技术领域
[0001] 本
发明涉及兽医
生物制品学、免疫学及生物医学工程中的病毒检测，具体涉及一种新城疫病毒压电免疫传感检测方法，属于兽医生物技术领域。
背景技术
[0002] 新城疫(Newcastle Disease，ND)是一种急性、败血性、高度
接触性一类动物疫病，其传播迅速，发病率和死亡率高，一旦爆发疫情，将会给养禽业造成不可估量的损失。在《国家中长期动物疫病防治规划(2012—2020)中，新城疫被列为优先防控的重大动物疫病之一。因此，动物疫控机构、动物卫生监督机构和养殖场非常重视新城疫的防控。
[0003] 新城疫的诊断有多种方法，但均存在一定的局限。血凝-血凝抑制试验(HA-HI)和酶联
免疫吸附试验(ELISA)耗时长，特异性不强，程序相对复杂；鸡胚病毒分离方法是一种敏感特异的方法，但整个过程约需3周左右，且操作烦琐，不利于现场检疫或监测；CN1827775A(
专利申请号为200510008997.6)“检测
新城病毒的核苷序列、
试剂盒及检验方法”，该发明选择新城疫病毒F基因(合成F蛋白)作为靶区域，选择能够反映裂解位点特性且缺乏二级结构的保守区设计多对引物和探针，建立
荧光PCR检测新城疫病毒，该方法比传统的PCR方法灵敏度高100-1000倍，但从样品处理到出结果需要4小时左右，该方法的实施还需荧光定量PCR仪等昂贵仪器，不宜在
基层推广。因此，研究一种快速检测新城疫病毒的诊断方法以便对疫情进行现场及时监控，已经是目前畜牧生产中急需解决的问题。
发明内容
[0004] 针对
现有技术存在的上述不足，本发明的目的在于提出一种新城疫病毒压电免疫传感检测方法，本检测方法具有较高的敏感性和特异性，可实时在线检测，检测快速。
[0005] 本发明的技术方案是这样实现的：
[0006] 一种新城疫病毒压电免疫传感检测方法，步骤如下，
[0007] 1)先在
石英晶体表面包被葡萄球菌A蛋白；
[0008] 2)再将制备的新城疫病毒单克隆
抗体与葡萄球菌A蛋白结合，得到新城疫病毒压电免疫
传感器；
[0009] 3)然后将新城疫病毒压电免疫传感器插入被检样品中，通过检测仪检测石英晶体是否出现谐振
频率变化，如出现谐振频率变化，则说明被检样品中有新城疫病毒，否则被检样品中没有新城疫病毒。
[0010] 步骤1)在石英晶体表面包被葡萄球菌A蛋白时，将洗涤烘干后的石英晶体置于葡萄球菌A蛋白溶液中，在37℃保持30min即可，其中葡萄球菌A蛋白溶液浓度为0.2mg/ml。
[0011] 步骤2)新城疫病毒单克隆抗体与葡萄球菌A蛋白结合时，将步骤1)表面包被有葡萄球菌A蛋白的石英晶体置于新城疫病毒单克隆抗体溶液中，在37℃保持30min即可，其中新城疫病毒单克隆抗体浓度为0.2mg/ml。
[0012] 步骤3)检测石英晶体是否出现谐振频率变化的时间不低于30分钟。
[0013] 所述葡萄球菌A蛋白按如下方法提取，复苏并培养金黄色葡萄球菌1.800菌株，收集菌液，采用溶解酶处理并离心，上清用饱和
硫酸铵沉淀，PBS溶解后转入
透析袋透析；透析物用小鼠IgG-sephrose 4FF亲和层析柱纯化；吸附在柱上的SPA用0.1M，pH2.7
盐酸甘
氨酸缓冲液洗脱；收集样品，合并透析，浓缩后备用。
[0014] 所述新城疫病毒单克隆抗体按如下方法制备，复苏新城疫病毒单克隆抗体杂交瘤细胞株4E11，培养至其对数生长期，取12周龄的BALB/c小鼠若干只，并分别
腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.2-0.3ml/只；3天后腹腔接种用无血清培养基稀释的杂交瘤细胞，每只小鼠1—6
3×10 /0.3ml；间隔5天后，每天观察小鼠腹
水产生情况，如腹部明显膨大，以手触摸时，
