肿瘤坏死因子,如:TNF-α和TNF-β,以及其他多肽因子。
53.一种含有如权利要求1-39任一所述的抗体或其抗原结合片段的药物组合物,其中所述的抗体或其抗原结合片段与一种或多种结合物相连。
54.如权利要求53所述的组合物,其中所述的结合物选自于如下的一组:选自以下
123 124 125 131 35 3 111 112 14 64 67 86 88 90 177 211
放射性同位素:I、I、 I、I、S、H、In、 In、C、Cu、Cu、Y、Y、Y、Lu、 At、
186 188 153 212 32
Re、 Re、Sm、 Bi和 P,镧系元素、化学发光标记物、选自如下一组的荧光标记物:荧光素、罗丹明、丹黄酰(dansyl)、藻红素、或得克萨斯红(Texas Red),以及酶-底物标记物例如辣根过氧化物酶、磷酸酶、或β-D-半乳糖苷酶。
55.一种在细胞中调控ER-α36活性的方法,所述方法包括将如权利要求1-35任一所述的抗体和其抗原结合片段与表达ER-α36的细胞接触
56.一种在样品中检测ER-α36存在的方法,所述方法包括将如权利要求1-35任一所述的抗体和其抗原结合片段与样品接触并检测ER-α36的存在。
57.一种在对象中治疗或预防与ER-α36相关的状态的方法,所述方法包括对所述对象使用治疗有效浓度的药物组合物,所述药物组合物含有如权利要求1-35任一所述的抗体或其抗原结合片段。
58.根据权利要求57所述的方法,其中所述状态选自于如下的一组:骨丢失、骨折、骨质疏松、转移性骨病、帕哲氏病、牙周病、软骨退变、子宫内膜异位、子宫肌瘤、热潮红、LDL胆固醇水平升高、心血管疾病、认知功能损伤、大脑退行性疾病、术后再狭窄、男子女性型乳房、管道平滑肌细胞增殖、肥胖、失禁、焦虑、雌激素受体导致的抑郁、更年期抑郁、产后抑郁、经前综合征、躁狂忧郁、焦虑、痴呆、强迫症、注意缺陷障碍、睡眠障碍、激惹、冲动、免疫缺失、自身免疫性疾病、愤怒管理、多发性硬化症和帕金森(氏)病、炎症、炎症状态、炎性肠病、呼吸系统疾病、性功能障碍、高血压视网膜变性、哮喘和癌状态。
59.根据权利要求57所述的方法,其中所述的状态包括骨丢失、骨折、骨质疏松、绝经、经前综合征、子宫内膜异位、子宫疾病、阳痿、性功能障碍、LDL胆固醇水平升高、心血管疾病、管道平滑肌增殖、雌激素受体导致的抑郁、更年期抑郁、产后抑郁、免疫缺失、自身免疫性疾病、炎症、炎症状态、哮喘和癌状态。
60.根据权利要求59所述的方法,其中所述的状态选自于如下的一组:骨丢失、子宫内膜异位、阳痿、心血管疾病、动脉粥样硬化、免疫缺失、炎症、炎症状态、哮喘和癌状态。
61.根据权利要求59所述的方法,其中所述炎症状态选自于如下的一组:类湿性关节炎、牛皮藓、硬皮病、慢性阻塞性病,以及哮喘。
62.根据权利要求59所述的方法,其中所述的癌状态选自于如下的一组:恶性肿瘤、胚细胞瘤、肉瘤、生殖细胞瘤、或者血液或淋巴的恶性肿瘤,例如:白血病、淋巴瘤、或多骨髓瘤。更具体地,可以使用本发明提供的抗体或其抗原结合片段治疗的癌状态和肿瘤种类包括但不限于,鳞状细胞癌、肺癌(如,小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺部腺癌、或肺部鳞状细胞癌)、腹膜癌、肝癌(如肝细胞瘤)、胃癌(如胃肠癌)、胰腺癌、脑癌(如,胶质母细胞脑瘤/多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非胶质母细胞脑瘤、或脑膜瘤),神经胶质瘤(如,室鼓膜瘤、星细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、或混合型胶质瘤如星形细胞混合瘤)、宫颈癌、子宫癌、肝癌(如,肝母细胞瘤、肝细胞瘤或肝癌)、膀胱癌(如,尿路上皮癌)、乳癌、结肠癌、肠癌、直肠癌、子宫内膜或宫颈癌、涎腺癌、肾癌(如:肾横纹肌样瘤)、前列腺癌、外阴癌、阴茎癌、肛门癌(如,肛管鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头颈部癌(如,鼻咽癌)、皮肤癌(如,黑素癌或鳞状细胞癌)、骨肉瘤、尤文氏肉瘤、软骨肉瘤、软组织肉瘤(如,横纹肌肉瘤、纤维肉瘤、卡波西肉瘤)、类癌、眼癌(如:视网膜母细胞瘤)、间皮瘤、淋巴细胞白血病(如,T细胞和B细胞前体谱系的急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性髓细胞性白血病(AML)、包括肥大细胞白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、滤泡性淋巴瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、淋巴瘤(BL)、蕈样肉芽肿、Sezary综合征,皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、孤立性浆细胞瘤、骨髓异常增生综合征、慢性和非慢性骨髓增生异常、中枢神经系统瘤、脑垂体瘤、前庭神经鞘瘤、神经外胚层肿瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、原发性骨髓纤维化症,以及儿童癌,如,小儿肉瘤(如:神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤以及骨肉瘤)。
63.根据权利要求57所述的方法,其中所述药物组合物经注射途径给药,包括皮下注射、腹腔注射、静脉注射、肌肉注射、或皮内注射,或非注射给药,包括皮肤给药、口服给药、鼻腔给药、眼内给药、舌下给药、直肠给药或外用给药。
64.根据权利要求57所述的方法,其中所述的治疗有效剂量为约0.01mg/kg到约
100mg/kg。
65.根据权利要求64所述的方法,其中所述的治疗有效剂量选自于如下的一组:约
0.01mg/kg,约0.5mg/kg,约1mg/kg,约2mg/kg,约5mg/kg,约10mg/kg,约15mg/kg,约20mg/kg,约25mg/kg,约30mg/kg,约35mg/kg,约40mg/kg,约45mg/kg,约50mg/kg,约55mg/kg,约
60mg/kg,约65mg/kg,约70mg/kg,约75mg/kg,约80mg/kg,约85mg/kg,约90mg/kg,约95mg/kg,以及约100mg/kg。
66.一种确定对象中与ER-α36相关状态的状况的方法,所述方法包括使用如权利要求1-35所述的抗体或其抗原结合片段测定ER-α36的水平。

说明书全文

治疗激素受体相关疾病抗体及方法

发明领域

[0001] 本发明涉及可用于预防和/或治疗雌激素受体相关疾病的抗体、药物组合物及其预防和/或治疗方法。

背景技术

[0002] 雌激素参与人体中多种关键的生理功能。雌激素功能包括发育雌性性器官,为怀孕做子宫准备和为分娩后作哺乳准备。雌激素在维持适度心血管功能和骨密度方面也发挥
重要的作用。雌激素可刺激细胞增殖,故可增加女性患癌症的险,特别是乳腺癌和子宫
癌。
[0003] 雌激素在靶细胞中可结合雌激素受体并调节细胞功能。在人体细胞中已发现了两种雌激素受体(hER),hER-α和hER-β。它们的蛋白结构类似,都有三个独立但相互作用
的功能域:N端结构域(A/B结构域)、中间DNA结合结构域(C结构域)和C端配体结合域
(D/E/F结构域)。N端结构域具有配体非依赖性的激活功能(AF-1),在没有配体存在的条
件下可与激活辅助因子相互作用并参与靶基因的转录激活。DNA结合结构域可特异性地结
合DNA序列,并在受体二聚化中发挥重要作用。C端结合域介导配体结合,具有配体依赖性
的激活功能(AF-2),可在配体存在的条件下激活基因转录。
[0004] hER-α蛋白全长66kDa,称为hER-α66。hER-α66含有全部的三个功能结构域。随后发现hER-α66的剪接异构体,称为hER-α46。hER-α46分子量约为46KDa,缺失
hER-α66中的N端AF-1结构域。最近又发现了一种新的36kDa的hER-α变体,hER-36α。
其缺失hER-α66的N端AF-1结构域和C端AF-2结构域(Wang et al.,Biochem.Biophys.
Res.Commun.336,1023-1027(2005))。
[0005] hER-α66被认为是通过激活雌激素靶基因的转录从而介导雌激素刺激细胞增殖。雌激素结合hER-α66后可激活其反式激活域,从而刺激下游靶基因的表达并最终导
致细胞增殖。研究发现,hER-α46在雌激素的刺激下可介导一化氮的在细胞膜的迅速
合成(Li et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 100:4807-4812(2003))。缺失AF-1域的
hER-α46可抑制hER-α66的AF-1活性(Flouriot,G.,EMBO,19,4688-4700,(2000))。由
于hER-α36缺失AF-1和AF-2转录激活域,所以具有hER-α66和hER-β显性失活的抑
制剂活性,可抑制hER-α和hER-β两者的AF-1和AF-2功能。另外,hER-α36主要定
位于细胞膜,介导雌激素的细胞膜信号转导,刺激细胞增殖和有丝分裂。(Wang et al.,
Biochem.Biophys.Res.Commun.336,1023-1027(2005);Wanget al.,Proc.Natl.Acad.Sci.
U.S.A.103:9063-9068(2006))。
[0006] 大量研究证明,雌激素受体信号转导是由经典核转录激活通路以及非经典膜信号通路介导。hER-α66和hER-α46可能主要在核内发挥功能而hER-α36主要通过核外发挥
功能。
[0007] 研究还表明,hER-α36缺失原始hER-α66配体结合域的螺旋8-12,所以完全改变了hER-α36的配体结合特异性。因此,hER-α36可结合与hER-α66和hER-β不同的配
体。
[0008] 由于雌激素和雌激素受体相关的疾病仍然在影响诸多个体,因此迫切需要发现可用于预防和/或治疗这些疾病的新方案如新的抗体和/或新的预防/治疗方法。

发明内容

[0009] 本发明提供了可用于治疗、预防、诊断与雌激素受体ER-α36(SEQ ID NO:1,基因登陆号BX640939)相关状态的抗体及其抗原结合片段,以及药物组合物和使用方法。
[0010] 在某些实施方式中,本发明提供了一抗体或其抗原结合片段,其可特异性结合ER-α36而非ER-α66(基因登陆号X03635,基酸序列见图1a)或ER-α46(氨基酸序列
见图1b)。在某些实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段可特异性地结合SEQ ID NO:1中
的氨基酸残基284到310,或SEQ ID NO:2中的氨基酸残基1到27。
[0011] 在某些实施方式中,本发明提供了一抗体或其抗原结合片段,其结合的表位基本上同于ScFv1(SEQ ID NO:3)、ScFv2(SEQ ID NO:5)、ScFv3(SEQ ID NO:7)、ScFv4(SEQ ID
NO:9)、ScFv5(SEQ ID NO:11)、ScFv6(SEQ ID NO:13)、ScFv7(SEQ ID NO:15)所特异性结
合的表位。
[0012] 在某些实施方式中,本发明提供了一抗体或其抗原结合片段,其包含ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列。在某些
这样的实施方式中,所述的抗体或其抗原结合片段包含ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、
ScFv6或ScFv7的HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列。在某些这样的实施方式中,所述的抗体或
其抗原结合片段包含ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的重链可变区。
[0013] 在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段包含ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的LCDR1、LCDR2、和/或LCDR3序列。在某些这样的实施方式中,
所述的抗体或其抗原结合片段包含ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的
LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列。在某些这样的实施方式中,所述的抗体或其抗原结合片段包
含ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的轻链可变区。
[0014] 在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段含有1)ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2序列;2)ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、
ScFv5、ScFv6或ScFv7的LCDR1、LCDR2、和/或LCDR3序列。在某些这样的实施方式下,所
述的抗体或其抗原结合片段含有1)ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的
HCDR1、HCDR2、和HCDR3序列;以及2)ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的
LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列。
[0015] 在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段含有一重链可变区,其含有1)一重链CDR1,选自于如下的一组:ScFv 1 HCDR1、ScFv 2 HCDR1、ScFv 3 HCDR1、ScFv 4 HCDR1、
ScFv 5 HCDR1、ScFv 6 HCDR1、和ScFv 7 HCDR1;2)一重链CDR2,选自于如下的一组:ScFv
1 HCDR2、ScFv 2 HCDR2、ScFv 3 HCDR2、ScFv 4 HCDR2、ScFv 5 HCDR2、ScFv 6 HCDR2、和
ScFv 7 HCDR2,和3)一重链CDR3,选自于如下的一组:ScFv 1 HCDR3、ScFv 2 HCDR3、ScFv
3 HCDR3、ScFv 4 HCDR3、ScFv 5 HCDR3、ScFv 6 HCDR3、和ScFv 7 HCDR3。ScFv m HCDR i
指ScFv m的HCDR i(1≤i≤3,1≤m≤7)。
[0016] 在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段含有轻链可变区,其含有1)一轻链CDR1,选自于如下的一组:ScFv 1 LCDR1、ScFv 2 LCDR1、ScFv 3 LCDR1、ScFv 4 LCDR1、
ScFv 5 LCDR1、ScFv 6 LCDR1、和ScFv 7 LCDR1;2)一轻链CDR2,选自于如下的一组:ScFv
1 LCDR2、ScFv 2 LCDR2、ScFv 3 LCDR2、ScFv 4 LCDR2、ScFv 5 LCDR2、ScFv 6 LCDR2、和
ScFv 7 LCDR2,和3)一轻链CDR3,选自于如下的一组:ScFv 1 LCDR3、ScFv 2 LCDR3、ScFv
3 LCDR3、ScFv 4 LCDR3、ScFv 5 LCDR3、ScFv 6 LCDR3、和ScFv 7 LCDR3。ScFvm LCDRi是
指ScFvm的LCDR i(1≤i≤3,1≤m≤7)。
[0017] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有1)一重链可变区,其含有ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的HCDR3、HCDR1、和/或HCDR2
序列;和2)一轻链可变区,其含有ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的
LCDR1、LCDR2、和/或LCDR3序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段含
有1)一重链可变区,其含有ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6或ScFv7的HCDR1、
HCDR2、和HCDR3序列;2)一轻链可变区,其含有ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6
或ScFv7的LCDR1、LCDR2、和LCDR3序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结
合片段含有1)一重链可变区,选自由ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、ScFv5、ScFv6和ScFv7
的任意重链可变区组成的群组,和2)一轻链可变区,选自由ScFv1、ScFv2、ScFv3、ScFv4、
ScFv5、ScFv6和ScFv7的任意轻链可变区组成的群组。
[0018] 在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段含有:A)一重链可变区,其含有1)一重链CDR1选自于如下的一组:ScFv 1 HCDR1、ScFv 2
