【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】安全性が高く、美白作用、細胞賦活作用、保湿作用等に優れた化粧料。

【０００２】

【従来の技術】牛の胎盤から得られた水溶性物質の化粧品への利用は古くから行われている。 その成分としては水溶性ビタミン群：チミン、リボフラビン、ピリドキシン、シアノコバラミン、ニコチン酸、パントテン酸、パラアミノ安息香酸、ビオチン、フォック酸、イノシトールや、アミノ酸群：アルギニン、シスチン、ロイシン、
ヒスチジン、グルタミン酸、イソロイシン、リジン、メチオニン、フェニルアラニン、スレオニン、トリプトファン、バリン、セリン、アラニン、ヒドロキシプロリン、アスパラギンや、ミネラル群：カルシウム、ナリウム、カリウム、塩素、珪酸、マグネシウム、銅、コバルト、鉄や、その他の成分：アルカリホスファタゼ、コレステロール、コレステロールエステル、デオキシリボ核酸などが含まれていることが知られている。 そしてその効果としては、皮膚の組織呼吸の作用；メラニン形成阻害；皮膚柔軟化作用；小じわ、肌あれの改善などが報告されている。 現在まで、胎盤抽出液の有効性を上げるために特願昭６２−１１６５１９号公報のように高分子成分に着目して種々の検討がなされている。

【０００３】一方、リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムは化粧品原料基準外成分規格に記載されており、既に安全性と有効性については確認がなされている。

【０００４】

【発明が解決しようとする課題】本発明者が、従来の牛の胎盤から得られた水溶性物質のアレルギー試験を行った結果、いずれの検体にも、陽性反応を示し、その中に感作性物質が含まれていることが分った。 また、生体抽出物にはホスファターゼが広く分布しているため、リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムと共に化粧品に配合すると、加水分解され、アスコルビン酸となる。 これは容易に酸化してしまうため、これらの酵素の除去も必要となる。 しかし、このアレルギー源となる物質及びホスファターゼを除去すれば、同時に胎盤抽出液の有効性も失われることが憂慮された。 本発明の目的は、これらの生物由来原料より感作性物質及びホスファターゼが少なく、美白作用、細胞賦活作用、保湿作用等に優れた化粧料を提供することである。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者は前記課題を解決するため鋭意研究を行った結果、水溶吐胎盤抽出液の分子量分画により有効性を保持しつつ、感作性物質及びホスファターゼを除去できることを見いだし、さらにリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムを混合して用いることによって非常に強い美白作用を発揮することを発見し、本発明を完成した。

【０００６】即ち本発明は健康な牝牛の胎盤より血液等の不純物を洗浄、除去後、粥状胎盤となし、水溶性成分のみを低温下で抽出を行い、更に遠心分離及び無菌濾過を行って水溶性胎盤抽出液を得、該抽出液を限外濾過又はゲル濾過にかけて、分子量分画を行うが、分子量分画の限界分子量を９００〜１１００の範囲として、この限界分子量超の成分を除去することを特徴とする抽出物とリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムの化粧品原料の提供である。 胎盤としては妊娠３〜４箇月の健康な牝牛の胎盤が好ましい。 動物抽出成分は蛋白分解物を主成分とするので、一定分子量を超える成分は、感作性を有することが予想された。 しかし一方、ある分子量を超える成分を除去することは水溶性胎盤抽出液の有効性の一部を除去する結果となることも考えられる。 本発明者は、
水溶性胎盤抽出物の分子量約１０００超の成分を除去してみたところ、感作性をなくすことができ、しかも細胞賦活、メラニン形成阻害、皮膚柔軟化作用、小じわ、肌あれの改善の有効性は保持されていることが各種の実験によて証明された。