皮肤有紧张感，即可采集腹水，纯化即得新城疫病毒单克隆抗体。
[0015] 步骤3)检测石英晶体谐振频率是否变化时，以新城疫病毒标准
抗原作阳性对照，禽流感病毒作阴性对照，PBS液作空白对照。
[0016] 将不同的新城疫病毒压电免疫传感器对应插入抗原浓度不同但已知的标准抗原中，检测不同浓度标准抗原下石英晶体刚插入时的初始谐振频率及谐振频率稳定时的稳定谐振频率，得到不同浓度对应的频率差，即频移值，进而得到抗原浓度与频移值的关系曲线；然后再进行步骤3)，如石英晶体出现频率变化，进一步确定被检样品对应的频移值，根据抗原浓度与频移值的关系曲线，即可得到被检样品中新城疫病毒浓度。
[0017] 相比现有技术，本发明具体优点如下：
[0018] 本发明利用抗原抗体反应的特异性和压电石英晶体传感器的敏感性对新城疫病毒进行检测。将葡萄球菌A蛋白(SPA)包被石英晶体，再将新城疫病毒单克隆抗体与SPA结合，然后检测待测样品中的新城疫病毒，新城疫病毒与抗体结合前和结合后，石英晶体在检测仪上会反应出谐振频率的变化，根据谐振频率的变化即可确定样品中是否有新城疫病 毒。本发明可实时在线检测NDV，具有较高的敏感性和特异性，线性检测范围在2.56ng/ml-150ng/ml，最低检测下限为2ng/ml，40min内出现结果。本发明具有较高的敏感性、准确性，快速且低成本。
附图说明
[0019] 图1-小鼠IgG-sephrose 4FF亲和层析柱纯化SPA。其中第一个峰为含杂蛋白的穿透峰，第二个峰为含有Protein A的洗脱峰。
[0020] 图2-纯化的SPA SDS-PAGE
电泳鉴定结果(1-2：提纯的SPA)。
[0021] 图3-SDS-PAGE电泳鉴定腹水抗体纯度(1-3:辛酸-硫酸铵法纯化后腹水，4:未提纯的小鼠腹水)。
[0022] 图4-NDV单抗浓度与频移值变化曲线。
[0023] 图5-新城疫压电免疫传感器检测标准NDV AV29。
[0024] 图6-新城疫压电免疫传感器检测标准AIV-H9。
[0025] 图7-新城疫压电免疫传感器检测NDV标准曲线。
[0026] 图8-本发明压电免疫传感检测原理图。
具体实施方式
[0027] 下面结合附图对本发明作进一步详细说明。
[0028] 压电石英晶体
生物传感器是利用压电石英晶体谐振频率对晶体表面
质量负载和表面性状如
密度、
粘度、电导、
介电常数等的高度敏感性与生物识别分子的高度特异性相结合发展起来的一种新型传感器。具有灵敏度高、特异性好、操作简单，不需任何标记，检测速度快、成本低廉、能实时检测等特点。近年来，压电石英晶体传感器在医学实验诊断、军事监控、环境检测、食品卫生检验、工业生产实时监测等野外流动作业和在线检测等领域得到广泛应用，但目前在动物疫病诊断领域尚未利用。根据这种情况，本发明提供了一种新城疫病毒压电免疫传感器及其检测方法。利用抗原抗体反应的特异性和压电石英晶体传感器的敏感性对新城疫病毒进行检测。其思路在于：将葡萄球菌A蛋白(SPA)包被石英晶体，再将新城疫病毒单克隆抗体与SPA结合，得到新城疫病毒压电免疫传感器，然后将其插入检测样品中检测新城疫病毒，因为新城疫病毒与抗体结合前和结合后，石英晶体表面质量会发生变化，该变化会导致石英晶体在检测仪上反应出谐振频率的变化，根据谐振频率是否变化即可确定样品中是否有新城疫病毒。其具体检测实现涉及如下过程。
[0029] 1 金黄色葡萄球菌外膜A蛋白(SPA)的提取与鉴定
[0030] 1.1 SPA的提取
[0031] 取营养肉汤培养基上生长24小时金葡菌培养物，用0.05M T r i s-H C l，p H 7.5液洗下菌苔，按菌重每100g湿菌加溶菌酶5mg，调p H至3.5，离心后上清液调p H至7.0。
