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中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基

阅读:122发布:2022-10-02

专利汇可以提供中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供了污 水 中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基。本发明的筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法包括:将污水样本在液体BM培养基中扩大培养,经过梯度稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养,初步筛选得到污水中的菌株;其中,所述BM培养基包括:每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4和0.1-0.3g MgSO4,加入超纯水至1000mL;每1000mL固体培养基中可在液体培养基 基础 上含有14-16g琼脂。本发明的技术能有效地筛选到对药物降解效率高的工程菌株。,下面是中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基专利的具体信息内容。

1.一种筛选污中可降解残留药物的菌株的方法,该方法包括:
将污水样本在液体BM培养基中扩大培养,经过稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养,初步筛选得到污水中的菌株;
其中,所述BM培养基包括:
每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4和0.1-0.3g MgSO4,加入超纯水至1000mL;
每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4和14-16g琼脂,加入超纯水至1000mL。
2.根据权利要求1所述的方法,该方法还包括:
在FM培养基中加入两种以上不同浓度的污水残留药物的混合物,接种初步筛选得到的菌种,培养24h以上后,利用Agilent HP1100液相色谱质谱联用技术检测培养基中药物含量,进一步筛选除药物降解菌。
3.根据权利要求2所述的方法,其中,所述FM培养基包括:
每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.4-0.6g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏,加入超纯水至1000mL。
4.根据权利要求2所述的方法,其中,所述污水残留药物选自以下中的至少两种:头孢苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylic acid)。
5.根据权利要求1所述的方法,该方法包括:
取1-2mL从城市污水处理厂采集的污水样本,加入到15-20mL BM液体培养基中,调节转速为150-200RPM,温度为26-30℃,放置在摇床上培养3-5天;
将富集的培养液分别按照1X、3X、5X、10X的稀释比例,再次加入到BM液体培养基中培养
24-48h;
之后将各个梯度的培养液分别涂布于BM固体培养基上,在26-30℃的条件下倒置培养
3-5天;
将培养的菌株进一步在新的平板上分离纯化,得到初步筛选的菌株,根据颜色、形态和
16S rRNA基因的序列比对结果,将分离纯化的菌分类。
6.根据权利要求5所述的方法,该方法还包括:
选取以下药物中的至少两种:头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylic acid),混合后,按照0.1ppm和1ppm两种浓度分别加入灭过菌的FM液体培养基中;
在无菌操作条件下,将初步筛选的菌株富集培养后分别接种于上述加入残留药物的灭过菌的FM培养基中,26-30℃,150-200RPM培养3-5天;
培养得到的混合液离心,之后用Oasis HLB纯化柱和Agilent HP1100液相色谱质谱串联法分离和检测药物含量,筛选出药物降解菌。
7.一种用于筛选污水中可降解残留药物的菌株的培养基,该培养基包括液体和/或固体形式的改进的BM培养基,所述改进的BM培养基包括:
每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4和0.1-0.3g MgSO4,加入超纯水至1000mL;
每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4和14-16g琼脂,加入超纯水至1000mL。
8.根据权利要求7所述的培养基,该培养基还包括液体形式的改进的FM培养基,所述改进的FM培养基包括:
每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.4-0.6g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏,加入超纯水至1000mL。

说明书全文

中残留药物降解菌的筛选方法及所用培养基

技术领域

[0001] 本发明属于污水中可降解药物的菌株筛选技术,具体而言,本发明是关于一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法、该方法中所用到的培养基组合物、该方法所筛选到的污水中残留药物降解菌、以及利用所述降解菌对污水中残留药物进行降解的方法。

背景技术

[0002] 据研究报道,目前城市污水处理厂经过处理的污水仍然残留有多种药物,常见的残留药物如头孢苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylic acid)等,这类污水直接排放到环境中,会对自然环境造成很大污染,对人类造成潜在危害。
[0003] 为能去除污水中的残留药物,筛选一些能降解污水中残留药物的生物是当前生化处理污水的一个研究方向。
[0004] 现有的可降解残留药物的微生物菌种的筛选方法,多为LB培养基方法。然而,实际实验表明,采用LB培养基筛选方法,难以有效地全面筛选到对药物降解效率高的工程菌株,所筛选到的菌株种类有限,基本都是已知的种属,不具有检测残留药物降解性的意义。