【０００７】次に原料の製造方法を詳述する。 〔牛胎盤抽出液〕妊娠３〜４箇月の健康な牝牛の胎盤より血液等の不純物を洗浄除去する。 胎盤は通常凍結した形態で入手するので、解凍した後、組織を細砕できる方法例えばミンチの機械、ミキサー、ホモジスパー等で細砕する。 これら総ての操作は５℃以下程度の低温で実施しなければならない。 従って細砕に当っても発熱する方法は取れないのと、この後、組織内の血液等の不純物を除去する工程があるので、余りすり潰して有効成分の流出をまねくことも好ましくない。 血液等の不純物を除去する工程は、圧搾機で行うのが好ましい。 最終工程で、
限外濾過の工程があるので厳密に行う必要はない。 この後、ブタノール水溶液を抽出溶媒として加えるが、ブタノールの濃度は１５〜５０重量％が好ましい。 加える溶媒の量は、胎盤の湿重量の２〜５倍が適当である。 ブタノール水溶液を加えた後、よく攪拌均質化して、水溶性成分を低温下で抽出を行う。 そして、固体相等の溶解しない部分を濾過或いは遠心分離を行って除き、静置してブタノール層を除き、酢酸、クエン酸等で弱酸性、好ましくはＰＨ４．５〜５．０に調整し、攪拌する。 この操作によて生じた沈澱、浮遊物等を遠心分離して除く。 更にブタノールを完全に取り除くため、減圧濃縮する。 この濃縮は元の量の３分の１〜１０分の１位になるように実施する。 得られた液に防腐剤とエタノールを加えるが、最後の工程に凍結乾燥の工程を加えて粉末状にする場合には、この必要はない。 またエタノールは、この化粧品原料を貯蔵しておくとき、脂肪酸等の影響で沈澱を生じるおそれがあるので添加するが、その濃度は２〜１
０重量％が適当である。 この液から、感作性成分を除去するために限外濾過又はゲル濾過の方法で分子量分画を行う。 この分子量分画は、限界分子量を約１０００として分画するが、限外濾過等の精度を考慮すると、この限界分子量が９００〜１１００の間にあればよい。 限界分子量が９００未満であれば、化粧品原料としての有効成分が失われるおそれがあり、又１１００超であると感作性成分が残ってくるおそれがあって好ましくない。 この後、メンブランフィルター等を用いて菌濾過を行い、本発明の化粧品原料を得る。 最終的に凍結乾燥等の方法を実施して、粉未状にすることも可能である。 これらの諸工程はすべて低温下で、好ましくは５℃以下の温度で実施する。