HCDR1、ScFv 3 HCDR1、ScFv 4 HCDR1、ScFv 5 HCDR1、ScFv 6 HCDR1、和ScFv 7HCDR1;2)一
重链CDR2选自于如下的一组:ScFv 1 HCDR2、ScFv 2 HCDR2、ScFv 3 HCDR2、ScFv 4 HCDR2、
ScFv 5 HCDR2、ScFv 6 HCDR2、和ScFv 7 HCDR2;以及3)一重链CDR3选自于如下的一组:
ScFv 1 HCDR3、ScFv 2 HCDR3、ScFv 3 HCDR3、ScFv 4 HCDR3、ScFv 5 HCDR3、ScFv 6 HCDR3、
和ScFv 7 HCDR3;以及
[0019] B)一轻链可变区,其含有1)一轻链CDR1选自于如下的一组:ScFv 1 LCDR1、ScFv2 LCDR1、ScFv 3 LCDR1、ScFv 4 LCDR1、ScFv 5 LCDR1、ScFv 6 LCDR1、和ScFv 7 LCDR1;
2)一轻链CDR2选自于如下的一组:ScFv 1 LCDR2、ScFv 2 LCDR2、ScFv 3 LCDR2、ScFv 4
LCDR2、ScFv 5 LCDR2、ScFv 6 LCDR2、和ScFv 7 LCDR2;以及3)一轻链CDR3 选自于如下
的一组:ScFv 1 LCDR3、ScFv 2 LCDR3、ScFv 3 LCDR3、ScFv 4 LCDR3、ScFv 5 LCDR3、ScFv
6 LCDR3、和ScFv 7 LCDR3。
[0020] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一重链可变区,其含有1)一种或多种在SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和/或SEQ ID NO:22中列出的氨基
酸序列;2)一种或多种在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和/或SEQ ID NO:28中列出的氨
基酸序列;3)一种或多种在SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和/或SEQ ID NO:34中列出的
氨基酸序列;4)一种或多种在SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、和/或SEQ ID NO:40中列出
的氨基酸序列;5)一种或多种在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、和/或SEQ ID NO:46中列
出的氨基酸序列;6)一种或多种在SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和/或SEQ ID NO:52中
列出的氨基酸序列;或7)一种或多种在SEQ IDNO:56、SEQ ID NO:57、和/或SEQ ID NO:
58中列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式下,抗体或其抗原结合片段含有一重链可
变区,其包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID
NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、和SEQ ID NO:72。
[0021] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有1)一种或多种在SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和/或SEQ ID NO:19中列出的氨基
酸序列;2)一种或多种在SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和/或SEQ ID NO:25中列出的氨
基酸序列;3)一种或多种在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和/或SEQ ID NO:31中列出的
氨基酸序列;4)一种或多种在SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和/或SEQ ID NO:37中列出
的氨基酸序列;5)一种或多种在SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、和/或SEQ ID NO:43中列
出的氨基酸序列;6)一种或多种在SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、和/或SEQ ID NO:49中
列出的氨基酸序列;或7)一种或多种在SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、和/或SEQ ID NO:
55中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段含有一种轻链可变区,
其包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:
65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、和SEQ ID NO:71。
[0022] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一重链可变区,其含有1)一重链CDR1,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:26、SEQ ID
NO:32、SEQ ID NO:38和SEQ ID NO:44;2)一重链CDR2,包括选自于如下一组的序列:SEQ
ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39和SEQ ID NO:45;和3)一重链
CDR3,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、SEQ ID NO:34、SEQ ID
NO:40、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、和SEQ ID NO:58。在某些这样的实施方式中,所述
抗体或其抗原结合片段含有一重链可变区,其包括选自于如下的一组的序列:SEQ ID NO:
60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID NO:70、和SEQ ID
NO:72。
[0023] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有1)一轻链CDR1,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID
NO:35、SEQ ID NO:47和SEQ ID NO:53;2)一轻链CDR2,包括选自于如下一组的序列:SEQ
ID NO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:54;和3)一轻链
CDR3,选择由以下组分组成的群组:SEQ ID NO:19、SEQ ID NO:25、SEQ ID NO:37、SEQ ID
NO:43、SEQ ID NO:49、和SEQ ID NO:55。在某些这样的实施方式中,所述的抗体或其抗原
结合片段含有一轻链可变区,其包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:
61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:67、SEQ ID NO:69、和SEQ ID NO:71。
[0024] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有:A)一轻链可变区,其含有1)一种或多种在SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和/或SEQ
ID NO:19中列出的氨基酸序列;2)一种或多种在SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和/或
SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列;3)一种或多种在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和/
或SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列;4)一种或多种在SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和
/或SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列;5)一种或多种在SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、
和/或SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列;6)一种或多种在SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:
48、和/或SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列;或7)一种或多种在SEQ ID NO:53、SEQ ID
NO:54、和/或SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列;和
[0025] B)一重链可变区,其含有1)一种或多种在SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和/或SEQ ID NO:22中列出的氨基酸序列;2)一种或多种在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和/
或SEQ ID NO:28中列出的氨基酸序列;3)一种或多种在SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和
/或SEQ ID NO:34中列出的氨基酸序列;4)一种或多种在SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、
和/或SEQ ID NO:40中列出的氨基酸序列;5)一种或多种在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:
45、和/或SEQ ID NO:46中列出的氨基酸序列;6)一种或多种在SEQ ID NO:50、SEQ ID
NO:51、和/或SEQ ID NO:52中列出的氨基酸序列;或7)一种或多种在SEQ ID NO:56、SEQ
ID NO:57、和/或SEQ ID NO:58中列出的氨基酸序列。
[0026] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有:A)一重链可变区,其含有1)一重链CDR1,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:20、
SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:38、和SEQ ID NO:44;2)一重链CDR2,包括选
自于如下一组的序列:SEQ ID NO:21、SEQ ID NO:27、SEQ ID NO:33、SEQ ID NO:39和SEQ
ID NO:45;和3)一重链CDR3,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:22、SEQ ID NO:28、
SEQ ID NO:34、SEQ ID NO:40、SEQ ID NO:46、SEQ ID NO:52、和SEQ ID NO:58;和
[0027] B)一轻链可变区,其含有1)一轻链CDR1,包括选自于如下一组的序列:SEQ IDNO:17、SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:47、和SEQ ID NO:53;2)一轻链CDR2,
包括选自于如下一组的序列:SEQ IDNO:18、SEQ ID NO:24、SEQ ID NO:36、SEQ ID NO:48、
和SEQ ID NO:54;和3)一轻链CDR3,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:19、SEQ ID
NO:25、SEQ ID NO:37、SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:49、和SEQ ID NO:55。
[0028] 在某些实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段含有A)一轻链可变区,包括选自于如下一组的序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:61、SEQ ID NO:63、SEQ ID NO:65、SEQ ID
NO:67、SEQ ID NO:69、和SEQ ID NO:71;以及B)一重链可变区,包括选自于如下一组的序
列:SEQ ID NO:60、SEQ ID NO:62、SEQ ID NO:64、SEQ ID NO:66、SEQ ID NO:68、SEQ ID
NO:70、和SEQ ID NO:72。
[0029] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:17、SEQ ID NO:18、和SEQ ID NO:19中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:20、SEQ ID NO:21、和SEQ ID NO:22中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:59中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在SEQ ID NO:60中列出的氨基酸序列。
[0030] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:23、SEQ ID NO:24、和SEQ ID NO:25中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27、和SEQ ID NO:28中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:61中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在SEQ ID NO:62中列出的氨基酸序列。
[0031] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:29、SEQ ID NO:30、和SEQ ID NO:31中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33、和SEQ ID NO:34中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:63中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在SEQ ID NO:64中列出的氨基酸序列。
[0032] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:35、SEQ ID NO:36、和SEQ ID NO:37中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:38、SEQ ID NO:39、和SEQ ID NO:40中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:65中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在SEQ ID NO:66中列出的氨基酸序列。
[0033] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:41、SEQ ID NO:42、和SEQ ID NO:43中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:44、SEQ ID NO:45、和SEQ ID NO:46中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:67中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在SEQ ID NO:68中列出的氨基酸序列。
