结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法
阅读：155发布：2023-03-26
专利汇可以提供结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 生物 技术领域，具体涉及结合多交叉置换扩增和金纳米检测 肺 炎链球菌的方法，本发明提供的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因 片段 靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；在所述扩增引物C1的5’端标记半 抗原 荧光 素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。，下面是结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法专利的具体信息内容。
1.一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1，其特征在于，
在所述扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；
采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；
以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。
2.根据权利要求1所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为10fg-10ng。
3.根据权利要求1所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度范围为62-67℃。
4.根据权利要求3所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述温度为65℃。
5.根据权利要求1所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。
6.根据权利要求5所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。
7.根据权利要求5所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；
所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。
8.根据权利要求1-7任一项所述的一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，其特征在于，所述引物选自下列序列组合：
如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO：5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID N0：6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO：
8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的扩增引物R2。
结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法
技术领域
背景技术
[0002] 核酸检测，即核酸扩增检测技术泛指以扩增DNA或RNA为手段，从而筛查特定基因的检测技术，核酸扩增技术包括PCR扩增技术、恒温扩增技术等，恒温扩增技术相较PCR及其衍生技术而言，具有不依赖于热循环扩增设备，整个扩增过程恒定在固定的温度，反应速度快，敏感性强，特异性高等特点，有利于实现快速扩增，便捷检测及现场诊断。目前，应用较为广泛的恒温扩增技术有滚环扩增(RCA)、链置换扩增(SDA)、解旋酶依赖的恒温扩增(HDA)、环介导恒温扩增(LAMP)及交叉扩增(CPA)等，检测时存在不够便捷、快速、敏感、特异的问题。
发明内容
[0003] 鉴于上述问题，提出了本发明以便提供一种克服上述问题或者至少部分地解决上述问题的结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法。
[0004] 本发明实施例中提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法(MCDA-LFB)，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1，
[0006] 采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；
[0007] 以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。
[0008] 进一步的，所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为10fg-10ng。
[0009] 进一步的，所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度范围为62-67℃。
[0010] 进一步的，所述温度为65℃。
[0011] 进一步的，进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。