【０００８】〔製造例〕以下に製造例によって、本発明を更に具体的に説明するが、本発明は、この製造例によって何等限定されるものではない。 ％は乾燥重量当りである。 （製造例） 〔牛胎盤抽出液〕妊娠３〜４箇月の健康な牝牛の新鮮な胎盤１００ｋｇの凍結物を融解後、ミンチ機械にて細砕した。 これを圧搾機で血液等を除き、これに精製水５０
リットルとブタノール１００リツトルとを加えて、４℃
で１０時間攪拌均質化した。 遠心分離し、沈降した部分を除き、上澄を濾過した。 これを静置してブタノール層を捨てた。 酢酸でｐＨ４．７に調整し、３時間攪拌したの遠心分離し静置した。 遠心分離し、沈降した部分を除き、上澄を濾過した。 これを２００リツトルになるまで減圧濃縮した。 この液を限外濾過で分子量１０００超の成分を除去した。 この分子量１０００以下の成分を後記の化粧品原料の実施例で得た胎盤抽出液とした。 この限外濾過前の水溶性胎盤抽出液全体を比較製造例１とし、
分子量１００００以上の成分を比較製造例２、分子量１
０００〜１００００の成分を比較製造例３、分子量１０
００以下の成分を製造例１と表示する。 試験方法は次の方法によった。 （１）感作性試験（Ｍａｘｉｍｉｚａｔｉｏｎ Ｔｅｓ
ｔ） ハトレー系白色モルモット１５匹を用い、１０匹は感作処置用、５匹は誘発時の対照とする。 （対照群は検体を皮膚に塗布したとき、感作性以外の反応（１次刺戟）があるかをみて、感作群と比較するための群である。） （感作１） 肩甲骨上皮膚を刈毛しアジュバント （免疫増強剤） 検体、検体十アジュバントをそれぞれ左右２ケ所０．０５ｍｌずつ皮内注射する。 （１週間経過） （感作２）同部位に１０％ラウリル硫酸ナトリム（ＳＬ
Ｓ）を塗布し、さらに２４時間後、検体０．２ｍｌを４
８時閉塞貼布した。 （２週間経過） （誘発）腹側部を刈毛し、検体０．２ｍｌを開塞貼布した。 （２４時間経過） （誘発とは感作１、２で抗原抗体反応で体内に抗体が生成された後、もう一度抗原を塗布してアレルギー反応が起るかどうかを見ることをいう。） （判定）貼付除去後１、２４、４８、７２時間後に判定する。 （判定基準） Ｓｃｏｒｅ ０：肉眼的に変化なし １：軽度またはまばらな紅斑 ２：中等度の紅斑 ３：強度の紅斑および浮腫 １０匹のｓｃｏｒｅを合計して平均値を表示する。 （２） 細胞毒性、細胞賦活性試験 カバーガラスの入った６ｃｍのシャレーにＥａｇｌｅ
ＭＥＭ（牛胎児血清２０％）培地を５ｍｌずつ分注 ＪＴＣ−１７細胞（毒性試験＝３０万個、賦活性試験＝
２０万個）浮遊液を添加５％ＣＯ _２ ，３６℃，４８時間培養 緩衝液ＰＢＳ（−）（ＮａＣｌ ８．０ｇ，ＫＣｌ
０．２ｇ，Ｎａ _２ ＰＯ _４ １．１５ｇ，ＫＨ２ＰＯ４
０．２ｇを含む緩衝液）で２度洗浄 毒性試験 ＰＢＳ（−）で各濃度に希釈した試料３ｍｌを加え、３
６℃，６０分培養後、Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ（牛胎児血清２０％）培地７ｍｌ分注し、５％ＣＯ _２ ３６℃，８時間培養、固定、染色、判定 賦活性試験 Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ（無血清）培地で各濃度に希釈した試料５ｍｌと牛胎児血清０．０５ｍｌを加え、５％ＣＯ
_２ ３６℃，８時間培養、固定、染色、判定 ◇細胞毒性・細胞賦活性試験判定基準 〔１〕細胞数による判定（異常細胞数も含む） Ｓｃｏｒｅ−３：Ｃｏｎｔｒｏｌのほぼ１．５倍（大巾に増加） −２：Ｃｏｎｔｒｏｌの４／３位（肉眼でも分かる程度に増加） −１：Ｃｏｎｔｒｏｌとほぽ同じ（僅かに染色濃度勝る） ０：Ｃｏｎｔｒｏｌと同じ １：Ｃｏｎｔｒｏｌとほぼ同じ（僅かに染色濃度劣る） ２：Ｃｏｎｔｒｏｌの２／３位（肉眼でも分かる程度に減少） ３：Ｃｏｎｔｒｏｌのほぽ半分（大巾に減少） ４：Ｃｏｎｔｒｏｌの１／３位（細胞数はごく僅か） ５：細胞を認めない（全く、または殆ど認めない） 〔２〕 細胞形態による判定 Ｓｃｏｒｅ ０：正常像 １：異常細胞が僅かに認められる（正常細胞８０％以上） ２：異常細胞が認められる（正常細胞５０％以上） ３：異常細胞が多数認められる（正常細胞２０〜５０％
位） ４：殆ど異常細胞である（正常細胞１０％位） ５正常細胞を認めない（△：染色性低下細胞） 第３表、第４表において、最初の数字は細胞数による判定結果を、括弧内の数字は細胞形態による判定結果を示す （３） メラニン生成抑制試験 Ｅａｇｌｅ ＭＥＭ培地に牛胎児血清１０％および試料を加え、検体とする。 ６ｃｍシャーレに検体を入れ、Ｂ
１６細胞１×１０ ^５ ｃｅｌｌ／０．１ｍｌ加え、５％Ｃ
Ｏ _２ 、３７℃で培養し３日目に検体を交換する。 （培養細胞は付着性であるので、培養３日目に培養瓶を使けて培養液のみを捨てて、検体の入った培養液を培養瓶の中に入れて再度培養することを意味する。）培養６日目に細胞を剥離し（付着性であるので物理的に剥離）遠心分離して、白色化度を観察する。 （判定基準）白色度による判定 Ｓｃｏｒｅ −：自色化なし ＋：わずかに白色化 ＋＋：明らかな白色化 ＋＋＋：強い白色化 ＋＋はメラニン生成抑制能力があることを表わし、＋が多い程、メラニン生成抑制能力が強いことを示す。 （４）ホスファターゼ定量試験 １）試薬及び試液 ａ）緩衝液 ０．１Ｍ炭酸ナトリウム溶液１０００ｍｌに０．１Ｍ炭酸水素ナトリウム溶液滴下混合し、ｐＨを正確に１０．
５０とした液１０００ｍｌに塩化マグネシウム（ＭｇＣ
ｌ _２・６Ｈ _２ ０）２０．３ｍｇを加えて製する。 ｂ）基質液 フェニルリン酸ナトリウム（試薬特級）０．５０８ｇ、
４−アミノアンチピリン０．０８１ｇをａ）の緩衝液に溶かし、２００ｍｌとする。 ｃ）発色液 ほう酸２．５ｇ、フェリシアン化カリウム０．４０ｇを水にとかし、２００ｍｌとする。 ｄ）フェノール標準液 純フェノール５．０ｇを０．１Ｎ塩酸にとかし、１００
０ｍｌとする。 この液は日局「塩酸加フェノール水」の項の定量法を準用して正確な濃度を求める。 ２）操作 本品１ｍｌを正確に量り、水２ｍｌを加えて検液とする。 試験管に基質液４ｍｌを取り、３７℃の恒温層に入れて約５分間加温する。 次に検液０．１ｍｌを加え正確に１５分間３７℃に保ち、発色液４ｍｌを加えて振混ぜる。 これにつき約１０分後５００ｎｍにおける吸光度（Ａγ）を測定する。 対照として検液のかわりに蒸留水０．１ｍｌを使用し、全く同様の操作を行って得たもの（Ａο）を用いるＡγ−Ａοの値を計算し、別に作成した検量線により、その吸光度に相当するフェノール標準液の濃度（Ｃ．ｍｇ／ｄｌ数）を求める。 本品のアルカリホスファターゼ単位＝Ｃ×３（キングアームストロング単位、試料１ｄｌが上の条件で１５分間に遊離するフェノールのｍｇ数）