[0034] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:47、SEQ ID NO:48、和SEQ ID NO:49中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:50、SEQ ID NO:51、和SEQ ID NO:52中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:69中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在序列70中列出的氨基酸序列。
[0035] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段含有一轻链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:53、SEQ ID NO:54、和SEQ ID NO:55中列出的氨基酸序列,
和一重链可变区,其含有一种或多种在SEQ ID NO:56、SEQ ID NO:57、和SEQ ID NO:58中
列出的氨基酸序列。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的轻链可变区
含有在SEQ ID NO:71中列出的氨基酸序列。在某些实施方式中,该抗体或其抗原结合片段
的重链可变区含有在序列72中列出的氨基酸序列。
[0036] 在某些以上的实施方式中,本发明中公开的抗体或其抗原结合片段进一步含有一λ轻链、κ轻链、一γ1重链、一γ2重链、一γ3重链、或一γ4重链恒定区。在某些这样
的实施方式中,所述的抗体或其抗原结合片段含有一IgG2恒定区。在某些实施方式中,本
发明所公开的抗体为完整抗体。在某些这样的实施方式中,所述抗体可以是单克隆抗体、多
克隆抗体、重组抗体、双特异抗体、人源化抗体、嵌合抗体、标记抗体、双价抗体、抗独特型抗
体、或完全人抗体。在某些实施方式中,本发明中提供的抗体或其抗原结合片段可以是骆驼
化单域抗体(camelized single chain domain antibody),双功能抗体(diabody),scFv,
scFv二聚体,BsFv,dsFv,(dsFv)2,dsFv-dsFv′,Fv片段,Fab,Fab′,F(ab′)2,ds双功能
抗体(ds diabody),纳米抗体,域抗体,或双价域抗体。
[0037] 在某些实施方式中,本发明中提供的抗体或其抗原结合片段可特异性地结合ER-α36和/或调控ER-α36活性。在某些实施方式中,本发明中公开的抗体或其抗原结合
片段可治疗、抑制、减少、或预防与ER-α36相关的疾病。例如,本发明中公开的抗体或其抗
原结合片段可抑制肿瘤生长,其抑制作用与肿瘤生长抑制百分比呈函数关系;可减小肿瘤
大小;或延迟肿瘤生长至一特定的大小。
[0038] 在某些实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段与ER-α36结合的KD值≤1000pM。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段与ER-α36结合的KD值
≤500pM,在另一实施方式中≤200pM,≤100pM,≤50pM,≤20pM,≤10pM,或≤1pM。
[0039] 在某些实施方式中,本发明提供了某些方法,可通过对需求对象给予治疗有效剂量的一种或多种本发明中公开的抗体或其抗原结合片段,从而在所述对象中抑制、治疗、减
少或预防与ER-α36相关的疾病。在某些实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的单次
给药剂量为约0.01mg/kg到约100mg/kg(例如,约10mg/kg或约5mg/kg或更少)。在某些
这样的实施方式中,所述的抗体或其抗原结合片段的单次给药剂量为1mg/kg或更少,在其
他的实施方式中约为0.5mg/kg或更少,在另外其他的实施方式中约为0.1mg/kg或更少。在
某些实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段的给药方式为多次给药,每次给药间隔为一
天一次到每两月一次。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段可以约一周
给药一次,约两周给药一次,约一月给药一次,或约两月给药一次。
[0040] 在某些实施方式中,本发明提供了诊断的方法,通过将某样品与本发明提供的抗体或其抗原结合片段接触,确定所述抗体或其抗原结合片段与所述样品的结合,从而确定
ER-α36蛋白的存在或与ER-α36相关的某疾病的进行/退行。例如,本发明提供了一试剂
盒,含有一种或多种本发明中公开的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中,所述试剂
盒含有使用所述抗体或其抗原结合片段的使用说明,和/或试剂盒中其他组分使用说明。
[0041] 在某些实施方式中,本发明提供了多核苷酸,其编码本发明公开的抗体或其抗原结合片段的氨基酸序列。在某些其他实施方式中,本发明提供了含有上述多核苷酸的载体,
在某些其他实施方式中,本发明提供了含有上述载体的宿主细胞。在某些实施方式中,本发
明提供了表达一种或多种本发明公开的抗体或其抗原结合片段的方法,该方法通过在一定
条件下培养宿主细胞,使载体中的编码所述抗体或其抗原结合片段的多核苷酸得以表达。
在某些实施方式中,本发明提供的多核苷酸操作性地连接于载体中的启动子,如CMV启动
子。在某些实施方式中,含有本发明提供的载体的宿主细胞为中国仓鼠卵巢细胞。
[0042] 在某些实施方式中,本发明提供了药物组合物,其含有一种或多种本发明公开的抗体或其抗原结合片段。在某些实施方式中,所述组合物进一步含有一种或多种药物载剂
(carrier)。在某些这样的实施方式中,所述的一种或多种药物载剂可以是一种或多种药用
可接受的载剂包括,例如,稀释剂、抗氧化剂、佐剂、辅料或无毒的辅助物质。
[0043] 在某些实施方式中,本发明提供的一种或多种抗体或其抗原结合片段可用于制造药物,其可用于治疗与ER-α36相关的疾病。
附图说明
[0044] 图1为人ER的氨基酸序列。其中图1a为ERα66的氨基酸序列,图1b为ERα46的氨基酸序列。
[0045] 图2为以包涵体存在的ScFv1(S14),ScFv2(S24),ScFv3(S33),ScFv4(S41),ScFv6(S66)和ScFv7(S72)在SDS-PAGE电泳中的结果。图2a,2b,2c,2d,2e和2f为
SDS-PAGE电泳结果,分别显示了ScFv1,ScFv2,ScFv3,ScFv4,ScFv6和ScFv7在上清液S14,
S24,S33,S41,S66和S72的(见箭头)的存在。
[0046] 图3为纯化后的ScFv的SDS-PAGE电泳结果。图3a,3b和3c分别对应纯化后的ScFv1,ScFv4和ScFv6。
[0047] 图4为复性后的ScFv的SDS-PAGE电泳结果。在图4a中,1:复性后的ScFv1的还原SDS-PAGE电泳图;2:复性后的ScFv1的非还原SDS-PAGE电泳图。图4b显示复性后的
ScFv4的还原SDS-PAGE电泳图(1:复性后的ScFv4;2:分子量标准)。图4c显示了复性后
的ScFv6的还原SDS-PAGE电泳图(1:复性后的ScFv6;2:分子量标准)。
[0048] 图5为复性后ScFv1~ScFv7的还原SDS-PAGE电泳图,其中S14,S24,S33,S41,S53,S66和S72分别对应于ScFv1,ScFv2,ScFv3,ScFv4,ScFv5,ScFv6和ScFv7。
[0049] 图6为抗ER-α36 ScFv1~ScFv7的ELISA结果,显示ScFv1~ScFv7与ER-α36的结合
[0050] 图7为荷瘤裸鼠分别给药抗ER-α36 ScFv1,ScFv3,ScFv4,ScFv7和抗ER-α36多克隆抗体,阴性对照IgG以及阳性对照赫赛汀后,其相对肿瘤体积的变化。
[0051] 图8为荷瘤裸鼠分别给药抗ER-α36 ScFv1,ScFv3,ScFv4,ScFv7和抗ER-α36多克隆抗体,阴性对照IgG以及阳性对照赫赛汀后,其肿瘤重量的变化。
[0052] 图9为荷瘤裸鼠分别给药抗ER-α36 ScFv1,ScFv3,ScFv4,ScFv7和抗ER-α36多克隆抗体,阴性对照IgG以及阳性对照赫赛汀后,其肿瘤抑制率的变化。
[0053] 图10为荷瘤裸鼠分别给药阴性对照IgG(10a),阳性对照赫赛汀(10b),抗ER-α36多克隆抗体(10c),抗ER-α36 ScFv1(10d),抗ER-α36 ScFv3(10e),ER-α36 ScFv4(10f)
和抗ER-α36 ScFv7(10g)后取出的肿瘤的照片。
[0054] 图11为荷瘤裸鼠分别给药对照,ScFv7,和他莫昔芬后的相对肿瘤体积。
[0055] 图12为荷瘤裸鼠分别给药对照,ScFv7,和他莫昔芬后的相对肿瘤生长速度。
[0056] 图13为荷瘤裸鼠分别给药对照,ScFv7,和他莫昔芬后的肿瘤重量。
[0057] 图14为荷瘤裸鼠分别给药对照,ScFv7,和他莫昔芬后的肿瘤生长抑制率。
[0058] 图15为荷瘤裸鼠分别给药他莫昔芬(a),抗肿瘤抗体(b)和对照(c)后的取出的肿瘤的照片。
[0059] 图16为在SK-BR-3和HEK293/ER36细胞中用ScFv1~ScFv7检测ER-α36的Western Blot结果。

具体实施方式

[0060] 本发明的以下描述只为说明本发明的多种实施方式。同样地,此处讨论的具体修改方式不应理解为对发明范围的限制。本领域的熟练人员不偏离本发明范围即可很容易地
得出多种等同物,变化和修改,应理解这样的等同实施方式包括在本发明范围内。
[0061] 本发明中的“抗体”一词包括任意可结合某特定抗原的单克隆抗体、多克隆抗体、多特异性抗体或双特异性(双价)抗体。一个完整的抗体包含两条重链和两条轻链。每条重
链由一可变区和第一、第二、第三恒定区组成;每条轻链由一可变区和一恒定区组成。哺乳
动物的重链可分为α,δ,ε,γ,和μ,哺乳动物的轻链可分为λ或κ。抗体呈“Y”型,“Y”
型结构的颈部由两条重链的第二和第三恒定区组成,其通过二硫键结合。“Y”型结构的每条
臂包括其中一条重链的可变区和第一恒定区,其与一条轻链的可变区和恒定区结合。轻链
和重链的可变区决定抗原的结合。每条链的可变区均含有三个高变区,称互补决定区(CDR)
(轻链(L)的CDR包含LCDR1、LCDR2、LCDR3,重链(H)的CDR包含HCDR1、HCDR2、HCDR3。本
发明中公开的抗体和抗原结合片段的CDR边界可通过Kabat,Chothia或Al-Lazikani命名
法命名或识别。(Al-Lazikani 1997;Chothia 1985;Chothia 1987;Chothia 1989;Kabat
1987;Kabat 1991)。其中,三个CDR由被成为构架区(FR)的侧面连续部分间隔开,构架区
比CDR更加高度保守并形成一个支架支撑超变环。重链和轻链的恒定区与抗原结合无关,
但具有多种效应功能。抗体依据重链恒定区的氨基酸序列可以分成几类。根据是否含有
α,δ,ε,γ,和μ重链,抗体可分别分为五个主要的分类或异构体:IgA、IgD、IgE、IgG和
IgM。几个主要的抗体分类还可分为亚类,如IgG1(γ1重链)、IgG2(γ2重链)、IgG3(γ3
重链)、IgG4(γ4重链)、IgA1(α1重链)或IgA2(α2重链)等。
[0062] “双价”的抗体或其抗原结合片段含有两个抗原结合位点。这两个抗原结合位点可以结合同一个抗原,或分别结合不同抗原,这两种情况下该抗体或其抗原结合片段都认为
是“双价”。
[0063] 本发明中的“抗原结合片段”一词,指一种抗体片段,例如双功能抗体(diabody)、Fab、Fab′、F(ab′)2、Fv片段、二硫键稳定的Fv片段(dsFv)、(dsFv)2、双特异性
dsFv(dsFv-dsFv′),二硫键稳定的双功能抗体(ds diabody)、单链抗体分子(scFv)、scFv
二聚体(双价的双功能抗体),双价单链抗体(BsFv),由含有一个或多个CDR的抗体的一部
分形成的多特异性抗体、骆驼化单域抗体(camelized single domain antibody)、纳米抗
体、域抗体、双价域抗体、或任何其他结合抗原但不具有完整抗体结构的抗体片段。抗原结
合片段可以与母体抗体或母体抗体片段(如母体scFv)结合相同的抗原。在某些实施方式
中,抗原结合片段可以含有来自某特定人抗体的一个或多个CDR,移接至来自一个或多个不
同人抗体的框架区。
[0064] 抗体的“Fab”片段是指由一条轻链(包括可变区和恒定区)和一条重链的可变区和恒定区经二硫键结合起来的那部分抗体分子。
[0065] “Fab′”片段是指包含了部分铰链区的Fab片段。
[0066] “F(ab′)2”指的是Fab的二聚体。
[0067] 抗体的“Fc”指的是由重链的第二、第三恒定区经二硫键结合组成的那部分抗体。抗体的Fc段负责多种不同的效应功能如ADCC和CDC,但不参与抗原的结合。
[0068] 抗体的“Fv”段指的是含有完整抗原结合位点的最小抗体片段。Fv片段由一条轻链的可变区和一条重链的可变区组成。
[0069] “单链Fv抗体”或“scFv”是指由轻链可变区与重链可变区直接相连或通过一个肽链连接而成的工程抗体(Houston 1988)。
[0070] “单链抗体Fv-Fc”或“scFv-Fc”是指由连接到某抗体Fc段的scFv组成的工程抗体。
[0071] “骆驼化单域抗体(Camelized single domain antibody)”、“重链抗体”或“HCAb(Heavy-chain-only antibodies,HCAb)”都是指含有两个VH域而不含有轻链
的 抗 体 (Riechmann 1999;Muyldermans 2001;WO94/04678;WO94/25591;U.S.Patent
No.6,005,079)。重链抗体最初从驼科(骆驼、、单峰驼、和美洲驼)衍生得到。虽然缺失轻
链,骆驼化抗体(camelized antibodies)有确证的抗原结合全部功能(Hamers-Casterman
1993;Nguyen 2002;Nguyen 2003)。重链抗体的可变区(VHH域)是最小的已知的获得性免
疫产生的抗原结合单位(Koch-Nolte 2007)。
[0072] “纳米抗体”是指一种抗体片段,其由一个来自重链抗体的VHH域和两个恒定区CH2和CH3组成。
[0073] “双功能抗体(diabody)”包括带有两个抗原结合位点的小抗体片段,其中该片段含有在同一条多肽链上相连的VH域和VL域(VH-VL或VH-VL)(请参见,Holliger 1993;
EP404097;WO93/11161)。两个域之间衔接物很短,使同一条链上的两个域不能互相配对,从
而迫使两个域与另一条链的互补域配对,形成两个抗体结合位点。这两个抗体结合位点可
靶向结合相同或不同的抗原(或抗原表位)。
[0074] “域抗体”是指仅含有一条重链可变区或一条轻链可变区的抗体片段。在某些情况下,两个或多个VH域由一个多肽衔接物共价结合并形成双价域抗体。双价域抗体的两个VH
域可靶向作用于相同或不同的抗原。
[0075] 在某些实施方式中,“(dsFv)2”含有三条肽链:两个VH基团间通过一条多肽衔接物相连,并通过二硫键与两个VL基团结合。
[0076] 在某些实施方式中,“双特异性ds双功能抗体”含有VL1-VH2(由一个多肽衔接物相连)和VH1-VL2(也是由一个多肽衔接物相连),两者在VH1和VL1间通过二硫键结合。
[0077] 在某些实施方式中,“双特异性dsFv”或“dsFv-dsFv”含有三条多肽链:VH1-VH2基团,其中两者的重链通过多肽衔接物(如:长的弹性衔接物)相连,并通过二硫键分别与VL1
和VL2基团结合,每对通过二硫键配对的重链轻链具有不同的抗原特异性。
[0078] 在某些实施方式中,“scFv二聚体”是双价双功能抗体或双价单链抗体(BsFv),含有二聚化的两个VH-VL(由多肽衔接物连接)基团,其中一个基团的VH与另一个基团的VL
协作形成两个结合位点,这两个结合位点可靶向结合相同抗原(或抗原表位)或不同抗原
(或抗原表位)。在另一些实施方式中,“scFv二聚体”是双特异性双功能抗体,含有相互连
接的VL1-VH2(由多肽衔接物连接)和VH1-VL2(由多肽衔接物连接),其中VH1和VL1协作,VH2
和VL2协作,且每个协作的配对具有不同的抗原特异性。
[0079] 本发明中的“表位”是指抗原分子中与抗体结合的那部分氨基酸或原子基团。如果两种抗体表现出对抗原的竞争性结合,则可能结合抗原上的相同表位。例如,如果本发明中
公开的某抗体或其抗原结合片段与ScFv1,ScFv2,ScFv3,ScFv4,ScFv5,ScFv6或ScFv7竞争
结合ERα36,则该抗体可能,但不一定,被认为结合与ScFv1,ScFv2,ScFv3,ScFv4,ScFv5,
ScFv6或ScFv7相同的表位。
[0080] 本发明中的“ER”是指多种已知雌激素受体,ER-α66或ER-α46或ER-α36中的一种。全长的人ER-α称为hER-α66,其被确证为一个66kDa的蛋白,含有595个氨基
酸(见图1a)。hER-α66由三个独立但相互关联的功能域组成:N端A/B域,C或DNA结合
域,和D/E/F或配体结合域(见美国专利申请10/591,199,做为参考文献并入)。ER-α66
的N端结构域编码一个配体非依赖性激活功能(AF-1),该区域参与与辅助激活因子的相互
作用,以及对目的基因转录激活。DNA结合域或C域含有两个锌指结构,其在受体二聚化以
及与特异DNA序列结合中发挥重要作用。C端D/E/F域为配体结合域,调节配体结合,受
体二聚化,核转位,和配体依赖性激活功能(AF-2)。AF-1和AF-2对转录控制的相对贡献
在不同细胞和不同DNA启动子中会有所不同(Berry et.al.,EMBO J.,9:2811(1990)and