发明内容

[0005] 本发明主要是提供一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法,还提供了该方法中所用到的培养基组合物,以有效地筛选到对药物降解效率高的工程菌株,用于降解污水中残留药物。
[0006] 一方面,本发明提供了一种筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法,该方法主要是利用培养基BM(Basic Medium)分离污水中的菌株,具体如下:把采集的污水样本分别在液体培养基BM中扩大培养,经过梯度稀释(例如按照1X、3X、5X、10X的稀释比例)后再在固体培养基BM上涂布平板培养,初步筛选得到污水中的菌株。进一步,本发明在培养基FM中加入两种不同浓度的污水常见残留药物的混合物,培养后,利用Agilent HP1100液相色谱质谱联用技术检测两种培养基中各自的药物含量,计算得到各个菌株对各种药物的降解效率,从而进一步筛选药物降解菌。
[0007] 具体地,本发明提供的筛选污水中可降解残留药物的菌株的方法包括:
[0008] 将污水样本在液体BM培养基中扩大培养,经过梯度稀释后再在固体BM培养基上涂布平板培养,初步筛选得到污水中的菌株;
[0009] 其中,所述BM培养基包括:
[0010] 每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4和0.1-0.3g MgSO4,加入超纯水至1000mL;
[0011] 每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4和14-16g琼脂,加入超纯水至1000mL。
[0012] 根据本发明的具体实施方法,本发明的方法还进一步包括:
[0013] 在FM(Fermentation Medium)培养基中加入两种以上不同浓度的污水残留药物的混合物,接种初步筛选得到的菌种,培养24h以上后,利用Agilent HP1100液相色谱质谱联用技术检测培养基中药物含量,进一步筛选除药物降解菌。
[0014] 根据本发明的具体实施方法,本发明的方法中,所述FM培养基包括:
[0015] 每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.4-0.6g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏,加入超纯水至1000mL。
[0016] 根据本发明的具体实施方法,本发明的方法中,所述污水残留药物选自以下中的至少两种:头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylic acid)。
[0017] 在本发明的一更具体实施方案中,本发明的方法包括:
[0018] 取1-2mL从城市污水处理厂采集的污水样本,加入到15-20mL BM液体培养基中,调节转速为150-200RPM,温度为26-30℃,放置在摇床上培养3-5天;
[0019] 将富集的培养液分别按照1X、3X、5X、10X的稀释比例,再次加入到BM液体培养基中培养24-48h;
[0020] 之后将各个梯度的培养液分别涂布于BM固体培养基上,在26℃的条件下倒置培养3-5天;
[0021] 将培养的菌株进一步在新的平板上分离纯化,得到初步筛选的菌株,根据颜色、形态和16S rRNA基因的序列比对结果,将分离纯化的菌分类。
[0022] 更进一步地,该方法还包括:
[0023] 选取以下药物中的至少两种:头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylic acid),混合后,按照0.1ppm和1ppm两种浓度分别加入灭过菌的FM液体培养基中;
[0024] 在无菌操作条件下,将初步筛选的菌株富集培养后分别接种于上述加入残留药物的灭过菌的FM培养基中,26-30℃,150-200RPM培养3-5天;
[0025] 培养得到的混合液离心,之后用Oasis HLB纯化柱和Agilent HP1100液相色谱质谱串联法分离和检测药物含量,筛选出药物降解菌。
[0026] 本发明相较于传统的LB培养基方法,能够分离得到更多具有药物抗性的菌株,极大地提高了污水残留药物地降解效率。
[0027] 另一方面,本发明还提供了一种用于筛选污水中可降解残留药物的菌株的培养基,该培养基包括液体和/或固体形式的改进的BM培养基,所述改进的BM培养基包括:
[0028] 每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4和0.1-0.3g MgSO4,加入超纯水至1000mL;
[0029] 每1000mL固体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.25-0.75g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4和14-16g琼脂,加入超纯水至1000mL。
[0030] 根据本发明的具体实施方案,本发明的培养基还包括液体形式的改进的FM培养基,所述改进的FM培养基包括:
[0031] 每1000mL液体培养基中含有0.4-0.6g NaCl、1-2g NH4Cl、1-2g K2HPO4、0.4-0.6g KH2PO4、0.1-0.3g MgSO4、0.75-1.25g蛋白胨、0.25-0.75g酵母膏,加入超纯水至1000mL。
[0032] 另一方面,本发明还提供了一种可降解污水中残留药物的菌株,其是按照本发明所述的方法筛选得到的。
[0033] 另一方面,本发明还提供了利用所述降解菌对污水中残留药物进行降解的方法。
[0034] 本发明的有益效果:
[0035] (一)与传统用LB培养基方法相比,本发明所用的培养基可以分离得到更加丰富的菌株。在本发明的一具体实施例中,从同样采自香港沙田污水处理厂的污水样品中,本发明共分离得到22株细菌,而同时用LB培养基,只分离得到5株菌,BM方法是LB方法的4-5倍。一定程度上可以提高污水中药物抗性菌株和可降解菌株分离效率。
[0036] (二)本发明填补了污水中残留药物对污水处理工程菌株性能的效应的研究空白。本发明设置不同的残留药物浓度,对污水处理工程菌的药物降解性能进行研究,结果表明不同的药物组合下微生物的药物降解性能有很大不同。用本发明改进的培养基方法能够得到药物降解效率更高的工程菌株。本发明可以改进目前传统方法的不足,可以有效地改善目前城市污水处理厂中残留药物的降解,减小城市污水排放对自然环境和人类造成的潜在危害。