[0012] 进一步的，所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。
[0013] 进一步的，所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。
[0014] 进一步的，所述引物选自下列序列组合：
[0015] 如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO：5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO：8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的扩增引物R2。
[0016] 本发明实施例中的一个或多个技术方案，至少具有如下技术效果或优点：
[0017] 本发明实施例提供的检测方法，在多交叉置换扩增中的扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在扩增引物D1的5’端标记生物素，针对肺炎链球菌特异基因ply的扩增产物能被金纳米生物检测器可视化检测，所述方法便捷、快速、敏感、特异，适宜于推广应用于各种特异核苷酸片段的检测，及应用于该特异核苷酸片段对应的病原菌的检测。
[0018] MCDA的检测原理基于DNA在65℃左右处于动态平衡状态，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链，在此前提下利用不同的特异性引物识别靶基因的特定区域，在链置换型DNA聚合酶的作用下，以外侧引物区段的3’末端为起点，与模板DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。
[0019] LFB检测原理基于抗体(包被在LFB上)和半抗原(在引物的5’端标记)的结合。当有阳性扩增产物时，半抗原标记的扩增序列将与包被在检测线区域的抗体结合，呈现红色，从而对扩增产物进行可视化检测。与其他扩增产物的检测方法相比，LFB相对简单、快速和客观，可在几分钟内显示扩增结果。
[0020] 综上，MCDA扩增技术对原始信号有指数级的放大作用，LFB检测技术简单快速客观。将MCDA扩增技术和LFB检测技术结合则可对原始核酸序列起到指数级的放大作用，极大提高检测精度，缩短检测时间，实现对目的分子的精准检测。MCDA-LFB较既往检测方法能更加快速精准鉴定肺炎链球菌。附图说明
[0021] 通过阅读下文优选实施方式的详细描述，各种其他的优点和益处对于本领域普通技术人员将变得清楚明了。附图仅用于示出优选实施方式的目的，而并不认为是对本发明的限制。而且在整个附图中，用相同的参考图形表示相同的部件。在附图中：
[0022] 图1是本发明实施例中MCDA引物设计的位置和方向示意图；
[0023] 图2是本发明实施例中MCDA扩增原理示意图；
[0025] 图4是本发明实施例中MCDA引物验证结果图谱；
[0026] 图5是本发明实施例中MCDA最佳反应温度测试结果图谱；
[0027] 图6是本发明实施例中MCDA-LFB检测肺炎链球菌的灵敏度结果图谱。
具体实施方式
[0028] 下文将结合具体实施方式和实施例，具体阐述本发明，本发明的优点和各种效果将由此更加清楚地呈现。本领域技术人员应理解，这些具体实施方式和实施例是用于说明本发明，而非限制本发明。
[0029] 在整个说明书中，除非另有特别说明，本文使用的术语应理解为如本领域中通常所使用的含义。因此，除非另有定义，本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域技术人员的一般理解相同的含义。若存在矛盾，本说明书优先。
[0030] 除非另有特别说明，本发明中用到的各种原材料、试剂、仪器和设备等，均可通过市场购买得到或者可通过现有方法制备得到。
[0031] 本申请实施例中的技术方案为解决上述技术问题，总体思路如下：
[0032] 本申请提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1，
[0033] 在所述扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；
[0034] 采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；
[0035] 以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。
[0036] 本申请中，所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为10fg-10ng。
[0037] 本申请中，所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度范围为62-67℃。
[0038] 本申请中，所述温度为65℃。
[0039] 本申请中，进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。
[0040] 本申请中，所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。
[0041] 本申请中，所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。
