Fibroblast growth factor derived from milk
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CONSTITUTION: This fibroblast growth factor(FGF) derived from a milk is obtained by using a cream fraction obtained by the centrifugation of the milk of available mammals (e.g. a cow), especially a foremilk until 24hr postpartum. Since a part of cow's foremilk-FGF is present in a whey, this fraction can also be used. In this FGF, isoelectric points exist at the acidic side of 5-6 and at the basic side of 8-10, and further it has a potent affinity to heparin or heparan sulfate. FGF is a factor to enhance growth of mouse fibroblasts, especially demonstrates a potent activity to endotherial cells in blood vessels and widely produced and distributed in tissues and cells of the living body such as hypothalmus, brain, retina, eyes, kidneys, cardiac muscles, hepatic cells, prostate, placenta, cartilage, spleen, endothelial cells, fibroblasts, cerebral gland and macrophages, but its existence in the cells of mammalian gland and in the milk has not been reported.
COPYRIGHT: (C)1996,JPO，下面是Fibroblast growth factor derived from milk专利的具体信息内容。
【発明の詳細な説明】
【０００１】
【産業上の利用分野】この発明は、入手可能な哺乳類の乳汁由来新規線維芽細胞増殖因子に関するものである。
【０００２】
【従来の技術】線維芽細胞増殖因子（FGF）は、マウス線維芽細胞の増殖を促進する因子として、牛の脳及び下垂体から単離された。 当初、線維芽細胞に特異的に作用すると考えられていたが、現在では間葉系細胞、神経細胞、上皮細胞などに広く作用し、特に血管内皮細胞に強い活性を有することが明らかにされている。 なおFGFは等電点（pl）が５〜６の酸性FGF（aFGF）とplが９〜10
の塩基性（bFGF）に区別されている。
【０００３】aFGF，bFGFはともに、視床下部、脳、網膜、眼、腎、心筋、肝細胞（再生時）、前立腺、胎盤、
軟骨、脾、内皮細胞、線維芽細胞、脳線、マクロフア−
ジなど生体内各組織や細胞で広く産生、分布しているが、乳腺細胞や乳汁中での存在は報告されていない。 しかし、哺乳類の乳はそれぞれの種の新生子にとつて唯一の完全食であり、それらの中には発育に不可欠な種々の栄養成分の他にも、インスリン様増殖因子（Francis,
GL et al, Biochem. J., 251, 95-103, (1988))、上皮細胞増殖因子(Shin. YW et al, Endocrinology, 1
15, 273-282 (1984))、形質転換増殖因子（Noda, K. et
al, Gann, 75, 109-112（1984）,Tokuyama,H., et al,
Growth Factors, 3, 105-114(1990))など、種々の活性を有する増殖因子を特に初乳中に多く含有している。
【０００４】そこで発明者らは、多様な機能を有するFG
Fも当然含有されていると考え、FGFの特徴であるヘパリンやヘパラン硫酸（HS）親和性に着目し、この発明を完成した。 すなわち、乳脂肪球皮膜（MFGM）には、HSプロテオグリカンの存在が明らかにされている(Shimizu,
M., et al, Agric. Biol. Chem., 45, 741-745(198
1))。 一般的にFGFは生体内各細胞で産生された後、細胞膜や基底膜に存在するHSプロテオグリカンと結合し、貯蔵、安定化されている(Folkman, J. et al, Am. J.Path
ol., 130, 393-400(1988), Gospodarowicz, D. et al,
J. Cell Physiol.,128, 475-484 (1986))。 したがつて、乳においても乳腺細胞で産生された後、その大部分はMFGMのHSプロテオグリカンに存在することが予測される。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】既述のように、乳中の増殖因子を検索するにあたり、すべての研究者はホエ−