用饱和硫酸铵沉淀，PBS溶解后转入透析袋透析。透析物用小鼠I g G-sephrose 4FF亲和层析柱纯化(图1)，吸附在柱上的SPA用0.1M，pH2.7盐酸甘氨酸缓冲液洗脱。收集样品，合并透析，浓缩后作分析。
[0032] 1.2 SPA的鉴定
[0033] 采用BCA法测浓度，结果显示SPA蛋白浓度为0.933mg/ml；SDS-PAGE电泳结果显示42KD处有明显的电泳条带，与文献报道一致(图2)。以SPA为抗原，提纯小鼠IgG为样品进行ELISA，结果显示小鼠IgG稀释到1:25600时仍能与SPA结合(表1)，表明提取的SPA活性较高。
[0034] 表1 ELISA试验鉴定SPA与小鼠IgG
反应性[0035]
[0036] 2 新城疫病毒单克隆抗体的制备及纯化
[0037] 2.1 新城疫病毒腹水单克隆抗体的制备
[0038] 复苏新城疫病毒单克隆抗体4E11杂交瘤细胞，培养至对数生长期时，取12周龄的BALB/c小鼠20只，腹腔注射弗氏不完全佐剂，0.2-0.3mL/只；3天后腹腔分别接种用无血清培养基稀释的4E11杂交瘤细胞，每只小鼠3×106/0.3mL，共10只；间隔5-7天后，采集腹水，连续采2-3次，每只小鼠采集4-6mL腹水，共收集4E11腹水52mL。
[0039] 2.2 抗体的纯化及效价测定
[0040] 采用辛酸-硫酸铵法进行抗体的纯化。将纯化前后的腹水进行SDS-PAGE电泳鉴定，结果如图3，表明提纯腹水4E11单克隆抗体主要出现清晰的重链和轻链，纯度较好。经紫外分光光度计测得提纯后4E11抗体浓度为5.67mg/ml；采用间接ELISA测定小鼠4E11腹水抗体纯化前后的效价，提纯前小鼠腹水抗体效价为1:64000，提纯后抗体效价为1:32000，表明抗体提纯后效价损失小。制备的NDV单克隆抗体为后续的研究提供了有效的试剂。
[0041] 3、新城疫病毒压电免疫传感器的制备和检测方法
[0042] 3.1 石英晶振的洗涤
[0043] 将石英晶振置于1.2mol/l的NaOH溶液中静置10min，用双蒸水冲洗。再置于1.2mol/l 的HCl溶液中静置10min，双蒸水冲洗。于晶振
银电极表面分别滴加一滴浓盐
酸洗涤2min后，双蒸水冲洗干净，再分别先后置于丙
酮溶液，灭菌双蒸水中超声洗涤2min后凉干备用。
[0044] 3.2 SPA敏感膜的制备
[0045] SPA用0.01M，pH7.4PBS稀释成0.05、0.10、0.15mg/ml三个浓度；
温度选择25℃，37℃，4℃，时间设定为15min，30min，60min，设计
正交试验。频移值Δf达到最大时的条件即为制备SPA敏感膜的最佳反应条件。计算平均频移值Δf＝f1－f2，以平均频移值Δf最大的条件作为制备蛋白A敏感膜的最佳反应条件。最佳反应条件为SPA浓度为0.2mg/ml，37℃，30min(表2)。
[0046] 表2制备SPA敏感膜最佳反应条件的选择
[0047]
[0048]
[0049] 3.3 抗体的吸附
[0050] 将步骤2制备的NDV抗体用0.01M，pH7.4PBS稀释成0.025、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4mg/ml六个浓度；温度为37℃；固定时间设定为60min，30min，15min。设计正交试验确定最佳抗体固定条件。当SPA与抗体达到最大结合时，曲线趋于平稳，此时石英晶振谐振频率变化不大，频移值Δf达到最大。计算平均频移值Δf＝f1－f2。经正交试验分析，以平均频移值Δf最大的抗体固定条件作为固定抗体的最佳条件。经正交试验分析固定抗体的最佳条件是单抗浓度为0.2mg/ml，37℃下固定30min(图4)。由此得到新城疫病毒压电免疫传感器。
