一种用于检测人CD117蛋白的单克隆抗体、偶联蛋白、抗原表
位肽以及杂交瘤细胞株
技术领域
背景技术
[0002] CD117蛋白是一种分子量为145kDa的糖基化磷蛋白，有1个跨膜区，
氨基端位于细胞膜外侧，羧基端位于
细胞质膜内侧。CD117蛋白具有5个免疫球蛋白样结构域和一个III型酪氨酸激酶生长因子结构域，在调节细胞存活和增殖、造血、干细胞维持、肥大细胞发育、迁移和功能以及黑色素生成等方面发挥重要作用。
[0003] CD117蛋白在造血干细胞、黑色素细胞、肥大细胞、Cajal细胞、生殖细胞、
皮肤基底细胞和乳腺
导管上皮等正常组织细胞中表达，在胃肠道间质瘤(GIST)、
肺小细胞癌和黑色素瘤、肥大细胞
疾病、急性髓系白血病(AML)、和尤文氏肉瘤等异常组织中表达。在临床中常用于胃肠道间质瘤(85-95％阳性率)的诊断，也可与CD34联合使用。近年来，CD117蛋白作为GIST的特异性免疫组化标志物，可以用于靶点用药(格列卫)指导
治疗GIST患者。
[0004] 目前临床上常用免疫组织化学(IHC)的免疫学方法来检测
肿瘤细胞中蛋白的表达状况，特异性识别CD117蛋白的单克隆抗体对IHC检测CD117表达
水平具有重要的意义。免疫学方法(IHC)检测的核心为与CD117蛋白特异性结合的单克隆抗体，其特异性、灵敏度以及
稳定性的优劣直接决定整个检测的可靠性。国内使用的抗CD117单克隆抗体多来源于国外进口抗体(克隆号：YR145，EP10，A4502)，造价高昂；为获得与进口
试剂效果相当或者优异的抗CD117单克隆抗体，同时减轻病患负担，降低诊断及治疗
费用，研制出一种具备临床应用的抗CD117单克隆抗体具有重要的意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的是提供一种用于检测人CD117蛋白的单克隆抗体，其具有较高的特异性和灵敏度。
[0006] 本发明还提供了一种人CD117偶联蛋白，其能够作为抗原用于制备上述的用于检测人CD117蛋白的单克隆抗体。
[0007] 本发明还提供了一种抗原表位肽，其能够用于制备上述的人CD117偶联蛋白。
[0008] 本发明还提供了一种杂交瘤细胞株，该杂交瘤细胞株能够生产上述的用于检测人CD117蛋白的单克隆抗体。
[0009] 为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
[0010] 一种用于检测人CD117蛋白的单克隆抗体，该单克隆抗体是由人CD117单克隆抗体杂交瘤细胞株分泌获得；所述人CD117单克隆抗体杂交瘤细胞株是以人CD117偶联蛋白为抗原制备而成，所述人CD117偶联蛋白是由抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成；所述抗原表位肽的氨基酸序列为x-NRQKPVVDHSVRINS-y，所述x为0-10个氨基酸构成的辅助序列，所述y为0-10个氨基酸构成的辅助序列。
[0011] 本发明中根据Uniprot公布的P10721蛋白序列，选择以NRQKPVVDHSVRINS为核心的多肽序列作为抗原表位肽制备单克隆抗体；同时为提高抗原表位肽的免疫效果，在前述的核心序列N端或者C端增加至少1个同时不超过10个氨基酸，使其N端或者C端为含有巯基的氨基酸；将抗原表位肽上的巯基通过
偶联剂与载体蛋白上的氨基偶联获得人CD117偶联蛋白；以该人CD117偶联蛋白为抗原，用其对动物进行免疫，获得人CD117单克隆抗体。国内使用的抗CD117单克隆抗体多来源于国外进口抗体，本发明中为国内生产人CD117抗体提供了一个新的途径，获得单克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度；且价格便宜，能够减轻病患负担，降低诊断费用。
[0012] 本发明中的人CD117单克隆抗体是由人CD117杂交瘤细胞株分泌获得；所述人CD117杂交瘤细胞株由人CD117偶联蛋白为抗原制备得到。在抗体制备过程中抗原的选择最为关键，而其他过程如动物免疫、细胞融合、腹水注射和纯化过程为本领域的常规方法。本发明中的抗原表位肽通过常规的化学方法进行合成得到。