蛋白質を中心に行なつていた。 発明者らは乳中に存在する新たな増殖因子を検索するにあたり、MFGMを中心に主に免疫検定法を用いて行ない、ウシ初乳(BC)にBC-aFGF
とBC-bFGFの存在を見いだした。
【０００６】この発明は等電点が５〜６の酸性側にあり、等電点が８〜１０の塩基性側にあり、又はヘパリン又はヘパラン硫酸に対して強い親和性を有する乳由来線維芽細胞増殖因子を提案するものである。
【０００７】
【作用】この発明の特徴は、BC-FGF製造の原料として、
哺乳類の乳(特に初乳)のクリ−ム画分を用いることにある。 しかし、BC-FGFの一部はホエ−中にも存在するため、この画分を用いることもできる。 また、乳は入手可能なものであれば、その種類を問わない。
【０００８】次に実施例によつてこの発明を詳細に説明する。 例１、免疫検定用試料の調製：分娩後24時間までの牛初乳から遠心分離（3000rpm、20min)によつて得たクリ−ム画分を、0.15MNaCl加0.1Mトリス-塩酸バツフア−(pH7.0)に分散させた後、遠心分離した。 この操作を３回繰り返してクリ−ム画分を洗浄した後、凍結乾燥した。 乾燥クリ−ム１容に５容のアセトンを加え、室温下で１時間攪拌した。 この操作を３回繰り返えし、アセトン不溶物を遠心分離で集め、減圧下で残存アセトンを除去し、クリ−ム画分のアセトンパウダ−を作成した。
【０００９】アセトンパウダ−を２MNaClと６M尿素を含む0.1Mトリス塩酸バツフア-(pH7.0)に溶解し、２M NaCl
と６M尿素を含む同じバツフア−で平衡化したス−パ−
デツクス75（ファルマシア社製）カラムに負荷し、ゲル濾過した。 分画物をFGF抗体を固定化したセンサ−チツプを用いて、BIAcore(ファルマシア社製)でモニタ−
し、FGF抗体と反応する画分を集め、0.15M NaClを含む2
0mMトリス-塩酸バツフア−(pH7.0)に対して透析した。
これをレチノイン酸固定化セルロフアイン(生化学工業社製)カラムと、Cu−キレ−トセルロフアイン（生化学工業社製）カラムを直接結合したカラムに負荷し、非吸着画分を集め、コンカナバリンＡセフアロ−スカラム（フアルマシア社製）に負荷した。
【００１０】非吸着画分を直接ヘパリン−セファロ−ス（ファルマシア社製）に負荷し、2.0M NaClまでの直線的濃度勾配法で溶出した。 1M NaCl付近と1.5M NaCl付近に溶出される物質を集め、それぞれ脱イオン水に対して透析した後、凍結乾燥した。 これを常法に基づいてSDS
電気泳動した後、常法に基づいてウエスタンブロツトした。 染色用に用いた抗体は、aFGF抗体とbFGF抗体（共にシグマ社製）である。 また同じ調製物を常法でELISAを行ない、aFGFとbFGFの含量を測定した。 aFGFとbFGFは牛初乳1LにaFGFは数μg、bFGFは20〜30μg含まれていた。
【００１１】例２、活性測定用試料の調製：例１に記載の洗浄クリ−ムに最終尿素濃度が６Mになるように固形尿素を加え、pHを7.0に調製した。 氷冷下でポリトロンで攪拌(12,000rpm,10min)し、生じたバタ−塊と不溶物を遠心分離（3,000rpm,15min)で除去した。 得た清澄液にNaClを2.0Mになるように加え、例１に記載のス−パ−
デツクス75（ファルマシア社製）カラムに負荷した。 以降例１に記載の方法によりaFGFとbFGFを調製した。 また、ヘパリン−セファロ−スカラムに負荷する前のコンカナバリンＡセファロ−スカラム非吸着画分と、ヘパリン−セファロ−スカラム1.0M NaCl溶出画分と、1.5M Na
Cl溶出画分を、それぞれアイソエレクトリックフォ−カシング(バイオラッド社製) pH3.5〜10の範囲で等電分画し、それぞれの画分の活性を測定した。 ホエ−からは、
酸−エタノ−ル法で脱カゼインし、得たホエ−を7.0に調製した後、例１に記載の方法で調製した。
【００１２】活性測定は、牛臍帯由来内皮細胞を５％牛胎児血清加RPMI 1640 で５%CO 2 、37℃、48時間予備培養し、血清を含まない同じ培地に交換した後、調製した1.
0MNaCl溶出物(BC-aFGF)と、1.5M NaCl溶出物(BC-bFGF)
を、0〜100ng/ml培地に添加し、さらに同一条件下で72
時間培養した。 培養後の細胞数をカウントし、活性を測定した。
【００１３】結果を図１に示す。 この図１に示したように、BC-FGFはpH５〜６と８〜10に等電点を示す２つに大別される増殖因子を含有している。 ヘパリン−セファロ−スカラムでの1.0M NaCl溶出画分の等電点は５〜６であり、1.5M NaClで溶出される画分のそれは８〜10であつた。 これらは内皮細胞に対し非常に強い活性を示すとともに、マウス3T3細胞(線維芽細胞)などにも作用した。
【００１４】また分娩後１〜２週間以内のヒト乳にもFG
Fは認められることから、FGFは単胃動物、反芻動物を問わずそれらの初乳中に分布していた。 さらに、分娩後16
時間以内のウシやヒト初乳から分離培養した乳腺細胞を、それぞれbFGF抗体で細胞染色するとともに、それぞれの培養培地を部分精製し、常法でウエスタンブロツテイングすると、それぞれの抗体に対し、明瞭な陽性反応を示した。 このことから、ウシやヒト乳中に存在するFG
Fは乳腺細胞で産生されたものであることを確認した。
【００１５】
【発明の効果】この発明によれば、入手可能な哺乳類の乳のクリ−ム画分を用いて、容易に乳汁由来新規線維芽細胞増殖因子を産生できるものである。
【図１】各種の条件下におけるウシ初乳の等電点を示す図である。
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