[0042] 本申请中，所述引物选自下列序列组合：
[0043] 如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO：5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO：8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的扩增引物R2。
[0044] 下面将结合附图和实施例对本申请进行详细说明。
[0045] 1.本发明中所涉及的试剂及设备：
[0046] 抗异硫氰酸荧光素抗体(anti-FITC)，金纳米粒子偶联的链霉素亲和素(SA-G)及生物素偶联的牛血清蛋白(B-BSA)购于Resenbio公司。背板，样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫购于Jie-Yi公司。脱氧核糖核酸恒温扩增试剂盒(lsothermal Amplification Kit)购于北京海泰正元科技有限公司。DNA提取试剂盒(QIAamp DNA minikits)购于德国Qiagen公司。DL1000 DNA Marker购于宝生物工程(大连)有限公司。其余试剂均为市售分型纯产品。
[0047] 本发明实验中使用的主要仪器：恒温实时浊度仪LA-320C(Eiken Chemical Co.，Ltd，Japan)购于日本荣研公司。PCR仪为Sensoquest Labcycler，德国Sensoquest产品；电泳设备为北京君意东方电泳设备有限公司产品；凝胶成像系统为Bio-Rad Gel Dox XR，美国Bio-Rad产品。
[0049] 表1菌株来源
[0050]
[0051] 2.引物设计
[0052] 本发明针对肺炎链球菌特异基因ply设计了一套MCDA扩增引物，引物设计示意图见图1。引物序列及修饰见表2。
[0053] 表2引物序列及修饰
[0054]
[0055] aC1*，在5’端标记异硫氰酸荧光素(FITC)；D1*，在5’端标记生物素(Biotin)。
[0056] bnt，nucleotide，核苷酸；mer，monomeric unit，单体单元。
[0057] 3.MCDA扩增
[0058] 标准MCDA反应体系：交叉引物CP1和CP2的浓度为1.6μM，置换引物F1和F2的浓度为0.4μM，扩增引物C1*，C2，D1*，D2，R1和R2的浓度为0.8μM，12.5μL的2×反应缓冲液，1μL Bst DNA聚合酶(10U)，1μL的DNA模板，补加去离子水至25μl。整个反应恒温在65℃40min，85℃
5min终止反应。
5min终止反应。
[0059] 4.生物检测器(LFB)的设计及原理
[0060] LFB的设计：如图3所示，LFB包含五个部分，样品垫，金标垫，纤维膜，吸水垫及背板。首先将样品垫，金标垫，纤维膜及吸水垫依次组装在背板上。然后将SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)，anti-FITC(抗异硫氰酸荧光素抗体)，及B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)分别包被在金标垫，检测线及控制线(CL)，待干燥后备用。
[0061] LFB的检测原理：将MCDA产物0.2μL直接滴加到LFB的样品垫区域，然后将120μL的检测缓冲液加到样品垫区域，MCDA产物在虹吸作用下，从下往上运动(从样品垫向吸水垫方向运动)。当MCDA产物达到金标垫后，双标产物的一端(即生物素标记端)与SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)反应。当产物继续运动，双标产物的另一端(即异硫氰酸荧光素标记端)与检测线区域的抗体结合，将双标产物固定在检测线区域。随着产物在检测线区域的积累，通过另一端的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)进行显色反应，从而对MCDA产物进行可视化检测。此外，过剩的SA-G(金纳米粒子偶联的链霉素亲和素)可与CL(质控线)区域的B-BSA(生物素偶联的牛血清蛋白)，进行直接显色反应，判断LFB的功能是否正常。
[0062] 结果验证：
[0063] 1.通过MCDA扩增构建可检测产物
[0064] MCDA反应体系包括10条引物，识别靶序列的10个区域，包括2条交叉内引物，即CP1和CP2(Cross Primer，CP)，2条置换引物，即F1和F2，6条扩增引物，即D1，C1，R1，D2，C2和R2。为了构建可检测产物，在扩增引物C1的5’端标记半抗原如异硫氰酸荧光素(FITC)，在扩增引物D1的5’端标记生物素(Biotin)，新标记的引物被命名为C1*和D1*。CP1包含Cls(C1区域的互补序列)和P1，即5′-Cls-P1；CP2包含C2s(C2区域的互补序列)和P2，即5′-C2s-P2。两条交叉引物CP1和CP2是介导MCDA扩增的主要引物；置换引物F1和F2在MCDA反应中发挥置换作用，置换交叉引物CP1和CP2；六条扩增引物D1*，C1*，R1，D2，C2和R2能够加速MCDA反应及增加MCDA产物量，见图2。