[0013] 优选的，所述的抗原表位肽和载体蛋白通过SMCC法进行偶联。SMCC是一类含有N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)活性酯和
马来酰亚胺的双功能偶联剂，可以将分别含有巯基和氨基的化合物键接在一起。因此，可以在抗原表位肽上连接具有巯基的氨基酸或氨基酸序列，或者直接合成含有辅助序列的抗原表位肽。具体的，所述x为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的N端为含有巯基的氨基酸。具体的，所述y为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的C端为含有巯基的氨基酸。
[0014] 更为优选的，所述x为CSP，y为0，组成的抗原表位肽的氨基酸序列为CSPNR QKPVV DHSVR INS。本发明中使用前述的人CD117抗原表位肽制备成抗原，免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株较多，杂交瘤细胞株分泌的抗体特异性强和灵敏度高。
[0015] 具体的，所述载体蛋白为血蓝蛋白、
牛血清
白蛋白、鸡卵白蛋白中的任一种。载体蛋白首选是KLH(血蓝蛋白)，也可以使用BSA(牛血清白蛋白)和OVA(鸡卵白蛋白)，三者为常规载体蛋白。
[0016] 一种人CD117偶联蛋白，是由抗原表位肽与载体蛋白偶联制备得到；所述抗原表位肽的氨基酸序列为x-NRQKPVVDHSVRINS-y；所述x为0-10个氨基酸构成的辅助序列，所述y为0-10个氨基酸构成的辅助序列。
[0017] 本发明中提供的人CD117偶联蛋白，是在人CD117抗原表位核心序列的N端或者C端增加至少1个同时不超过10个氨基酸，使其N端或者C端为含有巯基的氨基酸；将抗原表位肽上的巯基通过偶联剂与载体蛋白上的氨基偶联获得人CD117偶联蛋白；使用前述的人CD117偶联蛋白作为CD117抗原，免疫小鼠获得的杂交瘤细胞株较多，杂交瘤细胞株分泌的抗体特异强和灵敏度高。
[0018] 优选的，所述x为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的N端为含有巯基的氨基酸。优选的，所述y为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的C端为含有巯基的氨基酸。
[0019] 更为优选的，所述x为CSP，y为0，组成的抗原表位肽的氨基酸序列为CSPNR QKPVV DHSVR INS。
[0020] 优选的，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白中的任一种。
[0021] 一种抗原表位肽，所述抗原表位肽的氨基酸序列为x-NRQKPVVDHSVRINS-y；所述x为0-10个氨基酸，所述x的N端为含有巯基的氨基酸；所述y为0-10个氨基酸，所述y的C段为含有巯基的氨基酸。
[0022] 本发明中提供的抗原表位肽，是根据Uniprot公布的P10721蛋白序列，通过结构分析获得，其能够用于制备人CD117抗原，用其免疫获得的单克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。
[0023] 优选的，所述x为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的N端为含有巯基的氨基酸。优选的，所述y为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的C端为含有巯基的氨基酸。
[0024] 更为优选的，所述x为CSP，y为0，组成的抗原表位肽的氨基酸序列为CSPNR QKPVV DHSVR INS。
[0025] 优选的，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白中的任一种。