Tzukerman et.al.,Mol.Endocrin.,8:21(1994))。人ER-α46(h ER-α46,见图1b)是
hER-α66的剪接异构体,具有约46kDa的分子量,含有412个氨基酸,缺少hER-α66的N端
AF-1域。人ER-α36(hER-α36,其序列如SEQ ID NO:1所示)是一个36kDa的hER-α66的
异构体,其缺失hER-α66的N端AF-1域和C端AF-2域(Wang et al.,Biochem.Biophys.
Res.Commun.336,1023-1027(2005),美国专利申请10/591,199,WO2005/087811)。但是与
hER-α66或hER-α46相比,hER-α36在其C端有独特的27个氨基酸残基添加。这27个
氨基酸残基为SEQ ID NO:1中的第284到310个氨基酸残基,或SEQ ID NO:2中的第1到
第27个氨基酸残基。
[0081] 本发明中的“ER活性”包括由ER(如,hER-α36)介导的细胞内活动,如受体磷酸化(如,酪氨酸磷酸化),细胞内信号分子与受体或其他细胞内信号分子的结合,信号级联
的起始,和/或某生物反应的起始(如,具有ER(如,hER-α36)的细胞的基因表达诱导和
生理或发育中的变化(如,增殖))。
[0082] 本发明中的“癌症”或“癌状态”是指任何由肿瘤或恶性细胞生长、增殖、或转移所介导,并引发实体瘤和非实体瘤如白血病的医疗状态。本发明中的“肿瘤”是指肿瘤和/或
恶性细胞的实体物质。
[0083] 对某种状态的“治疗”或“疗法”包括预防或减轻某种状态,降低某种状态兴起或发展的速度,减少发展出某种状态的风险,预防或延迟与某种状态相关的症状发展,减少或
终止与某种状态相关的症状,产生某种状态的完全或部分的逆转,治愈某种状态,或以上的
组合。对于癌症来说,“治疗”或“疗法”可以指抑制或减缓肿瘤或恶性细胞生长,繁殖,或转
移,或以上的某些组合。对于肿瘤来说,“治疗”或“疗法”包括清除全部或部分的肿瘤,抑制
或减缓肿瘤生长和转移,预防或延缓肿瘤的发展,或以上的某些组合。
[0084] 本发明中的“特异性结台”是指,指两分子间的非随机结合反应,如抗体和抗原间的反应。在某些实施方式中,特异性结合某抗原的抗体或其抗原结合片段与抗原结合的
-6 -7 -7 -7 -8 -8 -8
亲和力(KD)≤10 M(如:≤5x10 M,≤2x10 M,≤10 M,≤5x10 M,≤2x10 M,≤10 M,
-9 -9 -9 -10
≤5x10 M,≤2x10 M,≤10 M,≤10 M)。本发明中的KD是指解离速度与结合速度的比值
(koff/kon),可通过本领域公知的方法测定(如:用Biacore或Kinexa方法)。
[0085] “被分离”的物质已经经人工由自然状态改变。如果自然界中出现某种“被分离”的物质或成分,那么其已经被改变或脱离其原始状态,或二者均有发生。例如,某一活体动
物体内天然存在的多核苷酸或多肽是未被分离的,但如果这些多核苷酸或多肽与之在天然
状态下共存的物质足够分离并以足够纯的状态存在,则可以认为是“被分离”。
[0086] 本发明中“载体”是指,可将编码某蛋白的多核苷酸操作性地插入其中并使该蛋白获得表达的一种运载工具。载体可用于转化、转导或转染宿主细胞,使其携带的遗传物质元
件在宿主细胞内得以表达。举例来说,载体包括:质粒、噬菌粒、柯斯质粒、人工染色体如酵
母人工染色体(YAC)、细菌人工染色体(BAC)或P1衍生的人工染色体(PAC)、噬菌体如λ
噬菌体或M13噬菌体,以及动物病毒等。用作载体的动物病毒种类有逆转录病毒(包括慢
病毒)、腺病毒、腺相关病毒、疱疹病毒(如单纯疱疹病毒)、痘病毒、杆状病毒、乳头瘤病毒、
乳头多瘤空泡病毒(如SV40)。载体可含有多种控制表达的元件,包括启动子序列、转录起
始序列、增强子序列、选择元件及报告基因。另外,载体还可含有复制起始位点。载体还可
包括协助其进入细胞的成分,包括但不限于,病毒颗粒、脂质体或蛋白外壳
[0087] 本发明中“宿主细胞”是指导入外源多核苷酸和/或载体的细胞。宿主细胞可选自多种细胞种类,如大肠杆菌或枯草菌等原核细胞,酵母细胞或曲霉菌等真菌细胞,S2果蝇
细胞或Sf9等昆虫细胞,或者动物细胞如纤维原细胞,CHO细胞,COS细胞,NSO细胞,HeLa
细胞,BHK细胞,HEK 293细胞,或人细胞。
[0088] 本发明中的“与ER或ERα36相关或有关联的疾病”是指,任何由于ER(如:ERα36)活性升高或降低而导致、加剧、或其他相关的状态。这些状态包括由细胞介导的癌
症,这些细胞的生长、繁殖或转移依赖于ER(如ERα36);骨骼疾病,例如骨流失、骨裂或骨
质疏松;和炎症状态,如类风湿性关节炎、皮癣、硬皮病、慢性阻塞性炎或哮喘。
[0089] 本发明中的“阻断结合”或“竞争性结合”的能力是指抗体或其抗原结合片段将两个分子间结合的相互作用抑制到任何可检测的程度的能力。在某些实施方式中,阻断两个
分子间结合的抗体或抗原结合片段可将两个分子间结合的相互作用抑制至少50%。在某些
实施方式中,这样的抑制作用可以大于60%,在某些实施方式中大于70%,在某些实施方
式中大于80%,在某些实施方式中大于90%。在某些实施方式中,被抑制的结合相互作用
可以是ScFv 1,ScFv 2,ScFv 3,ScFv 4,ScFv 5,ScFv 6,或ScFv 7与hER-α36的结合。
[0090] 本发明中的“治疗有效剂量”或“有效剂量”是指,某种药物有效治疗与hERα36相关疾病或状态的剂量或浓度。例如,对于本发明中公开的抗体或其抗原结合片段的用途来
说,治疗有效剂量是在该剂量或浓度下,该抗体或抗原结合物可以清除全部或部分肿瘤、抑
制或减缓肿瘤生长、抑制介导癌状态的细胞的生长或繁殖、抑制肿瘤细胞转移、减轻任何与
肿瘤或癌状态相关的症状或标记,预防或延缓肿瘤或癌状态的发展,或以上的某些组合。
[0091] “药用可接受的”是指所指的载剂、溶媒、稀释剂、辅料、和/或盐,总的来说在化学上和/或在物理上与制剂中的其他配料相兼容,并在生理上与接受者相兼容。
[0092] 本发明提供了抗hERα36的抗体及其抗原结合片段,其特征在于可特异性地结合SEQ ID NO:1中的第284~第310位氨基酸残基,和/或具有体内抗肿瘤活性。
[0093] 本发明公开了全长人单链抗体ScFv 1,ScFv 2,ScFv 3,ScFv 4,ScFv 5,ScFv 6,或ScFv 7,所有这些均特异性的结合hERα36(如hERα36的第284~第310位氨基酸残
基),均通过在噬菌体展scFv文库中用靶多肽筛选得到。该靶多肽的序列在SEQ ID NO:2
中列出,对应于SEQ ID NO:1中的第284~第310位氨基酸残基。
[0094] SEQ ID NO:1,SEQ ID NO:2和7种单链抗体的氨基酸序列在以下列出(衔接多肽加下划线,所有的CDR加框)。
[0095] SEQ ID NO:1的氨基酸序列:Met Ala Met Glu Ser Ala Lys Glu Thr Arg Tyr Cys Ala Val Cys Asn Asp Tyr Ala
Ser Gly Tyr His Tyr Gly Val Trp Ser Cys Glu Gly Cys Lys Ala Phe Phe Lys Arg Ser
Ile Gln Gly His Asn Asp Tyr Met Cys Pro Ala Thr Asn Gln Cys Thr Ile Asp Lys Asn
Arg Arg Lys Ser Cys Gln Ala Cys Arg Leu Arg Lys Cys Tyr Glu Val Gly Met Met Lys
Gly Gly Ile Arg Lys Asp Arg Arg Gly Gly Arg Met Leu Lys His Lys Arg Gln Arg Asp
Asp Gly Glu Gly Arg Gly Glu Val Gly Ser Ala Gly Asp Met Arg Ala Ala Asn Leu Trp
Pro Ser Pro Leu Met Ile Lys Arg Ser Lys Lys Asn Ser Leu Ala Leu Ser Leu Thr Ala
Asp Gln Met Val Ser Ala Leu Leu Asp Ala Glu Pro Pro Ile Leu Tyr Ser Glu Tyr Asp
Pro Thr Arg Pro Phe Ser Glu Ala Ser Met Met Gly Leu Leu Thr Asn Leu Ala Asp Arg
Glu Leu Val His Met Ile Asn Trp Ala Lys Arg Val Pro Gly Phe Val Asp Leu Thr Leu
His Asp Gln Val His Leu Leu Glu Cys Ala Trp Leu Glu Ile Leu Met Ile Gly Leu Val
Trp Arg Ser Met Glu His Pro Gly Lys Leu Leu Phe Ala Pro Asn Leu Leu Leu Asp Arg
Asn Gln Gly Lys Cys Val Glu Gly Met Val Glu Ile Phe Asp Met Leu Leu Ala Thr Ser
Ser Arg Phe Arg Met Met Asn Leu Gln Gly Glu Glu Phe Val Cys Leu Lys Ser Ile Leu
Leu Leu Asn Ser Gly Ile Ser His Val Glu Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asn Leu His Pro
Lys Ile Phe Gly Asn Lys Trp Phe Pro Arg Val
[0096] SEQ ID NO:2的氨基酸序列:Gly Ile Ser His Val Glu Ala Lys Lys Arg Ile Leu Asn Leu His Pro Lys Ile Phe
Gly Asn Lys Trp Phe Pro Arg Val
[0097] ScFv1的氨基酸序列(SEQ ID NO:3):
[0098] ScFv 2的氨基酸序列(SEQ ID NO:5):
[0099] ScFv 3的氨基酸序列(SEQ ID NO:7):
[0100] ScFv 4的氨基酸序列(SEQ ID NO:9):
[0101] ScFv 5的氨基酸序列(SEQ ID NO:11):
[0102] ScFv 6的氨基酸序列(SEQ ID NO:13):
[0103] ScFv 7的氨基酸序列(SEQ ID NO:15):
[0104] 编码七种单链抗体的核苷酸序列如下所列:
[0105] ScFv 1的核苷酸序列(SEQ ID NO:4):5‘-TCCTATGAGCTGACTCAGCCACCCTCGGTGTCAGTGGCCCCAGGAAAGACGGCCAGGATTACCT
GTGGGGGAAACAACATTGGAAGTAAAAGTGTGCACTGGTACCAGCAGAAGCCAGGCCAGGCCCC
TGTGCTGGTCGTCTATGATGATAGCGACCGGCCCTCAGGGATCCCTGAGCGATTCTCTGGCTCCAA
CTCTGGGAACACGGCCACCCTGACCATCAGCAGGGTCGAAGCCGGGGATGAGGCCGACTATTACT
GTCAGGTGTGGGATAGTAGTAGTGATCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTCACCGTCCTAG
GTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACCCA
GGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTTTCCTGTG
CAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGAAGGGCC
TGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTGAAGGGCC
GATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAAATGAACAGTCTGAGAGCT
GAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGTATCCGCGTATAGCAGCTCGTTTGACTACTGGGGC
CAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC-3’
[0106] ScFv 2的核苷酸序列(SEQ ID NO:6):5’-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCT
GCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCA
AAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGG
CTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTA
TTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTTTGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGACCGTCCT
AGGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACC
CAGGTGCAGCTGTTGGAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCCGGGGCCTCAGTGAAGGTTTCCT
GCAAGGCATCTGGATACACCTTCACCGCCTACTATATGCACTGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAG
GGCTTGAGTGGATGGCAATGATCGACCCCAGTGGTAGTATCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAG
GGCAGAGTCACCATGAGCAGGGACACGTCCACGAGCACACTCTACATGGAGCTGAGCAGCCTGA
GATCTGACGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGATCTGAAAGAGGGGTTTAGTGTCCCTGGG
GCTTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACTGTCTCTTCAGCTAGC-3’
[0107] ScFv 3的核苷酸序列(SEQ ID NO:8):5’-CAGTCTGTGTTGACGCACCCTGCCTCCGTGTCTGGGTCTCCTGGACAGTCGATCACCATCTCCT
GCACTGGAACCAGCAGTGACGTTGGTGGTTATAACTATGTCTCCTGGTACCAACAGCACCCAGGCA
AAGCCCCCAAACTCATGATTTATGATGTCAGTAAGCGGCCCTCAGGGGTTTCTAATCGCTTCTCTGG
CTCCAAGTCTGGCAACACGGCCTCCCTGACCATCTCTGGGCTCCAGGCTGAGGACGAGGCTGATTA
TTACTGCAGCTCATATACAAGCAGCAGCACTCTGGTATTCGGCGGAGGGACCAAGCTCACCGTCCT
AGGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTACC
GAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCGTGGCCCAGCCTGGGAGGTCCCTGAGACTCTCCTG
TGCAGCCTCTGGAATCACCTTCAATAGCTATGGCATGCACTGGGTCCGCCAGGCTCCAGGCAAGGG
GCTGGAGTGGGTGGCAGTTATGCCATATGATGGAAGTAATGAATACTATGCAGACTCCGTGAAGGG
CCGATTCACCATCTCCAGAGACAATTCCAAGAACACACTGTATCTGCAAATGAACAGCCTGAGAGC
TGAGGACACGGCTGTGTATTACTGTGCGAAAGGTTCCGGGATGGTTCAGCTATGGGCGGATGCTTT
TGATGTCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGC-3’
[0108] ScFv 4的核苷酸序列(SEQ ID NO:10):5’-CAGTCTGTGTTGACGCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGCAGAGGGTCACCATCTC
TTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGA
ACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTC
TGGCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTGCAGCATGGGATGACAGCCTGAATGGTCCGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGC
TGACCGTCCTAGGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCT
CGAGCGGTACCCAGGTCCAGCTGGTACAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGTCCTCGG
TGAAGGTCTCCTGCAAGGCTTCTGGAGGCACCTTCAGCAGCTATGCTACCAGCTGGGTGCGACA
GGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAGGGATCATCCCTACCTTTGGTACAGCAAACTAC
GCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACGATTACCGCGGACGAATCCACGAGCACAGCCTACATG
GAGCTGAGCAGCCTGAGATCTGAGGACACGGCCGTGTATTACTGTGCGAGAGAGGGTCTGGGCT
ACTTTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC-3’
[0109] ScFv 5的核苷酸序列(SEQ ID NO:12):5’-CAGTCTGCCCTGACTCAGCCACCCTCAGCGTCTGGGACCCCCGGGTAGAGGGTCACCGTCTC
TTGTTCTGGAAGCAGCTCCAACATCGGAAGTAATACTGTAAACTGGTACCAGCAGCTCCCAGGA
ACGGCCCCCAAACTCCTCATCTATAGTAATAATCAGCGGCCCTCAGGGGTCCCTGACCGATTCTC
TGCCTCCAAGTCTGGCACCTCAGCCTCCCTGGCCATCAGTGGGCTCCAGTCTGAGGATGAGGCT
GATTATTACTGTGCAGCATGGGATGATAGCCTGAATGGTCATGTGGTATTCGGCGGAGGGACCAA
GCTCACCGTCCTAGGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATC
CTCGAGCGGTACCCAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGCAGAGGTGAAAAAGCCCGGGGAGTC
TCTGAAGATCTCCTGTAAGGGTTCTGGATACAGCTTTACCAGCTACTGGATCGGCTGGGTGCGCC
AGATGCCCGGGAAAGGCCTGGAGTGGATGGGGATCATCTATCCTGGTGACTCTGATACCAGATAC
AGCCCGTCCTTCCAAGGCCAGGTCACCATCTCAGCCGACAAGTCCATCAGCACCGCCTACCTGC
AGTGGAGCAGCCTGAAGGCCTCGGACACCGCCATGTATTACTGTGCGAGCGGAATCTATGATGC
TTTTGATATCTGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC-3’
[0110] ScFv 6的核苷酸序列(SEQ ID NO:14):5’-GAAATTGTGATGACGCAGTCTCCCGGCACCCTGTCTTTGTCTCCAGGGGAGAGAGCCACCCT
CTCCTGCAGGGCCAGTCAGAGTGTTGACAGCAACTTCTTAGCCTGGTATCAGCAAAGACCTGGC
CAGGCTCCCCGGCTCCTCATCTATGGTGTATCCAGCAGCGCCACTGGCATCCCAGACAGGTTCAG
TGGCAGTGGGTCTGGGACAGACTTCACTCTCTCCATCGACAGACTGGAGCCTGAAGATTTTGCT
GTGTATTACTGTCAGCAATATGGTAGCTCACCCACTTTCGGCGGAGGGACCAAGCTGGAAATCAA
ACGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCTCGAGCGGTAC
CCAGGTGCAGCTGCAGGAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCCTGAGACTCTC
CTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAAGCTCCAGGGA
AGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGCGGACTCTGTG
AAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCACTGTATCTGCAAATGAACAGCC
TGAGAGCCGAGGACACGGCTGTTTATTACTGTGCGAGATCCGGTGACTACGGGGCTTTTGATATC
TGGGGCCAAGGGACAATGGTCACCGTCTCCTCAGCTAGC-3’
[0111] ScFv 7的核苷酸序列(SEQ ID NO:16):5’-CAGTCTGTGCTGACGCAGCCGCCCTCAGTGTCTGCGGCCCCAGGACAGAAGGTCACCATCTC
CTGCTCTGGAAGCAGCTCCAACATTGGGAATAATTATGTATCCTGGTACCAGCAGCTCCCAGGAA
CAGCCCCCAAACTCCTCATTTATGACAATAATAAGCGACCCTCAGGGATTCCTGACCGATTCTCT
GGCTCCAAGTCTGGCACGTCAGCCACCCTGGGCATCACCGGACTCCAGACTGGGGACGAGGCC
GATTATTACTGCGGAACATGGGATAGCAGCCTGAGTGCTGGGGTGTTCGGCGGAGGGACCAAGC
TGACCGTCCTAGGTTCCGGAGGGTCGACCATAACTTCGTATAATGTATACTATACGAAGTTATCCT
CGAGCGGTACCGAGGTGCAGCTGGTACAGTCTGGGGGAGGCTTGGTACAGCCTGGCAGGTCCC
TGAGACTCTCCTGTGCAGCCTCTGGATTCACCTTTGATGATTATGCCATGCACTGGGTCCGGCAA
GCTCCAGGGAAGGGCCTGGAGTGGGTCTCAGGTATTAGTTGGAATAGTGGTAGCATAGGCTATGC
GGACTCTGTGAAGGGCCGATTCACCATCTCCAGAGACAACGCCAAGAACTCCCTGTATCTGCAA
ATGAACAGTCTGAGAGCTGAGGACACGGCCTTGTATTACTGTGCAAAAGAGGGAGATAGCAGTG
GCTGGTCCCCTGACTACTGGGGCCAGGGAACCCTGGTCACCGTCTCTTCAGCTAGC-3’
[0112] 表1列出了七种单链抗体的重链和轻链可变区的序列。重链和轻链的CDR区序列在表2和表3种列出。详细地说,ScFv1的轻链可变区在SEQ ID NO:59中列出,ScFv1的
重链可变区在SEQ ID NO:60中列出。ScFv1轻链可变区如SEQ ID NO:59所示,含有位于
SEQ ID NO:59的第23~33位残基的轻链CDR1(ScFv1 LCDR1,SEQ ID NO:17),位于SEQ ID
NO:59的第49~55位的轻链CDR2(ScFv1 LCDR2,SEQ ID NO:18),以及位于SEQ ID NO:59
的第88~98位的轻链CDR3(ScFv1 LCDR3,SEQ ID NO:19)。ScFv1重链可变区如SEQ ID
NO:60所示,含有位于SEQ ID NO:60的第31~35位残基的重链CDR1(ScFv1 HCDR1,SEQ
ID NO:20),位于SEQ ID NO:60的第50~66位的轻链CDR2(ScFv1 HCDR2,SEQ ID NO:21),
以及位于SEQ ID NO:60的第99~108位的轻链CDR3(ScFv1 HCDR3,SEQ ID NO:22)。
表1
表2
表3
[0113] 本发明中公开的七种ScFv的CDR区,轻链区和重链区可通过本领域公知的方法移接至其他框架区域或恒定区,从而形成骆驼化单域抗体(camelized single domain
antibody)、双功能抗体(diabody)、scFv二聚体、BsFv、dsFv、(dsFv)2、dsFv-dsFv′、Fv片
段、Fab、Fab′、a F(ab′)2、ds双功能抗体(ds diabody)、纳米抗体、域抗体、双价域抗体、
或完整抗体。本发明中公开的抗体可以是单克隆抗体、重组抗体、双特异性抗体、人源化抗
体、嵌合抗体、标记抗体、双价抗体、抗独特型抗体、或完全人抗体。
[0114] 通过对七种公开的ScFv的CDR区或FR区随机突变,并进行随后的结合和功能实验,可产生有增强性质的(如:更高亲和力)抗体或其抗原结合片段。因此,在某些实施方
式中,本发明中提供的抗体和抗原结合片段含有七种公开的ScFv的一种或多种CDR序列,
其中所述一种或多种CDR序列含有一种或多种氨基酸替换,增加或删减。通过这种方式得
到的抗体或其抗原结合片段可通过筛选与ERα36的结合性质从而识别有更好结合性质的
抗体。有更好结合性质的抗体可以通过一种或多种功能性实验确定活性,如抑制癌细胞体
外生长或增殖活性或抑制肿瘤体内生长的活性。
[0115] 抗体和抗原结合物的使用方法
[0116] 本发明中提供的抗体和抗原结合物可在体内抑制肿瘤生长。因此,所述抗体和抗原结合片段可用于治疗多种与ERα36相关的状态或疾病。
[0117] 在某些实施方式中,本发明提供了预防和/或治疗与ERα36相关的疾病的方法,包括对对象使用治疗有效剂量的含有所提供的抗体或抗原结合物的药物组合物。与ERα36
相关的疾病实例包括,但不限于,骨丢失、骨折、骨质疏松、转移性骨病、帕哲氏病、牙周病
软骨退变、子宫内膜异位、子宫肌瘤、热潮红、LDL胆固醇平升高、心血管疾病、认知功能
损伤、大脑退行性疾病、术后再狭窄、男子女性型乳房、管道平滑肌细胞增殖、肥胖、失禁、焦
虑、雌激素受体导致的抑郁、更年期抑郁、产后抑郁、经前综合征、躁狂忧郁、焦虑、痴呆、强
迫症、注意力缺陷障碍、睡眠障碍、激惹、冲动、免疫缺失、自身免疫性疾病、愤怒管理、多发
性硬化症和帕金森(氏)病、炎症、炎症状态、炎性肠病、呼吸系统疾病、性功能障碍、高血
压、视网膜变性、哮喘和癌状态。优选地,与ERα36相关的疾病实例包括,骨丢失、骨折、骨
质疏松、绝经、经前综合征、子宫内膜异位、子宫疾病、阳痿、性功能障碍、LDL胆固醇水平升
高、心血管疾病、管道平滑肌增殖、雌激素受体导致的抑郁、更年期抑郁、产后抑郁、免疫缺
失、自身免疫性疾病、炎症、炎症状态、哮喘和癌状态。更优选地,与ERα36相关的疾病实例
包括,骨丢失、子宫内膜异位、阳痿、心血管疾病、动脉粥样硬化、免疫缺失、炎症、炎症状态、
哮喘和癌状态。本发明中的炎症状态包括类风湿性关节炎、牛皮藓、硬皮病、慢性阻塞性肺
病,以及哮喘。所述对象可以是哺乳动物如狗、猫、牛、羊、或人,优选为人。所述方法所需
的治疗剂量可根据具体疾病而有所变化,本领域普通技术人员根据本发明公开内容即可确
定。
[0118] 在某些实施方式中,本发明提供了在某对象中预防和/或治疗癌状态的方法,包括对所述对象使用含有所提供的抗体或抗原结合物的药物组合物。可以使用本发明提供的
抗体或其抗原结合片段进行治疗的癌状态和肿瘤种类包括但不限于,恶性肿瘤、胚细胞瘤、
肉瘤、生殖细胞瘤、或者血液或淋巴的恶性肿瘤,例如:白血病、淋巴瘤、或多骨髓瘤。更具
体地,可以使用本发明提供的抗体或其抗原结合片段治疗的癌状态和肿瘤种类包括但不限
于,鳞状细胞癌、肺癌(如,小细胞肺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺部腺癌、或肺部鳞状细胞
癌)、腹膜癌、肝癌(如肝细胞瘤)、胃癌(如胃肠癌)、胰腺癌、脑癌(如,胶质母细胞脑瘤
/多形性胶质母细胞瘤(GBM)、非胶质母细胞脑瘤、或脑膜瘤),神经胶质瘤(如,室鼓膜瘤、
星细胞瘤、间变型星形细胞瘤、少突胶质细胞瘤、或混合型胶质瘤如星形细胞混合瘤)、宫颈
癌、子宫癌、肝癌(如,肝母细胞瘤、肝细胞瘤或肝癌)、膀胱癌(如,尿路上皮癌)、乳癌、结
肠癌、肠癌、直肠癌、子宫内膜或宫颈癌、涎腺癌、肾癌(如:肾横纹肌样瘤)、前列腺癌、外
阴癌、阴茎癌、肛癌(如,肛管鳞状细胞癌)、甲状腺癌、头颈部癌(如,鼻咽癌)、皮肤
(如,黑素癌或鳞状细胞癌)、类癌、眼癌(如:视网膜母细胞瘤)、间皮瘤、淋巴细胞白血病
(如,T细胞和B细胞前体谱系的急性淋巴细胞白血病(ALL)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、
急性髓细胞性白血病(AML)、包括肥大细胞白血病、慢性髓细胞性白血病(CML)、毛细胞白
血病(HCL)、霍奇金淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、慢性粒单核细胞白血病(CMML)、滤泡性淋巴
瘤(FL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLCL)、套细胞淋巴瘤(MCL)、淋巴瘤(BL)、蕈样肉芽肿、
Sezary综合征,皮肤T细胞淋巴瘤、肥大细胞瘤、髓母细胞瘤、肾母细胞瘤、孤立性浆细胞
瘤、骨髓异常增生综合征、慢性和非慢性骨髓增生异常、中枢神经系统瘤、脑垂体瘤、前庭神
经鞘瘤、神经外胚层肿瘤、室管膜瘤、脉络丛乳头状瘤、真性红细胞增多症、血小板增多症、
原发性骨髓纤维化症,以及儿童癌,如,小儿肉瘤(如:神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤以及骨肉
瘤)。此外,肿瘤可以是恶性的(如:癌症)或者是良性的(如:增生、囊肿、拟孢囊、错构瘤
和良性肿瘤)。
[0119] 在某些实施方式中,本发明中公开的抗体和抗原结合片段为ERα36调控剂,可用于在体外和在体内调控细胞的ERα36活性。在某些实施方式中,本发明公开的抗体和抗原
结合片段可到引起细胞死亡和/或细胞增殖。
[0120] 在某些实施方式,细胞中调控ERα36功能的方法包括将表达ERα36的细胞与本发明公开的抗体和其抗原结合物片段相接触。所述细胞可内源表达ERα36,或通过基因工
程外源表达ERα36。在一种实施方式中,所述细胞内源表达ERα36。在一优选的实施方式
中,所述细胞为内源表达ERα36的癌细胞。表达ERα36的癌细胞实例有,乳腺癌细胞、白血
病细胞、肺癌细胞、骨髓瘤细胞,前列腺癌细胞、卵巢癌细胞、直肠癌细胞、和胃癌细胞。在一
更优选的实施方式中,所述细胞为内源表达ERα36的乳腺癌细胞。表达ERα36的乳腺癌细
胞实例有MCF7和MDA-MB-231细胞。通过用一种或多种物质进行处理,可使内源的ERα36
的表达升高或降低。所述的物质的实例有血清、E2(17-雌二醇)、他莫昔芬和ICI182,780。
[0121] 在另一实施方式中,所述细胞通过基因工程表达外源的ERα36。表达外源ERα36的细胞可通过本领域公知的基因工程方法制得(见Sambrook等,Molecular Cloning,
A Laboratory Manual(2d Ed.1989)(Cold Spring Harbor Laboratory))。简要的说,外
源的ERα36制备并插入到表达载体中,转入宿主细胞,在适宜于表达外源ERα36的培养
液中生长。人ERα36的基因序列实例已经公开在Wang et al.,Biochem.Biophys.Res.
Commun.336,1023-1027(2005)(GenBank登陆号BX640939)。表达外源ERα36的细胞可以
表达或不表达内源ERα36。通过用一种或多种其他物质进行处理,可使所述细胞中的内源
和外源ERα36的表达水平升高或降低。所述的物质的实例有血清、E2(17-雌二醇)、他莫
昔芬和ICI182,780。表达ERα36的细胞可以表达或不表达其他雌激素受体如ER-α66、
ER-α46和ER-β。
[0122] 本发明公开的抗体和抗原结合片段可单独给药或与一种或多种其他治疗手段或物质联合给药。例如,本发明公开的抗体和抗原结合片段可与化疗、放疗、癌症治疗手术
(如肿瘤切除术)、一种或多种抗呕吐药或其他化疗导致的并发症的疗法、或任何其他用于
癌症的治疗物质或任何由ERα36介导的病症的治疗物质进行联用。在某些这样的实施方
式中,本发明公开的抗体和抗原结合片段与一种或多种治疗物质联用时,可与所述的一种
或多种治疗物质同时给药,在某些这样的实施方式中,所述的抗体和抗原结合片段可作为
同一个药物组合物的一部分同时给药。但是,与其他治疗物质“联用”的抗体和抗原结合物
不需要同时给药或与该治疗物质在同一组合物中给药。本发明中“联用”的含义还包括在
另一个治疗物质之前或之后给药的抗体和抗原结合物也被认为是与该治疗物质“联用”,即
使所述抗体或其抗原结合片段与第二种物质通过不同给药方式给药。在可能的情况下,与
本发明公开的抗体或其抗原结合片段联用的其他治疗物质可参照该其他治疗物质的产品
说明书的方法用药,或参照外科医生的案头参考书2003(Physicians′Desk Reference,
57th Ed;Medical Economics Company;ISBN:1563634457;第57版(2002年11月)),或
参照其他本领域公知的方法。治疗物质的实例包括,但不限于,淫羊藿、他莫昔芬、17β-雌
激素,ICI 182,780,2007年10月23日申请的美国专利申请11/877,575中公开的化合物,