[0065] 在既定的恒温条件下，双链DNA在处于半解离和半结合的动态平衡状态中，任何一个引物向双链DNA的互补部位进行碱基配对延伸时，另一条链就会解离，变成单链。首先在Bst DNA聚合酶的作用下，以CP1引物P1区段的3′末端为起点，与对应的DNA互补序列配对，启动链置换DNA合成。F1引物与C1s前端F1s序列互补，以3′末端为起点，通过链置换活性DNA聚合酶的作用，首先置换出CP1引物合成的DNA链，同时合成自身DNA。最终F1引物合成而得的DNA链与模板DNA形成双链。然而由交叉引物CP1先合成的DNA链被F1引物进行链置换产生一单链，该单链的D1s，C1s，R1s，P2s，F2s区域能够依次与扩增引物D1*，C1*，R1，交叉引物CP2及置换引物F2结合，并发挥链置换扩增作用(步骤1，2)。C1*引物扩增并置换D1*的扩增链，生成短片段C1s-D1产物，该产物能够与C1*和CP1引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤3和循环1)。R1引物扩增并置换C1*的扩增链，生成短片段C1s-C1产物，该产物能够与C1*和CP1引物结合，启动链置换扩增，进入循环扩增1(步骤4和循环2)。在循环扩增2中，随着MCDA扩增的进行，大量的双标产物被形成，C1*端标记异硫氰酸荧光素，D1*端标记生物素(图2)。该双标的产物能被金纳米生物传感器检测，从而进行可视检测(图3)。因此，在利用MCDA-LFB技术进行靶序列检测时，可利用C1*和D1*引物构建可检测产物。
[0066] 2.验证MCDA引物的可行性
[0067] MCDA扩增之后，三种检测方法用于MCDA扩增结果的判别(图4)。首先，在反应混合物中加入可视染料(如孔雀石绿试剂，Malachite green，MG)，阳性反应管从无色或浅蓝色变为蓝色，阴性反应保持无色或浅蓝色不变。其次，通过LFB对产物进行检测。最后，MCDA产物可以通过琼脂糖电泳后检测扩增子，由于产物中包含了不同大小的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈特异性阶梯状，阴性反应不出现任何条带。
[0068] 可视颜色变化法：MCDA在合成DNA的同时产生大量的焦磷酸根离子，该离子能够夺取与钙黄绿素结合的锰离子，使钙黄绿素恢复游离状态而发荧光。该发光混合物能够与反应中产生的镁离子结合，使荧光得到增强。可以通过荧光目视检测颜色变化判读结果，阳性对照管从无色或浅蓝色变为蓝色，阴性对照保持无色或浅蓝色不变，见图4A。A1表示阳性扩增(反应管中加入肺炎链球菌ATCC49619模版，作为阳性对照)，A2表示阴性扩增(反应管中加入金黄色萄萄球菌模板，作用阴性对照)，A3表示阴性扩增(反应管中加入伤寒杆菌模版，作用阴性对照)，A4表示空白对照反应(1微升的双蒸水代替模板，作为空白对照)。只有阳性对照出现阳性扩增，说明针对特异基因设计的检测肺炎链球菌的MCDA引物可用。
[0069] LFB检测：将图4A的产物进行LFB检测。由于针对肺炎链球菌的MCDA引物标记的半抗原为FITC(异硫氰酸荧光素)，因此，当TL和CL出现红色条带时表示为肺炎链球菌检测阳性。通过LFB检测法判读MCDA扩增结果，阳性对照出现了预期的结果，而阴性对照和空白对照仅出现CL红色条带，验证了本研究所设计的MCDA-LFB技术及MCDA引物可行，能够用于目的靶序列的检测(图4B)。
[0070] 电泳检测法：将图4A的产物进行电泳检测，由于MCDA的扩增产物包含了许多大小不一的短片段及一系列反向重复的靶序列构成的茎环结构和多环花椰菜样结构的DNA片段混合物，电泳后在凝胶上显现不同大小区带组成的阶梯式图谱，见图4C。通过电泳检测法判读MCDA扩增结果，阳性反应出现了预期的结果，而阴性反应和空白对照未出现任何扩增条带，进一步验证了本研究所设计的MCDA引物可行，能用于靶序列扩增检测。
[0071] 3.确定MCDA技术的最佳反应温度
[0072] 在标准反应体系条件下，加入针对肺炎链球菌(ATCC49619)模板对应的MCDA引物，其模板浓度为1pg/ul。反应在不同的恒温条件下进行(62℃-67℃)，结果运用实时浊度仪进行检测，可得到MCDA引物的扩增动态曲线图(图5)。如图5所示，在不同的温度下均可见到稳健的扩增曲线。根据扩增曲线峰出现的最早时间，推荐65℃作为适宜于本次专利涉及的MCDA引物扩增的最佳反应温度。
[0073] 4.MCDA-LFB检测肺炎链球菌的灵敏度
[0074] 运用连续稀释好的肺炎链球菌(ATCC49619)基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应后，4种检测方法用于MCDA扩增结果判别。
[0075] 首先，采用可视染料法检测MCDA扩增结果(图6A)。在反应混合物中加入可视染料(如孔雀石绿(Malachite green，MG)试剂)，如反应液从无色变为蓝色为阳性反应，仍保持原来的无色则为阴性反应。检测显示：肺炎链球菌(ATCC49619)MCDA的检测范围可低至10fg，阳性扩增管变为蓝色，(图6A：1-5)。而当反应体系中肺炎链球菌(ATCC49619)基因组含量为1fg及以下，或无肺炎链球菌(ATCC49619)基因组模板时，反应液不出现颜色变化，仍然为无色，表示阴性结果(图6A：6-8)。图6A运用染料法可视化读取MCDA扩增结果：图6A中1-
8表示肺炎链球菌(ATCC49619)的模板量为10ng，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，空白对照(双蒸水)。
8表示肺炎链球菌(ATCC49619)的模板量为10ng，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，空白对照(双蒸水)。