[0026] 一种杂交瘤细胞株，是以人CD117偶联蛋白为抗原制备而成；所述人CD117偶联蛋白是由抗原表位肽与载体蛋白偶联制备而成；所述抗原表位肽的氨基酸序列为x-NRQKPVVDHSVRINS-y，所述x为0-10个氨基酸构成的辅助序列，所述y为0-10个氨基酸构成的辅助序列。
[0027] 本发明中的提供的杂交瘤细胞株，可以由人CD117偶联蛋白为抗原采用常规的动物免疫、细胞融合的免疫学方法获得，所获得杂交瘤细胞株分泌的单克隆抗体具有较高的特异性和灵敏度。
[0028] 优选的，所述x为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的N端为含有巯基的氨基酸。优选的，所述y为1-10个氨基酸构成的辅助序列，该辅助序列的C端为含有巯基的氨基酸。
[0029] 更为优选的，所述x为CSP，y为0，组成的抗原表位肽的氨基酸序列为CSPNR QKPVV DHSVR INS。
[0030] 优选的，所述载体蛋白为血蓝蛋白、牛血清白蛋白、鸡卵白蛋白中的任一种。
附图说明
[0031] 图1为本发明中单克隆抗体的Westernblot结果图；
[0032] 图2为本发明中免疫组化法检测阑尾组织中CD117表达情况图；
[0033] 图3为本发明中免疫组化法检测睾丸组织中CD117表达情况图。
具体实施方式
[0034] 下述
实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
[0035] 实施例1
[0036] 本实施例中的抗原表位肽，氨基酸序列为NRQKPVVDHSVRINS。该序列是根据Uniprot公布的P10721蛋白序列所设计，为CD117蛋白抗原表位的核心多肽序列。
[0037] 实施例2
[0038] 本实施例中的抗原表位肽，氨基酸序列为CSPNRQKPVVDHSVRINS。该抗原表位肽是在实施例1中的核心多肽序列的
基础上在N端添加了“CSP”辅助序列，该抗原表位肽可以通过化学方法直接合成。
[0039] 实施例3
[0040] 本实施例中的人CD117偶联蛋白包括两部分，合成人CD117抗原表位肽和载体蛋白。合成的人CD117抗原表位肽序列为CSPNRQKPVVDHSVRINS；载体蛋白为KLH(血蓝蛋白)。
[0041] 本实施例中的人CD117偶联蛋白由
生物公司进行多肽合成以及偶联。
[0042] 实施例4
[0043] 本实施例中的杂交瘤细胞株，由包括如下步骤的方法制得：
[0044] 1、动物免疫：将合成人CD117抗原表位肽和KLH偶联后的抗原(人CD117抗原的实施例1)与
水溶性佐剂按照1:1体积比混合，采用肌肉注射方法免疫6-8周龄BALB/c小鼠，免疫剂量为50μg/只，间隔三周后进行第二次免疫，免疫剂量同第一次。
[0045] 免疫两次后取尾血以ELISA法梯度稀释测定血清效价：
[0046] a、将合成人CD117抗原表位肽和KLH偶联后的抗原按照50ng每孔包被ELISA检测板；
[0047] b、采集血清按照1:1000、1:2000、1:4000、1:8000、1:16000、1:32000、1:64000倍比稀释，同时设置阴性对照孔，37度孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；
[0048] c、HRP标记羊抗鼠IgG按照1:5000稀释，37度孵育30min，PBST洗涤3次，每次5min；
[0049] d、加入底物TMB显色，读数。
[0050] 根据结果确定是否加强免疫，选取抗体效价最高的小鼠进行细胞融合。本实施例中共免疫3只小鼠，血清效价数据分别为：1:16000、1:32000、1:16000；对比后选择2号小鼠进行下一步实验。
[0051] 2、细胞融合：骨髓瘤细胞采用BALB/c来源的sp2/0，融合时处于对数生长期；取已免疫小鼠脾脏，制成淋巴细胞单细胞悬液；将小鼠脾淋巴细胞与骨髓瘤细胞以1:5混合，滴加37℃的50％PEG(pH8.0)1mL，加入不完全培养基及其余终止液，离心弃上清后加入HAT培养基悬浮混匀，定容到50mL，滴加到96孔细胞培养板中，置于37℃、5％CO2恒温