[0051] 3.4 新城疫病毒压电免疫传感器检测方法的建立
[0052] 以NDVAV29标准株(购自中国兽医药品监察所)作阳性对照；H9亚型禽流感病毒株(购于中国农业科学院哈尔滨兽医研究所)作阴性对照。将前面得到的传感器与便携式压电痕量生化检测仪连接，插入被检样品中立即记录石英晶振谐振频率(f5)，若被检样品为阳性，固定在石英晶振表面上的抗体就能捕获到相应的抗原，发生免疫反应形成抗原-抗体复合物沉积在石英晶振表面，其谐振频率降低。所捕获的抗原量通过传感器的频率变化加以监测。即：随着抗体捕获抗原的增加，检测曲线缓慢下降。当检测曲线趋于平稳，石英晶振谐振频率下降到最大且谐振频率变化不大，表明此时压电免疫传感器捕获的抗原达到最大。记录其频率(f6)，计算频移值Δf＝f5－f6，此时的频移值Δf为最大频移值Δf。将此时作为压电免疫传感器的检测时间。同时，记录反应10min，20min，30min，40min时的频率，分别计算其频移值Δf，并分析检测曲线的变化趋势。以检测曲线趋于平稳，频移值Δf最大时的检测时间，作为压电免疫传感器的检测时间。结果如图5-6。利用NDV 免疫传感器检测NDV标准抗原溶液，当检测20-30min时，检测曲线趋于平稳，其频移值最大。浓度高的检测时间短，浓度低的检测时间长，综合上述情况，本发明将检测时间确定不低于30分钟，实际按40min进行。
[0053] 4 新城疫压电免疫传感器灵敏度试验
[0054] 将NDVAV29标准抗原用0.01M，pH7.4PBS稀释成1、2.5、5、10、25、50、100、200mg/ml八个浓度，新城疫压电免疫传感器检测NDV标准抗原溶液。同时，用AIV作阴性对照，0.01M，pH7.4PBS作对照。便携式压电痕量生化检测仪监测检测过程，并在电脑中显示检测曲线变化趋势：随着检测进行，检测曲线不断下降并逐渐趋于平稳。计算检测过程的频移值Δf，各稀释度重复检测3次，计算平均频移值Δf。以抗原浓度为横坐标，平均频移值Δf作纵坐标，建立标准曲线，确定最低检测下限。经线性分析y＝-0.2236x2+79.66x+1889.8，线性回归常数R2＝0.9934。线性检测范围在2.56ng/ml-150ng/ml，其线性良好，最低检测下限为2ng/ml。图7为新城疫压电免疫传感器检测NDV标准曲线。
[0055] 根据上述抗原浓度与频移值的标准曲线，即可进行待测样品新城疫病毒浓度检测。此时只需要把新的传感器置于待测样品中，如石英晶体出现频率变化，再进一步确定被检样品对应的频移值，根据上述标准曲线，即可得到被检样品中新城疫病毒浓度。如果频移值处于标准曲线对应的频移值峰值，说明待测样品新城疫病毒浓度超过了本标准曲线的检测上限，此时再对被检样品进行稀释即可，直到检测出的频移值在标准曲线内，根据标准曲线频移值对应的浓度，在结合稀释情况反推，即可得到被检样品中新城疫病毒实际浓度。
[0056] 本发明检测原理：先在石英晶体表面包被SPA，抗体的Fc段可非特性地与SPA结合。抗体固定后，再通过其Fab
片段的抗原结合区与相应抗原发生特异性结合。新城疫病毒与抗体结合前和结合后，石英晶体表面会发生质量变化，质量变化会导致检测仪检测出谐振频率的变化，根据谐振频率的变化即可确定样品中是否有新城疫病毒，其原理见图8。
[0057] 最后需要说明的是，以上
实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制，尽管
申请人参照较佳实施例对本发明进行了详细说明，本领域的普通技术人员应当理解，对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本技术方案的宗旨和范围，均应涵盖在本发明的
权利要求范围当中。