[0076] 其二，实时浊度仪用于分析MCDA扩增(图6B)。连续稀释好的肺炎链球菌(ATCC49619)基因组DNA进行标准的MCDA扩增反应同时，运用实时浊度仪实时监测扩增情况，结果显示：肺炎链球菌(ATCC49619)MCDA的检测范围可低至10fg，阳性扩增浊度曲线被观察到。而当反应体系中肺炎链球菌(ATCC49619)基因组含量为1fg及以下，或无肺炎链球菌(ATCC49619)基因组模板时，不出现阳性扩增浊度曲线，表示阴性结果。图6B运用实时浊度仪可视化读取MCDA扩增结果。
[0077] 其三，运用LFB检测MCDA产物(图6C)。结果显示：肺炎链球菌(ATCC49619)MCDA-LFB的检测范围可低至10fg，LFB在TL和CL区域出现红色线(图6C：1-5)。而当反应体系中肺炎链球菌(ATCC49619)基因组含量为1fg及以下，或无肺炎链球菌(ATCC49619)基因组模板时，LFB仅在CL区域出现红色线，表示阴性结果(图6C：6-8)。图6C运用LFB可视化读取MCDA扩增结果：图6C中1-8表示肺炎链球菌(ATCC49619)的模板量为10ng，10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，空白对照(双蒸水)。
[0078] 其四，通过琼脂糖凝胶电泳检测MCDA产物(图6D)。由于产物中包含了大小不同的扩增片段，因此阳性扩增产物的电泳图呈阶梯状，而阴性反应则不出现任何条带。电泳检测显示：肺炎链球菌(ATCC49619)MCDA的检测范围可低至10fg，阳性反应出现阶梯状条带(图6D：1-5)。而当反应体系中肺炎链球菌(ATCC49619)基因组合量为1fg及以下，或无肺炎链球菌(ATCC49619)基因组模板时，则不出现特异的阶梯状条带，为阴性结果(图6D：6-8)。图6D运用电泳法检测MCDA扩增结果；图6D中1-8表示肺炎链球菌(ATCC49619)的模板量为10ng，
10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，空白对照(双蒸水)。
10pg，1pg，100fg，10fg，1fg，0.1fg，空白对照(双蒸水)。
[0079] 5.测定MCDA-LFB技术的特异性
[0080] 以常见的致病菌及条件致病菌DNA为模板评价MCDA-LFB技术的特异性。(菌株信息及检测结果详见衰1)。衰中1号为肺炎链球菌标准菌株ATCC49619，LFB检测结果为阳性；表中2-15号为肺炎链球菌临床分离纯化株，LFB检测结果为阳性；表中16-40号依次为产志贺毒素大肠杆菌、肠集聚性大肠杆菌、肠侵袭性大肠杆菌、肠致病性大肠杆菌、产肠毒素大肠杆菌、伤寒杆菌、弗氏柠檬酸杆菌、李斯特氏菌、单核细胞增多性李斯特氏菌、肺炎克雷伯菌、猪链球菌、奇异变形杆菌、唾液链球菌、深黄奈瑟氏球菌、科氏葡萄球菌、铜绿假单胞菌、阴沟肠杆菌、粘质沙雷氏菌、克柔假丝酵母菌、蜡样芽孢杆菌、大肠杆菌、鲍曼不动杆菌、铜绿假单胞菌、大肠杆菌、无乳链球菌的标准菌株或临床分离纯化株，其LFB检测结果均为阴性。从表中可以看出MCDA-LFB技术能准确的鉴别肺炎链球菌，说明MCDA-LFB方法的特异性良好。
[0081] 以上内容已经用一般性说明及具体的实施结果对本发明做了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所作的修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。
[0082] 实施例1
[0083] 本实施例提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1，
[0084] 在所述扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；
[0085] 采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；
[0086] 以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。
[0087] 所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为1pg/ul。
[0088] 所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度为65℃。
[0089] 进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。
[0090] 所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。
[0091] 所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。
[0092] 所述引物选自下列序列组合：
[0093] 如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO：5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO：8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的扩增引物R2。
[0094] 实施例2
[0095] 本实施例提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1.