【０００９】次に製造例により製造した胎盤抽出液とリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムを配合した化粧品の実施例を示すと共に、該化粧品の有効性の確認試験の結果を示す。 （実施例１）エモリエントクリーム１ （重量％） Ａ 流動パラフィン ５．０ ミリスチン酸オクチルドデシル ３．０ ホホバ油 ２．０ ラノリン ２．０ セタノール ５．０ ステアリン酸 ４．０ パルミチン酸 ４．０ グリセリンモノステアレート ３．０ ポリオキシエチレン（２０モル）セチルエーテル １．０ 酸化防止剤 ０．２ Ｂ 精製水 ５１．１ トリエタノールアミン １．０ １，３プチレングリコール ７．０ プロピレングリコール ５．０ 防腐剤 ０．２ Ｃ 製造例１で得た胎盤抽出液 ５．０ リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウム １．０ Ｄ 香料 ０．５ ＡとＢとをそれぞれに計量し、約７０℃に加温しＡを攪拌しＢを徐々に加えて６０℃になったら、ＣとＤを加えて室温まで冷却する。 （実施例２）ローション Ａ 香料 ０．１ スクワラン ０．２ ポリオキシエチレン（２５モル）オレイルエーテル ３．０ ポリオキシエチレン（２０モル）ソルビタンモノオレエート ２．０ Ｂ 精製水 ６８．５ グリセリン ８．０ ジプロピレングリコール ２．０ ポリエチレングリコール１０００ ５．０ カルボキシビニルポリマー（１．０％水溶液） ５．０ 製造例１で得た胎盤抽出液 ５．０ リン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウム １．０ 防腐剤 ０．２ Ａを計量し、約７０℃に加温、攪拌しつつ冷却する。 Ａ
を攪拌しつつ、Ｂを加える。

【０００９】（比較実施例・１）実施例・１の製造例１
で得た胎盤抽出液をＡ社製の胎盤抽出液に置き換え、その他は同様にしてエモリエントクリームを作成した。 （有効性の確認方法）実施例・１と比較実施例・１を１
０２名の女性（１８〜５４才）で試験を行った。 テスト方法はランダムに５１名ずつに分け、１群は実施例・１
を、他方は比較実施例・１を１ヶ月間使用してもらった。 その結果、刺激があるとした人の人数は 実施例・１ ０名 比較実施例・１ ３名 であった。

【００１０】使用テスト 女性６名づつの顔面を左右に分け、一方を実施例、もう一方を比較例として毎日、１回以上使用してもらって、
３週間後、アンケートした。 比較例１・ 実施例１よりリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムを除いたもの 比較例２・ 実施例１より胎盤抽出液を除いたもの 比較例３・ 実施例１よりリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムと胎盤抽出液を除いたもの 比較例４・ 実施例２よりリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムを除いたもの 比較例５・ 実施例２より胎盤抽出液を除いたもの 比較例６・ 実施例２よりリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムと胎盤抽出液を除いたもの

【００１１】

【００１２】

【発明の効果】製造例の胎盤抽出液を分子量分画した各成分の試験結果をみると、細胞賦活性においては、抽出液全体及び他の分子量１０００超の成分と変わりないが、細胞毒性においては、抽出液全体及び他の成分よりはるかに微弱となっている。 メラニン生成抑制効果においても、抽出液全体および他の成分よりも抑制能力が強い。 特に本発明で目的とする感作性の点については、本発明方法で製造した分子量１０００以下の成分は、他の成分が感作性が中であるのに対し、全く感作性が認められない。 またアルカリホスファターゼも完全に除去されているためリン酸Ｌ−アスコルビルマグネシウムと共に配合しても分解の恐れがない。 さらに、牛の胎盤抽出物とリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムをそれぞれを単独で使用した化粧品よりも、美白作用の点で有意な差が認められた。 即ち本発明によれば、分子量分画した牛の胎盤抽出物とリン酸−Ｌ−アスコルビルマグネシウムを共に化粧品に配合する事により、感作性及びホスファターゼも少なく、単独で配合するよりも優れた美白作用の効果を発揮する。 また、当然であるが、各々が持っている、細胞賦活、保湿作用等も発揮する。