具体实施方式

[0037] 以下通过具体实施例详细介绍本发明的实施过程和所产生的有益效果,旨在帮助阅读者更好地了解本发明的精神所在,但不能理解为对本发明可实施范围的任何限定。
[0038] 实施例1
[0039] 改进的培养基BM(Basic Medium)配方:每1000mL液体培养基中含有0.5g NaCl、1.5g NH4Cl、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4和0.2g MgSO4,加入超纯水至1000mL;每1000mL固体培养基中含有0.5g NaCl、1.5g NH4Cl、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4和15g琼脂,加入超纯水至1000mL。
[0040] 改进的培养基FM(Fermentation Medium)配方:每1000mL液体培养基中含有0.5g NaCl、1.5g NH4Cl、1.5g K2HPO4、0.5g KH2PO4、0.2g MgSO4、1g蛋白胨、0.5g酵母膏,加入超纯水至1000mL。
[0041] 一、首先,利用BM培养基筛选污水样品中的菌株,具体方法如下:
[0042] (1)按照以上配方配置改进的BM培养基。
[0043] (2)取1mL从香港沙田污水处理厂采集的污水样本,加入到20mL上述配制的改进的BM液体培养基中,调节转速为200RPM,温度为26℃,放置在摇床上培养5天。
[0044] (3)将富集的培养液分别按照1X、3X、5X、10X的稀释比例,再次加入到BM液体培养基中培养。
[0045] (4)培养24-48小时后,将各个梯度的培养液分别涂布于BM固体培养基上,在26℃的条件下倒置培养3-5天。
[0046] (5)菌株进一步在新的平板上分离纯化。根据颜色、形态和16S rRNA基因的序列比对结果,将分离纯化的菌分类。
[0047] 本实施例中,从同样采自香港沙田污水处理厂的污水样品中,采用本实施例的方法共分离得到22株细菌,这22株菌经NCBI在线BLAST鉴定,属于9个菌种(species),6个菌属(genus),分别是Pseudomonas(12株,本发明中分别命名为CE21、CE22、CH21、E1、E2、E3、E21、R4、R21、R22、T21、T2,分属于3个种),Achromobacter(1株,本发明中命名为CE23),Stenotrophomonas(2株,本发明中命名为CE24、E4,属于2个种),Enterobacter(2株,本发明中命名为OF21、OF31,属于1个种),Alcaligenes(3株,本发明中命名为OF33、OF34、T23,属于2个种),Acinetobacter(2株,本发明中命名为R3、R5,属于1个种)。各菌属内菌株的BLAST相似性鉴定结果具体请参见表1。传统LB筛选出的5株菌属于3个genus,分别是
Stenotrophomonas,Pseudomonas,Alcaligenes);而同时用传统LB培养基筛选法,只分离得到5株菌(属于3个genus,分别是Stenotrophomonas,Pseudomonas,Alcaligenes)。本发明的BM培养基筛选方法所筛到的菌株数量是LB方法的4-5倍。与传统用LB培养基方法相比,本发明所用的培养基可以分离得到更加丰富的菌株,一定程度上可以提高污水中药物抗性菌株和可降解菌株分离效率。
[0048] 表1 本发明筛选出的22株菌的BLAST鉴定结果(相似性,%)
[0049]
[0050] 二、其次,利用FM培养基对分离得到的菌株进行药物降解性能的检测。具体方法如下:
[0051] (1)按照以上配方配置FM液体培养基,121℃灭菌20分钟待用。
[0052] (2)选取污水残留药物中具有代表性的药物,包括头孢氨苄(Cefalexin)、氯霉素(Chloramphenicol)、萘普生(Naproxen)、新诺明(Sulfamethoxazole)、咖啡因(Caffeine)、水杨酸(Salicylic acid)等。将以上几种药物混合后,按照0.1ppm和1ppm两种浓度分别加入灭过菌的FM液体培养基中。
[0053] (3)在无菌操作条件下,将分离纯化后富集培养得到的菌株分别接种于灭过菌的FM培养基,26℃,200RPM培养3天。
[0054] (4)同时,将同等条件设置下,加入经过121℃灭菌20分钟灭菌杀死的菌株细胞培养作为空白对照。
[0055] (5)培养得到的混合液离心后,用Oasis HLB纯化柱和Agilent HP1100液相色谱质谱串联法分离和检测药物含量。
[0056] 经100ppm药物试验表明,本发明筛选到的22株菌中,具有对各自对应药物的抗性。具体如下:CE23\CE24对Cefalexin有抗性;E1\E2\E3\E4\E21对Erythromycin有抗性;OF21/OF31/OF33/OF34对Ofloxacin有抗性;R3/R4/R5/R21/R22对Roxithromycin有抗性;T2/T21/T22对Tetracycline有抗性;CH21对Chloramphenicol有抗性。除了CE21和CE22外的其他菌株对药物都没有降解效应。
[0057] 本实施例中,选用所筛选出菌株中的两株具有代表性的菌株CE21和CE22,分别计算每种药物的降解率。结果参见表2。
[0058] 表2 菌株CE21和CE22对各药物的降解率
[0059]
[0060] 结果表明0.1ppm浓度下每种药物的降解率和1ppm浓度下每种药物的降解率都有差异。其中对药物氯霉素、咖啡因、水杨酸在不同药物浓度组合下的生物降解率具有明显差异。
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