[0096] 在所述扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；
[0097] 采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；
[0098] 以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。
[0099] 所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为1pg/ul。
[0100] 所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度为62℃。
[0101] 进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。
[0102] 所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。
[0103] 所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。
[0104] 所述引物选自下列序列组合：
[0105] 如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO：5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO：8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的扩增引物R2。
[0106] 实施例3
[0107] 本实施例提供一种结合多交叉置换扩增和金纳米检测肺炎链球菌的方法，所述多交叉置换扩增MCDA中，含有多条引物，用以识别目标基因片段靶序列的多个区域，并对所述目标基因片段进行所述MCDA反应；所述多条引物包括：一对交叉引物、一对置换引物、6条扩增引物，所述扩增引物包括扩增引物C1和D1，
[0108] 在所述扩增引物C1的5’端标记半抗原荧光素，在所述扩增引物D1的5’端标记生物素，获得新标记的扩增引物C1*和D1*；
[0109] 采用所述扩增引物C1*和D1*，在Bst DNA聚合酶、链置换活性DNA聚合酶、其余引物存在下，使用所述目标基因片段作为模板恒温扩增DNA，获得含半抗原荧光素和生物素标记的双标MCDA基因片段；所述其余引物为除所述扩增引物C1*和D1*外的所述多条引物；
[0110] 以所述双标MCDA基因片段作为检测物，采用金纳米检测方法对肺炎链球菌进行检测。
[0111] 所述MCDA反应中，所述目标基因片段模板浓度为1pg/ul。
[0112] 所述MCDA反应中，所述反应温度为恒温，且温度为67℃。
[0113] 进行所述检测时，依次将所述检测物、检测缓冲液滴加在所述检测器具表面。
[0114] 所述检测物与所述检测缓冲液用量体积比为1∶600。
[0115] 所述检测器具的组成部件包括：样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫及背板，所述样品垫、金标垫、纤维膜、吸水垫、背板按从上至下依次进行设置；所述金标垫中物质包括如下之一：金纳米粒子偶联的链霉素亲和素SA-G、抗异硫氰酸荧光素抗体anti-FITC、生物素偶联的牛血清蛋白B-BSA。
[0116] 所述引物选自下列序列组合：
[0117] 如SEQ ID NO：1所示的置换引物F1，如SEQ ID NO：2所示的置换引物F2，如SEQ ID NO：3所示的交叉引物CP1，如SEQ ID NO：4所示的扩增引物C1*，如SEQ ID NO：5所示的交叉引物CP2，如SEQ ID NO：6所示的扩增引物C2，如SEQ ID NO：7所示的扩增引物D1*，如SEQ ID NO：8所示的扩增引物D2，如SEQ ID NO：9所示的扩增引物R1，如SEQ ID NO：10所示的扩增引物R2。
[0118] 最后，还需要说明的是，术语“包括”、“包含”或者其任何其他变体意在涵盖非排他性的包含，从而使得包括一系列要素的过程、方法、物品或者设备不仅包括那些要素，而且还包括没有明确列出的其他要素，或者是还包括为这种过程、方法、物品或者设备所固有的要素。
[0119] 尽管已描述了本发明的优选实施例，但本领域内的技术人员一旦得知了基本创造性概念，则可对这些实施例作出另外的变更和修改。所以，所附权利要求意欲解释为包括优选实施例以及落入本发明范围的所有变更和修改。
[0120] 显然，本领域的技术人员可以对本发明进行各种改动和变型而不脱离本发明的精神和范围。这样，倘若本发明的这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内，则本发明也意图包含这些改动和变型在内。
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