以参考文献的形式并入本发明;2008年4月8日申请的美国专利申请60/046,255,以参考
文献的形式并入本发明;细胞因子、抗VEGF抗体(例如,贝伐单抗或阿瓦斯汀)、抗HER2抗
体(例如:赫赛汀或曲妥珠单抗),以及抗EGFR抗体(尼妥珠单抗(Nimotuzamab)或西妥
昔(Erbitux))、酪氨酸受体抑制剂(例如Gapatinib,拉帕替尼)。
[0123] 细胞因子的实例包括但不限于淋巴细胞因子、单核因子、人生长激素、牛生长激素、甲状旁腺激素、甲状腺素、胰岛素、胰岛素原、耻骨松弛激素、耻骨松弛激素原、卵泡刺
激素、促甲状腺素、黄体生成素、肝生长因子、纤维原生长因子、泌乳刺激素、胎盘催乳激
素、肿瘤坏死因子、缪勒(氏)管抑制物质、小鼠促性腺激素相关肽、抑制素、活化素、整
联蛋白、促血小板生成素、神经生长因子、如NGF-β、血小板生长因子、转化生长因子、如:
TGF-α和TGF-β、胰岛素样生长因子I和II、促红细胞生成素、成骨因子、干扰素、如:干
扰素-α、-β、和-γ;集落刺激因子、如:巨噬细胞-CSF、粒细胞巨噬细胞CSF、和粒细
胞-CSF、白介素、如:IL-1、IL-1α、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、
IL-11、以及IL-12、肿瘤坏死因子,如:TNF-α和TNF-β,以及其他多肽因子。
[0124] 在某些实施方式中,本发明公布的抗体或其抗原结合片段可通过与一种或多种化疗物质相连或联用的方法使用。化疗物质的实例包括,但不限于,氨柔比星,阿曲生坦、
骨化三醇、西仑吉肽、达沙替尼、德卡坦尼(decatanib)、伊多特卡林(edotecarin)、恩扎
妥林(enzastaurin)、盐酸厄洛替尼片、依维莫司、吉马替康、酚伊匹里单抗(gossypol
ipilimumab)、洛那法尼(lonafarnib)、硫蒽、纽莱迪(neuradiab)、诺拉曲特、奥利默
森(oblimersen)、欧法图穆单抗(ofatumumab)、欧格沃单抗(oregovomab)、帕尼单抗、
帕佐泮尼(pazopanibrubitecan)、他仑帕奈、特穆斯洛利(temsirolimus)、特斯密利
(tesmilifene)、汉防已硷、提斯利姆单抗(ticilimumab)、特拉倍特定(trabectedin)、凡
德他尼、维特斯潘(vitespan)、扎诺利姆单抗(zanolimumab)、唑仑二膦酸盐、组氨瑞林、阿
扎胞苷、右雷佐生、阿仑单抗、来那度胺、吉姆单抗、酮康唑、氮芥、替伊莫单抗、地西他滨、
六甲基嘧胺、贝沙罗汀、托西莫单抗、三氧化二砷、伊地托奈特(editronate)、环孢霉素、
Edwina-天门冬酰胺酶、以及锶89。
[0125] 可以设想,本发明中的抗体或其抗原结合片段可与多种结合物连接(见,例如, ″ Conjugate Vaccines ″,Contributions to Microbiology and Immunology,
J.M.Cruse and R.E.Lewis,Jr.(eds.),Carger Press,New York,(1989))。这些结合物可
以通过共价结合、亲和结合、嵌入、同等结合(coordinate binding)、络合、结合、混合或加
入等其他方式与所述抗体或抗原结合物连接。在某些实施方式中,本发明公开的抗体和抗
原结合片段可以通过工程的方法使其含有表位结合部分以外的特定位点,这些位点可用来
结合一种或多种结合物。例如,这样的位点可包含一种或多种反应性氨基酸残基,例如半胱
氨酸残基、组氨酸残基,用于协助与结合物的共价连接。在某些实施方式中,抗体可间接连
于结合物,或通过另一个结合物相连。例如,所述抗体或其抗原结合片段可结合生物素,然
后间接结合第二个结合物,其与亲和素相连。
[0126] 在某些实施方式中,与本发明公开的抗体或其抗原结合片段相连的结合物可包括一种或多种物质,其旨在改变所述抗体或其抗原结合片段的一种或多种代谢性质,例如聚
乙二醇(PEG)可增加所述抗体或抗原片段的半衰期或降低其免疫源性。
[0127] 在某些实施方式中,与本发明公开的抗体或其抗原结合片段相连的结合物可含有123 124 125 131 35
一种或多种可检测的标记。所述标记包括,但不限于,放射性同位素如 I、 I、I、 I、S、
3 111 112 14 64 67 86 88 90 177 211 186 188 153 212 32
H、 In、In、C、Cu、Cu、Y、Y、Y、 Lu、At、 Re、Re、 Sm、Bi、和 P、其他镧系元
素、化学发光标记物、荧光标记物例如:荧光素、罗丹明、丹黄酰(dansyl)、藻红素、或得克
萨斯红(Texas Red),以及酶-底物标记物例如辣根过氧化物酶、性磷酸酶、或β-D-半乳
糖苷酶。
[0128] 在某些实施方式中,本发明公开的抗体或其抗原结合片段可作为药物组合物的一部分给药,该药物组合物含有一种或多种药用可接受载剂。用在本发明公开的药物组合物
中的药用可接受载剂可包括,例如,药用可接受的液体、凝胶、或固体载剂、水相介质、非水
相介质、抗微生物物质、等渗物质、缓冲液、抗氧剂、麻醉剂、悬浮剂/分散剂、螯合剂、稀释
剂、佐剂、辅料、或无毒辅助物质,其他本领域公知的组分、或以上的多种组合。
[0129] 适用的组分可包括,例如,抗氧剂、填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲液、防腐剂、润滑剂、搅味剂、增稠剂着色剂或乳化剂。
[0130] 适用的抗氧剂可包括,例如,甲硫氨酸、抗坏血酸、EDTA、硫代硫酸钠、铂、过氧化氢酶、柠檬酸、半胱氨酸、巯基甘油、巯基乙酸、巯基山梨醇、丁基甲基茴香醚、丁基化羟基甲
苯、和/或没食子酸丙酯。如本发明所公开,在一种含有本发明公开的抗体或其抗原结合片
段的组合物中包括一种或多种抗氧剂如甲硫氨酸,可将降低所述抗体或其抗原结合片段的
氧化。对氧化作用的减少可防止或减少结合亲和力的降低,从而提高抗体稳定性并延长保
质期。因此,在某些实施方式中,本发明提供的组合物中含有一种或多种所述的抗体或其抗
原结合片段以及一种或多种抗氧剂例如甲硫氨酸。本发明进一步提供了多种方法,通过将
本发明中提供的抗体或其抗原结合片段与一种或多种抗氧剂混合,例如甲硫氨酸,可防止
所述抗体或其抗原结合片段氧化、延长其保质期、和/或提高其活性。
[0131] 进一步的说,药用可接受的载剂可包括,例如,水相介质如氯化钠注射液,林格氏液注射液,等渗葡萄糖注射液,无菌水注射液,或葡萄糖和乳酸林格注射液,非水介质例如:
植物来源的不挥发性油,棉花子油,玉米油,芝麻油,或者花生油,细菌抑制或真菌抑制浓
度下的抗菌物质,等渗剂如:氯化钠或葡萄糖,缓冲液如:磷酸盐或枸橼酸酸盐缓冲液,抗
氧化剂如:硫酸氢钠,局部麻醉剂如:盐酸普鲁卡因,助悬剂和分散剂如:羧甲基纤维素钠、
羟丙基甲基纤维素、或聚乙烯吡咯烷酮,乳化剂如:聚山梨醇酯80(吐温-80)、螯合试剂如
EDTA(乙二胺四乙酸)或EGTA(乙二醇双(2-氨基乙基醚)四乙酸),乙醇、聚乙二醇、丙二
醇、氢氧化钠、盐酸、柠檬酸、或乳酸。作为载剂的抗菌剂可加入多次剂量容器中的药物组合
物中,其包括酚类或甲酚,汞制剂,苯甲醇,氯代丁醇,甲基和丙基对羟基苯甲酸酯、噻汞撒、
氯苯甲烷铵和氯苯乙铵。适用的辅料可包括,例如,水、盐、葡萄糖、甘油、或乙醇。适用的无
毒辅助物质可包括,例如,乳化剂、pH值缓冲剂、稳定剂、增溶剂,或者醋酸钠、去水山梨糖醇
月桂酸酯、三乙醇胺油酸酯、或者环糊精之类的物质。
[0132] 本发明中提供的抗体或其抗原结合片段的治疗有效剂量依赖于本领域公知的多种因素,例如体重、年龄、过往病史、现用治疗、对象的健康状况、和交叉感染的潜力、过敏、
超敏、和副作用,以及给药途径和肿瘤发展的程度。本领域熟练人员可根据这些或其它条件
或要求按比例降低或升高剂量。
[0133] 在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段可在治疗有效剂量约0.01mg/kg到约100mg/kg之间给药(例如,约0.01mg/kg,约0.5mg/kg,约1mg/kg,约2mg/
kg,约5mg/kg,约10mg/kg,约15mg/kg,约20mg/kg,约25mg/kg,约30mg/kg,约35mg/kg,约
40mg/kg,约45mg/kg,约50mg/kg,约55mg/kg,约60mg/kg,约65mg/kg,约70mg/kg,约75mg/
kg,约80mg/kg,约85mg/kg,约90mg/kg,约95mg/kg,或约100mg/kg)。在某些实施方式中,
所述抗体或其抗原结合片段以约50mg/kg或更少的剂量给药,在某些实施方式中,给药剂
量为10mg/kg或更少,5mg/kg或更少,1mg/kg或更少,0.5mg/kg或更少,或0.1mg/kg或更
少。某特定剂量可在多个间隔给药,例如每天一次、每天两次或更多、每月两次或更多、每周
一次、每两周一次、每三周一次、每月一次、或每两月或更多月一次。在某些实施方式中,给
药剂量可随治疗进程变化。例如,在某些实施方式中,初始给药剂量可比后续给药剂量高。
在某些实施方式中,给药剂量在治疗进程中根据给药对象的反应进行调整。
[0134] 给药方案可通过调整达到最优反应(如治疗反应)。例如,可进行单剂量给药或在一段时间分多个分隔的剂量给药。
[0135] 本发明中公开的抗体和抗原结合片段可通过本领域公知的给药方式给药,例如注射给药或非注射给药,(如,皮下注射、腹腔注射、静脉注射,包括静脉滴注,肌肉注射、或皮
内注射)或非注射给药(如,口服给药、鼻腔给药、舌下给药、直肠给药、或外用给药)。在所
述抗体或其抗原结合片段以注射方式给药的实施方式中,可注射的药物组合物可以任何常
规的形式制备,例如,液体溶剂、悬浮剂、乳化剂、或适用于产生液体溶剂、悬浮剂或乳化剂
的固体形式。注射制剂可包括现用的无菌和/或无热原溶液、使用前现与溶剂结合的无菌
干燥的可溶物,如冻干粉,包括皮下片、注射即用的无菌悬浮剂、使用前现与介质结合的无
菌干燥不溶产品,和无菌和/或无热原的乳剂。溶剂可以为水相或非水相。
[0136] 在某些实施方式中,单位剂量的注射制剂包装在一个安瓿、一支管或一支带有针的针筒中。本领域习知,所有注射给药的制剂应为无菌无热原。
[0137] 在某些实施方式中,通过将本发明公开的抗体或其抗原结合片段溶解于某适当的溶剂中可制备无菌冻干的粉末。所述溶剂可含有一种可提高粉或由粉末制得的重组溶液的
稳定性,或改善粉末或重组溶液的其他药理组分。适用的辅料包括,但不限于,水、葡萄糖、
三梨糖醇、果糖、玉米糖浆、木糖醇、甘油、葡萄糖、蔗糖或其他适用的物质。溶剂可含有缓冲
液,如枸橼酸缓冲液、磷酸钠或磷酸缓冲液或其他本技术熟练人员公知的缓冲液,在一种
实施方式中,缓冲液的pH为中性。在本领域公知的标准条件下进行对所述溶解进行随后
的过滤除菌,然后冻干制得理想的制剂。在一种实施方式中,将所得的溶剂分装至小管中
冻干。每支小管可容纳单次剂量或多次剂量的所述抗hER抗体或其抗原结合片段或其组合
物。每支小管中的装入量可略微高于每次剂量所需或多次剂量所需(例如10%过量),从
而保证取样精确和给药精确。冻干粉可在适当的条件下储存,如在约4℃到室温范围。
[0138] 用注射用水将冻干粉重溶得到用于注射给药的制剂。在一种实施方式中,可将冻干粉加至无菌无热原水或其他适用的液体载剂中重溶。精确的量由选择的疗法决定,可根
据经验值决定。
[0139] 本发明中提供的抗体和抗原结台片段可以在多种非治疗用途中使用。在某些实施方式中,抗体或其抗原结合片段可作为亲和纯化剂用于纯化ERα36或其片段。在这些实施
方式中,可通过本领域公知的方法,将抗体或其抗原结合片段固定在固相上,如树脂滤纸
上。所述抗体和抗原结合片段也可用于从溶液中沉降ERα36或其片段。在其他非治疗的
实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段可用于多种体外或体内诊断或检测用途。在某些
这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段可与可检测的标记物结合。在其他实施方
式中,所述抗体或其抗原结合片段可以不与可检测的标记物结合,但可以用某个可与所述
抗体结合的带标记的二抗检测。在某些实施方式中,本发明提供的抗体或其抗原结合片段
可用于检测ERα36的表达。在某些这样的实施方式中,所述抗体或其抗原结合片段可用于
诊断与ERα36活性增强或减弱相关的状态。例如,所述抗体或其抗原结合片段可与某对象
的生物样品接触,从而诊断该对象中与ERα36活性增强或减弱相关的状态,具体的说,与
ERα36相关的状态的进行或退行。同样地,所述抗体或其抗原结合片段可直接给药于所述
对象,并用本领域公知的方法检测与ERα36的结合。
[0140] 在某些实施方式中,本发明提供了被分离的编码所述抗体或其抗原结合片段的核苷酸,含有所述核苷酸的载体和宿主细胞,和制备所述抗体的重组方法。
[0141] 对于所述抗体的重组生产,编码该抗体的核苷酸可被分离并插入可复制的载体中进行进一步克隆(DNA扩增)或进行表达。在另一实施方式中,所述抗体可通过本领域公知
的同源重组的方法制得。编码所述单克隆抗体的DNA可以通过常规的方法分离和测序(如
可以使用寡核苷酸探针,该探针可特异性与编码所述抗体的重链和轻链的基因结合)。多种
载体可供选择。载体组分通常包括,但不限于,以下的一种或多种:信号序列、复制起始点、
一种或多种标记基因、增强序列、启动子和转录终止序列。
[0142] 本发明中适用于克隆或表达所述载体中的DNA的宿主细胞为原核细胞、酵母、或上述高级真核细胞。适用于本发明用途的原核细胞包括真细菌如,革兰氏阴性菌或革兰氏
阳性菌,例如,肠杆菌科,如,大肠杆菌,肠杆菌属,欧文氏菌属,克雷白氏杆菌属,变形杆菌
属,沙门氏菌属,如,鼠伤寒沙门(氏)杆菌,沙雷氏菌属,如,粘质沙雷氏菌,以及志贺氏菌
属,及杆菌属如,枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌,假单胞菌如,绿脓杆菌和链霉菌。
[0143] 除了原核细胞以外,真核微生物如丝状真菌或酵母也可作宿主细胞克隆或表达编码抗ER抗体的载体。酿酒酵母,或面包酵母是最常用的低等真核宿主微生物。但是,许多其
他属、种和株都比较常用且在本发明中适用,如粟酒裂殖酵母;克鲁维酵母属宿主如,乳酸
克鲁维酵母,脆壁克鲁维酵母(ATCC 12,424),保加利亚克鲁维酵母(ATCC 16,045),魏氏
克鲁维酵母(ATCC 24,178),克鲁雄酵母(ATCC 56,500),果蝇克鲁维酵母(ATCC 36,906),
耐热克鲁维酵母和马克斯克鲁维酵母;解脂耶氏酵母(EP 402,226);巴斯德毕赤酵母(EP
183,070);假丝酵母;里氏木霉(EP 244,234);链孢霉;西方许旺酵母,如:西方许旺酵母;
和丝状真菌,如:脉孢菌,青霉菌,弯颈霉,和曲霉菌,如:钩巢曲霉和黑曲霉。
[0144] 本发明中提供的适用于表达糖基化抗体或其抗原结合片段的宿主细胞由多细胞生物衍生得到。无脊椎细胞的实例包括植物和昆虫细胞。已发现多种杆状病毒株
(baculoviral strains)及其变体以及对应的许可性昆虫宿主细胞(permissive insect
host cells),来自于诸如以下的宿主:草地夜蛾(毛虫)、埃及斑蚊(蚊子)、白纹伊蚊(蚊
子)、黑腹果蝇(果蝇),及家蚕。多种用于转染的病毒株为公众可得,例如苜蓿纹夜蛾核
型多体病毒和家蚕核型多角体病毒的Bm-5变种,这些病毒都可在本发明中使用,特别是
用于转染草地夜蛾细胞。棉花、玉米、土豆、大豆、矮牵牛花、西红柿、和烟草的植物细胞培养
也可用作宿主。
[0145] 但是,脊椎细胞的研究最热,且脊椎细胞的培养(组织培养)已经成为常规操作。可用的哺乳动物宿主细胞实例有,SV40转化的猴肾细胞CV1系(COS-7,ATCC CRL 1651);
人胚胎肾细胞系(293或悬浮培养的293细胞亚克隆,Graham et al.,J.Gen Virol.36:
59(1977));幼地鼠肾细胞(BHK,ATCC CCL 10);中国仓鼠卵巢细胞/-DHFR(CHO,Urlaub et
al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77:4216(1980));小鼠睾丸支持细胞(TM4,Mather,Biol.
Reprod.23:243-251(1980));猴肾细胞(CV1 ATCC CCL70);非洲绿猴肾细胞(VERO-76,
ATCC CRL-1587);人宫颈癌细胞(HELA,ATCC CCL2);犬肾细胞(MDCK,ATCC CCL34);布法罗
大鼠肝细胞(BRL3A,ATCC CRL 1442);人肺细胞(W138,ATCC CCL75);人肝细胞(Hep G2,
HB 8065);小鼠乳腺瘤(MMT 060562,ATCC CCL51);TRI细胞(Mather等,Annals N.Y.Acad.
Sci.383:44-68(1982));MRC 5细胞;FS4细胞;及人肝癌细胞系(Hep G2)。
[0146] 用上述的可产生抗ER抗体的表达或克隆载体转化宿主细胞,并将其在常规的营养培养基中培养,所述营养培养基经修饰后适宜于诱导启动子、选择转化细胞或扩增编码
目的序列的基因。
[0147] 本发明中用于产生所述抗体或其抗原结合片段的宿主细胞可在多种培养基中培养。市售的培养基如Ham′s F10(Sigma)、最低基本培液(MEM,(Sigma))、
RPMI-1640(Sigma),及Dulbecco′s Modified Eagle′s Medium((DMEM),Sigma)可用于培
养所述宿主细胞。另外,任何在Ham et al.,Meth.Enz.58:44(1979),Barnes et al.,Anal.