培养箱中进行培养。
[0052] 3、筛选和克隆：挑选融合7-10天内的细胞克隆，使用CD117多肽进行间接ELISA检测，从808孔中筛选出136株单克隆细胞株。从136株细胞株中通过阑尾组织
石蜡切片筛选出8个特异性较高的细胞株。对阳性孔细胞进行有限稀释，每次有限稀释后5-6天测定ELISA值，挑取OD450阳性值较高的单克隆孔进行有限稀释，直至ELISA测定96孔板全板结果为阳性。挑取阳性值高的单克隆细胞株。
[0053] 实施例5
[0054] 本实施例中的用于检测人CD117蛋白的单克隆抗体，由包括如下步骤的方法制得：
[0055] 腹水单克隆抗体的制备与纯化：取8-10周龄的BALB/c小鼠
腹腔注射0.5mL液体石蜡，一周后用1mL
注射器腹腔注射经PBS洗涤重悬的单克隆细胞悬液，该细胞株为实施例4的8株中最优的一株，细胞用量为5×106/只，注射3只处理后小鼠。待小鼠腹水积聚后收集腹水，离心取上清，Protein A柱层析法进行腹水纯化，纯化后的单抗浓度测定、分装、冻存在-
20℃。
[0056] 试验例1以实施例5中纯化的单克隆抗体为一抗的蛋白印迹(Western-Blot)检测[0057] 1、样品制备：准备小鼠脑组织样品、精原细胞瘤组织(睾丸组织)，
研磨破碎后用含1mM PMSF的RAPI裂解后，加入5×SDS-PAGE Loading buffer制样。
[0058] 2、
电泳以及转膜：按照80V 20min，然后120V电泳至溴酚蓝至凝胶底部。然后开始转膜，提前用转移缓冲液浸泡NC膜与
滤纸，三明治形式置于湿转转膜仪，顺序为：
电极(-)-海绵-滤纸-凝胶-NC膜-滤纸-海绵-电极(+)，恒压90V、90min。
[0059] 3、封闭：用封闭液(含5％
脱脂奶的TBST)浸没NC膜并置于37℃孵育2小时。
[0060] 4、一抗孵育：将NC膜置于CD117鼠单抗(以封闭液将抗体按1:4000稀释)中，37℃温箱孵育1h后，再用TBST洗膜3次，每次5min。
[0061] 5、二抗孵育：将NC膜置于HRP标记的羊抗鼠IgG二抗(以封闭液将抗体按1:5000稀释)中，37℃摇床孵育30min后，TBST洗膜3次，每次5min。
[0062] 6、显色：ECL发光液中A与B组分按1：1混匀后加在NC膜上，在曝光仪中曝光。
[0063] 蛋白印迹检测结果如图1所示，其中M为Marker，1为小鼠脑组织裂解液；2为睾丸组织裂解液。CD117蛋白为糖蛋白，在不同组织中会存在因为蛋白翻译后修饰的不同，造成分子量产生差异，因此两种组织中的CD117蛋白的大小存在差异。
[0064] 试验例2纯化的单克隆抗体为一抗的免疫组化检测
[0065] 1、分别取阑尾、睾丸组织的蜡
块，使用Leica
组织切片机进行切片，组织厚度为3μm，65℃干烤2h。
[0066] 2、使用Leica Bond Max免疫组化自动
染色机对本发明中抗体进行免疫组化染色测试，使用机器自带的脱蜡与水化条件，具体步骤为：60℃孵育30min，应用脱蜡溶液(Leica)洗3遍。抗原修复采用抗原修复液2(ER2，Leica)，100℃孵育30min。
[0067] 一抗使用本发明抗体，采用抗体稀释液(Leica)稀释到终浓度为0.5μg/mL，150μL。抗体室温孵育30min。使用配套的二抗(Leica)150μL，室温孵育8min。使用多聚物检测液(Leica)150μL，室温孵育8min。使用内源性过
氧化物酶封闭液150μL室温孵育5min。使用DAB显色液(Leica)150μL，室温孵育10min。苏木素复染，室温孵育5min。
[0068] 3、脱水和透明：去离子水清洗3min；85％
乙醇1min；95％乙醇1min；100％乙醇2min、2次；二
甲苯2min、3次；中性树胶封片。
[0069] 4、镜检：在
显微镜下观察组织中CD117蛋白的表达水平。
[0070] 镜检结果如图2和图3所示所示，图2为阑尾组织(40×)，图3为睾丸组织(40×)，从图中可以看出细胞内CD117蛋白
定位于细胞膜、细胞质，在阑尾、睾丸组织中呈现特异性表达。