Biochem.102:255(1980),U.S.Pat.No.4,767,704;4,657,866;4,927,762;4,560,655;or
5,122,469;WO 90/03430;WO 87/00195;或美国专利申请Re.30,985中说明的培养基都可
以用作所述宿主细胞的培养基。这些培养基都可添加必要的激素和/或其他生长因子(如
胰岛素、转蛋白、或表皮生长因子)、盐类(如氯化钠、氯化、氯化镁和磷酸盐)、缓冲液
(如HEPES)、核苷酸(如腺苷酸和胸腺嘧啶)、抗生素(如庆大霉素)、微量元素(定义为终
浓度通常在微摩尔范围无机化合物),和葡萄糖或与之等同的能量源。所述培养基还可含有
本领域公知的适当浓度的任何其他必要的添加剂。所述培养基的条件,如温度、pH值等类
似条件,为选择用于表达的宿主细胞此前所使用的条件,为普通技术人员所熟知。
[0148] 在使用重组技术时,所述抗体可在胞内、壁膜空间生成,或直接分泌到培养基中。如果所述抗体在胞内生成,首先除去宿主细胞或裂解片断的颗粒残骸,例如,可通过离心或
超声的方法。Carter et al.,Bio/Technology 10:163-167(1992)描述了将分泌到大肠杆
菌壁膜空间的抗体分离的方法。简要地说,在醋酸钠(pH 3.5)、EDTA和苯甲磺酰氟(PMSF)
存在的条件下化开细胞糊(cell paste)约30分钟以上。离心除去细胞碎片。如所述抗体分
泌到培养基中,则通常首先使用市售的蛋白浓度过滤器,如Amicon或Millipore Pellicon
ultrafiltration unit,浓缩该表达系统的上清液。在任何前述的步骤中都可加入蛋白酶
抑制剂如PMSF以抑制蛋白降解,以及抗生素以防止偶然污染物的生长。
[0149] 从所述细胞中制得的抗体可采用纯化方法进行纯化,例如羟磷灰石色谱、凝胶电泳、透析以及亲和色谱,其中亲台色谱为优选的纯化技术。所述抗体的种类以及所述抗体中
存在任何免疫球蛋白的Fc结构域决定了蛋白A作为亲和配体是否适合。蛋白A可用于纯化
基于人γ1,γ2或γ4重链的抗体(Lindmark et al.,J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。
蛋白G适用于所有鼠源异构体和人γ3(Guss et al.,EMBO J.5:1567 1575(1986))。琼脂
糖是最常用的亲和配体附着基质,但也可选用其他基质。机械力稳定的基质如可控孔度玻
璃或聚(苯乙烯)苯与用琼脂糖相比可实现更快的流速和更短的处理时间。如该抗体含
有C.sub.H3结构域,则可用Bakerbond ABX.TM树脂进行纯化(J.T Baker,Phillipsburg,
N.J.)。也可根据需要获得的抗体确定其他蛋白纯化的技术,如离子交换柱中的分馏、乙醇
沉淀、反相HPLC、胶色谱、基于阴离子或阳离子交换树脂的肝素琼脂糖凝胶色谱(如聚天
冬氨酸柱)、层析聚焦、SDS-PAGE、以及硫酸铵沉淀。
[0150] 在任意初步纯化步骤之后,可用低pH疏水相互作用色谱的方法处理含有感兴趣的抗体和杂质的混合物,用pH约2.5-4.5的洗脱缓冲液,优选地在低盐浓度下进行(例如,
从约0到0.25M盐浓度)。
[0151] 在某些实施方式中,本发明中的抗体或抗原结合片段可以试剂盒的形式提供,如,包装好的含有预设数量的试剂组合,并带有诊断实验操作说明书。如所述抗体带有酶标记,
则所述试剂盒可包括所述酶所需的底物和辅助因子(如提供可检测的色素集团或荧光基
团的底物前体)。另外,也可含有其他添加剂,如稳定剂、缓冲剂(如阻断缓冲液或裂解缓冲
液)及其类似物。所述的多种试剂的相对量可有较大的不同,从而可提供多种浓度的试剂
溶液以实质上优化实验的敏感度。具体地说,所述多种试剂可以为粉末,通常为冻干状态,
包括辅料,其在溶解后可得到适宜浓度的试剂溶液。
[0152] 在某些实施方式中,本发明提供了含有可治疗上述状态的制品。所述制品含有容器和标签。适用的容器包括,例如,瓶子、小管、针筒或试管。所述容器可由多种材料如玻璃
或塑料组成。所述容器装有本发明提供的可有效治疗所述状态的药物组合物(含有本发明
公开的抗体或其抗原结合片段),以及具有无菌的出口(例如所述容器可以是静脉输液袋
或具有可被皮下注射针刺破的瓶塞)。容器上或容器相关的标签指明该组合物用于治疗所
选择的状态。所述制品可进一步含有第二种容器,其含有药用可接受的缓冲液,例如磷酸盐
缓冲液、林格氏液以及葡萄糖溶液。其还可进一步包含从商业角度和使用角度上可取的其
他材料,包括其他缓冲液、稀释剂、过滤器、针、针筒以及附有使用说明的包装。
[0153] 以下实施例旨在更好地说明本发明,且不应理解为限制本发明的范围。所有下述的特定组合物、材料和方法,其整体或部分,都在本发明的范围内。这些特定的组合物、材料
和方法不是为了限制本发明,而只是为说明特定的实施方式在本发明的范围内。本领域熟
练技术人员可不添加创造性及不偏离本发明范围而开发出等同的组合物、材料和方法。应
理解,在对本发明的方法作出的多种改动可以仍然包括在本发明范围内。发明人意在将这
样的变动包括在本发明的范围内。
实施例
[0154] 实施例1从人噬菌体展示天然抗体库中筛选表达抗ERα36 scFv的噬菌体。
[0155] 制备ERα36及生物素化ERα36:
[0156] ERα36通过化学合成的方法制得,然后用生物素标记,制得生物素化的ERα36。
[0157] 噬菌体展示:
[0158] 通过噬菌体展示的方法筛选展示有抗ERα36 scFv,因为它相对于经典的杂交瘤技术有明显的优点。例如,噬菌体展示可直接获人抗体,避免对通过杂交瘤技术产生的
抗体进行人源化改造过程。噬菌体展示在本领域中为公知技术,具体方法可参见参考文
献(Phage antibodies:filamentous phage displaying antibody variable domains.
Nature.1990 Dec 6;348(6301):552-4)。按如下说明的方法进行噬菌体展示。
[0159] 准备噬菌体文库:
[0160] 噬菌体文库的构建选用ScFv表达载体。将健康人的淋巴细胞分离纯化,提取总细胞RNA并用于合成cDNA。通过聚合酶链式反应(PCR)扩增抗体可变区基因及ScFv基
因。纯化重链可变区VH和轻链可变区VL的PCR产物,并组装成ScFv片段,用于构建ScFv
单链噬菌体抗体库。具体方法可参见参考文献(Lennard S.,Standard protocols for
the construction of scFv libraries.Methods Mol Biol.2002;178:59-71;Sheets MD,
Efficient high-affinity human single-chain antibodies to protein antigens,Proc
Natl Acad Sci U S A.1998 May 26;95(11):6157-62.)
[0161] 筛选表达抗ERα36 scFv的噬菌体:
[0162] 筛选管和链霉亲和素包被的磁珠(购自Promega)4℃用封闭液(0.1M NaCO3,pH8.6,5mg/ml BSA,0.02%NaN3,0.1μg/ml链霉亲和素)封闭过夜。用0.1%PBST(含
0.1%Tween 20(v/v)的磷酸盐缓冲溶液)洗涤封闭后的筛选管和磁珠。在第一轮筛选中,
12
将4×10 pfu的噬菌体文库与等体积的4%PBSM(含4%牛奶的磷酸盐缓冲溶液)混合,室
温培养60分钟。在噬菌体混合物中加入终浓度为10μg/ml的生物素化的ERα36,室温培
养30到60分钟。在磁分离装置中用PBST洗涤链霉亲和素包被的磁珠/抗原样品。将样
品用2%PBSM重悬,室温平衡1到2小时。从PBSM中分离得到平衡后的磁珠,并重悬于噬
菌体与生物素化ERα36的混合液中,室温培养15分钟。将筛选管放于磁分离器上,上下翻
转2分钟。除去筛选管中的液体,用PBSMT(含2%牛奶和适量吐温-20的磷酸盐缓冲溶液)
洗磁珠,磁珠转移到新管后再用PBSMT洗磁珠,然后磁珠转移到新管后再用PBS洗磁珠。最
后将磁珠转移到新管后再用加入酸性洗脱液在室温下洗脱噬菌体。洗脱的噬菌体用于下一
轮筛选。
[0163] 第二轮筛选:
[0164] 将第一轮筛选后得到的洗脱的噬菌体重新感染对数生长期的TG1细菌。扩增后,12
将4.0×10 pfu的噬菌体用于第二轮筛选,筛选方法与第一轮筛选基本一致,但是用0.5%
的PBST代替0.1%PBST,且噬菌体中加入终浓度为1μg/ml的生物素化的ERα36。
[0165] 第三轮筛选:
[0166] 将第二轮筛选后得到的洗脱的噬菌体用于感染对数生长期的TG1细菌。扩增后,12
将3.9×10 pfu的噬菌体用于第三轮筛选,筛选方法与第二轮筛选基本一致,但是在噬菌
体中加入终浓度为0.1μg/ml的生物素化的ERα36。
[0167] 第四轮筛选:
[0168] 将第三轮筛选后得到的洗脱的噬菌体用于感染对数生长期的TG1细菌。扩增后,12
将4.0×10 pfu的噬菌体用于第四轮筛选,筛选方法与第三轮筛选基本一致,但是用1mg/
mlERα36代替酸性洗脱液进行竞争洗脱。
[0169] 四轮筛选的具体条件及筛选结果如表4所示。与噬菌体混合的生物素化ERα36功能肽的浓度逐步降低,Tween-20在洗涤液中的百分比逐步升高,这显著提高了筛选的严格
度。使用酸性洗脱液,以保证回收到前三轮筛选中的多种结合物。在最后一轮筛选中,用高
浓度的非生物素化ERα36竞争结合表达ERα36抗体的噬菌体,从而实现特异性洗脱。如
表4所示,富集因子有效降低,表明富集效应明显。
表4筛选过程总结
注:富集因子=投人/产出
[0170] 实施例2鉴定表达人抗ERα36 scFv的噬菌体阳性克隆
[0171] 挑选表达抗体的噬菌体单克隆:
[0172] 将实施例1中第四轮筛选得到的噬菌体单克隆分别接种至2TY-AG培养液中(含有100μg/ml氨苄青霉素和1%(w/v)蔗糖的2TY),37℃培养过夜。取培养过夜的菌液
100μl至20ml 2TY-AG培养液中,37℃培养至OD600值达0.4~0.5。加入辅助噬菌体,
37℃培养使噬菌体感染细菌。5000g离心10分钟,收集被感染的细菌,并在2TY-AK培养液
中重悬,37℃培养16小时。用噬菌体沉淀剂沉淀噬菌体,离心除去细菌碎片。PBS重悬噬菌
体,再离心除去未结合噬菌体的抗体片断,再用PBS重悬。
[0173] 噬菌体ELISA实验:
[0174] 用冲洗液(含有0.1%Tween-20的PBS)洗涤中性亲和素(Neutravidin)预包被的孔板(购自Pierce),封闭液封闭所有的孔,置4℃培养1到2小时。弃去封闭液,洗涤液
洗板6次后倒置晾干孔板。待测孔中每孔加入100μl生物素化ERα36的PBS溶液,室温培
养1~2小时后除去上述溶液,用冲洗液洗板一次。每孔中加入100μl噬菌体溶液,室温
培养1~2小时,冲洗液洗板6遍。用封闭液以1∶5000的比例稀释HRP连接的兔抗M13
抗体(购自GEHealthcare),每孔中加入100μl稀释的HRP连接的兔抗M13抗体,室温培养
1小时后,冲洗液洗板六遍。
[0175] 每个待测孔中加入100μl HRP底物溶液,室温培养30分钟,然后用酶标仪在490nm处进行检测。HRP底物溶液按如下方法配制:在100ml 50mM pH4.0的枸橼酸钠溶液
中溶解22mgOPD(购自Sigma)配成OPD储存液,过滤除菌。OPD储存液在4℃保存。每次检
测前,在每21mlOPD储存液中现加入36μl 30%的过氧化氢溶液。实验包括阳性对照、阴
性对照1和阴性对照2。阳性对照为M13噬菌体包被的版,用HRP连接的抗M13抗体检测。
阴性对照1中不含有生物素化ERα36,阴性对照2中不含有噬菌体。
[0176] 按上述方法,从第四轮筛选出的噬菌体单克隆中鉴定得到40个表达人抗ERα36scFv的噬菌体阳性克隆,结果如表5所示。
表5噬菌体单克隆的ELISA实验结果
注:P为阳性对照;N1为阴性对照1;N2为阴性对照2。
[0177] 实施例3测定噬菌体阳性克隆中表达的人抗ERα36 scFv的核苷酸序列。
[0178] 对40个阳性噬菌体阳性克隆分别进行DNA测序,测序引物分别为:5′-TGGAATTGTGAGCGGATAACAATT-3′,
5′-GTAAATGAATTTCTGTATGAGG-3′。将测序结果在序列分析软件Vector NTI中(购
自Invitrogen)进行分析,得出7种不同的核酸序列(SEQ ID NO:4、SEQ ID NO:6、SEQ ID
NO:8、SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:12、SEQ ID NO:14、及SEQ ID NO:16,见说明书)和7种
预测的氨基酸序列(SEQ ID NO:3、SEQ ID NO:5、SEQ ID NO:7、SEQ ID NO:9、SEQ ID NO:
11、SEQ ID NO:13、及SEQ ID NO:15,见说明书)。7种人抗ERα36 scFv分别记为ScFv1,
ScFv2,ScFv3,ScFv4,ScFv5,ScFv6和ScFv7。相应的序列具体参见前文具体实施方式中相
关部分。根据预测的7种氨基酸序列,对40个测序的噬菌体克隆进行分组,结果如表6所
示。
表6根据表达的抗ERα36 scFv氨基酸序列对阳性噬菌体克隆进行分组
氨基酸序列编号 噬菌体克隆编号
ScFv1(SEQ ID NO:3) 2,5,6,9,13,19,20,29,31,33,36
ScFv2(SEQ ID NO:5) 1,7,11,15,17,25,28,34,38
ScFv 3(SEQ ID NO:7) 4,8,14,22,23,37
ScFv 4(SEQ ID NO:9) 10,16,21,32,35
ScFv 5(SEQ ID NO:11) 3,30,40,18
ScFv 6(SEQ ID NO:13) 27,39,26
ScFv 7(SEQ ID NO:15) 12
ND 24
注:ND为未测出。
[0179] 实施例4表达并纯化人抗ERα36 ScFv1-ScFv7。
[0180] 从LB平板上挑取一HB2151(购自GE Healthcare)单菌落至2TY培液中37℃培养扩增,至OD600约0.6~0.8。将实施例3中鉴定得到的表达ScFv1~ScFv7的噬菌体
克隆各取1μl,分别接种于200μl对数生长期的HB2151中,37℃培养30分钟。感染的培
养物用于涂LB-AG平板(含有氨苄青霉素和蔗糖的LB培养基),37℃培养过夜。取250μl
培养的菌液接种至25ml 2TY培液,37℃扩大培养,至OD600约为0.6。在每个培养物中加入
250μl 2TY诱导培液(含有0.1mM IPTG诱导剂的2TY),30℃培养过夜。3500g离心10分
钟收集细胞,重悬于PBS中(1∶50v∶v)。超声处理细胞混悬液,使其释放出可溶ScFv,
在9000g离心10分钟,收集含有可溶ScFv的上清液。将含有ScFv1,ScFv2,ScFv3,ScFv4,
ScFv5,ScFv6,ScFv7的上清液分别记为S14,S24,S33,S41,S53,S66和S72。用十二烷基
硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)测定上清液中是否存在7种ScFv。7种ScFv主要
在上清中发现,且都以包涵体的形式表达。图2显示了S14,S24,S33,S41,S66和S72六种
上清液的电泳照片示例。
[0181] 由于7种可溶ScFv都是以包涵体的形式表达,故采用变性条件下Ni柱亲和柱纯化7种scFv。将上清液S14,S24,S33,S41,S53,S66和S72在20mM Tris.HCl,pH 8.0,8M
尿素,50mM beta-ME的变性条件下变性,再进行Ni柱亲和纯化。将变性后的7种包涵体溶
液分别上Ni柱(购自GE Healthcare)。冲洗液(20mM Tris.Cl,pH 8.0,8M尿素,10mM咪
唑,25mM NaCl)冲洗柱子,平衡液(同冲洗液)平衡柱子至基线平稳,然后用洗脱液(平衡
液加梯度递增的咪唑)进行梯度洗脱。收集洗脱液,并进行SDS-PAGE电泳分析。图3a-3c
分别为S14,S41和S66的洗脱液电泳照片示例。结果表明,在洗脱液中目的条带浓度高,杂
带少,说明洗脱液中目的蛋白的纯度较高,纯化效果好。
[0182] 将Ni柱洗脱样品按照1∶10的比例透析至透析缓冲液(含有8M尿素的50mM酸缓冲液,pH8.9)。透析17小时后,更换透析液,继续透析7小时。将透析后的样品用硼酸
缓冲液(50mM,pH8.9,含有8M尿素)稀释至300μg/ml,以1∶10比例透析复性。各步缓
冲液成分如下:
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,4M尿素,pH8.9;
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,2M尿素,pH8.9;
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,1M尿素,pH8.9;
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,0.5M尿素,pH8.9;
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,pH8.7;
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,pH8.7;
50mM硼酸缓冲液,1%甘氨酸,pH8.7。
其中,S24部分样品复性中用0.4M L-精氨酸取代1%甘氨酸。
[0183] 7种含有包涵体的上清液经复性后,得到多个ScFv的复性样品。样品批号、浓度以及总蛋白量如表7所示。结果表明,大部分复性样品的蛋白浓度较高,总蛋白收率几乎都在
10mg以上,可用于后续研究。复性样品采用还原SDS-PAGE电泳进行分析。S14,S24,S33,
S41,S53,S66和S72复性样品的还原电泳示例图如图4a-c和图5所示。图4a-c中,复性
后和复性前的S14,S41和S66的电泳条带位置没有明显变化,表明复性对蛋白的分子量没
有明显改变。图5显示,在SDS-PAGE中,7种ScFv的复性样品中的每一种都仅有一条明显
的目的条带,表明复性蛋白的纯度仍然很高。将复性得到的7种ScFv溶液中加入0.15M海
藻糖,冻干后储存备用。
[0184] 表7抗ERα36 ScFv 1-ScFv 7的复性后的产量
[0185] Western Blot验证抗ERα36 ScFv1~ScFv7:
[0186] 将纯化复性所得的ScFv1~ScFv7通过Western Blot的方法进行验证。人工构建可表达重组ERα36的HEK293细胞。培养人乳腺癌细胞SK-BR-3和表达重组ERα36的
HEK293细胞,分别收获细胞,加入裂解液裂解,获得裂解蛋白。将蛋白以20μg/孔上样,进
行SDS-PAGE凝胶电泳,并将电泳后的蛋白样品分别电转移至ScFv1~ScFv7分别标记过的
聚偏二氟乙烯(PVDF)膜。将膜用脱脂牛奶封闭,加入抗His-HRP,以显影得到结果(图16)。
[0187] Western Blot实验结果表明,ScFv1~ScFv7作为一抗可特异性地检测到重组表达的ERα36,证明ScFv1~ScFv7可特异性地与ERα36结合。
[0188] 实施例5鉴定抗ERα36 ScFv1-ScFv7与抗原的结合能力。
[0189] ScFv的ELISA实验:
[0190] 将链霉亲和素包被的96孔板用PBS洗两遍,每个待测孔加入终浓度为20μg/ml的生物素化ERα36,室温放置2小时,PBST洗板三遍。分别在待测孔中加入复性ScFv样
品(100ul,S14A1r1、S24A2r2、S33A2r1、S41A3r3、S53A1r1、S66A1r1和S72A2r1),每个样
品5倍稀释5个梯度,每个梯度平行做两个复孔。37℃培养1小时。PBST洗板三遍,每孔
加入100μl小鼠抗His-6单抗(1∶2000稀释),37℃培养1小时。PBST洗板三遍,每孔
加入100μl羊抗小鼠-HRP(1∶2500稀释),37℃培养1小时。PBST洗板六遍,每孔加入
100μlOPD显色液,避光显色,每孔加入50μl 2M H2SO4终止反应,酶标仪490nM处读数。
[0191] 实验同时平行做一个阳性对照和三个阴性对照。阳性对照为用兔抗ER多抗血清代替各ScFv复性样品,用羊抗兔-HRP代替羊抗小鼠-HRP。阴性对照1(N1)不含ScFv复性
样品;阴性对照2(N2)使用200μg/ml ScFv复性样品,不加His-6单抗。阴性对照3(N3)
不含ScFv复性样品和His-6单抗。实验结果如表8所示。对7种ScFv分别做浓度-OD490
图,如图6所示。结果表明,scFv1~scFv7在所测试的浓度下,与抗原ERα36的结合呈明
显的浓度依赖性,提示scFv1~scFv7可特异性地与抗原ERα36结合。
表8抗ERα36ScFv S1-ScFv S7与ERα36结合的ELISA实验数据
注:P为阳性对照,N1为阴性对照1,N2为阴性对照2,N3为阴性对照3。
[0192] 实施例6人抗ERα36 ScFv-1,ScFv-3,ScFv-4,ScFv-7和抗ERα36兔多克隆抗体对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制作用。
[0193] 实验动物:
[0194] 采用49只雌性BALB/c-nu裸鼠(由北京大学医学部实验动物科学部提供)。
[0195] 实验分组:
[0196] 实验动物分成7组,每组设7只裸鼠。7个组分别为:用人IgG抗体(购自北京博奥森生物技术有限公司)治疗的阴性对照组,用赫赛汀治疗的阳性对照组,用抗ER-36兔源
多克隆抗体(由Creighton University Wang Zhao-Yi组提供)的多克隆抗体测试组,以
及分别用人抗ERα36 ScFv-1,ScFv-3,ScFv-4和ScFv-7抗体治疗的单克隆抗体测试组。
[0197] 给药:
[0198] 测试组分别给药同样剂量的抗ER-36兔多克隆抗体,抗ER-36人单克隆ScFv-1,ScFv-3,ScFv-4和ScFv-7抗体(5mg/kg,100μg/剂量)。阳性对照组给药5mg/kg赫赛汀
(100μg/剂量)。阴性对照组给药5mg/kg人IgG抗体(100μg/剂量)。
[0199] 实验方法和数据分析:
[0200] 每只实验裸鼠的右前肢腋下移植人乳腺癌BCAP-37(雌激素受体阳性,由中国医学科学院药物所药理系提供)。移植后,经口灌胃乙烯雌酚,7μg/天/只,连续给药9天。
第10天将小鼠分成7组,通过静脉注射对应的受试药物,给药间隔为3-4天,连续给药6次。
每3-4天测量荷瘤裸鼠体重和移植肿瘤生长体积,并用以下公式计算参数:
各组动物肿瘤体积(VT): (公式1)
其中a,b分别表示肿瘤长宽;
相对体积(RVT): (公式2)
其中V0为分组时给药前测量所得肿瘤体积,Vt为每次测量时的肿瘤体积,V0的计算公
式同Vt;
肿瘤增殖率T/C(%): (公式3)
其中TRTV为治疗组的RTV算术平均值,CRTV为阴性对照组的RTV算术平均值。
[0201] 连续观察给药21天后处死各组荷瘤裸鼠,剥离瘤组织,照相,并用1/10000分析天平称重。计算平均肿瘤重量和计算各组肿瘤生长抑制率:
(公式4)。
[0202] 全部实验数据采用平均值±标准差表示。采用t检验比较各组数据。
[0203] 实验结果:
[0204] 五种受试抗体均用无菌注射用水溶解,形成澄清溶液。给药期间各组荷瘤裸鼠均无死亡。测试组和阴性对照组中的小鼠的体重未见显著差异(见表9,表10)。根据观察到
的荷瘤小鼠的肿瘤体积(TV)(见表11,表12),相对肿瘤体积(RTV)(见表13,表14,图7),
肿瘤相对增殖率T/C,肿瘤实测重量(见表15,图8),和肿瘤生长抑制率(见表16,图9)发
现,五种受试抗体对荷瘤小鼠的肿瘤生长均有明显的抑制作用,其中ScFv-3组和ScFv-7组
对肿瘤生长抑制作用最强。五种受试抗体对肿瘤生长抑制作用略低于阳性药赫赛汀对照
组。对七组小鼠的病理学检查结果(见图10)显示,阴性对照组的肿瘤体积显著大于阳性对
照组的肿瘤体积,也明显大于所有受试抗体组的肿瘤体积。测试组中,多克隆抗体组的肿瘤
体积略大于单克隆抗体组,但明显小于阴性对照组。单克隆抗体组中,ScFv-3组和ScFv-7
组的肿瘤体积最小,抑瘤效果接近阳性对照赫赛汀。ScFv-1组和ScFv-4组的肿瘤体积与阴
性对照相比明显较小,与多克隆组相比效果相当,但肿瘤体积比阳性对照赫赛汀略大。
表9荷瘤小鼠分组情况、给药剂量及分组时体重
组别 动物数量(只) 分组时体重 给药剂量
阴性药物对照组 7 19.82±0.44 5mg/kg
阳性药物对照组 7 19.87±0.44 5mg/kg
多克隆抗体组 7 19.88±0.57 5mg/kg
单克隆ScFv-1抗体组 7 19.91±0.49 5mg/kg
单克隆ScFv-3抗体组 7 19.94±0.81 5mg/kg
单克隆ScFv-4抗体组 7 19.67±0.57 5mg/kg
单克隆ScFv-7抗体组 7 19.67±0.67 5mg/kg
表10各实验组荷瘤裸鼠给药期间体重(g)变化比较
天 72.0 64.0 95.0 14.0 63.0 52.0 74.0
12 ±88 ±26 ±07 ±48 ±26 ±46 ±25
药给 .32 .32 .32 .32 .32 .32 .32

9 4 5 3 6 9 8
天 4.0 4.0 6.0 4.0 4.0 3.0 5.0
81药 ±14. ±79. ±53. ±26. ±83. ±74. ±51.
给 32 22 32 32 32 32 32
天 25.0 14.0 63.0 53.0 95.0 64.0 25.0
41药给 ±12.22 ±89.12 ±10.22 ±50.22 ±40.22 ±10.22 ±10.22
天 36.0 24.0 24.0 14.0 55.0 15.0 15.0
11药给 ±46.12 ±43.12 ±43.12 ±23.12 ±42.12 ±44.12 ±43.12
5 3 8 2 1 8 4
天 3.0 3.0 3.0 3.0 3.0 2.0 2.0
7药 ±54. ±47. ±56. ±47. ±57. ±27. ±56.
给 02 02 02 02 02 02 02
24 93 93 04 45 84 15
天4药 .0±80.0 .0±72.0 .0±82.0 .0±52.0 .0±82.0 .0±70.0 .0±20.0
给 2 2 2 2 2 2 2
44. 44. 75. 94. 18. 75. 76.
0 0 0 0 0 0 0
前 ±2 ±7 ±8 ±1 ±4 ±7 ±7
药给 8.91 8.91 8.91 9.91 9.91 6.91 6.91

组 组
照 照 组 组 组 组 组
对 对 体 体 体 体 体
别组 物药性阴 物药性阳 抗隆克多 抗1-vFcS 抗3-vFcS 抗4-vFcS 抗7-vFcS
注:分别与阴性对照组比较均未见显著性差异。
3
表11各实验组荷瘤裸鼠给药期间肿瘤体积(mm)变化比较
组别 给药前 给药4天 给药7天 给药11天 给药14天 给药18天 给药21天
阴性药物对照组 50.48±11.72 350.70±85.00 663.67±196.02 3159.09±593.30b 4501.79±530.09 6281.90±732.53 7287.01±889.55b
阳性药物对照组 50.95±15.31 89.08±25.89b 186.80±58.36b 1049.69±251.43b 1394.53±201.24b 2141.61±276.39b 2586.37±233.62b
多克隆抗体组 50.45±12.48 228.78±44.33b 387.25±66.52b 1693.71±389.00b 2346.03±506.84b 3317.76±713.86b 3919.27±642.95b
ScFv-1抗体组 50.83±16.51 184.31±81.10b 344.75±135.70b 1493.66±517.68b 2174.87±514.19b 3208.12±595.60b 3792.10±639.19b
ScFv-3抗体组 50.51±10.12 171.91±73.68b 302.93±100.01b 1442.70±406.32b 1993.02±405.84b 2859.65±427.16b 3324.97±460.89b
ScFv-4抗体组 50.25±13.96 222.27±104.89b 427.50±136.98a 1930.04±390.85b 2666.60±464.32b 3644.40±414.64b 4098.31±557.11b
ScFv-7抗体组 50.62±13.32 186.11±71.13a 308.85±117.52b 1521.45±366.24b 2136.49±479.95b 2944.61±526.75b 3358.43±445.13b注:a表示与阴性对照组比较p<0.05;b表示与阴性对照组比较p<0.01。
3
表12统计学(P值)比较各给药组组间肿瘤体积(mm)
统计学比较 阳性对照组 多抗组 ScFv-1组 ScFv-3组 ScFv-4组 ScFv-7组
与阴性对照组比较 1.3E-08 3.2E-06 2.2E-06 2.2E-07 3.6E-06 2.2E-07
与阳性对照组比较 —— 0.00024 0.00053 0.00261 2.5E-0.5 0.00157
与多抗组比较 —— —— 0.71702 0.07016 0.5879 0.08208
与ScFv-1组比较 —— —— —— 0.1427 0.35819 0.16648
与ScFv-3组比较 —— —— —— —— 0.01518 0.89242
与ScFv-4组比较 —— —— —— —— —— 0.01776
表13.各实验组荷瘤裸鼠给药期间相对肿瘤体积(RTV)变化比较
注:a表示与阴性对照组比较p<0.05;b表示与阴性对照组比较p<0.01。
表14.给药21天后各给药组组间肿瘤体积(RTV)统计学比较(P值)
表15给药21天后各给药组组间肿瘤重量(g)统计学比较(P值)
组 80-
7-vF E317 7020 740 202 686 160
cS .3 .0 .0 .0 .0 .0
组4 80-E 11
-vFc 311. 000. 209. 465. 400. —
S 2 0 0 0 0 —
组 01- 2
3-vF E546 0900 3200 740 — —
cS .4 .0 .0 .0 — —
8
组1- 0-E5 201 1
vFcS 86.7 00.0 94.0 —— —— ——

80-E 50-E
组抗 146. 987. — — — —
多 1 7 — — — —
组照 01-
对性 E957 — — — — —
阳 .8 — — — — —
较比 较比 较比 较比 较比
较比 组照对 组照对 较比组 组1-v 组3-v 组4-v
学计 性阴 性阳 抗多 FcS FcS FcS
统 与 与 与 与 与 与

表16.各实验组荷瘤裸鼠肿瘤重量(g)和肿瘤生长抑制率(%)变化比较
组别 例数 肿瘤重量(g) p值 肿瘤生长抑制率(%)
阴性对照组 7 6.805±0.487 —— ——
阳性对照组 7 1.952±0.572 <0.001 71.31
多抗组 7 3.544±0.434 <0.001 47.92
ScFv-1组 7 3.338±0.631 <0.001 50.94
ScFv-3组 7 2.738±0.344 <0.001 59.76
ScFv-4组 7 3.514±0.465 <0.001 48.36
ScFv-7组 7 2.860±0.696 <0.001 57.97
注:p值由各给药组与阴性对照组进行统计学比较计算得到。
[0205] 实施例7比较抗ERα36ScFv-7和他莫昔芬对荷瘤裸鼠的肿瘤抑制作用。
[0206] 实验动物和分组:
[0207] 21只雌性BALB/c-nu裸鼠分成3组,每组设7只裸鼠。
[0208] 给药剂量:
[0209] 将抗ERα36人单克隆ScFv-7以0.1mg/20g体重/天的剂量给药。阳性对照组他莫昔芬以0.33mg/20g体重/天的剂量给药阴性对照组给药人IgG。
[0210] 实验方法和数据分析:
[0211] 每3-4天对荷瘤裸鼠测量体重和移植肿瘤体积。分别用公式2和公式4计算相对肿瘤体积和相对肿瘤增殖率。对动物给药18天,停药24小时后处死动物,剥离瘤组织并称
重,用公式4计算平均肿瘤重量和肿瘤生长抑制率。
[0212] 实验结果:
[0213] 给药18天后,测试组的肿瘤体积VT、相对体积RVT(见图11)及相对肿瘤增殖率T/C%(见图12)均明显低于平行的阴性对照组水平。与阴性对照组相比,测试组和阳性对
照组的平均重量有显著差异,p值低于0.01(见图13)。受试样品组和阳性对照组的肿瘤生
长抑制率相似,均接近60%(见图14)。三组荷瘤小鼠肿瘤组织病理学检查结果(见图15)
显示,阴性对照组的肿瘤体积显著大于阳性对照组的肿瘤体积。测试组的肿瘤体积与阴性
对照相比明显较小,与用他莫昔芬治疗的阳性对照比较接近。
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